Krooninen sairaus

tiivistelmä

luonnehdinta syövän kantasolujen (CSC) subpopulaatio, vertailemalla geenin ilmentymisen allekirjoituksen suhteen natiivi syöpäsoluja, on erityisen tärkeää tunnistaa uusia ja tehokkaampia syövän vastaisia ​​strategioita . Kuitenkin CSC on erikoinen liittyvät ominaisuudet pito, kasvua ja aineenvaihduntaa että mahdollisesti merkitsee eri modulaatio ilmentymisen yleisimmin käytetty siivous geenejä (HKG), kuten b-aktiini (ACTB). Vaikka on tärkeää tunnistaa, mitkä ovat vakain HKG geenit normalisoida datan johdettu kvantitatiivinen Real-Time PCR-analyysi saada kestäviä ja johdonmukaisia ​​tuloksia, tyhjentävä validointi viitataan geenien CSC puuttuu edelleen. Täällä eristetty CSC pallojen erilaisista tule-sarkoomat ja karsinoomat mallina tutkia vakauteen mRNA ilmaus 15 yleisesti käytettyjä HKG, suhteen natiivi soluihin. Valitun geenit analysoitiin variaatiokerroin ja verrattiin käyttäen suosittu algoritmeja NormFinder ja geNorm arvioida vakautta sijoitusta. Tämän seurauksena olemme havainneet, että: 1) Tata sitova proteiini (TBP), Tyrosiini 3-mono-oksigenaasin /tryptofaani 5-mono-oksygenaasi aktivointi proteiini zeta-polypeptidin (YWHAZ), Peptidylprolyl isomeraasi A (PPIA), ja Hydroxymethylbilane syntaasi (HMBS) ovat vakaa HKG varten vertailua CSC ja natiivin soluja; 2) vähintään neljä viittaus geenien tulisi harkita luotettavia tuloksia; 3) käyttö ACTB ei tulisi suositella, 4) erityistä HKG tulee harkita tutkimuksia, jotka keskittyvät vain tiettyyn kasvaintyyppi, kuten sarkooma tai syöpä. Tuloksemme olisi otettava huomioon kaikkien tutkimuksissa geeniekspressioanalyysiä CSC, ja edistää merkittävästi tulevien tutkimusten tavoitteena oli tunnistaa uusia syöpähoidolla perustuu CSC kohdistamista.

Citation: Lemma S, Avnet S, salerno M, Chano T, Baldini N (2016) tunnistaminen ja validointi Housekeeping Geenit geeniekspressioanalyysiä Cancer Stem Cells. PLoS ONE 11 (2): e0149481. doi: 10,1371 /journal.pone.0149481

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 20 lokakuu 2015; Hyväksytty: 01 helmikuu 2016; Julkaistu: 19 helmikuu 2016

Copyright: © 2016 Lemma et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustus (FIRB RBAP10447J NB) Italian opetusministeriön, yliopiston ja tutkimus, jonka Italian Association for Cancer Research ( AIRC IG11426 NB), ja Italian Ministry of Health, taloudellinen tukeminen Scientific Research ”5 promillen 2012” (NB). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eri kantojen solut muodostavat pahanlaatuisia kasvaimia. Sisällä tahansa normaaleissa kudoksissa, asuvat alapopulaation kantasolujen kykyjä itseuudistumisen ja erilaistumista erikoistuneita soluja. Samoin kasvain koostuu heterogeenisen populaation pahanlaatuisten solujen erilliset sijoitus erilaistumista, leviämisen ja Tuumorigeenisuustutkimuksissa. Tällaisia ​​heterogeeninen pahanlaatuisia soluja, syövän kantasolut (CSC) on tarkoitettu niin pieni, mutta selvä väestö tekijä kasvaimen massa, jotka ovat ensisijaisesti mukana vaiheet aloittamisesta, transformaatio ja myöhemmin kasvaimen edistymistä [1]. CSC: n malli väittää, kuten kantasoluja normaaleissa kudoksissa, kasvainsolut seurata hierarkkisia organisaatioita, joissa CSC makaa kärkeen pidä kapasiteetti kasvaimien synnyn [2], etäpesäke edistäminen [3-5], ja kestävyys kemoterapiaa tai sädehoitoa [6 -8]. Tämä kasvainta aloittamista solupopulaation eristettiin ja karakterisoitiin ensimmäisen kerran ihmisen myelooista leukemiaa [9,10], ja sittemmin myös muita kiinteitä kasvaimia [11-13]. Laajimmin käytetty määritys eristämiseen CSC on palloja muodostavan määritys ja perustuu kykyyn CSC kasvaa kiinnittymisestä riippumaton olosuhteissa ja muodostaa kelluvan pesäkkeitä [12], niin kutsutut ”pallot”. Aiemmin olemme eristetty CSC pallojen ihmisen liikuntaelimistön sarkoomat [14-16], ja tässä tutkimuksessa myös eristetty CSC eri syöpä. Kun taas karsinoomat ovat yleisiä aikuisten pahanlaatuisten kasvainten, jotka näyttävät korkea metastaattinen indeksin diagnoosi ja laaja sairastuvuutta [7, 12], liikuntaelinten sarkoomat ovat heterogeenisiä, suhteellisen harvinaisia, ja erittäin aggressiivinen pahanlaatuisia kasvaimia luun ja pehmytkudosten että usein esiintyy lapsilla ja nuorilla aikuisilla [17] . Korkea nopeus uusiutumisen tyypillistä Neoplasmojen dramaattisesti vaikuttaa kliiniseen tulokseen ja huolimatta leikkaus voi olla parantava, kasvain ennustetta edelleen heikko. Siksi nykyiset hoitomenetelmät eivät riitä parantamaan kliinisen tuloksen, ja lisäparannukset voivat perustua ainoastaan ​​ymmärtää paremmin molekulaarisia mekanismeja näiden sairauksien ja kartoittaa erityisiä markkereita, jotka varmasti erottavat CSC muista syöpäsoluja. Siten tämän yhteydessä

in vitro

eristämiseen pallojen tarjoaa korvaamaton työkalu.

kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) on herkin ja tarkka menetelmä mitata mRNA: n ilmentymisen yhden geenin erilaisissa koeolosuhteissa, ja vaatii normalisointi tietoja vastaan ​​viittaus geeni, joka tyypillisesti on oltava erittäin stabiili ilmentyminen mukaisesti eri kokeellinen menettelyt [18]. Tunnistaminen erityisiä taloudenhoito geenien (HKG) on keskeinen edellytys tutkitaan suhteellinen muutos mRNA ilmaisun kohdegeenin. Valittua HKG ei pitäisi yhteistyössä säädellä kohdegeenin tai vaikuttaa kokeellinen menettely. Olisi myös ilmaistava runsaasti ja on minimaalinen vaihtelevuus. Yleisin menetelmä normalisoimiseksi geenin ilmentymisen tasolle on verrata mRNA-tasoja ja kiinnostuksen kohteena olevan geenin ja endogeenisen kontrolligeenin. Normalisoituminen qRT-PCR data vastaan ​​satunnainen HKG voi johtaa virheellisiin laskettaessa normalisointikertoimeen käytettiin vertaamaan koeolosuhteissa, ja siksi piilossa biologisia eroja näytteiden [19]. Eri viite geenejä, beeta-aktiini, Glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi, tai beta-Tubulin ovat yleisimmin käytetty, koska ne ovat erittäin ilmaistaan, selviytymisen kannalta on tarpeellista, ei-säännelty signalointireittien, ja syntetisoidaan kaikissa tumallisissa solutyypeissä . Kuitenkin viimeaikaiset havainnot osoittivat, että jopa beeta-aktiini, yksi yleisimmin käytetty HKG, voi olla sopimaton sisäinen ohjaus [20,21].

qRT-PCR-analyysit CSC on jo tehty, mutta on Tietääksemme mitään perusteita valintaan HKG on edelleen käytettävissä. Tässä tutkimuksessa valitsimme 15 eniten käytetty HKG arvioida niiden vakautta sekä CSC ja kiinnittyneet natiivi soluja eristettiin ihmisen rabdomyosarkooma (RS), osteosarkooma (OS), Ewingin sarkooma (ES), rintasyöpä (BC) ja munuaisten karsinooma (RC). Kautta vertailu kertoimen vaihtelua ja käyttö geNorm [22] ja NormFinder [23] ohjelmistot teimme voimassa, toistettavissa, ja vertaileva analyysi vakautta valitun HKG.

Materiaalit ja menetelmät

Native kasvainsolulinjoja ja CSC kulttuureissa

RS solulinja (RD), OS solulinjat (MG-63, HOS, Saos-2), ES solulinja (A-673), BC solu line (MDA-MB-231) ja RC solulinja (ACHN), hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA), ja viljeltiin Iscoven modifioitu Dulbeccon alustassa (IMDM, Gibco), plus 20 U /ml penisilliiniä, 100 mg /ml streptomysiiniä ja 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS) (täydellinen IMDM) 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-ilmakehässä. Ihmisen ensisijainen ES kulttuuri (ES4540) käytettiin myös, ja se on saatu tuoreista biopsia ihmisen ES, ja tunnettu siitä, kuten aikaisemmin on kuvattu [16]. ES4540 näyte kerättiin jälkeen allekirjoitettu tietoon perustuvan suostumuksen ja hyväksymisen jälkeen Istituto ORTOPEDICO Rizzoli eettinen komitea (0033626, 09 marraskuu 2011), mukaan kanssa Helsingin julistuksen. Lyhyesti, kudosnäytteet kohdistuu mekaaninen jauhaminen, jota seuraa entsymaattinen digestio, jotta saadaan yhden-soluja, jotka oli siirrostettu täydellinen IMDM muodostumiseen saakka yksikerroksinen.

CSC-solut saatiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [16]. Lyhyesti, kaikki natiivit kasvainsolujen viljelmiä pidettiin kiinnittymisestä riippumaton olosuhteissa DMEM: F12 -alustassa, jossa progesteronin (20 nM), putreskiini (10 mg /ml), natriumseleniittiä (30 nM), apo-transferriini (100 ug /ml) ja insuliini (25 ug /ml) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) matalan kiinnitys pulloihin (Nunc, Penfield, NY) (palloja muodostavan määritys). Olemme saaneet CSC kulttuuriin ylläpitämällä sferoidi in kiinnittämisestä riippumaton olosuhteita tietyssä solussa media, lisäten kasvutekijöitä EGF ja bFGF 3-4 päivän välein (kahdesti viikossa). Tuore ihmisen EGF: ää (20 ng /ml) ja bFGF (10 ng /ml) (PeproTech, Rocky Hill, NJ) lisättiin kahdesti viikossa, kunnes solujen alkoi kasvaa kelluva aggregaatit (palloja). Sferoidiviljelmiä monistettiin käsittelemällä ensisijainen CSC kulttuuri trypsiinillä, mitä seurasi hellävarainen mekaanisen dissosiaatio, ja uudelleen pinnoite yksi-solususpensio saamiseksi toisen pallomainen kulttuuriin. Elinkelpoisuus varmistettiin erytrosiini värjäystä. Prosenttiosuus kuolleita soluja oli alhainen (10-15% kuolleita soluja). Vain ne viljelmät, jotka pystyivät muodostamaan aloilla ja että ilmaistu kantasolujen liittyviä markkereita pidettiin.

Illumina genomin analysaattorin sekvensointi ja tietojen analysointi

Syvä Sekvensointianalyysin MG-63, HOS, ja Saos-2 OS solumalleja suoritettiin vertaamaan maailmanlaajuiseen transkription ilmaus CSC vastaaviin natiivi soluja, jotta voitaisiin valita paneelin vakaan HKG varten qRT-PCR-analyysiin. Lyhyesti, kokonais-RNA kerättiin talteen solulysaatista happo guanidiniumtiosyanaatti-fenoli-kloroformilla [24]. Kokonais-RNA kvantitoitiin Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA) seuraten valmistajan ohjeita. RIN (RNA Integrity Number) ja A260 /A280-suhde valmis kokonais-RNA olivat kaikki 10, ja yli 1,8, tässä järjestyksessä. Kirjaston malli molekyylien suuren suoritustehon DNA-sekvensointia muutettiin kokonais-RNA käyttäen TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 (Illumina, San Diego, CA), seuraten valmistajan protokollaa. Kirjasto oli myös määrällisesti Bioanalyzer (Agilent), seuraten valmistajan ohjeita. Kirjasto (yhdeksäntoista) altistettiin klusterin vahvistus on Single Lue Flow Cell v4 klusterin sukupolven väline (Illumina). Sekvensointi suoritettiin genomi Analyzer GAIIx 70 sykliä käyttäen Cycle Sequencing v4 Regents (Illumina). Ihmisen genomin build 19 (hg19) ladattiin University of California, Santa Cruz genomin selaimen (https://genome.ucsc.edu/). Kuva-analyysi ja pohja calling suoritettiin käyttämällä Off-Line Basecaller Software 1.6 (Illumina). Lukee rinnastettiin käyttämällä ELAND v2 CASAVA Software 1.7, jonka sekvenssi aineistoja. Transcript kattavuus jokaisen geenilokuksesta laskettiin kokonaismäärästä kulkee suodattimen lukee että kartoitettu, jonka ELAND-RNA, jotta eksonit. Nämä analyysit suoritettiin käyttäen oletusparametrejä. Aineisto katsella esimerkiksi Genome Studio Software (Illumina). Kehittynyt analyysi kvantifiointiin kanssa rikvantiilin normalisointia algoritmi suoritettiin käyttäen Avadis NGS ohjelmistoa (version1.5, Strand Scientific Intelligence Inc., San Francisco, CA).

RNA: n eristys ja cDNA-synteesi

Yhteensä RNA uutettiin CSC ja natiivi soluja kaikista eri histotypes mukana tutkimuksessa käyttämällä NucleoSpin RNA II (Macherey- Nagel, Düren, Saksa). On-pylväs DNaasi hajotus suoritettiin valmistajan ohjeita noudattaen. Kokonais-RNA: n puhtaudella kvantitoitiin käyttäen Nanodrop Spektrofotometri (NanoDrop Technologies). Kokonais-RNA (0,5 pg) oli käänteistranskriptoitu cDNA: ta 20 ul: n lopullisessa tilavuudessa, käyttäen MuLV-käänteistranskriptaasia ja RNaasi-inhibiittoria (Applied Biosystems, Foster City, Ca, USA). Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin käyttäen sattumanvaraisia ​​heksameerejä. Kutakin näytettä varten 3 biologinen rinnakkaisnäytteiden käsiteltiin.

qRT-PCR

qRT-PCR suoritettiin käyttäen Light Cycler väline ja Universal Probe Kirjastot (Roche Applied Science, Monza, Italia ). Koetin ja alukkeet valittiin käyttämällä web-pohjainen määritys suunnitteluohjelmisto (ProbeFinder https://www.roche-applied-science.com), ja ne edelleen ohjata Oligo Primer Analysis Software. Vain alukkeita ulottuu eksonin eksonin risteys ja tuottaa PCR monistustuotteen pituus välillä 70 ja 150 emäsparia valittiin. Kaikki alukkeet suunnitellut analysoitiin BLAST tarkistaa niiden spesifisyyden (National Center for Biotechnology Information). Kaikki cDNA laimennettiin 1:10, ja 10 ui käytettiin templaattina ja mukana on 20 ui kokonaistilavuuteen qRT-PCR-reaktiossa. Protokolla vahvistus oli: 95 ° C: ssa 10 min; 95 ° C: ssa 10 s, 60 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C: ssa 1 s 45 sykliä; 40 ° C: ssa 30 s. Kukin määritys sisälsi tyhjä. Taulukossa 1 esitetään yhteenveto kaikista HKG primeerisekvenssit, ja koettimet mukana tässä tutkimuksessa. Arviointia varten ilmentymisen c-Myc (NM_002467.4), Klf4 (NM_004235.4), Nanog (NM_0248695.2) ja Oct3 /4 (NM_002701.4), seuraavia alukkeita käytettiin: c-Myc-F 5′-gctgcttagacgctggattt-3 ’, c-Myc-R 5′-taacgttgaggggcatcg-3′, koetin 66; Klf4-F 5’-ccatctttctccacgttcg-3 ’, Klf4-R 5′-agtcgcttcatgtgggagag-3′, koetin 7 ;. Nanog-F 5’-ATGCCTCACACGGAGACTGT-3 ’, Nanog-R 5′-AGGGCTGTCCTGAATAAGCA-3, anturi 69; Oct3 /4-F 5’-CTTCGCAAGCCCTCATTTC-3 ’, Oct3 /4-R 5′-GAGAAGGCGAAATCCGAAG-3’, koetin 60. varten normalisointi, suhteellinen ilmentyminen Klf4, c-Myc, Nanog ja Oct3 /4 normalisoitiin viitteen geeni ACTB tai geometrinen keskiarvo YWHAZ ja GAPDH CSC ja natiivi soluja MG-63, tai geometrinen keskiarvo PPIA ja HMBS CSC ja natiivi solujen ACHN ja MDA-MB-231. Suhteellinen ilmentyminen kantasolujen merkkiaineita laskettiin käyttäen ΔΔCt malli [25].

NormFinder analyysi

NormFinder ohjelma on VBA appletti [23], joka perustuu varianssi arviointi lähestymistapa , jonka riveissä ehdokas HKG perustuvat niiden vakauden arviointiin, ja antaa vakautta arvo jokaiselle ehdokkaalle geeniä käyttäen mallipohjaisuus. Suostumuksella NormFinder vaatimuksia, Ct-arvoja muuttuivat suhteellisen määrän, käyttämällä pienintä Ct arvo kalibraattorimatriiseina. Mukaan analyysiin, alin vakautta arvo oli sijoilla. Me ryhmitellään kaikki tiedot 3 eri klustereissa: 1) kaikki tiedot CSC eri kasvaimia; 2) kaikki tiedot kotoisin soluista eri kasvaimia; 3) kaikki tiedot eri kasvaimista CSC ja natiivi solut yhdistettiin. Kolmannen ryhmän tietojen lisäksi CSC ja natiivi jotka oli saatu kaikista kasvaimista yhdistettiin, me katsotaan myös CSC ja natiivi solujen saatu yksittäinen kasvaimen tyyppi, mistä sarkooma tai syöpä. Kaikki tulokset saatiin 3 sarjaa toistojen.

GeNorm analyysi

GeNorm v. 3.0 [22] käytettävissä Qbase + [26] (Biogazelle, Gentin yliopisto, Belgia, http: //www .qbaseplus.com) käytettiin stabiilisuuden arvioimiseksi ehdokas HKG. GeNorm laskee kaikki mahdolliset keskimääräinen pareittain vaihtelua kandidaattigeeneihin ja antaa mitan ilmaisun vakauden (M) kunkin geenin. M-arvo on alle 1,5 tarkoittaa vakaata HKG. Ehdokas viite geeni, jolla on alhaisin M arvon katsottiin olevan vakain ilmaisua. GeNorm riveissä ehdokas viittaus geenien perusteella niiden vakauden ilmaisun, ja suorittamalla vaiheittaista syrjäytymisen geenin, jolla on korkein M-arvo (vähiten stabiili ilmaistu geeni), ja laskee M-arvot jäljellä geenejä. Käytämme myös GeNorm tarkistaa, onko yksittäinen HKG riittää riittävä normalisointia. Todellakin, GeNorm tarjoaa optimaalisen määrän viite geenejä tarvitaan tarkkaa normalisointi. V-arvot alle cut-off-arvo 0,15 ilmoitettu optimaalinen määrä geenejä tarvitaan datan normalisointi. Samoin kuin analyysin kanssa NormFinder, me ryhmitelty kaikki tiedot ja tulokset 3 eri klustereissa. Kaikki tulokset saatiin 3 sarjaa toistojen.

Variaatiokerroin analyysin

Geenien ilmentyminen vakautta arvioidaan variaatiokerroin (CV) laskettiin jakamalla keskihajonta (SD) raja jaksoa (Ct) keskiarvolla Ct-arvo. Kuten analyysi suoritettiin NormFinder ja GeNorm, me ryhmitelty kaikki tiedot 3 eri klustereissa, ja tulokset saatiin 3 sarjaa toistojen.

Rank yhdistäminen

analyysit suorittama kolme kuvattu menetelmiä osoitti jonkin verran eroja vakautta sijoitus on HKG. Siksi olemme tunnistaneet vakain geenejä tarkastelemalla alimman arvon matemaattinen keskiarvo NormFinder, geNorm ja CV menetelmä sijoittuu jokaisesta geenistä.

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin StatView ™ 5.0.1 ohjelmistoa (SAS Institute Inc., Cary, NC). Sillä luonnehdinta CSC ja natiivi soluja MG-63, MDA-MB-231 ja ACHN, tietojen ei katsottu normaalijakaumaa, ja nonparametric U-testi käytettiin. Tulokset ilmoitettiin keskiarvona ± keskivirhettä (SEM). Keskihajonta (SD) delta Cycle kynnys (ACt) arvot laskettiin yhdistettiin keskihajonta (SDpooled). HKG ilmaisua vaihtelua CSC ja natiivi solut arvioitiin kanssa pariksi Wilcoxonin-rank-testi. Kaikkien analyysien erot pidettiin merkittävinä kanssa

p

arvot ≤ 0,05.

Tulokset

RNA laadunvalvonta ja luonnehdinta CSC

perustettu pallo kulttuureissa kaupallisesti saatavissa solulinjoista 3 eri sarkooma ja 2 karsinooma histotypes (MG-63 OS, RD RS, A-673 ES, MDA-MB-23 BC, ja ACHN RC), ja siitä tuore ES biopsia (ES4540). Spektrofotometrinen analyysi vahvisti Näytteiden puhtaus, jossa on A

260 /

280 suhde 2,08 ± 0,06, mikä osoittaa proteiini-free puhdasta RNA: ta, ja a

260/230 suhde 1,98 ± 0,21, mikä osoittaa, että kokonais-RNA oli fenolia ja etanolia vapaa.

stemness kaltaisia ​​piirteitä kaikille CSC kulttuureissa mukana tässä tutkimuksessa on aiemmin tunnettu [16,27], lukuun ottamatta cscMG-63, cscMDA- MB-231, ja cscACHN, joiden kykyä kasvun kelluva aggregaattien (kuvio 1), ja mRNA: n ilmentymisen ja Klf4, c-Myc, Nanog, ja Oct3 /4 stemness markkereita [28] ovat tässä vahvistettiin.

kuvat ovat tarttuvien natiivi solujen ja CSC kelluvien pallojen havaita käänteinen optisella mikroskoopilla eri solulinjojen (asteikko bar 100 mikrometriä, vasen paneeli), ja geenien ilmentyminen kantasolujen merkkiaineiden qRT-PCR (oikea paneeli). Normalisoinnin ACTB. Sillä cscMG-63, c-Myc ** p = 0,0019, Klf4 p = ns, Nanog ** p = 0,0010, Oct3 /4 * p = 0,0265. Sillä cscMDA-MB-231, c-Myc ** p = 0,0011, Klf4 * p = 0,0130, Nanog ** p = 0,0011, Oct3 /4 * p = 0,0325. Sillä cscACHN, c-Myc p = ns, Klf4 * p = 0,0130, Nanog * p = 0,0130. Sillä kiinnittynyt ACHN, Oct3 /4 * p = 0,0130. (N = 6-12).

Erityisesti cscMG-63 löydettiin suuntaus lisääntyneen ilmentymisen Klf4 (kuvio 1; n = 12; p = ns), ja merkittävästi korkeampi ilmaisu c-Myc (** p = 0,0019), Nanog (** p = 0,0010), ja Oct3 /4 (* p = 0,0265). CSC MDA-MB-231 erittäin ilmaista kaikki stamness markkereita kuin kiinnittyvä kulttuuri (kuvio 1; n = 6; Klf4 * p = 0,0130, c-Myc ** p = 0,0011; Nanog ** p = 0,0011; Oct3 /4 * p = 0,0325), kun taas pallo viljelmät ACHN ilmaistuna yhtäläinen mRNA Klf4 ja Nanog (kuvio 1; n = 6; Klf4 * p = 0,0130; Nanog * p = 0,0130), ja ei eroa ilmaisun c-Myc . Vuonna cscACHN, ilmaus Oct3 /4 merkki on pienempi kuin kiinnittyvä nativeculture (kuvio 1; * p = 0,0130). Stemness geenit normalisoitiin ACTB, yksi yleisimmin käytetty HKG.

Expression profiilin ehdokas HKG geenit

Viisitoista ehdokas viite geenejä (taulukko 1) valittiin analysoimalla kirjallisuuden kysely tutkimukset normaaleilla kantasoluja ja kasvaimen solut qRT-PCR-analyysiin.

Valitsimme ne geenit, jotka kuuluvat eri toiminnallisia luokkia tai väyliä vähentämiseksi todennäköisyyttä sisällyttää analyysiin yhdessä geenien. Otteen profilointi valittujen geenien alustavat analysoitiin Illumina Genome Analyzer sekvensointi. Syvä sekvensointi osoitti, että mahdollinen viittaus geenejä ekspressoida pysyvästi, lukuun ottamatta G6PD (taulukko 2, kuvio 2A).

(A) Heat kartan suhteellinen ekspressio valitun geenien natiivi soluissa ja CSC MG-63, HOS, ja SAOS-2. (B). Transkription profiilia Cycle kynnys (Ct) arvot ehdokas HKG geenien CSC ja natiivi solulinjoissa. Laatikot ovat alhaisemmat ja yläkvartiilit sykli äänikynnysrajat mediaanin ilmoitettu, pystypalkit edustavat 10

th ja 90

th persentiilit. Sekä CSC ja kiinnittynyt solulinjoissa, 18S rRNA oli pisimmälle ilmaistu geeni (alempi Ct-arvo), kun taas G6PD oli vähiten ilmaisi geenin (korkein Ct-arvo).

Käytimme vain MG-63 edustajana OS histotype seuraavalla qRT-PCR-analyysi vahvistaa saadut tiedot syvä sekvensoinnilla. Vertailla eri mRNA transkriptio tasoja käytimme kynnyksen syklit (Ct) arvot. Ct-arvo on leikkauspisteessä monistuskäyrää ja kynnyksen linja, ja kääntäen korreloi määrä kohdegeenin läsnä PCR-reaktiossa [29]. 15 ehdokasta viite geenien näytteille laajan ilmaisun tasolla. Jakelu mediaani Ct-arvojen ja persentiilin kunkin geenin näkyy Blox käyrä kuvion 2B. Viite geenejä vähemmän ilmaistu CSC verrattuna natiivi soluihin. Pienimmät erot geeni-ilmentymisen välillä CSC: n ja natiivin solulinjat, ilmaistuna ACt, havaittiin ja B2M, TBP ja SDHA, kun taas korkein ACt laskettiin ACTB, TUBB ja PGK1 (taulukko 3). Suorittamalla pariksi Wilcoxonin-rank-testiä kunkin geenin arvioida eroa CSC ja natiivin solut saadaan samasta soluista alkuperää, löysimme merkittävä ero HKG ilmaisun välillä CSC ja natiivin soluja noin puolet HKG tutki ( taulukko 3).

määritys taloudenhoito geeniekspression vakautta

HKG ilmaisun vakautta arvioitiin käyttämällä NormFinder VBA applet, The GeNorm ohjelmisto, ja laskemalla ja vertaamalla variaatiokerroin ( CV) kolmeen eri ryhmään: in (1) CSC tai (2) natiivi soluja, joiden tavoitteena on tunnistaa vakain geenit tietyssä solualatyyppien, ja (3) yhdistetyssä CSC ja natiivi soluja, joiden tavoitteena on tunnistaa vakain geenit voidaan pitää viitteenä geenit vertailun geenin ilmentymisen välillä CSC: n ja natiivin soluja.

vakaus arvot NormFinder ja M arvot GeNorm ovat parametreja vakauden että ne ovat käänteisesti verrannollisia ilmentymiseen vakautta HKG. Kaikki 15 ehdokasta viittaus geenit oli M-arvo pienempi kuin kynnysarvo 1,5 (taulukko 4), joka osoitti, että kaikki voidaan pitää hyväksyttävänä vakaudelle [22].

1) vakain HKG CSC. Käyttämällä NormFinder VBA Applet, 3 vakain HKG johti GAPDH, PGK1- ja HMBS (ensimmäisestä kolmanteen vakaa), kun taas vähemmän vakaa olivat RPL13a, B2M ja GUSB. Käyttämällä GeNorm ohjelmisto tunnistimme YWHAZ, GAPDH ja TBP vakain HKG, kun taas vähemmän vakaa geenit olivat ACTB, GUSB ja B2M. CV menetelmä korosti myös, että käyttö ACTB tulisi välttää, kun taas, kuten on GeNorm ja NormFinder analyysien käyttö PGK1- ja YWHAZ suositellaan. Vertailu ranking tuotettu kolmella tavalla paljasti ero riippuen algoritmi soveltaa. Vähimmäismäärän viite geenejä tarvitaan normalisointia määritettiin GeNorm laskemista pairwise vaihtelu (variaatiokerroin, V) välillä tietty määrä geenejä ja sisältyy uusi geeni, ja optimaalinen määrä viite-geenin laskettiin 3 (V3 /4 0,114, kuvio 3A). Johtopäätös on, että geenin ilmentymisen analyysit eristetty mRNA CSC, optimaalinen normalisointi tekijä olisi laskettava geometrinen keskiarvo viitearvonsa YWHAZ, GAPDH ja PGK1.

minimaalinen määrä geenejä tarvitaan datan normalisointi arvioitiin pareittain vaihtelu (Vn /n + 1) (A) CSC, (B) natiivi soluja, (C) CSC ja natiivi solulinjoissa kaikista kasvaimista, (D) sarkooma ja (C) karsinoomia. Vaihtelu kerroin (V) alle 0,15 osoittaa optimaalinen määrä geenejä, joita tarvitaan datan normalisointi. V2 /3 0,15 osoittaa, että 2 geenejä tarvitaan datan normalisointi.

2) vakain HKG natiivi tarttuneet solut. NormFinder analyysi paljasti, että 18S rRNA, TBP, ja PPIA olivat kolme parasta HKG, kun taas RPL13a, G6PD, ja ACTB oli pahempi ilmaisun vakautta. Samoin GeNorm tunnistettu PPIA ja 18S rRNA kuin kaksi vakain HKG, jonka jälkeen GAPDH, kun taas vähemmän vakaa geenit, jotta viimeisestä sijoittui olivat G6PD, RPL13a, ja ACTB. CV menetelmä ehdotti HMBS, TBP ja YWHAZ kuin kolme vakain geenejä. GeNorm laskettaessa variaatiokerroin V ehdotti, että optimaalinen määrä viite geenejä oli 2 (V2 /3 0,146; Kuva 3B), ja lisäksi kolmas viite geeni johti pieni vaikutus normalisointi (alle cut-off-arvo 0,15). Johtopäätös on, että natiivi solu, mukaan Analyysien optimaalisen normalisointi tekijä olisi laskettava geometrinen keskiarvo PPIA ja TBP.

3) Lopuksi suoritimme analyysin CSC ja natiivi yhdistetään soluja kaikissa kasvaimet (A), in sarkooma (B) ja syövän (C).

(3a) CSC ja natiivi soluja kaikista kasvaimista, NormFinder tunnistettu GAPDH, TBP, ja PPIA kuin kolme vakain HKG, kun taas ACTB, RPL13a ja GUSB olivat vähemmän stabiileja. PPIA ja GAPDH vahvistettiin myös GeNorm analyysi, yhdessä 18S rRNA. Jälleen ACTB oli viimeinen geenin vakautta GeNorm analyysiä yhdessä B2M ja G6PD. CV arviointi ehdotti TBP, B2M ja SDHA (taulukko 4), kun taas ACTB, TUBB ja 18S rRNA olivat vähemmän stabiileja. GeNorm suositeltavaa käyttää 4 HKG tarkkaan geenien ilmentymisen analyysi (V 0,15 verrattaessa normalisointitekijän perustuu 4 tai 5 vakain tavoitteet; Kuva 3C). Näin ollen normalisointikerroin olisi laskettava geometrinen keskiarvo TBP, PPIA, HMBS, ja YWHAZ tai GAPDH.

(3 b) CSC ja natiivi soluja sarkooma, The NormFinder ohjelmisto tunnistaa GAPDH, YWHAZ ja 18S rRNA vakain geenit, vaan G6PD, RPL13a ja B2M olivat vähemmän stabiileja. GAPDH ja YWHAZ tunnistettiin parhaiten HKG myös siitä GeNorm analyysi, kun taas ACTB ja RPL13a olivat viimeinen sijoittui geenejä. CV menetelmä osoitti HMBS, TBP, ja SDHA oli paras sijoitus sijainti (taulukko 5). Optimaalinen määrä viitearvonsa on 2 (V2 /3 0,143, Kuva 3D). Lopuksi optimaalinen normalisointi tekijä voidaan laskea geometrinen keskiarvo viitearvonsa YWHAZ ja GAPDH.

(3C) analyysi HKG vakauden karsinooma paljasti, että PPIA, HMBS ja RPL13a olivat vakain HKG varten NormFinder. GeNorm vahvisti myös PPIA ja RPL13a kuin vakain tavoitteensa GeNorm, jonka jälkeen 18S rRNA, kun taas CV menetelmää ehdotti B2M, TBP ja G6PD (taulukko 5). GeNorm laskettaessa kerrointa V ehdotti, että 2 HKG riittävät normalisointi (V2 /3 0,084, Kuva 3E). Lopuksi optimaalinen normalisointi tekijä tässä tapauksessa olisi laskettava geometrinen keskiarvo kahden seuraavista geeneistä, PPIA, HMBS tai RPL13a, joilla on sama yleinen sijoitus arvo.

validointi tunnistettu HKG vuonna CSC: n malli

geenin ilmentymisen arviointi, käyttö optimaalisella HKG voi tuottaa virheellisiä tuloksia tai voi piilottaa ero geenien ilmentyminen. Tämä on erityisen tärkeää geenien hieman vaihtaa kahden populaation soluja, kuten CSC ja natiivi-soluissa.

Analysoimme ilmentymistä stemness geenien c-Myc, Klf4, Nanog, ja Oct3 /4, jotka olivat aikaisemmin normalisoitu ACTB (kuvio 1), jossa tunnistettu kärkikastiin HKG CSC ja natiivi soluja, vuonna sarkooma ja karsinooma, vastaavasti (GAPDH ja YWHAZ varten sarkooma ja PPIA ja HMBS varten karsinooma). Jotkut varsi liittyvien geenien katsotaan osoitti parannettua luotettavuutta tilastollinen analyysi suoritettiin normalisoinnin kanssa vakain HKG, osalta kanssa ACTB. Erityisesti, kuten on esitetty kuviossa 4, huomasimme, että normalisoituminen Nanog geometriseen keskiarvoon vakain HKG johti *** p = 0,0007 varten cscMG-63 ja ** p = 0,0043 varten cscACHN, kun taas ACTB normalisointia saimme ** p = 0,0011 ja * p = 0,0130, vastaavasti. In cscMG-63, sillä cMyc saimme *** p = 0,0003 uuden analyysin sijasta ** p = 0,0019 kanssa normalisoinnin ACTB.

vaikutus geenin ilmentymisen normalisoituminen optimaalista HKG oli tutki CSC ja natiivi soluja MG-63 ja ACHN. (A) varten luusarkoomasolulinjassa ilmaisu kantasolujen merkkiaineita Nanog ja cMyc arvioitiin ja normalisoitiin geometrinen keskiarvo GAPDH ja YWHAZ. *** P = 0,0007 varten Nanog, *** p = 0,0003 c-Myc. (B) varten ranal masolulinjassa, ilmaus Nanog ja cMyc normalisoitiin geometrinen keskiarvo PPIA ja HMBS. ** P = 0,0043 varten Nanog. (N = 6).

Keskustelu

kehittyvä käsite CSC on herättänyt paljon huomiota, ja luonnehdinta CSC on näyttänyt tietä uusia mahdollisille varten syöpähoitojen. CSC ovat vähemmistö osajoukko kasvaimeen aloittamista osallistuvien solujen eri vaiheissa pro-tuumorigeenisen prosessista, kasvain aloittamisesta [30], jotta chemoresistance [31] ja uusiutumisen [32]. CSC voidaan eristää solu- linjat ja kudosnäyte kanssa pallo järjestelmä menetelmän [12], joka perustuu kykyyn CSC kasvaa pallomainen kelluva siirtomaat kiinnittymisestä riippumaton olosuhteissa. Toistaiseksi tätä pidetään korvaamaton tapa hankkia CSC rikastettua kulttuureissa. Viime aikoina olemme eristetty CSC päässä liikuntaelinten sarkoomat, niin solulinjasta ja raikas koepala [16,27].