Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sisplatiini resistanssi on yksi tärkeimmistä syistä, jotka johtavat korkea kuolleisuus munasarjasyöpään . Metyyli-Capture sekvensointi (MethylCap-kohdat), jossa yhdistyvät saostuminen metyloitua DNA yhdistelmä metyyli-CpG sitova domeeni MBD2 proteiinia NGS, globaali ja puolueeton selvitys globaaleista DNA metylaation. Käytimme MethylCap-seq analysoida genominlaajuisten DNA metylaatio profiilia sisplatiinin herkkien munasarjasyövän A2780 ja sen isogeenisistä johdannainen kestävä linja A2780CP. Saimme 21763035 raaka lukee että lääkkeille vastustuskykyiset solulinjan A2780CP ja 18,821,061reads herkälle A2780. Havaitsimme 1224 hyper-metyloidut ja 1216 hypometyloidut DMRs (differentiaalisesti metyloitu alue) in A2780CP verrattuna A2780. Meidän MethylCap-kohdat tietoa tästä munasarjasyöpä sisplatiini kestävä malli antoi hyvän resurssi tutkimusyhteisön. Huomasimme myös, että A2780CP verrattuna A2780, on pienempi havaittu odotettua metyloitu CpG suhteet, mikä viittaa alempi maailmanlaajuinen CpG metylaatio A2780CP soluissa. Metylaatiospesifisen PCR ja bisulfiitti sekvensointi vahvisti hypermetylaatiota PTK6, PRKCE ja BCL2L1 A2780 verrattuna A2780CP. Lisäksi hoidon demetylaation reagenssilla 5-atsa-dC A2780 soluissa demetyloitunut promoottorien ja palautti ilmaus PTK6, PRKCE ja BCL2L1.

Citation: Yu W, Jin C, Lou X, Han X, Li L, hän Y, et ai. (2011) Global analyysi DNA metylointi metyyli-Capture Sequencing paljastaa Epigeneettiset valvonta sisplatiinia Resistance in munasarjasyöpäsolu. PLoS ONE 6 (12): e29450. doi: 10,1371 /journal.pone.0029450

Editor: Matteo Pellegrini, UCLA-DOE instituutti Genomics ja Proteomiikka, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 lokakuu 2011; Hyväksytty: 29 marraskuu 2011; Julkaistu: 22 joulukuu 2011

Copyright: © 2011 Yu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat varat BL ministeriön Science and Technology of China [2006AA02A303, 2006AA02Z4A2, 2006DFA32950, ​​2007DFC30360]. Tätä työtä tukee varoja JZ National Science Foundation (30921140312), National Research Program for Basic Research (2009CB825606, 2009CB825607 ja 2010CB912802) ja kansainvälinen yhteistyö Grant (2009DFA31010) ja XD). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Lääkeaineresistenssi on tärkeä syy johtaa korkea kuolleisuus munasarjasyöpään. Kemoterapeuttinen aine sisplatiini (cis-diamminedi-chloroplatinum (II)) on erityisen tehokas vastaan ​​munasarjasyövän ensimmäisen vastauksen on enintään 70% [1]. Kuitenkin munasarjasyöpä lopulta kehittyy vastustuskykyisiä sisplatiinin ja 5 vuoden pysyvyys potilaille on vain 15-20% [2]. Sisplatiini välittää sen toimintaa muodostamalla DNA addukteja-ensisijaisesti sisäiseen lohkon ristisidosyhdisteiden addukteja [3] ja aktivoi useita signaalintransduktioreitteihin kuuluvat ATR, p53, p73, ja MAPK reittejä, jolloin apoptoosin [3], [4].

DNA: n metylaatio liittyy usein transkription tukahduttamisesta geenin ilmentymisen [5] sekä vastaukset kemoterapiaa [6], [7]. Yksi klassinen esimerkki on, että metylaatio MGMT (O6-metyyliguaniini-DNA metyylitransferaasi) promoottori glioomis- on hyödyllinen ennustaja reagointikykyä kasvainten alkylointiaineen karmustiini [1,3-bis (2-kloorietyyli) -1-nitrosourea] sekä yleistä ja taudista vapaan eloonjäämisen glioomis- [6]. Munasarjojen syöpien, Taniguchi et ai. ehdottaa mallina munasarjojen syövän etenemisen joissa alkuperäinen metyloinnin FANCF seuraa FANCF demetylaation ja lopulta johtaa sisplatiinin vastus [7]. DNA: n metylaatio useiden geenien munasarjojen syöpien, mukaan lukien HSulf-1 [8], ABCG2 [9], EZH2 [10] on havaittu olevan yhteydessä lääkeresistenssin. Boettcher et al. analysoidaan HD- DNA metylaatio profiilit 800 CpG-saarekkeiden (CGI) valittujen geenien ja havaittiin, että hyper-metylaatio CGI BRCA1-, CDH1, DNAJC15 ja SULF2 sekä hypo-metyloinnin CGI varten ABCB1, APC ja HIC1 geenit osoittivat lisääntynyttä doksorubisiini toleranssi [11]. Chang et al. käytetty maailmanlaajuisesti geenin ilmentymisen profilointi analysoida syöpäsolujen ennen hoitoa ja sen jälkeen DNA-metyylitransferaasi inhibitor5-atsa-2′-deoksisytidiini, joka uudelleen aktivoi metylaatio vaiennettu geeni [12]. He tunnistivat useita satoja geenejä, jotka säädellä vähentävästi sisplatiini resistenttien syöpäsolujen ja aktivoida DNA metyylitransferaasi inhibiittori 5-atsa-2′-deoksisytidiini [12]. Li et ai. vertasi mety- A2780 ja niistä resistenttejä solulinjan useiden kiertojen jälkeen lääkkeen valinnat globaali CGI metylaatio paneelit ja mRNA ilmaisun mikrosiruja [13].

Hyödyntämällä seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) teknologiat metyloitua osa genomin vangiksi MeDIP-kohdat [14], methylCap-kohdat [15] ja methylcap-kohdat [16] on profiloitu syvällisemmin kuin array-pohjainen, paljastaen monia uusia alueita, jotka ovat eri tavoin metyloitu biologisen sisällön. Kirjoittajat raportoivat vertailua maailmanlaajuisen DNA metylaation of ciplatin herkkien (A2780) ja resistenttejä (A2780CP) munasarjan solulinjat keskeisille epigeneettiset säätimet vastuussa sisplatiinin vastus. Havaitsimme 1224 hyper-metyloidut ja 1216 hypometyloidut DMRs (differentiaalisesti metyloitu alue) in A2780CP verrattuna A2780. Huomasimme myös, että A2780CP verrattuna A2780, on alempi maailmanlaajuinen CpG metylaatio. Useita geenejä vahvistettiin olevan sekä promoottorin metylaation ja vastaava ilmaisu muuttuu myös PTK6, PRKCE ja BCL2L1 ja hoidon demetylaation reagenssilla 5-atsa-dC A2780 soluissa demetyloitunut edistäjiä ja palauttaa niiden ilmaisua.

Tulokset

Methylomic analyysi sisplatiinin resistenttien A2780CP ja sen isogeenisistä sisplatiinin herkän A2780

Human munasarjasyöpäpotilailla A2780CP solulinja (sisplatiini-resistentti) johdettiin A2780 (sisplatiini-herkkä) solulinjassa, mutta näytä lisääntyneen resistenssin sisplatiinin [17]. A2780CP ja A2780 ovat isogeenisistä (sama genominen DNA). Sen varmistamiseksi, että solulinja A2780CP olimme silti edelleen sisplatiini vastus, suoritimme MTT määrityksessä arvioimaan sisplatiiniin huumeiden vasteita A2780CP ja A2780-soluissa. Olemme havainneet, että IC50 A2780CP (5,0 ug /ml), on lähes 3-kertaa suurempi kuin A2780 (1,8 ug /ml) (Fig. 1). Tuloksemme on yhdenmukainen aiempien raportoitu sisplatiinin vaste profiilit A2780CP [17], mikä osoittaa, että solulinjat meillä oli laboratoriossa säilyttää ero sisplatiinin vastarintaa.

Sekä A2780 ja A2780CP käsiteltiin sisplatiinin eri annokset 0 ug /ml 16 ug /ml 72 tunnin ajan.

Olemme näin ollen soveltaa MethylCap-seq analysoida methylomic profiilit sekä A2780 ja A2780CP soluja. Saimme 21763035 raaka lukee että lääkkeille vastustuskykyiset solulinjan A2780CP ja 18,821,061reads herkälle A2780. 13950202 (64,1%) ja 13671899 (72,6%) lukee oli ainutlaatuisesti kartoitettu ihmisen genomin A2780CP ja A2780 vastaavasti.

selityksin lukee nähden CpG saarilla ihmisen genomin (http: //genomin .ucsc.edu /) ja havaittiin, että noin 1,4% ja 2,5% lukee paikantaa sisällä CpG-saarekkeiden vastaavasti A2780CP ja A2780.The keskimääräinen järjestyksessä syvyyden CpG saarten katettu on noin 16 ja 24,5 kertaa. Noin 68% ja 66% ihmisen CpG saaret kuuluivat meidän analyysi A2780CP ja A2780 (taulukko 1). CpG kattavuus ja syvyys saimme meidän MethylCap-kohdat on samanlainen kuin mitä aiemmin julkaistu [18].

havaitsemiseksi ero metylaatio alueet (DMRs) ihmisen genomin välisen herkän ja resistentit solut, käytimme MEDIPS, äskettäin kehitetty työkalu erikoistunut analysointiin immunosaostus perustuu metylointianalyysi (esim MeDIP-kohdat ja MethylCap-kohdat) [19]. Asetamme kriteerit merkittävä DMRs: pituus piikkien asetettiin 500 emäsparin ja huiput 20 rpm (lukee miljoonasosaa), p-arvo alle 0,001 ja suhde rpm kahden solulinjan 20. Saimme 1224 DMRs joka on hyper-metyloitavaa A2780CP verrattuna A2780 (taulukko S1) ja 1216 DMRs joka on hyper-metyloituja A2780 verrattuna A2780CP (taulukko S2). Nämä DMRs olivat selityksin niiden genomista sijainnit ja niihin liittyvien geenien -5 K ep + 5 K bp transkription aloituspaikat (taulukko S3 ja 4).

Lähes puolet DMRs sijaitsivat 5 k ep transkriptilaji aloittaa sivustoja (TSS) geenien. 190 ja 270 DMRs sijaitsivat ylävirtaan TSS vastaavasti A2780 ja A2780CP (taulukko 1). Loput kartoitettu muille alueille ihmisen genomin kuten intronit, eksonit, geenien välinen alueet ja toistot (Ensembl ihmisen genomi merkinnät) (Fig. 2A). Hypermetyloitunut alueet promoottorit geenien tiedetään vähentävän geeniekspressiota [17], mutta vaikutus hypermetylaation alueiden muualle geenin alueella on edelleen epäselvä. Hypermetylaatiota toistuvien genomisekvenssien saattaa estää kromosomi epävakautta, translokaatiot, ja geeni johtuvat häiriöt reaktivaatio transposonien DNA-sekvenssit [17], [20].

. Prosenttiosuus hypermetyloitunut piikkien perustuu niiden lokalisoitu genomista ominaisuuksia. B. jakelu CpG

o /e hypermetyloitunut huippuja perustuu niiden lokalisoitu genomista ominaisuuksia.

Li et al. verrataan isogeenisiin A2780 ja niiden valittu kestävä solulinjasta käyttäen 60-mer oligo microarray sisältävien 40000 CpG-rikas fragmentteja 12000 tunnetun geenin promoottorit (Agilent, Santa Clara, CA) [13]. Käyttäen cutoff-arvo 1,5-kertainen, tunnistettiin 595, 870 ja 1176 hypermetyloitunut geenit Round1, Round3 ja Round5 resistenttejä alalinjoja vertaamalla sitä vanhempien ( ”Round0”) A2780-soluja [13]. Tekniikka he käyttivät on ero metylaatio hybridisaatio (DMH) [21], jossa metyloitua DNA erotettiin metyloitumattomalla mukaan metylaatioherkän entsyymi diagestion luotaa oligonukleotidin joukko ihmisen CpG saaristoalueilla. DMH eroaa MDB-kohdat, joissa metyloitu DNA saostettiin yhdistelmä metyyli-CpG sitova domeeni MBD2 proteiinia, ja sitten sekvensoitiin. Vuonna DMH, eristetty DNA digestoitiin metylaatio-herkkä restriktioentsyymillä Bfal (C∧TAG), ligatoitiin linkkerit, ja pilkottiin jälleen metylaatioherkän entsyymit HinP1I (G∧CGC) ja HpaII (C∧CGG). Digestiotuotteet monistettiin sitten käyttäen liittimiä ja leimattu Cy3 tai Cy5 väriaineet vertaileva hybridisointeja [21]. Huolimatta eri tekniikoihin, Vertasimme MDB-seuraavien tietojen Li et al.: N DMH tiedot. Olemme havainneet, että 221 (1224, 18,1%) ja 142 (sekä 1216, 11,68%) on hypermetyloitunut ja hypometyloidut geenejä A2780CP verrattuna A2780 olivat myös array että Li et al. (taulukko S3, S4). Olemme havainneet, että 15 alueet (vastaten 13-geenit) ja 23 aluetta (21 geenejä), jotka ovat yhteisiä kahden datan sarjaa (taulukko 2), jotka ovat erittäin merkittäviä päällekkäisyys hypergeometrisen todennäköisyyksiä 1.11E-5 ja 4.22E-20 vastaavasti . Yleisesti hypermetyloitunut geenien resistenttien solujen kuuluvat retinoblastooma sitovan proteiinin 8 (RBBP8), SRY-box 1 (SOX1), siivetön-tyyppinen MMTV Integraatiokohdan perhe (WNT9A), yleinen transkriptiotekijä IIIA (GTF3), ja yleisesti hypometyloidut geenit resistentit solut sisältävät liuenneen aineen kantaja perheen 22 (kopuolisia monoamiinin kuljettaja) (SLC22A3), aldehydidehydrogenaasin 1 perhe (ALDH1A3), hyaluronaanisyntaasia 3 (HAS3) ja CUB verkkotunnuksen sisältävä proteiini 1 (CDCP1) (taulukko 2).

on 410 hypermetyloitunut DMRs (taulukko S3) ja 316 hypometyloidut (taulukko S4) in A2780CP verrattuna A2780, jotka eivät olleet array että Li et al. käytetyt, ja ei olisi tunnistaa DMH lähestymistapaa. Nämä uudet DMRs paljasti voima MDB-kohdat identifioida uusia DMRs ilman aiempaa tietoa ehdokas promoottorien laitetaan paneelit käytettäväksi DMH. Lisäksi nämä uudet DMRs voi johtua eroista johdannainen resistenttejä solulinjoja, joita käytettiin Li et al. ja meille.

Matalampi maailmanlaajuinen CpG metylaatio sisplatiinin resistenttien A2780CP soluja verrattuna sisplatiiniin herkkien A2780 soluissa

Ymmärtääksemme maailmanlaajuinen rakenteessa CpG metylaation molemmissa solulinjoissa, olemme analysoineet ominaisuudet ja hypermetyloitunut CpG: t koko genomin laskemalla viereisten CpG: t sisällä 500 bp: n alueiksi, jotka ympäröivät hypermetyloitunut sivustoja ja lasketaan CpG havaittu /odotettu-suhde (CpG

o /e) kunkin CpG käyttäen menetelmää, jonka Ruike et ai . [22]. Huomasimme, että yleisesti, A2780CP on pienempi CpG

O /e kuin A2780, mikä viittaa alempi maailmanlaajuinen CpG-metylaation A2780CP verrattuna A2780 (Fig. 2B vasemmassa yläkulmassa paneeli). Erot olivat enimmäkseen ilmenee korkeampi CpG

o /e vuonna intronin ja toista sekvenssit A2780 verrattuna A2780CP. Vertaamalla CpG

O /e eri genomin alueella luokat (Fig. 2B), CpG

O /e oli suurempi kuin 0,6 eksoneissa ja promoottorit sekä kestävä ja herkkä solulinjoissa, mutta vähemmän kuin 0,6 muissa genomista alueet (toistoja, intronit ja geenien välinen alueet) (Fig. 2B).

Toiminnalliset merkinnät ja koulutusjakson rikastamiseen analyysi DMR geenien

Me tehdään GO analyysin hypermetyloitunut geenien sekä kestävä (taulukko S5) ja herkkä solulinja (taulukko S6). Huomasimme, että hypermetyloitunut geenit herkällä solulinjassa rikastettiin GO termejä: anti-apoptoosin (GO: 0006916), negatiivisen säätelyn solukuoleman (GO: 0060548), ja sääntely solunsisäisen proteiinin kinaasikaskadin (GO: 0010627). Hypermetyloitunut geenien resistenttien solulinjassa on useita rikastunut liittyvistä ehdoista transkriptio tekijä sääntelyn kuten GO: 0030528 transkription säädin toimintaa ja GO: 0003677 DNA sitova.

Meillä on myös suoritettu Kegg koulutusjakson analyysi DRM geenien ja löysi että geenejä hypermetyloitunut promoottorit rikastuneet seuraavissa Kegg reitit mukaan lukien 11 geenien hsa04010 (MAPK -signalointireitistä), 18 geenien hsa05200 (Pathways syövän), 5 geenien hsa04310 (Wnt-signalointireitin), 5 geenien hsa00982 (Drug aineenvaihduntaa ), ja 5 geenien hsa04115 (p53-signalointireitin) (taulukko 3).

Mielenkiintoista on, että monet ECM-liittyviä ja kalvon kanavan proteiinit hypermetyloitunut. Esimerkiksi KCNS1 ja KCNA1, kaksi kalium jänniteherkkiin kanava proteiinia, ja SLC15A4 (liuenneen aineen kantaja perheen 15, osa 4) on hypermetyloitunut A2780CP soluissa taas SLC4A11 (liuenneen aineen kantaja perheen 4, natriumboraatti kuljettaja, jäsen 11) on hypermetyloitunut A2780 solut. COL18A1 (kollageeni, tyyppi XVIII, alfa 1) on hypermetyloitunut A2780 soluissa, kun taas KRTAP10-6 (keratiini liittyvä proteiini 10-6) ja LRFN5 (leusiini rikas toista ja fibronektiinin tyypin III domeenin, joka sisältää 5) hypermetyloitunut A2780CP soluissa. Havaitsimme myös hypermetylaation useissa microRNA loci lukien hypermetylaatiota MI6A2, MIR129-2, MIR124-1, MIR124-3, ja MIR10A vuonna A2780CP ja hypermetylaatiota MIR185, MIR548Q, MIR642A ja MIR661 A2780 (taulukko 4).

Validation geenien kanssa DMRs MS-PCR: llä ja bisulfiitti sekvensointi

geenien ilmentymistä kanssa hypermetyloitunut promoottori tarkastettiin RT-qPCR, jos ilmaus on merkittävä muuttunut sitten metylaatiospesifisen PCR (MS- PCR) käytettiin vahvistamaan metylaatiostatuksen DMR alueiden välillä kaksi solulinjaa. Olemme tunnistaneet seuraavat geenit BCL2L1 (BCL2-like 1), PPKCE (proteiinikinaasi C: n, epsilon), PTK6 (PTK6 proteiinityrosiinikinaasin 6), RAC2 (ras liittyvät C3 botuliinitoksiinin substraatin 2), SECTM1 (erittynyt ja transmembraani- 1) ja DDIT3 (DNA-vaurioita-indusoituva transkriptio 3), joka muuttuu sekä promoottorin metylaation ja ilme. Kuvio 3A osoitti ilmentyminen muuttuu näiden geenien, ja kuvio 3B osoitti promoottorin metylaation näistä geeneistä. DDIT3 oli hypometyloidut A2780 soluissa verrattuna A2780CP, loput osoittivat päinvastainen (Fig. 3B). Edelleen vahvistaa DMRs välillä A2780 ja A2780CP, käytimme bisulfiitti sekvensoinnin sekvensoida promoottorialueet kolme sattumanvaraisesti geeni 6 geeneistä. Kuva 3C osoitti, että kaikki promoottori alueilla poimitaan geenin PTK6, PRKCE ja BCL2L1 oli hypometyloidut vuonna A2780CP verrattuna A2780.

. Reaaliaikainen PCR osoittaa ero ilmentymistä valittujen geenien välillä sisplatiinin herkkä A2780 ja sisplatiinin resistenttejä A2780CP soluja. B. MS-PCR tietoja, jotka osoittavat ero metylaatio toteaa promoottori alueille valittujen geenien välillä A2780 ja A2780CP soluja. C. bisulfiittimodifiointi sekvensointi tulos promoottorialueille valittujen geenin PTK6, PRKCE ja BCL2L1 (valkoinen sykli: metyloimattoman CpG, Musta sykli: metyloitu CpG).

Palauttaminen geenin ilmentymisen DMR vaikuttaa geenien treatmentwith 5 -aza-dc demetylaatio reagenssi

jotta edelleen vahvistaa meidän tiedot, käytimme 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC) onko voimme aktivoida uudelleen metylaatio hiljaiset geenien tunnistimme. 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC) on analoginen sytosiinin. Kun sisällytetty DNA, se sitoutuu palautumattomasti metyylitransferaasin entsyymejä, jolloin passiivinen de-methylationand aktivoituminen epigeneettiseltä vaiennettu geeni [23]. Käytimme 5-atsa-dC hoitoon sekä A2780CP ja A2780 soluissa eri annoksina 0 uM 10 uM. Geenien ilmentymistä käsitelty alhaisin (0 uM) verrattiin käsitelty korkein (10 uM) annos demetylaatio reagenssia.

Osoitimme, että pystyimme demetyloimiseksi promoottorit hypermetyloitunut PRKCE, BCL2L1, RAC2, PTK6, SECTM1 (Fig. 4A, B), ja palauttaa sen ilmaisun jälkeen, kun hoidon 5-atsa-dC: A2780-soluissa. Samoin pystyimme demetyloimiseksi promoottorit hypermetyloitunut geenin DDIT3, ja palauttaa sen ilme hoidon jälkeen 5-atsa-dC A2780CP soluissa (kuvio. 4A, B).

. Validointi muutosten metylaatiostatuksen MS-PCR kuuden geenejä hoidon 0 uM ja 10 uM 5-atsa-dC. B. geeniekspressio muuttuu (Y-akseli, suhteellinen kertainen muutokset) valitun kuudesta geenistä käsittelyn jälkeen eri pitoisuus (X-akseli) demetylaatio reagenssia 5-atsa-dC.

Keskustelu

Kuvaamme täällä ensimmäistä kertaa MDB-seuraavissa analyysi sisplatiinin vasteen malli munasarjasyöpä soluja. Epigeneettisenä väliset muutokset isogeenisissä parin sisplatiinipiikin herkkien A2780 ja sen fenikoliresistenttiin A2780CP solut viittaavat epigeneettisestä valvontamekanismin sisplatiinin vastus. Maailmanlaajuinen MDB-seuraavissa datajoukko luodaan tämän parin isogeenisen solut on hyödyllinen resurssi tutkimusyhteisön kiinnostunut sisplatiinin vastuksen ja epigenetiikka ja munasarjasyövän yleensä. Global DNA metylaatiomuutokset aikana syövän synnyn ja on usein ennustaja hoidon vastauksia. Esimerkiksi, Anisowicz et ai. osoittivat, että jopa normaali osa keuhkojen syöpäpotilaasta on jo kokenut menetyksen maailmanlaajuisen DNA: n metylaatio verrattuna normaalista yksilöstä [24]. Kim et ai. osoitti, että maailmanlaajuinen CpG metylaatio on merkitystä epigeneettiset valvonnassa radioherkkyyttä keuhkosyövässä solulinjoissa [25]. Glioomis-, LINE-1 metylointi, maailmanlaajuinen DNA: n metylaatio markkeri, on verrannollinen MGMT promoottorin metylaation ja korkeamman LINE-1 metylointi on suotuisa ennustetekijä ensisijainen GBM, jopa verrattuna MGMT promoottori metylaatio [26]. Tässä havaitsimme alempi maailmanlaajuinen CpG metylaatio sisplatiinin resistenttien A2780CP soluja verrattuna sisplatiiniin herkkä A2780 soluissa, mikä viittaa siihen, että maailmanlaajuinen DNA metylaation voisi ennustaa sisplatiinin vastustuskyky munasarjojen syöpiä. Edelleen kokeilu on tarpeen arvioida tämän hypoteesin.

Saimme 1224 ja 1216 DMRs joka on hyper-metyloitua tai hypo-metyloitavaa A2780CP verrattuna A2780 soluissa (taulukko S1, S2). Huomasimme, että hypermetyloitunut geenit herkällä solulinjassa rikastettiin GO termejä anti-apoptoosin (GO: 0006916) ja negatiivisen säätelyn solukuoleman (GO: 0060548), mikä viittaa mahdolliseen yleinen mekanismi epigeneettiset vaiennettu antiapoptoosi geenejä, jolloin herkkyys sisplatiinia. Olemme myös havainneet, että DMRs rikastetaan useilla signalointireittejä kuten hsa04010 (MAPK signalointireitin), hsa04310 (Wnt-signalointireitin aktivaatio), ja hsa04115 (p53-signalointireitin) reittien (taulukko 3). Wnt-signalointireitin on liitetty munasarjasyövän etenemiseen ja chemoresistance [27]. Aktivointi JNK /p38 MAPK väyliä vastauksena sisplatiinia voisi johtaa Fas-ligandin induktion ja solukuoleman munasarjakarsinoomasolut [4]. P53 ja sen signalointireitin oli myös liitetty sisplatiinin resistenssin munasarjasyöpäsoluja [28], [29]. Tuloksemme viittaavat siihen, että epigeneettisellä sääntely näistä signalointipolkujen on yksi mekanismeista, joka edistää näiden koulutusjaksojen sisplatiinin resistenssin munasarjasyöpäsoluja.

Meillä on myös tunnistettu hypermetylaation useissa microRNA loci lukien hypermetylaatiota MI6A2, MIR129- 2, MIR124-1, MIR124-3, ja MIR10A vuonna A2780CP ja hypermetylaatiota MIR185, MIR548Q, MIR642A ja MIR661 A2780 (taulukko 4). MikroRNA ovat sekaantuneet sisplatiinin resistenssin munasarjasyöpä [30]. Esimerkiksi Yang et ai. osoitti, että monet miRNA sääntely on purettu ihmisen munasarjasyövän lukien miR-214, miR-199 *, miR-200a, miR-100, miR-125b, ja anna-7 klusteri, ja että miR-214 indusoi solujen eloonjäämistä ja sisplatiini vastarintaa kohdistaminen PTEN [30]. Epigeneettiseltä äänieristys MikroRNA ovat sekaantuneet syövissä [31], [32]. Kuitenkin, metylaatio miRNA-lokuksen ei ole raportoitu aiemmin munasarjojen syöpien; kumpikaan ei ole raportteja suhdetta miRNA metylaatio ja sisplatiinin vastus. Tuloksemme saattavat viitata uuden suunnan tutkimus metylaation mikroRNA loci ja sisplatiinin vastus.

Huomasimme, että BCL2L1 (BCL2 kaltainen 1), PPKCE (proteiinikinaasi C, epsilon), PTK6 (PTK6 proteiini tyrosiinikinaasi 6), RAC2 (ras liittyvät C3 botulinumtoksiini alustaan ​​2), SECTM1 (erittyy ja transmembraani- 1) on hypermetyloitunut sisplatiinipiikin herkkien A2780 soluissa ja DDIT3 (DNA-vaurioita-indusoituva transkriptio 3) on hypermetyloitunut sisplatiinipiikin kestävä A2780CP solut. Niiden ilme myös oli myös muuttunut vastaavasti oletusta, että hypermetylaation olisi hiljentää geeniekspressiota. Varmistimme metylaatio näiden geenien MS-PCR, ja myös pystyivät demetyloimiseksi promoottorit näiden geenien ja palauttaa niiden ilmentyminen käsittelyn jälkeen 5-atsa-dC, ainetta, joka de-methylates ja aktivoi sekä epigeneettiseltä vaiennettu geeni [ ,,,0],23].

Löysimme BCL2L1 on hypermetyloitunut herkällä A2780 soluissa. BCL2L1 (Bcl-xl) koodaa proteiinia, joka kuuluu BCL-2-proteiinia perhe, jonka proteiinin jäsenet toimivat anti- tai pro-apoptoottisten säätävät [33]. Yli-ilmentyminen Bcl-x L-proteiinin tiedetään resistenssin laajan mahdollisesti apoptoottisen ärsykkeen karsinogeneesissä prosesseissa, kuten onkogeenin aktivaation, hypoksia ja matriisi irtoaminen [34] – [37]. Tuloksemme paljastaa, että hypometylaatio BCL2L1 että resistenttien solujen (eli hypermetylaatiota BCL2L1 herkillä solut) lisäisi BCL2L1 ilmaisua, mikä resistenssin sisplatiinia. Tuloksemme on yhdenmukainen sen havainnon kanssa, Williams et al. että Bcl-xL: in munasarjasyövän liittyy chemoresistance ja uusiutuva sairaus [38]. Ottaen yhdessä, tämä viittaa siihen, että ilmentymisen moduloimiseksi BCL2L1 (Bcl-x L), jonka epigeneettisiä avulla voi olla keino ratkaista sisplatiinin resistenssin munasarjasyöpäsoluja.

Havaitsimme myös PTK6 (proteiinityrosiinikinaasin 6), kuten hypermetyloitunut että sisplatiinin herkkien A2780 soluissa verrattuna A2780CP soluihin. PTK6 suoraan fosforyloi AKT ja edistää AKT aktivoinnin vastauksena kasvutekijän [39]. Suhdetta PTK6 sisplatiiniin ei ole aiemmin tutkittu. Edelleen toiminnallinen analyysi PTK6 rooli moduloivan sisplatiinin vastus on perusteltua. PPKCE (proteiinikinaasi C, epsilon) on toinen geeni, joka on hypermetyloitunut sisplatiinipiikin herkkien A2780 soluissa verrattuna A2780CP soluihin. PPKCE kuuluu proteiinikinaasi C (PKC) perheen, jonka jäsenet fosfo- monenlaisia ​​proteiinia tavoitteet ja ovat mukana erilaisissa solun signaalireitteihin [40]. Mielenkiintoista on, sisplatiini, kykeni indusoimaan fosforylaation ja translokaatiota PPKCE plasmasta kalvon tumakalvon ja sytosolifraktion [41]. Hypermetylaatiota PPKCE herkillä soluissa vähentäisi sen ilmaisua, mikä vähemmän translokaatio tumakalvoa tai sytosolifraktion lisättäessä sisplatiinia. Kuitenkin myös vähentää ilmentymistä PPKCE antaa herkkyyden sisplatiiniin munasarjasyöpäsoluja jää tutkittavaksi.

Lopuksi tunnistettiin DDIT3 (DNA-vaurioita-indusoituva transkriptio 3), kuten hypermetyloitunut sisplatiini resistenttien A2780CP soluja verrattuna A2780-soluja. Myös nimeltään GADD153 (Growth pidätyksestä ja DNA-vaurioita-indusoituvan proteiinin 153), DDIT3 koodaa jäsen CCAAT /tehostajan-sitova proteiini (C /EBP) perheen transkriptiotekijöiden, ja aktivoidaan Endoplasmakalvosto stressi, ja edistää apoptoosia. DDIT3 (GADD153) ilmentyminen voidaan indusoida sisplatiinin [42]. Havaitsimme, että se on hypermetylaatio, että resistentit solut, mikä johtaisi vähentyneeseen ekspressioon DDIT3. On mahdollista, että sisplatiini toimii läpi DDIT3 edistää kasvua pysähtymiseen ja apoptoosiin, ja vähentää ilmentymistä DDIT3 soluissa tekisi niistä vastustuskykyisempiä sisplatiinia. Kuitenkin yksityiskohtainen mekanismi jäi tutkittava.

Yhteenvetona generated globaali aineisto varten munasarjasyöpä sisplatiini vastus malli ja havaittiin useita geenejä, jotka alistettiin epigeneettiset ohjaus moduloida sisplatiinin vastarintaa. Nämä geenit saattavat palvelee tavoitteita voittamiseksi chemoresistance sisplatiiniin munasarjojen syöpiä.

Methods

Solulinjat

A2780 ja A2780CP viljeltiin RPMI 1640 väliaineessa (Invitrogen), joka sisälsi 10 % naudan sikiön seerumia (10099-141) 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Solut toimitti ystävällisesti Dr. Stephen Collins UC San Diego (CA, USA).

Sytotoksisuus analyysi

Sekä kestäviä ja herkät solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille pitoisuutena 4000-solujen /hyvin viidessä rinnakkaisena valmiissa elatusaineessa. Sitten soluja käsiteltiin sisplatiinin eri annoksena 0 ug /ml 16 ug /ml. 72 tunnin kuluttua inkubaation elinkelpoisen ja kuolleet solut laskettiin käyttämällä MTT-määritystä, ja vain elävät solut otettiin mukaan analyysiin.

bisulfiittimodifiointi-modifioitu DNA-sekvensoinnin ja metylaatiospesifinen PCR

valmistimme genomista DNA viljellyistä soluista käyttäen DNeasy Veren kudos Kit (Qiagen). Noin 200 ng DNA: ta oli bisulfiitti-käsiteltiin EZ DNA Metylointi-Gold kit (Zymo Research) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. ZymoTaq Esiseos käytettiin metylaatiospesifinen PCR (MSP) ja mukaan näitä alukkeita (taulukko S7). Metylaatiospesifinen PCR ajettiin kokonaistilavuudessa 25 ui käyttäen ZymoTaq Esiseos (ZYMO tutkimus). MSP-reaktiot suoritettiin aluksi inkuboitu 95 ° C: ssa 10 minuuttia, minkä jälkeen 40 sykliä 95 ° C 30 sekuntia, ja lämpökäsittely sopivassa lämpötilassa 35 sekunnin ajan ja 72 ° C: ssa 40 sekunnin ajan. Lopullinen laajentaminen tehtiin inkuboimalla 72 ° C: ssa 7 minuutin ajan. MSP-tuotteet erotettiin 2% agaroosigeeleillä ja visualisoitiin etidiumbromidivärjäyksellä.

Alukkeet bisulfiitti-modifioitu sekvensointi (taulukko S7) ja MSP-suunnitellut web-työkalut MethPrimer (http: //www.urogene. org /methprimer /index1.html) [43]. Edellytykset bisulfiitti-modifioitu Sekvensointireaktion ovat samat kuin MSP. Tuotteet puhdistettiin käyttämällä MinElute PCR-puhdistus Kit, kloonattiin PMD 18-T-vektoriin (Takara) ja sekvensoitiin.

RNA: n eristys ja Reaaliaikainen RT-PCR-

RNA uutettiin käyttäen protokollaa for Trizol reagenssia (Invitrogen). 2 ug RNA ensiksi käänteistranskriptoidaan 25 ui kanssa Archive Kit (Applied Biosystems) ja 2 ui monistettiin Real Time PCR (Bio-RAD CFX96 Rea-Time System). cDNA näytteet monistettiin SYBR® Pre-mix Ex Taq ™. Lämpötilasyklit profiili koostuivat alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 30 sekunnin ajan ja 40 sykliä 95 ° C: ssa 5 sekuntia, 60 ° C: ssa 15 sekunnin ajan ja 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Jokainen näyte käsiteltiin kolmena kappaleena.

5-atsa-2′-deoksisytidiinin hoidon

Ihmisen munasarjakarsinoomasolut A2780 ja A2780CP kasvatettiin 5 päivää, kun läsnä on eri pitoisuuksia 5-atsa -DC (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, ja 10 uM). Tuoretta lääkettä, lisättiin 24 tunnin välein.

Metyloitu DNA Binding Protein-sekvensointi (MethylCap-kohdat)

3 ug genomista DNA: ta eristettiin kuten edellä on kuvattu hajanainen sonikoimalla kanssa Bioruptor (Diagenode, Belgia) ja lopussa korjattu, A-pyrstö, ja ligoitiin 2,5 mmol ”pariksi-end” adapterit (IDT Inc.) seuraten valmistajan suositella protokollan (Illumina Inc.). 1.2 ug DNA fraktioitiin kotitekoinen GST-MBD hartsia puskuriin vaiheittaista suolapitoisuuden noustessa [16]. Suuren suolapitoisuuden fraktio suoraan monistettiin 12 syklin PCR [18]. 350-450 bp osa PCR-tuotteet puhdistettiin geelillä ja kvantitoitiin käyttäen Agilent DNA 1000.

250-400 bp: n DNA fraktiot leikattiin ja puhdistettiin kuten edellä on kuvattu. Tuotteet arvioitiin ja kvantitoitiin käyttäen Agilent DNA 1000-sarjan II määritys ja Qubitfluorometer (Invitrogen) vastaavasti. Kukin kirjasto laimennettiin 8 nM sekvensointiin koskevasta Illumina Genome Analyzer II olevia valmistajan suosittelemaa menetelmää. Saatiin kuvat analysoitiin ja pohja kutsutaan käyttäen Illumina edellyttäen GA putki ohjelmisto OLB 1.6.0 kanssa oletusarvo. Raaka lukee MethylCap-kohdat on jätetty GEO tietokantaan, joka hakunumero isGSE31418.

250-400 emäsparin DNA osa monistetaan osa oli geelin puhdistettu. Kukin kirjasto laimennettiin 8 nM sekvensointi Illumina Genome Analyzer II sen jälkeen, kun valmistajan suosittelemaa menetelmää. Saatiin kuvat analysoitiin ja pohja sanottu käyttäen Illumina edellyttäen GA putki ohjelmisto OLB 1.6.0 kanssa oletusarvo. Raaka lukee MethylCap-kohdat on jätetty GEO-tietokantaan (hakunumero GSE31418).

kartoitus Sequence Lukee

Ihmisen genomin ja mappausinformaatiota (helmikuu 2009, GRCh37 /hg19) oli