Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vγ9Vδ2 solut ovat sytotoksisia T-soluja, jotka kykenevät tunnistamaan munasarjan epiteelin karsinooma (EOC) soluja. Siksi Vγ9Vδ2 solupohjaiset adoptiovanhemmat siirto on houkutteleva hoito EOC. Kuitenkin tehoton

ex vivo

laajennus jälkeen erityisiä stimulaatio Vγ9Vδ2 solujen joillakin potilailla ja niiden väliset suhteet Vγ9Vδ2 solujen ja kliininen kulku EOC ovat asioita, joita on selvennettävä. Tässä, perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMC: t) 60 EOC potilaiden stimuloitiin bromihydriini pyrofosfaatin (BrHPP) tai tsoledronaatti, jotka ovat spesifisiä agonisteja Vγ9Vδ2 soluja. Yhdisteet erosivat toisistaan ​​tehot aiheuttavan

ex vivo

Vγ9Vδ2 PBMC laajentumista, mutta 16/60 näytteet pysyivät tehottomasti laajennettiin molemmilla ärsykkeitä. Mielenkiintoista on, että Vγ9Vδ2 solut näissä matalan vastaa PBMC: t näytetään ennen laajennusta (

ex vivo

PBMC: t) muuntunut tuotannon proinflammatoristen sytokiinien IFN-γ: n ja TNF-α, vähentynyt naiivi osa ja harvemmin . Ei näyttöä osallistuminen CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ sääntelyn solujen havaittiin. Tärkeää on, meidän tiedot osoittavat myös, että Vγ9Vδ2 solun taajuudella 0,35% tai vähemmän EOC PBMC voitaisiin käyttää ennustamaan alhainen vastauksia sekä BrHPP ja tsoledronaattia. Lisäksi meidän data korosta, että tällainen puute ei korreloi kehittynyt EOC vaihetta vaan liittyy vaikeammissa valtioiden platinapohjaiseen kemoterapiaan ja on itsenäinen ennustaja lyhyemmän taudista vapaan eloonjäämisen jälkeen hoidon. Nämä tulokset ovat ensimmäinen ehdottaa mahdollisen panoksen Vγ9Vδ2 solujen antituumorivaikutuksia solunsalpaajalääkeaineiden ja ne vahvistavat kiinnostusta strategioita, jotka saattavat lisätä Vγ9Vδ2 solujen syöpäpotilailla.

Citation: Thedrez A, Lavoué V , Dessarthe B, Daniel P, Henno S, Jaffre I, et ai. (2013) määrällinen puutos ääreisveren Vγ9Vδ2 Cells on negatiivinen Prognostiset biomarkkereiden munasarjasyövässä Potilaat. PLoS ONE 8 (5): e63322. doi: 10,1371 /journal.pone.0063322

Editor: Eric Vivier, INSERM- CNRS- Univ. Méditerranée, Ranska

vastaanotettu: 02 tammikuu 2013; Hyväksytty: 02 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 23, 2013

Copyright: © 2013 Thedrez et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Institut National du Cancer (INCA) PL2008-034, Cancéropôle Grand-Ouest ja taloudellista tukea Medicine tiedekunnan Rennes yliopistosta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ihmisen Vγ9Vδ2 solut ovat vallitseva osajoukko ääreisveren γδ T-solut, jotka ilmentävät ainutlaatuinen TCR Vγ9-Vδ2 alueilla. Nämä solut, jotka yleensä muodostavat 0,5-10%: n reuna-lymfaattisessa allas, reagoida eri kasvainsoluja tunnustamalla fosforyloidun isoprenoid määriteltyjen johdannaisten phosphoantigens [1], [2]. Vγ9Vδ2 solut voivat suoraan tappaa tavoitteensa ja vapauttamalla pro-inflammatoristen sytokiinien, jotka parantavat anti-kasvain efektorisolujen adaptiivisen immuunijärjestelmän [3]. Näiden ominaisuuksien vuoksi, valikoiva laukeaminen näiden solujen voi olla tärkeiksi syövän immunoterapiassa [4]. Useat tällä hetkellä saatavilla kliinistä-luokan yhdisteet pystyvät vahvasti aktivoimaan Vγ9Vδ2 soluja ja IL-2, voi aiheuttaa valikoiva seuraus näiden solujen

in vitro

ja

in vivo

. Nämä yhdisteet ovat joko synteettisiä phosphoantigens, kuten bromihydriini pyrofosfaatti (BrHPP, Phosphostim ™), tai farmakologisen estäjät mevalonaatin reitin, kuten aminobisfosfo- (ts, tsoledronaatti, Zometa ™). Tällaisia ​​yhdisteitä on äskettäin arvioitu passiiviset ja aktiiviset immunoterapeuttinen tutkimukset hematologisia maligniteetteja tai kiinteitä kasvaimia [5] – [14]. Nämä hoidot ovat yleensä hyvin siedetty ja ovat aiheuttama rohkaisevia tavoite vasteita joillakin potilailla [12], [15], [16].

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC) on viidenneksi useimmin esiintyvä syöpä naisilla ja aiheuttaa enemmän kuolemia kuin mikään muu gynekologiset syöpään. Useimmat EOC potilaat diagnosoidaan edennyt pitkälle. Tällä hetkellä kaikki potilaat läpikäyvät kirurgisia toimenpiteitä, ja 90% potilaista saavat myös platinapohjaisen kemoterapian. Kuitenkin 5 vuoden pysyvyys on alle 40%. Siksi lisäämään tietoa roolista immuunitutkimusohjelmasta vuonna EOC on johtanut etsimällä innovatiivisia terapeuttisia strategioita, jotka kohdistuvat immuunijärjestelmä [17]. Äskettäin ryhmämme osoitti, että

in vitro

phosphoantigen-laajentunut Vγ9Vδ2 solujen EOC potilailla osoittavat korkeaa sytolyyttinen aktiivisuus tuoreista munasarjojen autologisia kasvainsoluja, mikä tarjoaa järkevää Vγ9Vδ2 solupohjaisen adoptiivisen siirron EOC potilailla [18] . Kuitenkin väliset suhteet Vγ9Vδ2 solujen ja etenemisen tai kliinisten tulosten EOC pysyvät tutkimaton. Lisäksi joitakin huolenaiheita olemassa siitä tehosta Vγ9Vδ2 solun laajennusten tavanomaisia ​​protokollia, jotka perustuvat

ex vivo

stimulaatio perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC: t), joissa on yksi annos joko BrHPP tai tsoledronaattia ja viljelyolosuhteet että vaativat IL-2. Nämä protokollat ​​ovat sopivia soluja terveiltä luovuttajilta [19], [20]. Kuitenkin he eivät tehokkaasti laajentaa Vγ9Vδ2 solujen joidenkin EOC potilaista [18], samanlaisia ​​havaintoja muissa syövissä [12], [14], [20] – [22]. Jää nähtäväksi, onko nämä epäonnistumiset joillakin EOC potilasta luontaisia ​​eroja Vγ9Vδ2 soluissa tai johtuvat eroista muissa ympäristö- parametrit. Ymmärtäminen tällaiset erot auttaisi optimoimaan tulevaa kliinisten kokeiden Vγ9Vδ2 solupohjaiset adoptiovanhemmat siirto hoitomuotojen EOC.

Tässä tutkimuksessa tutkimme seuraavat kohortin 60 EOC potilaat: liittyviä parametrejä tehoton BrHPP- ja tsoledronaattia aiheuttama Vγ9Vδ2 solu laajennuksia ja mahdollisuus yhdistyksen välillä läsnäolo Vγ9Vδ2 solujen ja kliinistä kulkua EOC. Me raportoimme että PBMC jotka tehottomasti laajennettiin BrHPP ja tsoledronaattia ovat ennen laajentumista (

ex vivo

PBMC) vähensi taajuudet Vγ9Vδ2 solujen ja että nämä solut näyttää muutoksia fenotyyppiään ja toiminnallisuutta. Lisäksi olemme ilmenee, että Vγ9Vδ2 solun taajuudella 0,35% tai vähemmän

ex vivo

EOC PBMC ennustaa alhainen vastauksia sekä BrHPP- ja tsoledronaattia perustuva stimulaatio ja että tällainen solujen puute liittyy kliinisiin etenemisen ja uusiutumisen EOC kemoterapian jälkeen perustuvaa hoitoa.

tulokset

laajenemisesta Vγ9Vδ2 PBMC vastauksena BrHPP ja tsoledronaatti ovat alhaisempia EOC Potilaat kuin terveillä luovuttajilla

Ensimmäinen, vertasimme laajennukset PBMC 60 EOC potilaista (EOC PBMC) ja 13 terveen naisen luovuttajien jälkeen tietyn Vγ9Vδ2 solustimulaatio yhdellä annoksella joko BrHPP tai tsoledronaattia (Zol), joilla oli merkitystä kliinisessä tutkimuksessa protokollia, ja kulttuurin kaksi viikkoa läsnä ollessa IL-2 (Fig. 1). Mediaani taajuus Vγ9Vδ2 solujen laajentunut PBMC (Fig. 1A) ja mediaani lukumäärä laajennetun Vγ9Vδ2 soluja (Fig. 1 B) oli merkitsevästi pienempi EOC potilailla kuin luovuttajien päivänä 14-stimulaation joko BrHPP tai Zol. Nämä tiedot vahvistavat, että vastaukset Vγ9Vδ2 PBMC sekä stimulaation protokollia pienentynyt merkittävästi EOC potilailla.

Vδ2

+ CD3

+ solun taajuuksien joukossa kasvatetut solut (A) ja Vδ2

+ CD3

+ solujen määrä tuotetaan 1 x 10

6 PBMC: t (B) mitattiin 14 päivää sen jälkeen, kun BrHPP (▴) tai tsoledronaatti (Zol) (▪) stimulaatio. Tulokset n = 60 potilasta PBMC ja n = 13 luovuttajan PBMC näkyvät.

BrHPP ja tsoledronaatti eroavat Valmiudet kasvuaan Vγ9Vδ2 PBMC EOC Potilaat

Kun otetaan huomioon meidän tulokset EOC potilaan PBMC laajennuksia (Fig. 1) ja minimaalinen määrä puhtauden joka oli aiemmin määritelty varten Vγ9Vδ2 solu-pohjainen terapia tuote [6], [23], valitsimme laajennetun Vγ9Vδ2 solujen määrä on 2 × 10

6 solua (syntyvät 1 x 10

6 PBMC) (katso taulukko 1 legenda lisätietoja) ja Vγ9Vδ2 solun taajuus 70% joukossa laajennettu solujen raja-arvot erottamaan tehokas laajennuksia (≥2 x 10

6 solua ja ≥70%) tehottomasta laajennuksia ( 2 x 10

6 solua tai 70%). Neljä tilastollisesti eri ryhmään näytteitä täten määriteltyjen meidän koeolosuhteissa (taulukko 1): vastanneista PBMC (R), jotka tehokkaasti laajennettiin sekä ärsykkeitä (53%); BrHPP-low-vastaamisen PBMC (Br-LR), joka oli vain tehokkaasti laajennettiin Zol (13%); Zol-low-vastaamisen PBMC (Zol-LR), joka oli vain tehokkaasti laajennettiin BrHPP (7%); ja matalan vastaamisen PBMC (LR), jotka tehottomasti laajennettiin riippumatta ärsykkeen sovellettu (27%). Nämä tiedot paljastavat erillisiä kyvyt tavanomaisten BrHPP- ja tsoledronaattia-pohjaiset protokollat ​​tehokkaasti laajentaa Vγ9Vδ2 PBMC EOC potilaista.

kapasiteetit Vγ9Vδ2 solujen yleistyisi ja tuottaa proinflammatoristen sytokiinien IFN γ ja TNF-α vähenevät LR EOC PBMC

tutkimiseksi liittyvät parametrit matalan vasteen tilasta Vγ9Vδ2 PBMC sekä BrHPP- ja tsoledronaattia perustuva stimulaatio, vertailevat analyysit rajoittuivat LR ja R-ryhmät.

ensimmäinen vertasi kertaisesta on Vγ9Vδ2 PBMC 14 päivän kuluttua BrHPP tai Zol stimulaation (Fig. 2A ja 2B). Taitteen nousu oli merkitsevästi pienempi LR PBMC kuin R PBMC käsittelyn jälkeen joko agonistin (Fig. 2A). Mediaani BrHPP aiheuttama Vγ9Vδ2 cell kertainen lisäys oli 812 [352-2333] varten R-ryhmän ja vain 132 [74-609] varten LR ryhmän (Fig. 2A). Samanlainen suuntaus havaittiin Zol käsiteltyjä soluja, jossa mediaani-kertaisesta 712 [339-1854] varten R-ryhmän ja 403 [140-872], että LR ryhmän (Fig. 2B). Tuotannon proinflammatoristen sytokiinien IFN-γ: n ja TNF-α byVγ9Vδ2 solujen LR ja R EOC PBMC: t ennen laajennusta (

ex vivo

PBMC: t) on osoitettu myös solunsisäisten värjäystä. Kokeet suoritettiin stimuloimalla

ex vivo

PBMC kanssa BrHPP tai PMA /Ionomycin. Johtuen harvat PBMC määriä näytteistä peräisin potilaista, tsoledronaattia ohitettiin seuraavasta aktivaatiotesteissä. Tuotannot TNF-α ja IFN-γ todettiin vähentää huomattavasti LR PBMC verrattuna R PBMC (Fig. 2C ja 2D). Tärkeää on, että annosta BrHPP jotka kyllästämällä R PBMC: t ei palauttaa IFN-γ: n ja TNF-α-vasteet LR PBMC: (Fig. S1). Yhdessä nämä tulokset osoittavat muuttuneeseen toiminnallista profiilia Vγ9Vδ2 solujen LR EOC PBMC.

A, B) Vδ2

+ CD3

+ solun kertaisesta LR (n = 16) ja R (n = 32), EOC PBMC: t on 14 päivää sen jälkeen, kun BrHPP (A) tai Zol (B) stimulaatio. C) Prosenttiosuudet IFN-γ

+ solujen Vδ2

+ CD3

+ soluja mitattuna 5 h kuluttua stimulaatio

ex vivo

LR (n = 10) ja R ( n = 10) PBMC: t BrHPP (3 uM) tai PMA /ionomysiinillä (PMA /iono). D) Prosenttiosuudet IFN-γ

+ solut (

vasen paneeli

) ja TNF-α

+ solut (

oikea paneeli

) joukossa Vδ2

+ CD3

+ soluja mitattuna 5 h stimulaation jälkeen on

ex vivo

LR (n = 4) ja R (n = 4), PBMC: t kasvavia annoksia BrHPP (0,1-6 pM). E) ilmentyminen CD3ζ ketjun mitattu Vγ9Vδ2 PBMC LR ja R-ryhmiä. Prosenttiosuus (

yläpaneeli

) ja MFI (

alempi paneeli

) on CD3ζ värjäytymistä Vδ2

+ CD3

+ soluja LR EOC PBMC (n = 5), R EOC PBMC: t (n = 3) ja R luovuttajan PBMC: t (n = 3). F) CRTAM ekspressio Vγ9Vδ2 soluihin mitattiin 20 h stimulaation jälkeen LR (n = 8) ja R (n = 8), EOC PBMC: t BrHPP. Ei stim: Ei stimulointia.

vähentää proliferaatiota ja sytokiinien tuotannon Vγ9Vδ2 soluja voi aiheutua eri tekijöistä, mukaan lukien vähentää ilmentymistä T-solureseptorin CD3ζ ketjut, muuttaa osuudet naiivien ja muisti-osajoukkoja tai epäedullinen suhde säätelijä-T-solujen Vγ9Vδ2 soluihin. Näitä mahdollisuuksia on sittemmin tutkittu.

ilmentymistason CD3ζ Ketjut on Samanlaisia ​​välillä

ex vivo

LR ja R EOC PBMC

aktivoituminen signaalitransduktion T-lymfosyyttien kulkee sytoplasmisen hännät T-solureseptorin CD3ζ ketjuja. Vika ilmaisussa näiden komponenttien

ex viv

o Vγ9Vδ2 soluja LR PBMC tutkittiin. Ei kuitenkaan ole merkittäviä eroja havaittu prosenttiosuudet ja tasot (MFI) CD3ζ ketjun ilmentymisen välillä

ex vivo

LR ja R Vγ9Vδ2 PBMC (Fig. 2E). Vertasimme myös kyvyt Vγ9Vδ2 solujen LR ja R EOC PBMC: t ilmaisemaan luokan I-rajoitettu T soluun liittyvän molekyylin (CRTAM) [24], joka tunnistettiin äskettäin ryhmämme kuin fenotyypin merkkiaine, joka on vahvasti liittyy aktivointi Vγ9Vδ2 PBMC-[25]. Mielenkiintoista on, että kun BrHPP stimulaation, CRTAM havaittiin ilmentyvän samalla tavalla (prosentteina ja MFI) on Vγ9Vδ2 soluja sekä LR ja R PBMC: t (Fig. 2F ja tietoja ei näytetty).

naiivi Vγ9Vδ2 Cell fraktio on alennettu in

ex vivo

LR EOC PBMC

naiivi ja muistin osajoukkoja Vγ9Vδ2 soluja analysoitiin

ex vivo

LR ja R EOC PBMC mukaan ilmaus CD27 ja CD45 -RA markkereita (Fig. 3). Mediaani naiivi solun taajuuden joukossa Vγ9Vδ2 PBMC oli merkitsevästi pienempi LR ryhmässä (37%) kuin R-ryhmä (53%; Fig. 3). Näin ollen, mediaani muistisolun taajuus oli suurempi LR ryhmässä. Merkittävä positiivinen korrelaatio löytyi naiivin solun taajuudet keskuudessa Vγ9Vδ2 PBMC ja kannen nousua Vγ9Vδ2 solujen jälkeen BrHPP stimulaation (p = 0,041 mukaan Spearmanin korrelaatio testi). Tällaista korrelaatiota ei havaittu kokeissa suoritettiin Zol. Sisällä Muistilokero ei havaittu tilastollisesti merkitseviä eroja havaittu välillä LR ja R ryhmien taajuudet Keski vaikuttajasolut tai lopullisesti erilaistuneita efektori osajoukkojen joukossa Vγ9Vδ2 PBMC (Fig. 3). Siten ei muisti Vγ9Vδ2 subsets rikastettiin sijassa

ex vivo

LR EOC PBMC.

Prosenttiosuudet naiivi (CD27

+ CD45RA

+), Keski-muisti (CM) (CD27

+ CD45RA

-), effektori (EM) (CD27

-CD45RA

-) ja lopullisesti erilaistuneita effektori (TEMRA) (CD27

-CD45RA

+) solujen joukossa Vδ2

+ CD3

+ solujen

ex vivo

LR (n = 13) ja R (n = 11) EOC PBMC.

epätasapaino CD4

+ CD25

highFoxP3

korkea Regulatory T-solujen ja Vγ9Vδ2 solut Olemassa in

ex vivo

LR EOC PBMC mutta ei osallistu arvoltaan alentuneita laajentaminen Vγ9Vδ2 Cells

taajuudet CD4

+ CD25

highFoxP3

korkea säätelijä-T-solujen (Tregs) ja suhteet Tregs ja Vγ9Vδ2 soluihin (Treg: Vγ9Vδ2 suhde) selvitettiin

ex vivo

LR ja R EOC PBMC. Treg solujen taajuuksia ei havaittu olevan merkitsevää eroa näiden LR ja R EOC PBMC (Fig. 4A). Kuitenkin merkitsevää laskua Vγ9Vδ2 solun taajuudet LR EOC PBMC johti Treg: Vγ9Vδ2 suhteet, jotka olivat merkittävästi suuremmat LR ryhmässä kuin R-ryhmän (Fig. 4B). Tärkeää on, ei käänteistä korrelaatioita ei havaittu näiden suhteet ja kannen nousua Vγ9Vδ2 soluja, jotka mitattiin sen jälkeen, kun on stimuloitu joko BrHPP tai Zol (mukaan Spearmanin korrelaatiokertoimen analyysit, p = 0,07 ja p = 0,67, vastaavasti). Lisäksi ehtyminen Tregs LR EOC PBMC anti-CD25 mikrohelmien ei parantanut laajennus kapasiteetin Vγ9Vδ2 solujen stimulaation jälkeen BrHPP tai Zol (Fig. 4C). Itse asiassa ei ole havaittu merkittäviä eroja taajuuksilla, numeroita tai taittaa nousua Vγ9Vδ2 solujen CD25-köyhdytettyä LR PBMC: t verrattuna ei-köyhdytettyä LR PBMC-stimulaation jälkeen joko BrHPP tai Zol (Fig. 4C ja tietoja ei ole esitetty). Huomattavaa on, että mitään ehtymistä Vγ9Vδ2 solujen ja muuttunut elinvoimaisten solujen olivat ilmeisiä, kun CD25-ehtyminen (tuloksia ei ole esitetty). Kaiken kaikkiaan nämä havainnot viittaavat siihen, että yhä suurempi osuus Tregs verrattuna Vγ9Vδ2 soluihin LR EOC PBMC ei mukana heikentynyt vaste Vγ9Vδ2 soluja.

A) CD4

+ CD25

highFoxP3

korkea solu (Treg) taajuudet ja vastaavat Vδ2

+ CD3

+ solun taajuudet

ex vivo

LR (n = 13) ja R (n = 11) PBMC. B) suhdeluvut Tregs (%) ja Vδ2

+ CD3

+ soluja (%) (Treg: Vδ2

+ ratio) joukossa PBMC LR ja R-ryhmiä. C) LR PBMC EOC potilailla (n = 6) stimuloitiin BrHPP (▴) tai Zol (▪) ja IL-2 ennen ja jälkeen ehtyminen CD25

+ -solut; leviämisen Vδ2

+ CD3

+ solut analysoitiin päivänä 7. Vδ2

+ CD3

+ solun taajuuksien joukossa kasvatetut solut (

vasen paneeli

) ja Vδ2

+ CD3

+ cell-kertaisesta (

oikea paneeli

) esitetään.

harvennettua Vγ9Vδ2 Solut

ex vivo

EOC PBMC ≤0.35 % ennustaa tehoton vastaus sekä BrHPP ja tsoledronaatti

analyysi

ex vivo

Vγ9Vδ2 solujen taajuuksia sitten suoritettiin neljään ryhmään aiemmin kuvattu taulukossa 1. taajuus Vγ9Vδ2 solujen oli vähensi LR ryhmässä verrattuna kaikkiin muihin ryhmiin (Fig. 5A). Mediaaniarvot Vγ9Vδ2 solun taajuuksien PBMC 0,28% varten LR ryhmässä ja 1,38% R- ryhmä (Kuva. 5A). Väliarvot havaittiin varten Br-LR ja Zol-LR ryhmiä, jossa mediaani taajuuksilla 0,48% ja 0,64%, tässä järjestyksessä. Kiinnostavaa kyllä, mitään merkittäviä eroja ei havaittu LR, Br-LR, Zol-LR ja R EOC ryhmien taajuudet ei-Vδ2

+ γδ T-soluja (kuvio. 5B) tai CD3

+ -solujen PBMC: t (Fig. 5C). Sitä paitsi, kun otetaan huomioon koko kohortin merkittävä positiivinen korrelaatio löytyi

ex vivo

Vγ9Vδ2 solujen taajuuksia ja kertaisesta stimulaation jälkeen BrHPP mutta ei Zol (p = 0,015 mukaan Spearmanin korrelaatio testit). Lisäksi, positiivinen korrelaatiot

ex vivo

Vγ9Vδ2 solun taajuudet ja IFN-γ-tuotannon vasteena joko BrHPP tai PMA /ionomysiinillä (mitattuna kuviossa. 2C) osoituksena (p = 0,015 ja p 0,001, vastaavasti). Nämä tiedot paljastavat tietyn väheneminen taajuuden Vγ9Vδ2 osajoukko, joka liittyy vahvasti toiminnallinen poikkeamia LR EOC PBMC.

Taajuuksia Vδ2

+ CD3

+ soluja (A), Vδ2

-γδ

+ CD3

+ soluja (B) ja CD3

+ solut (C) joukosta LR (n = 16), Br-LR (n = 8), Zol-LR (n = 4) ja R (n = 32), EOC PBMC: t on esitetty. Erot LR ryhmä ja kukin muista ryhmistä on merkitty. A) vastaanotin-operaattori (ROC) analyysi suoritettiin, jossa LR PBMC-näytteitä verrattiin muihin PBMC-näytteitä. Katkoviivat osoittavat cut-off at 0,35% ja 0,8%. Sp: Spesifisyys. Se: herkkyyttä.

onko tietty Vγ9Vδ2 solun taajuuden arvoa voidaan käyttää ennustamaan tehoton vastauksia sekä BrHPP ja Zol, vastaanotin-operaattori (ROC) analyysi. Vγ9Vδ2 solufrekvenssit keskuudessa PBMC 0,35% tai vähemmän on aina liittynyt alhainen vastauksia sekä BrHPP ja Zol (100%: n spesifisyys). Taajuuksilla 0,8% tai suurempi, kaikki laajennuksia olivat tehokkaita ainakin yhden ärsykkeitä. Kun taajuus on 0,35% ja 0,8%, tehoton vastauksia sekä ärsykkeisiin ja tehokkaita vasteita. Nämä tulokset osoittavat, että Vγ9Vδ2 solun taajuudella 0,35% tai vähemmän mm ​​

ex vivo

PBMC: ennustava tehotonta vastauksia sekä BrHPP ja Zol.

Vγ9Vδ2 Cell tiheys 0,35% tai vähemmän

ex vivo

EOC PBMC on negatiivinen Prognostiset Marker vuonna EOC potilaat

välisten suhteiden tutkimisessa Vγ9Vδ2 solujen ja EOC taudin kliinisiä tietoja potilaista analysoitiin suhteessa Vγ9Vδ2 solun taajuudet

ex vivo

PBMC: t (taulukko 2 ja kuvio. 5). Kaikista parametrit tallennettiin ajankohtana verinäytteen, yhdistys perustettiin vasta potilaan iän (taulukko 2). Mediaani potilaan ikä oli merkitsevästi korkeampi ryhmässä, joka oli Vγ9Vδ2 solun taajuuksien PBMC 0,35% tai vähemmän (group≤0.35%) kuin ryhmässä taajuuksilla yli 0,35% (ryhmä 0,35%). Tärkeää on, ei laskua veren pitoisuudet leukosyyttien ja PBMC: t havaittiin group≤0.35%, mikä vahvistaa tiettyjä määrällisiä puutos Vγ9Vδ2 soluja perifeerisen veren. No association välille perustettiin tämän puutteen ja kemoterapian ennen veren keräämistä. Ei myöskään korrelaatio löytyi oleva puute ääreisverenkierron Vγ9Vδ2 soluja ja pitkälle edenneessä sairauden tai korkeampi kasvaimen. Mitä hoitoon EOC potilaista (taulukko 2), ei havaittu merkittäviä eroja välillä group≤0.35% ja ryhmässä 0,35% vuonna tehoa rajaamisvai- leikkaus tai tyypin saaneet kemoterapiaa (taulukko 2). Kuitenkin kliinisiä tuloksia kemoterapiaa saaneilla EOC potilaista havaittiin olevan selvä ryhmien välillä. Mielenkiintoista, potilaiden osuus, jotka olivat olleet refraktaarisia kemoterapia oli merkitsevästi korkeampi group≤0.35% (62,5%) kuin ryhmässä 0,35% (17,5%) (taulukko 2). Lisäksi yhden muuttujan analyysit tautivapaan elinajan eri asiaankuuluvat tekijät osoittivat, että Vγ9Vδ2 solun taajuudella 0,35% tai vähemmän PBMC ja ei-optimaalinen debulking ennustavat lyhyempien tautivapaan elinajan ajan (taulukko 3). Kun keskimääräinen seurannan kesto 13 kuukautta näille potilaille keston mediaani taudista vapaan eloonjäämisen oli 1. kuukausi group≤0.35% vs. 10 kuukautta ryhmässä 0,35% (Fig. 5). Tärkeää on, että negatiivinen ennusteen arvioinnissa alennetun Vγ9Vδ2 solufrekvenssit säilytettiin tarkistuksen jälkeen vuonna Monimuuttuja-analyysissä (taulukko 3).

Keskustelu

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että tavanomainen

ex vivo

Vγ9Vδ2 solun laajeneminen protokollat ​​perustuvat stimulaatio PBMC kanssa BrHPP tai Zol epäonnistunut keskimäärin 35% syöpäpotilaista [12], [20] – [22], [26], [ ,,,0],27]. Täällä vahvisti nämä havainnot EOC. 60 EOC PBMC näytteitä, tehoton laajennuksia stimulaation jälkeen joko BrHPP tai Zol esiintyi 40% ja 33%: ssa tapauksista, vastaavasti. Mielenkiintoista, meidän vertailuanalyysit paljasti myös, että BrHPP ja Zol erosivat toisistaan ​​kapasiteetin laajentamiseksi Vγ9Vδ2 PBMC potilailta. Näytteitä, jotka eivät tehokkaasti laajennettiin BrHPP voitaisiin tehokkaasti laajentaa Zol, ja päinvastainen oli totta. Nämä tulokset viittaavat siihen, että kunkin yhdisteen voitaisiin testata pienen mittakaavan laajentamista määrityksiä voitaisiin valita paras yhdisteen kullekin potilaalle. Kuitenkin 27% PBMC näytteiden EOC potilaista pysyi tehottomasti laajentunut sekä yhdisteiden (LR PBMC). Osoitimme, että Vγ9Vδ2 solut näissä

ex vivo

LR PBMC: t ei vain ollut vähentää proliferatiivista kapasiteettia, mutta näkyy myös muuttunut tuotannon pro-inflammatoristen sytokiinien IFN-γ: n ja TNF-α? Verrattuna Vγ9Vδ2 soluja reagoimasta (R) PBMC. Kyllästää annokset BrHPP epäonnistui palauttaa vasteen Vγ9Vδ2 solujen LR PBMC. Nämä tulokset tukevat luontainen toiminnallinen vika LR Vγ9Vδ2 PBMC ja viittaavat siihen, että käyttää suurempia annoksia phosphoantigens parantaa vasteen Vγ9Vδ2 solujen LR EOC PBMC olisi epäonnistunut. Tietääksemme tämä on ensimmäinen

ex vivo

osoitus muuttunut Vγ9Vδ2 solun effektorifunktioita sisään EOC potilailla.

Monet parametrit voivat liittyä tähän rajoitettu. Menetys tai vähentynyt ilmentyminen CD3ζ ketjun T-solujen joukossa syöpäpotilaista on liitetty alentunut T-solujen aktivaation [28]. Ei kuitenkaan havaittu eroja CD3ζ ketjussa ilme

ex vivo

Vγ9Vδ2 solujen välillä LR ja R PBMC meidän EOC kohortin, mikä osoittaa, että ilmaus tästä ketju ei ole aiheuttajaa. Viat ilmaus aktivaatiomarkkereiden voitaisiin myös liittyä. Tässä molekyylin CRTAM, kuvattiin vastikään ryhmämme fenotyypin merkkiaine, joka on voimakkaasti sidoksissa aktivointi Vγ9Vδ2 PBMC-[25], todettiin ilmentyvän samalla on Vγ9Vδ2 solut molemmista LR ja R EOC PBMC: jälkeen BrHPP stimulaation. Tämä havainto viittaa siihen, että signalointi johtavia tapahtumia CRTAM ilmaisua eivät puutteellisia Vγ9Vδ2 LR PBMC. Lisäksi läsnäolo CD4

+ CD25

highFoxP3

korkea säätelijä-T-solujen (Tregs) voisi olla mukana Vγ9Vδ2 solupuutokset syöpäpotilailla [29]. Viimeaikaiset tiedot Kunzmann

et al

. ovat dokumentoineet, että lisääntyminen Treg: Vγ9Vδ2 suhde tukahdutettu phosphoantigen aiheuttama γδ T-solujen lisääntymistä ja osaltaan tilan näennäinen immunologista välinpitämättömäksi phosphoantigens että havaittiin joillakin syöpäpotilailla [27]. Tuloksemme EOC potilailla havaittiin suurentunut Treg: Vγ9Vδ2 suhde

ex vivo

LR PBMC. Emme kuitenkaan ole löytänyt käänteinen korrelaatio tämä suhde ja kannen nousua Vγ9Vδ2 solujen vastauksena joko BrHPP tai Zol. Lisäksi Kunzmann

et al

. ovat raportoineet, että ehtyminen Tregs (käyttäen CD25-ehtyminen) alhaisen vastata PBMC sairastavien potilaiden kasvaimia muiden kuin EOC palautettu Vγ9Vδ2 solun laajentuminen vastauksena phosphoantigens. Täällä, sama solujen vähäisyyttä LR PBMC EOC potilaista ei parantanut leviämisen Vγ9Vδ2 solujen vastauksena phosphoantigens tai aminobisfosfo-. Ylimääräisiä määrityksissä testasimme viisto tapa soluvajeeseen poistaa Tregs LR EOC PBMC säilyttäen CD25

+ aktivoida solujen käytön CD4

+ CD25

+ CD127

dim /- säätelijä-T-solujen eristäminen Kit II: Miltenyi Bio- tec (tuloksia ei ole esitetty). Mielenkiintoista, Tällaisen ehtymisen proliferaatioon Vγ9Vδ2 solut olivat samanlaisia ​​kuin havaittu CD25-ehtyminen. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että Tregs eivät ole mukana heikentynyt leviämisen Vγ9Vδ2 solujen EOC.

Vaihtoehtoisesti erot

ex vivo

osuudet naiivi ja muistin Vγ9Vδ2 solualaryhmiä voisi olla liittyvä alennettu toiminnallisuus Vγ9Vδ2 EOC PBMC: itä, kuten on havaittu muiden syöpien [12], [21], [22]. Tässä huomasimme, että naiivi osajoukko väheni merkittävästi

ex vivo

LR EOC PBMC. Tämä lasku olisi voinut aiheuttaa toistuvan antigeenipohjustus of Vγ9Vδ2 solujen

in vivo

kehittämisen aikana sairauden ja iän, mikä johtaa huomattavaan erilaistumiseen naiivi solujen muistin soluosastoon joillakin potilailla. Vγ9Vδ2 solun taajuudet

ex vivo

PBMC potilaat voivat liittyä myös tehoton Vγ9Vδ2 soluun laajennuksia. Tiedot kirjallisuudesta tässä asiassa ovat toisistaan ​​poikkeavia. Välinen korrelaatio perustason prosenttiosuudet Vγ9Vδ2 solujen PBMC eri syöpäpotilaita ja

ex vivo

laajentaminen kapasiteettia on perustettu äskettäin [12], kun taas toinen edellinen tutkimus kertoo ole yhdistyksen välillä samat parametrit suuressa kohortissa potilailla, joilla on erilaisia ​​syöpäkasvaimia, [27]. Tutkimuksemme on EOC potilasta tukee viimeisin havainto nimenomaan vähennettävä Vγ9Vδ2 solun taajuudet

ex vivo

LR PBMC. Nämä puutteet Vγ9Vδ2 PBMC yhdistettynä vähenemistä osa naiivi osajoukko, joka on jolla on proliferatiivinen kapasiteetti [30], saattaa olla osittain vastuussa vähennykset Vγ9Vδ2 soluproliferaatiota jotka havaittiin joissakin LR EOC PBMC. On huomioitava, että ääreisverenkierron Vγ9Vδ2 solun taajuudet EOC potilailla ei vaikuttanut kemoterapiaa ja me vahvisti ikäriippuvainen lasku Vγ9Vδ2 solun taajuuksien EOC potilailla, kuten havaittiin muiden kirjoittajien terveillä henkilöillä [31], [32]. Mikä tärkeintä, olemme osoittaneet, että Vγ9Vδ2 solun taajuuden joukossa

ex vivo

PBMC EOC potilaista 0,35% tai vähemmän on aina liittynyt tehotonta laajennuksia vastauksena BrHPP ja Zol. Nämä tiedot tunnistaa Vγ9Vδ2 solun taajuus PBMC 0,35% tai vähemmän ainutlaatuisena biomarkkereiden joka voisi olla hyödyllistä ennustamiseen tehottomien laajennukset PBMC EOC potilaiden vastauksena sekä perinteisessä BrHPP- tai Zol-pohjainen γδ laajennus protokollia.

Toinen tärkeä seikka on osoitettu tässä tutkimuksessa oli suhteita Vγ9Vδ2 solujen ja kliinisiä tuloksia EOC potilaista, joita hoidettiin leikkauksen plus platinapohjaiseen kemoterapiaan. Platinan johdannaiset on kuvattu immunomodulatorisia yhdisteitä, ja ehdokas im- biomarkkerit kuten αβ T-solujen on jo liitetty tehoa näiden syövänvastaisten aineiden [33], [34]. Kahdessa tutkimuksessa ihmisen kehittynyt munasarjasyöpäpotilailla ovat raportoineet, että läsnäolo kasvain infiltroituneen CD3

+ T-solujen korreloi parannetun kliinisiä tuloksia potilaiden, jotka saivat leikkauksen plus platina kemoterapian [35], [36]. Näiden kahden tutkimuksen, yksi on myös raportoitu korrelaatio läsnä infiltroivia γδ T-solujen ja lyhyt taudista vapaan aikavälin käsittelyn jälkeen [36]. Tämä tutkimus kuitenkin, joka perustui molekyyli- arviointiin TCRγ PCR-analyysillä, ei syrjiä Vγ9Vδ2 ja muiden γδ soluja. Tässä osoitamme, että EOC potilailla, joilla on pienentynyt perifeerisen veren Vγ9Vδ2 solun taajuuden 0,35% tai vähemmän, joka korreloi voimakkaasti heikentynyt Vγ9Vδ2 PBMC-funktionaalisia profiilin, ovat todennäköisemmin refraktorinen platinapohjaista kemoterapiaa ja näyttää lyhyempi taudista eloonjäämisaika hoidon jälkeen. Monimuuttuja-analyysissä vahvistaa, että tämä harventamisesta on itsenäinen ennustaja tautivapaan elinajan ajan. Siksi Vγ9Vδ2 solun taajuuden PBMC: voitaisiin käyttää prognostisena biomarkkeri on EOC potilailla. Yhdessä meidän havainnot tukevat sitä päätelmää, että tuloksia kemoterapiaa saaneilla potilailla ovat edullisempia, kun ei ole puutteita numerot ja toimivuutta ääreisverenkierron Vγ9Vδ2 soluja.