Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

konstitutiivisesti aktiivinen androgeenireseptorin variantteja (AR-V) puuttuu ligandia sitovan domeenin (LBD) voi edistää kastraation vastustuskykyisten eturauhassyöpä (CRPC). Ilmaisu AR-Vs on kliinisesti tärkein metastaattinen sivusto, luu, on kuitenkin ei ole hyvin dokumentoitu. Tavoitteena oli siis verrata tasoa AR-Vs in hormoni-naiivi (HN) ja CRPC luuetäpesäkkeistä verrattuna ensisijaisen PC ja ei-pahanlaatuiset eturauhasessa sekä suhteessa AR proteiinin ilmentymisen, koko genomin transkription profiileja ja elossaololuku.

Menetelmät /Principal havainnot

Hormoni-infektoitunut (n = 10) ja CRPC luustometastaaseja näytteitä (n = 30) saatiin 40 potilaiden etäpesäke leikkausta. Non-pahanlaatuinen ja pahanlaatuinen eturauhas- näytteet hankittiin 13 prostatectomized miehiä. Tasot täyspitkä AR (ARfl) ja AR-Vs kutsutaan AR-V1, AR-V7, ja AR-V567es mRNA mitattiin RT-PCR ja koko-genomin transkriptio profiilien kanssa Illumina BeadChip array. Proteiini tasot tutkittiin Western blottauksella ja immunohistokemia. Selostukset ARfl, AR-V1, ja AR-V7 havaittiin useimmissa ensisijainen kasvaimia ja etäpesäkkeitä, ja tasot lisääntyivät merkitsevästi CRPC luustometastaaseja. AR-V567es kopio todettiin 23%: n CRPC luumetastaaseja vain. Sub-ryhmä CRPC luuetäpesäkkeistä ilmaistu LBD-katkaistu AR proteiineja tasoilla verrattavissa ARfl. Havaittavissa AR-V567es ja /tai AR-V7 mRNA ylimpään neljännekseen, nähdään 1/3 kaikista CRPC luuetäpesäkkeistä, liittyi ydinvoiman AR Immunovärjäyksen pisteet, häiriintynyt solusyklin säätelyssä ja lyhyt selviytymistä.

Johtopäätökset /merkitys

Expression of AR-Vs lisääntyy CRPC verrattuna HN luustometastaaseja ja liittyy erityisen huonoon ennusteeseen. Lisätutkimuksia tarvitaan testata, jos potilaat ilmentävät tällaisia ​​AR-vs niiden luuston etäpesäkkeiden hyötyä enemmän huumeita toimivat tai alavirtaan näistä AR-vs niinkään hoitoja estämällä androgeenisynteesin.

Citation: Hornberg E, Ylitalo EB, Crnalic S, Antti H, Stattin P, Widmark A, et al. (2011) Expression of androgeenireseptorin silmukointivarianteista in Eturauhassyöpä luustometastaaseja liittyy kastraatio-Resistance ja Short Survival. PLoS ONE 6 (4): e19059. doi: 10,1371 /journal.pone.0019059

Editor: Paul Dent, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 helmikuu 2011; Hyväksytty: 23 maaliskuu 2011; Julkaistu: 28 huhtikuu 2011

Copyright: © 2011 Hornberg et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Ruotsin Cancer Society, Ruotsin Research Council, Lions Cancer Research Foundation, ja Pohjois-Ruotsin Cancer Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Androgeenit säännellä normaalissa eturauhasessa kudosten kasvua ja erilaistumista, aktivoimalla androgeenireseptoreille epiteelin ja strooman soluja, ja myös tärkeä rooli kaikissa vaiheissa eturauhassyöpä (PC) kasvua. Standardi hoitoa potilaille, joilla on edennyt PC näin ollen vähentää androgeenien, joko kirurginen tai kemiallinen kastraatio. Kauden jälkeen alkuperäisen remission kasvainten lopulta taudin uusiutumiseen, pääasiassa luuhun, ja sitten kutsutaan kastraatio kestävä PC (CRPC). Sääteleviä mekanismeja CRPC kasvua luuston etäpesäkkeet ovat kuitenkin suurelta osin tuntemattomia ja harvoin selvittävät se todella tutkii tällaiset etäpesäkkeiden potilailla.

Mielenkiintoista, androgeenireseptorin (AR) on yleisesti aktiivinen CRPC huolimatta kastraattimäärät kiertävän testosteronin [1 ], [2] ja intensiivinen ydinvoiman AR immunovärjäys CRPC luuetäpesäkkeistä liittyy erityisen lyhyt selviytymisen [3]. Erilaisia ​​mekanismeja on ehdotettu vaikuttavan AR aktivoinnin CRPC, mukaan lukien intracrine synteesi androgeenien, geneettisten ja epigeneettisten muutoksia AR tehden herkempiä aktivaatio androgeenien tai muut ligandit [1], [4], [5] ja ilmaus konstitutiivisesti aktiivisen AR variantteja (AR-V, katso alla). Nämä havainnot viittaavat siihen, että CRPC voitaisiin menestyksellisesti hoidettu uusia lääkkeitä nyt kliinisissä tutkimuksissa, jotka estävät androgeenisynteesin tai AR etäpesäkkeitä (tarkistetaan [6]), mutta että konstitutiivisesti aktiivinen reseptorit voivat silti olla ongelma. Tutkimukset Tarvitaan siis tutkia, jos nämä AR-vs yleisesti ilmaistu CRPC luun etäpesäkkeitä vai ei.

Rakenteellisesti ihmisen

AR

geeni koostuu kahdeksasta eksonista koodaa 110 kDa: n proteiinin, joka koostuu NH

2 terminaali trans aktivaatiodomeenina (NTD), DNA: ta sitovan domeenin (DBD), joka on sarana-alue, ja COOH terminaali verkkotunnus (CTD), joka on myös ligandisitoutumisdomeenista (LBD) [7]. LBD, jota koodaa eksonit 4-8, ei ole olennainen transkriptionaalista aktiivisuutta [8]. Katkaistu AR-Vs puuttuu LBD ja ehdotetaan olevan konstitutiivisesti aktiivisia reseptoreita on havaittu PC solulinjoissa sekä kliinisissä näytteissä, mukaan lukien hyvänlaatuiset ja pahanlaatuiset metastaattisen kudos, kuten johtavat toisten silmukoinnin tai ei-sense mutaatioita ihmisen

AR

geeni [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Lisääntyvät AR silmukointivarianteista ole havaittu CRPC verrattuna hormonin infektoitunut (HN) PC [13], [14], [16]. Nämä tutkimukset sisältyvät CRPC näytteestä saatujen ensisijainen kasvaimia leikkauksen tai pehmytkudoksen etäpesäkkeitä ja muutama luustometastaaseja ruumiinavausnäytteistä. Ilmaisu AR-Vs on kliinisesti tärkeimmät metastaattinen sivusto, luun, ei ole hyvin dokumentoitu.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli siis analysoida ilmaisun täyspitkän AR (ARfl) ja sen kliinisesti runsain silmukointivariantit tässä kutsutaan AR-V1, AR-V7 [14] (myös nimitystä AR3 [13], [17], ja AR-V567es [16] HN ja CRPC luuetäpesäkkeistä verrattuna ilmentymisen ensisijainen PC ja ei-pahanlaatuinen eturauhasessa. Lisäksi AR transkriptipitoisuuksissa liittyivät AR proteiinin ilmentymisen, koko genomin transkription profiileja ja kliiniseen tulokseen.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

tutkimus hyväksyi paikallinen eettinen tarkastelu hallituksen Uumajan yliopiston ja osallistujat antoivat kirjallinen tai suullinen suostumus.

Potilaat

Luuetäpesäkkeiden saatiin sarjasta makean pakastetut ja formaliini kiinteiden parafiiniin koepaloja kerättiin potilailta PC toiminut metastasoineeseen selkäydinkompressio tai patologisen murtumia Uumajan yliopistollisessa sairaalassa (2003-2009). Näitä potilaita on perusteellisesti kuvattu [3] ja kliinisiä tekijöitä ja hoitojen on esitetty yhteenvetona taulukossa 1. Tutkimuksessa myös 13 potilaalla, joita hoidettiin eturauhasen Uumajan yliopistollisessa sairaalassa, välillä helmikuu 2005 ja syyskuussa 2006. Mediaani-ikä potilaiden oli 60 vuotta (vaihteluväli 48-68 vuotta) ja mediaani PSA olivat 6,6 ng /ml (vaihteluväli 3,5-24 ng /ml). Yksitoista potilasta oli kasvaimet luokiteltiin Gleason (GS) 7 ja kaksi GS 8. Neljä kasvaimia vaiheessa T2 ja yhdeksän vaiheessa T3. Välittömästi kirurgisen poiston jälkeen eturauhasissa tuotiin patologian osastolla ja leikataan 0,5 cm paksuisiksi viipaleiksi. Näistä viipaleita 20 näytettä lävistettiin kustakin eturauhasen käyttäen 0,5 cm teräs sylinteri ja jäädytettiin -70 ° C 30 minuutin kuluttua leikkauksen. Eturauhasen viipaleita kiinnitettiin sitten 4% formaldehydiä 24 tuntia, kuivattu, upotettiin parafiiniin, leikattiin 5 mikronin paksuinen kohdat ja värjättiin hematoksyliinillä-eosiinilla. Luonne jäätynyt kudos näytettä (ei-pahanlaatuisia tai pahanlaatuinen) määritettiin niiden sijainti koko-mount osia, mutta myös varmistettiin valomikroskoopilla hematoksyliini /eosiini-värjättyä kryostaattileikkeessä kustakin kudosnäytteistä analysoitiin, kuten alla on kuvattu . Nämä kohdat prosentuaalinen kasvainkudoksen kvantitoitiin ja kasvaimen GS määritetty.

Kudospreparointi ja RNA

edustavalla luuetäpesäkkeistä, ensisijainen PC ja ei-pahanlaatuiset eturauhasessa olivat Kryosäilöntäaineiden leikattiin uuttoputkiin ja RNA eristettiin käyttäen Trizol protokollaa (Invitrogen, Tukholma, Ruotsi). Prosenttiosuus kasvainsolujen näytteissä vaihteli välillä 25-95%. RNA-pitoisuudet määritettiin kvantitatiivisesti absorbanssilla mittauksia käyttämällä spektrofotometriä (ND-1000 spektrofotometrillä, NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE). RNA laatu analysoitiin 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ja tarkasti olla RNA eheyden numeron ≥6.

Reaaliaikainen RT-PCR

Kaksi- (200) ng RNA: ta päinvastaiseksi transkriptoidaan Superscript II käänteiskopioijaentsyymiä (Invitrogen) kokonaistilavuudessa 10 ui. Sen jälkeen PCR-monistus suoritettiin käyttäen Biorad iQ5 iCycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Reaktiot tehdään 20 ul: n tilavuudessa käyttämällä IQ SYBR Green Supermixiä (Bio-Rad Laboratories). Seuraavat alukesarjat käytettiin; ARfl: 5′-CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC-3 ’ja 5′-AGCTTCTGGGTTGTCTCCTCAGTGG-3′, AR-V1: 5’-CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC-3 ’ja 5′-CTGTTGTGGATGAGCAGCTGAGAGTCT-3′, AR-V7: 5’-CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC-3 ’ja 5’-TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT-3 ’, ja AR-V567es: 5′- CCAAGGCCTTGCCTGATTGC ja 5′-TTGGGCACTTGCACAGAGAT-3′, jolloin amplikoneja 143, 145, vastaavasti 125 bp, kuten aiemmin on kuvattu [14], [16]. Alukkeet housekeeping-geeni RPL13A (5’-GTACGCTGTGAAGGCATCAA-3 ’ja 5′-GTTGGTGTTCATCCGCTTG-3’), monistettu 125 bp: n fragmentti. Kukin näyte ajettiin kahtena kappaleena ja oikaistu vastaava RPL13A tasoilla. Sulamiskäyräanalyysillä vahvisti monistetut tuotteet, jotka analysoitiin myös 1% agaroosigeelielektroforeesilla vahvistaa odotetun koon (tuloksia ei ole esitetty).

Western blot-analyysi

Pakastemarjat luun etäpesäkkeitä ja eturauhasen näytteet Cryo-leikkeiksi ja proteiinit uutettiin 20 osaa (10 pm kukin) käyttäen AllPrep Mini kit, mukaan valmistajan ohjeiden (Qiagen, Hilden, Saksa). Proteiinipitoisuus määritettiin BCA Protein Assay (Pierce Chemical Co., IL, USA). 22RW1 soluja ylläpidettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden (ATCC) ja proteiinit uutettiin, kuten aiemmin on kuvattu [18].

Näytteet (20 ug proteiinia) erotettiin 7,5 SDS-PAGE: lla pelkistävissä olosuhteissa ja siirrettiin sen jälkeen PVDF-kalvoille (Immobilon-P, Millipore, Billerica, MA). Kalvot värjättiin Ponceau red vahvistamaan yhtäläiset näyte lastaus ja siirto (tuloksia ei esitetä). Sitten kalvot estettiin 5% maitoa seurasi anti-AR-vasta inkubaatioiden; N-20 (laimennettu 1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) tai PG-21 (laimennettu 1:1000, Upstate, Lake Placid, NY), jotta havaita ARfl ja AR-Vs, ja C-19 (Santa Cruz), jotta voidaan havaita ARfl muttei AR-Vs puuttuu LBD. Ensisijainen vasta-aineet laimennettiin 1% maito /PBST: ssä ja inkuboitiin 4 ° C: ssa yli yön. Sekundaarinen anti-kani-IgG: tä (Dako, Glostrup, Tanska), vasta-ainetta (laimennettu 1:20 000 2,5% maito) levitettiin pesun jälkeen PBST: ssä ja inkuboitiin 1 h RT: ssä. Proteiinin ilmentyminen visualisoitiin jälkeen pesty käyttämällä ECL Advanced havaitseminen kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) ja määrällisesti kanssa ChemiDoc skanneri ja Määrä One 4 ohjelmisto (Bio-Rad Laboratories).

Immunohistokemia

Luumetastaasit tutkittiin tässä tutkimuksessa on aikaisemmin immunovärjättiin AR, Ki67 (solujen lisääntymistä), aktivoitu kaspaasi 3 (apoptoottisia soluja) ja PSA antigeenejä (taulukko 2) seuraavat kuvattujen ennen [3]. Nuclear AR ja sytoplasminen PSA immunovärjäys pisteytettiin mukainen intensiteetti (0, 1, 2 tai 3) ja osa värjättyjen solujen (0, 1, 2, 3, tai 4). Kokonaispistemäärä (vaihteluväli 0-12) saatiin kertomalla värjäytymisen intensiteetti ja murto tulokset. Kaikkiaan AR pisteet 8 tai yli (mediaani ja yllä) määriteltiin aiemmin korkea ja todettu liittyvän lyhyemmällä selviytymisen jälkeen ortopedisen etäpesäke leikkauksen kuin AR kokonaispistemäärä alle 8 [3]. PSA pisteet 8 ja alle (mediaani ja alla) liittyi epäsuotuisaan tulos CRPC potilailla [3]. Fraktiot (%) sekä Ki67 ja aktiivisen kaspaasin 3 värjättyä kasvainsoluja aiemmin määritelty ja ei todettu liittyvän lopputulokseen tässä potilasryhmässä aine [3].

geeniekspressioanalyysissä

Kaksi sadan viidenkymmenen (250) ng kokonais-RNA kohden näytettä käytettiin cRNA tuotantoon on Illumina TotalPrep RNA -monistustarvikesarjaa (Ambion Inc, St. Austin, TX, USA) mukaan tarjotaan protokollaa. Laatu cRNA arvioitiin käyttäen RNA 6000 pico kit (Agilent Technologies) ja Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Yhteensä 750 ng cRNA käyttää hybridisaatioon ihmisen HT12-v3 Illumina BeadChip geenin ilmentymistä array (Illumina, San Diego, CA, USA), mukaan lukien 48803 koettimet ja 37846 selityksin geenejä, mukaan valmistajan protokollaa. Taulukot skannattiin ja fluoresenssisignaalit saatiin käyttäen Illumina Bead Array Reader (Illumina, San Diego, CA, USA). Array data-analyysi suoritettiin GenomeStudio (versio 2009,1, Illumina). Näytteet normalisoitu kuutio spline algoritmi ja antureilla kaikki signaalit pienempi kuin kaksi kertaa suurempi kuin keskimääräinen tausta tasot suljettiin pois analyysistä. Ilmentyvät eri geenit tunnistettiin Mann-Whitney differentiaalikaavojen algoritmia (

P

0,05) ja määritellyt olla kertainen muutos-ryhmien välillä on suurempi kuin 1,5. Gene ontologia analyysi tehtiin kanssa Metacore ohjelmiston (GeneGoInc. St. Joseph, MI, USA).

Tilastollinen

väliset korrelaatiot muuttujien analysoitiin käyttämällä Spearmanin testi. Ryhmät verrattiin käyttäen U-testi jatkuvien muuttujien ja Chi-neliö testi kategorisen muuttujia. Kaplan-Meier eloonjääminen analyysi suoritettiin kuoleman PC tapahtuman ja seuranta-ajan ajan välillä etäpesäke kirurgian ja uusimmat seurantatutkimuksessa. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen Statistical Package for Social Sciences, SPSS 17.0 ohjelmisto (SPSS, Inc., Chicago, USA). P-arvo yhtä suuri tai pienempi 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Korkea mRNA tasoilla AR silmukointivarianteista in CRPC luuetäpesäkkeissä

Puhtaaksikirjoituksia normaalin ARfl ja runsain AR silmukointivarianteista tunnetaan toistaiseksi [16]; AR-V1, AR-V7, ja AR-V567es, havaittiin ja niiden tasojen määrällisesti kuin pahanlaatuinen ja GS7-8 kudoksen osaa ensisijainen eturauhasen kasvaimia ja luuetäpesäkkeissä näytteitä, käyttäen reaaliaikaista RT-PCR-analyysillä. Kuten taulukossa 3 ARfl, AR-V1, ja AR-V7 transkriptit havaittiin useimmissa ei-pahanlaatuinen, primaarikasvain, ja etäpesäkkeitä näytteet tutkittiin, kun taas AR-V567es transkripti havaittiin 7 (23%) of CRPC luuetäpesäkkeistä vain.

oli taipumus korkeampi ARfl, AR-V1, ja AR-V7 mRNA HN luumetastaaseja kuin ensisijainen PC kudoksessa, mutta erot olivat ei- merkittävä (kuvio 1). On selvää kohonnut ARfl, AR-V1 ja AR-V7 transkriptin tasot kuitenkin nähtävissä CRPC luun etäpesäkkeiden, joka osoitti 8, 44, vastaavasti 120 kertaa suurempi mediaani tasoilla kuin HN etäpesäkkeitä (

P

≤0.001, kuva 1). ARfl, AR-V1, ja AR-V7 mRNA-tasot ei-pahanlaatuinen eturauhas- näytteet olivat verrattavissa tasolle ensisijainen eturauhasen kasvaimia (kuvio 1).

Kaikki mRNA-tasot korjattiin vastaavan siivous geenin ( RPL13a) mRNA-tasot normalisoituivat mediaaniarvo primäärikasvaimissa näytteet, ja muunnettava luonnollinen logaritmi. Tasot hyvänlaatuisen eturauhasen kudoksen (

n

= 13), ensisijainen eturauhasen kasvain (

n

= 13), hormoni-naiivit etäpesäkkeitä luustossa (

n

= 10) ja kastraatio kestävä etäpesäkkeitä luustossa (

n

= 30) näytteet näkyvät valkoinen, vaaleanharmaa, tummanharmaa, ja musta, vastaavasti. Havaittavissa tasot eivät ole merkitty, vaan edustaa sarakkeet symboloi alhaisin mitattavissa oleva taso RT-PCR-analyysi jokaisen transkriptin variantin.

Expression of LBD-typistetyn AR proteiinin variantit CRPC luumetastaaseja

proteiinit tasoja AR-Vs tutkittiin käyttäen Western blot-analyysi 13 näytettä CRPC luuetäpesäkkeistä satunnaisesti valittu edustamaan tapauksia korkea AR-V7 mRNA tasolla (tasoilla yläkvartiili, Q4), tapauksissa alhainen ja väliportaan AR-V7 mRNA (tasot pienin, Q1, ja väli, Q2-Q3, kvartiileja vastaavasti) sekä havaittavissa /ei-havaittavia tasoja AR-V567es mRNA: ta (kuvio 2). 22Rv1 solulinja tiedetään ilmentävän AR-V7 variantti [13], mutta myös muita silmukoitumisvariantteja [15] toimi positiivisena kontrollina. Ensisijainen eturauhasen näyte huomaamaton AR-V7 mRNA toimi negatiivisena kontrollina (kuva 2). Proteiinivyöhykkeet, jolla on odotettu molekyylipaino on noin 110 kDa (ARfl) ja 80 kDa (presumingly AR-V1, AR-V7 tai -V567es) havaittiin CRPC luun etäpesäkkeitä, vasta-aineet on kohdistettu N-terminaalinen domeeni AR, kun taas 80 kDa: n AR-vs ei havaittu käyttäen vasta-ainetta suunnattu C-terminaalinen LBD domeenin (kuvio 2A). Voimakkain 80 kDa vyöhykkeet havaittiin näytteissä Q4 AR-V7-mRNA-tasoja, kun taas CRPC luumetastaasien alemman AR-V7 mRNA-tasot osoittivat alemman havaitsemattomille tasoille riippumatta vastaavan AR-V567es mRNA-tasot (kuvio 2B). Perustuen blot intensiteettiä, AR muunnosproteiineihin muodostuneen mediaani 32% ARfl proteiinin taso (0 ja 95%,

n

= 13, tuloksia ei ole esitetty). Tämä oli toisin kuin vastaaviin tunnuslukuja RNA-tasolla, jossa AR-V7 ja AR-V567 transkriptien edustettuna mediaani vain 0,4% (vaihteluväli 0,03-7%, tuloksia ei ole esitetty) ja 1,0% (vaihteluväli 0,3-1,2%, tietoja ei esitetty), vastaavasti, ARfl mRNA-tasolla, mukaan eroa RT-PCR-ct tasoilla. Tuloksemme siis viittaavat siihen, että AR-Vs josta puuttuu LBD verkkotunnuksen ovat mahdollisia transkription jälkeen tasaantunut CRPC luuetäpesäkkeistä suhteessa ARfl.

A) Vasta-aineita (N-20 ja PG-21), joiden tarkoituksena N- terminaali verkkotunnus (NTD) AR havainnut ARfl ja AR variantteja (AR-V; presumingly AR-V1, AR-V7, ja /tai AR-V567es). Vasta-aineen C-19 kohdistaminen LBD havaittu ARfl on ~110 kDa, mutta ei LBD-katkaistu AR variantteja noin -80 kDa. B) analyysi CRPC luun etäpesäkkeitä, jotka edustavat näytteitä, joilla on korkea AR-V7 mRNA (tasot korkein neljänneksessä, Q4, mukaan RT-PCR-analyysi), sekä näytteet, joissa AR-V7 mRNA-tasot Q1, Q2, ja Q3, käyttämällä N-20-vasta-ainetta. 22Rv1 soluekstrakti toimi positiivisena kontrollina ARfl ja -80 kDa AR variantteja ja ensisijainen eturauhassyövän näyte (P) toimi negatiivisena kontrollina AR varianttien.

Expression of AR-V7 ja AR- V567es mRNA liittyy huonoon ennusteeseen

AR-V1, AR-V7, ja ARfl mRNA-tasot korreloivat kaikissa tutkituissa näytteissä (tuloksia ei ole esitetty,

n

= 66), ja alaryhmä on CRPC etäpesäkkeitä luustossa (AR-V1 vs. AR-V7

Rs

= 0,91,

P

0,001, AR-V1 vs. ARfl;

Rs

= 0,47,

P

0,01, ja AR-V7 vs. ARfl;

Rs

= 0,58,

P

0,001,

n

= 30). Luustometastaaseja kanssa havaittavissa AR-V567es mRNA oli noin 3 kertaa suurempi ARfl mediaani mRNA tasolla kuin muut CRPC etäpesäkkeitä (

P

= 0,004).

Potilaat, joilla on AR-V7 mRNA-tasoja Q4 oli huomattavasti lyhyempi syöpää erityisiä selviytymisen jälkeen etäpesäke leikkauksen kuin muut CRPC potilaiden ja samanlainen tulos havaittiin potilailla, joilla on havaittavia tasoja AR-V567es verrattuna muuhun (kuvio 3A-B). Kymmenelle potilaalle CRPC luumetastaaseja oli joko sisällytetty AR-V7 Q4 alaryhmä ja /tai ollut havaittavia tasoja AR-V567es, ja edelleen kutsutaan AR-V korkea potilailla. AR-V korkea potilailla oli keskimääräinen eloonjäämisaika jälkeen etäpesäke leikkauksen vain 2 kuukauden verrattuna 8 kuukauden iästä loput CRPC potilaista (kuvio 3C). Ei assosioitunut ARfl tai AR-V1 mRNA-tasoja ja selviytymisen jälkeen etäpesäkkeiden leikkauksen (tuloksia ei ole esitetty).

Potilaat, joilla on A) AR-V7 [14] mRNA-tasoja korkeimmassa neljänneksessä (Q4), B ) havaittavissa AR-V567es [16] mRNA-tasoja, ja C) havaittavissa AR-V567 ja /tai AR-V7 Q4 (AR-V korkea) mRNA-tasot olivat lyhyempiä eloonjäämisen kuin muiden potilaiden kanssa CRPC sairaus.

etäpesäkkeitä joilla on korkea AR silmukointivarianteista osoittavat voimakasta ydin- AR immuunivärjäysmenetelmällä

Kuten olemme aikaisemmin havainneet, että korkea AR immuunivärjäysmenetelmällä tulokset olivat yhteydessä erityisen lyhyt selviytymisen jälkeen etäpesäke leikkauksen ja nyt AR-V korkea potilaiden ennuste oli huono, halusimme tutkia, jos korkeat AR värjäytyminen pisteet liittyi tasot AR-Vs. AR-V korkea etäpesäkkeitä oli kaikilla korkea AR värjäyksen tulokset verrattuna muihin CRPC luuetäpesäkkeistä joka osoitti muuttuja värjäytyminen vaihtelee heikosta voimakkaaseen (taulukko 2,

P

= 0,02).

Lisäksi AR-V korkea etäpesäkkeitä osoitti merkitsevästi pienempi PSA immuunivärjäysmenetelmällä pisteet (taulukko 2,

P

= 0,038) ja suuntauksia, joilla on korkeampi jakeet lisääntyvien ja apoptoottisten kasvainsolujen epiteelisolujen (

P

= 0,12 ja

P

= 0,085, vastaavasti) kuin muut CRPC etäpesäkkeitä (taulukko 2).

Expression of AR silmukointivarianttien liittyy häiriintynyt solusyklikontrollin

geeniekspression profiilin alaryhmä AR-V korkea luuetäpesäkkeistä verrattiin profiilia muiden CRPC luuetäpesäkkeistä, käyttämällä Illumina perustuvat cDNA array lukien 48803 geenikoettimia. Noin 17700 koettimet on määritelty, jolloin saadaan signaalit taustan yläpuolella PC luustometastaaseja. Sata ja yhdeksänkymmentä viisi (195) koettimet ilmentyvät eri välillä AR-V korkea luuetäpesäkkeistä ja muut CRPC luuetäpesäkkeistä mukaan kertamuutosta vähintään 1,5 in-ryhmien välillä (

P

0,05) ja edelleen mukana ontologian analyysi arvioinnissa rikastettu prosesseja. Monet (60) erottaa geenituotteiden ehdotettiin suoraan vuorovaikutuksessa kautta AR, C-MYC, ja CDK1 proteiineja (kuvio 4 ja taulukko S1). C-MYC ja CDK1 ovat kaksi keskeistä sääntelyviranomaisten solusyklin ja näin ollen top 5 rikastettu prosessi verkkoja löytyy AR-V korkea luustometastaaseja olivat; Cell cycle Core, solusyklin S-vaiheessa, solusyklin Mitosis, Cytoskeleton kara mikrotubuleiksi ja solusyklin G2-M. C-myc, ja CDK1 ovat myös pro-eloonjäämistekijät inhiboimaan apoptoosia ja lisäksi löysimme lisääntynyt transkriptio tasoja anti-apoptoottisten proteiinien surviviinipeptideille ja BCL2L12 AR-V korkea verrattuna muihin CRPC luun etäpesäkkeitä (kuvio 4). Erityisesti kuitenkin tasoa muiden keskeisten sääntelyviranomaisten apoptoosin, kuten kuolemareseptorien, BAX, BCL2, ja kaspaaseiksi eivät muuttuneet merkitsevästi ja lisäksi apoptoosiin liittyviä prosessi verkot eivät merkittävästi rikastettu meidän data (tuloksia ei ole esitetty). Useat geenitranskriptien tiedetään säätää positiivisesti AR havaittiin korkealla tasolla AR-V korkea etäpesäkkeitä, kuten CDK1, CYCLINA2, HSP27, C-MYC, UGT2B17, CDC20, UBE2C, kun taas toiset, kuten KLK3 (PSA) , KLK2, NKX3-1, FKBP5 ja TMPRSS2 eivät olleet (kuvio 4).

Red ympyrät ovat korkeammalla ja sininen ympyrä osoittavat alempia transkriptipitoisuuksissa AR-V korkea kuin muissa CRPC luustometastaaseja. Huomaa, että monet erottaa geenituotteet suoraan vuorovaikutuksessa kautta AR, C-MYC ja CDK1.

Keskustelu

Tässä asiakirjassa kuvataan, ensimmäistä kertaa, ilmaus mallia LBD-katkaistu AR silmukoitumisvariantit AR-V1, AR-V7 [14] ja AR-V567es [16] PC luumetastaaseja potilailla ja myös, että tasot nämä vaihtoehdot ovat lisääntyneet CRPC luumetastaaseja ja että ilmaus AR -V567es ja /tai hyvin korkea AR-V7 löytyy yksilöiden erityisen huonoon ennusteeseen.

Useat rakenteellisesti erilaisia, konstitutiivisesti aktiivinen AR-Vs on tunnistettu tähän mennessä kliinisissä PC näytteissä [10], [11], [13], [14], [16], [17], ja me täällä näyttää rikastuminen LBD-typistetyn AR silmukoitumisvarianttia PC luustometastaaseja. Toisin kuin Sun ja työtoverit, joka löysi AR-V567es olevan runsain silmukointivariantin tutkitaan [16], löysimme AR-V7 on yleisemmin ilmaistuna kuin AR-V567es in CRPC. Ero voitaisiin mahdollisesti teknisesti selittää eri herkkyydet RT-PCR-tekniikoita käytetään, mutta mahdollisesti myös heijastaa erilaisuuteen AR silmukointivariantti ilmaisun eri kudoksista peräisin kun tarkastelimme CRPC luun taas Sun et ai mukana CRPC eri sivustoja. Myös tärkeintä huomata, että useat tutki CRPC etäpesäkkeitä luustossa (AR-V korkea tapauksissa) ilmaisi LBD-katkaistu AR proteiineja tasoilla verrattavissa ARfl proteiinin tasot, vaikka vastaava AR variantti transkriptit havaittiin suhteellisesti paljon alhaisempi kuin ARfl mRNA. Jälkeinen transkription vakauttaminen AR silmukointivarianteista suhteessa ARfl valikoiva CRPC luustometastaaseja, on siis uskottava, vaikka mekanismia ei tunneta.

huonon ennusteen potilaita, joilla CRPC etäpesäkkeitä ilmentävät AR V567es ja /tai korkeita AR-V7 selostukset liittyvät todennäköisesti oletetun konstitutiivista aktiivisuutta näiden varianttien. AR-V567es sisältää ydin lokalisoinnin sekvenssin (NLS) sarana-alueen eksoni 4 [16] ja AR-V7, toisin kuin AR-V1, on oletettu, että se sisältää NLS sen kryptisiä eksonissa [14]. Näin ollen, AR-V7 ja AR-V567es on osoitettu translokoida tumaan, sitoutuvat AR reagoiva elementtejä, ja aktivoi /tukahduttaa geenin transkription

in vitro

ilman ligandia sitovan [14], [ ,,,0],16], [17]. Mielenkiintoista, Watson ja työkaveri osoittivat äskettäin hetkessä lisäystä AR-V7 ja AR-V1 mRNA-tasot ksenograftimalleissa PC jälkeen kastraatio sekä lasku jälkeen androgen lisäravinteiden, mikä osoittaa, että jotkut AR-vs voidaan suoraan säädellä androgeenit ja siten luultavasti aiheutettiin potilaille pian sen jälkeen kastraation hoidon [17]. On houkuttelevaa spekuloida, että nämä ja muut AR-Vs valitaan varten myös kehittämisen aikana kastraation-resistenttejä ja siten edistää taudin uusiutumiseen välillä hoitoja, joilla pyritään vähentämään steroidi tasolle tai ligandin sitoutumista normaaliin AR. Niinpä löysimme korkeampi AR silmukointivarianteista in CRPC kuin HN luustometastaaseja. AR-V1 ja AR-V7 transkriptit kuitenkin havaittiin myös merkittävä osa ei-pahanlaatuinen ja pahanlaatuinen eturauhasen yksilöitä, vaikkakin alhaisemmalla tasolla kuin luu etäpesäkkeitä, ja muut ovat osoittaneet, että tasot AR-V7 ( AR3) perus eturauhaskasvaimissa olivat ennustettavissa lopputuloksen jälkeen eturauhasen, lyhyemmän ajan kemiallisiin uusiutumisen yksilöiden korkeampi [13], [14]. Syy tähän ei tiedetä, mutta osoittaa, että konstitutiivisesti aktiivinen AR-vs voisi olla osa normaalia eturauhasen fysiologian ja että valinta näiden varianttien tapahtuu PC etenemisen.

rikastuminen rakenteellisesti erilaisia, konstitutiivisesti aktiivinen AR-Vs kehittämisen aikana CRPC etäpesäkkeiden huomauttaa monimutkainen ja heterogeeninen molekyylitason tapahtumia, jotka erotuksena tarkoittaa ilmeisesti varmistaa AR aktivoinnin puuttuessa kivesten androgeenien. Potilaat ilmentävät konstitutiivisesti aktiivinen AR-Vs tulee pitkällä aikavälillä todennäköisesti ole hyötyä antiandrogeeni hoitojen tavoitteena on vähentää sellaisia ​​steroidisynteesin, kuten kirurgisen kastraation, LHRH-analogien, tai äskettäin käyttöön agentti abirateronin joka estää CYP17 ja siten steroidisynteesin paitsi kiveksissä mutta myös lisämunuaisten ja kasvainkudoksessa [19], [20]. Yllättäen uusi AR-antagonisti MDV3100 kohdistuvat LBD on ARfl ja tällä hetkellä kliinisissä tutkimuksissa CRPC [21], [22], havaittiin estävän kastraatio kestävä kasvu indusoitiin ekspressiota konstitutiivista AR-V7 eläinmallissa PC [17]. Tämä on rohkaiseva uusina AR antagonisteina estämällä reseptori translokaation tumaan näin voi olla terapeuttisia vaikutuksia myös potilailla ilmentävät konstitutiivisesti aktiivinen AR-Vs. Kaikkia CRPC potilaat eivät kuitenkaan vastata abirateronin ja MDV3100 huumeita, ja myös ne, jotka eivät myöhemmin relapsi muutaman kuukauden kuluessa [20], [22]. Jos tällainen hoito vastustuskyky liittyy ilmaus konstitutiivisesti aktiivinen AR-Vs luun etäpesäkkeitä (ensisijainen tavoite hoito) ei tällä hetkellä tiedetä eikä sitä voida määrittää vasta kliinisissä tutkimuksissa alkaa sisällyttää koepalat luustometastaaseja. Lisäksi terapeuttiset aineet estämällä niitä AR-Vs tai niiden alavirran vaikutuksia on kehitettävä [23], [24]. Toinen mahdollinen selitys vastustuskykyä kastraatio hoito on läsnä AR negatiivisten kasvainsolujen ja siten AR ohituksen aikana syövän etenemistä [25]. Täydellinen puuttuminen AR ilmaisun löytyy vain pieni osa-väestö CRPC luuetäpesäkkeistä, mutta AR negatiivinen kasvainsoluja hajallaan positiivinen esiintyy useimmissa CRPC luuetäpesäkkeissä [3], ja näin korostetaan tarvetta myös hoitoja eivät vetoa ainoastaan on toiminnallinen AR.

kliiniset näytteet tutkittiin tässä tutkimuksessa, havaittavia tasoja AR-V567es ja /tai korkea AR-V7-transkriptit, jotka liittyvät säätelemättömään tasolla tunnettujen AR-ohjattu geenien , mutta nimenomaan ole klassista androgeenireseptorin geenien, kuten KLK3 (PSA), TMPRSS2, ja FKBP5 joka indusoitiin yli-ilmentyminen AR-V7 tai AR-V567es LNCaP-soluissa

in vitro

[14] , [16]. Siten AR-V korkea tapaukset osoittivat vähemmän PSA immuunivärjäysmenetelmällä kuin muut CRPC etäpesäkkeitä. Sen sijaan löysimme Geenitranskriptikuvion tasoa, joka erottaa AR-V korkea luuetäpesäkkeistä muista CRPC luuetäpesäkkeistä ilmoittamalla korkea C-myc ja CDK1 toimintaa, ja häiriintynyt solusyklikontrollin koskevat G1-S sekä G2-M siirtyminen huolimatta ei- merkittävä kasvu Ki67 merkinnöissä. Kehittäminen CRPC ollut tyypillistä epätasapainoinen leviämisen apoptoosin suhteen ja kestävyys apoptoottista ärsykkeille [26], [27]. Myöhään vaiheessa taudin tutkittu tässä tutkimuksessa emme kuitenkaan muutamaa poikkeusta lukuun ottamatta, löytää mitään selkeitä merkkejä muuttuneen ilmentymisen apoptoosin säätelevä geenejä tai edelleen vapautuminen apoptoottisen prosessin AR-V korkea verrattuna muihin CRPC luustometastaaseja. Perustuu tietoihin, emme pysty erottamaan, jos häiriintynyt solusyklikontrollin löytyy AR-V korkea luuetäpesäkkeistä on todella liittyy ilmentymisen AR-Vs The ARfl, tai vain liittyy erityisen kehittynyt taudin nämä CRPC tapauksissa. Kuitenkin, lisäymmärrystä biologisia prosesseja vapautettiin tapauksissa korkea ilmentyminen konstitutiivisesti AR-Vs voisi olla hyödyllinen kehitettäessä uusia hoitomuotoja CRPC. Esimerkiksi C-MYC-proteiini voi olla terapeuttinen tavoite valikoiva potilailla, joilla on PC kuten jo ehdottanut [28].

Johtopäätöksenä LBD-katkaistun AR-vs usein ilmaistaan ​​luun etäpesäkkeitä, korkeasti in CRPC kuin HN tapauksissa.