Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Limited tietoa myöskään mekanismeja jolla miRNA edistää keuhkojen syövän synnyn. Tässä tutkimuksessa tehtiin tutkia ilmentymistä ja toimintaa miRNA tupakansavun indusoimaa lauhde (CSC) normaaleissa ihmisen hengitysteiden epiteelin ja keuhkojen syöpäsoluja.

Menetelmät

Micro-array ja kvantitatiivinen RT- PCR (qRT-PCR) käytettiin arvioimaan miRNA ja vastaanottavan geenin ilmentyminen viljellyissä soluissa, ja kirurgisista näytteistä. Ohjelmisto-ohjattu analyysi, RNA cross-link immunosaostuksella (CLIP), 3 ’UTR lusiferaasireportteri määrityksiä, qRT-PCR, keskittyi super-paneelit ja western blot tekniikoita käytettiin tunnistaa ja vahvistaa tavoitteet miR-31. Kromatiinin immunosaostus (ChIP) tekniikoita käytettiin arvioimaan histonimerkkien ja transkriptiotekijöiden sisällä LOC554202 promoottori. Solumäärä ja vierassiirrekokeissa arviointiin käytettiin vaikutusten miR-31 proliferaatioon ja tuumorigeenisyystesti keuhko- syöpäsoluja.

Tulokset

CSC lisäsi merkittävästi miR-31 ilmentyminen ja aktivoitu LOC554202 normaalissa hengitysteiden epiteeli ja keuhkosyövän soluja; miR-31 ja LOC554202 ilme säilyi lopettamisen jälkeen CSC altistumista. miR-31 ja LOC554202 ekspressiotasoja olivat merkittävästi koholla keuhkosyöpä yksilöitä suhteessa viereisiin normaaliin keuhkojen kudoksia. CLIP ja toimittaja analyysit osoittivat suoraa vuorovaikutusta miR-31 kanssa Dickkopf-1 (DKK-1) ja dACT-3. Yli-ilmentyminen miR-31 merkittävästi vähentynyt DKK-1 ja DACT3 ekspressiotasot normaaleissa hengitysteiden epiteeli ja keuhkosyövän soluja. Knock-down of miR-31 lisäsi DKK-1 ja DACT3 tasolla, ja kumotaan CSC välittämä pienenemistä DKK-1 ja dACT-3 ilme. Lisäksi yli-ilmentyminen miR-31 väheni SFRP1, SFRP4, ja WIF-1, ja lisääntynyt Wnt-5a ilmentymistä. CSC lisääntynyt H3K4Me3, H3K9 /14Ac ja C /EBP-β tasoilla LOC554202 promoottori. Knock-down C /EBP-β kumottu CSC aktivaatio LOC554202. Yli-ilmentyminen miR-31 merkittävästi parannettu lisääntymistä ja tuumorigeenisyystesti keuhkosyöpään solujen knock-down of miR-31 esti näiden solujen kasvua.

Johtopäätökset

Tupakansavu indusoi ilmentymisen miR-31 kohdistaminen useita antagonisteja syövän kantasolujen signalointi normaalissa hengitysteiden epiteeli ja keuhkosyövän soluja . miR-31 toimii oncomir aikana ihmisen keuhkojen karsinogeneesissä.

Citation: Xi S, Yang M, Tao Y, Xu H, Shan J, Inchauste S, et ai. (2010) Cigarette Smoke indusoi C /EBP-β aktivaatio miR-31 Normal Human Respiratory epiteelin ja Keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 5 (10): e13764. doi: 10,1371 /journal.pone.0013764

Editor: Oliver Eickelberg, Helmholtz Zentrum München /Ludwig-Maximilians-University Munich, Saksa

vastaanotettu: 1. kesäkuuta, 2010 Hyväksytty: 04 lokakuu 2010; Julkaistu: 29 lokakuu 2010

Tämä on avoin-yhteys artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Public Domain ilmoitus, jonka mukaan, kun se on saatettu julkisia, tämä työ saa vapaasti kopioida, levittää, lähetetään, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Institutes of Health sisäiset varat. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Genetic sekä epigeneettisellä dysregulation geeniekspression aikana pahanlaatuisiksi johtuu osittain poikkeava ekspressio mikro-RNA: iden (miRNA) [1], [2]. Nämä pienet (~21-mer) ei-koodaavat RNA-molekyylien säädellä geeniekspressiota sitoutumalla 3 tulkitsemattoman alueet (3 ’UTR) kohde- mRNA: iden, liipaisu transkriptio hajoamisen tai translaation tukahduttaminen riippuen laajuudesta täydentävät toisiaan siemenen sekvenssi miRNA ja mRNA motiivi [3]. Noin 30% kaikista mRNA: iden ovat potentiaalisia miRNA kohteita. Tähän mennessä yli 800 miRNA on tunnistettu ihmisellä, joista kukin on kohdistettu useisiin toiminnallisesti liittyviä geenejä, mikä välittävä monimutkaisia ​​säätelyverkkoja [3], [4].

Erilaisia ​​miRNA ovat sekaantuneet patogeneesissä ihmisen keuhkosyövässä, valtaosa jotka aiheutuvat suoraan tupakoinnin [5], [6]. Jotkut näistä miRNA toimivat onkogeenien (oncomirs), kun taas toiset toimivat tuumorisuppressoreilla. Esimerkiksi miR-21, joka aktivoituu osittain kautta poikkeavaan EGFR signaloinnin tukahduttaa ilmaisun PTEN ja PDCD4, helpottaa leviämisen, invaasio, ja kestävyys apoptoosin keuhkosyöpään solujen [7] – [11]. Aktivointi miR-93, miR-98 ja miR-197 inhiboi ilmentymistä FUS1, parantaa solusyklin etenemistä ja Chemo-resistenssin keuhkosyövän soluihin [12], [13]. Tukahduttaminen miR-15A ja miR-16, joka kohdistaa sykliinejä D1, D2 ja E, kumotaan Rb välittämä solukierron säätelyssä keuhkojen syöpäsoluja [14]. Lisäksi alas-säätely let-7 perheenjäseniä kohdistaminen lukuisia koodaavien mRNA solusykliä sääteleviä proteiineja kuten Ras, AURKA, AURKB, ja E2F5 parantaa leviämisen ja tuumorigeenisyystesti keuhkosyöpään solujen [7], [15], [16]. Mielenkiintoista, useat miRNA muutoksia havaitaan usein keuhkosyövässä, kuten alas-säätely let-7 ja yli-ilmentyminen miR-17-92, havaitaan syövän kantasoluja [17], [18] sekä pseudoglandular keuhkoparenkyymistä [19], mikä viittaa alkion kyseeseen miRNA ilmaisun aikana keuhkojen syövän syntymistä.

huolimatta tuoreet tutkimukset miRNA ekspressioprofiileja korreloi kasvainhistologiaa sekä tupakointi ja ennusteen primaarisessa keuhkosyövässä, [6], [20] – [22], on vain vähän koskevat miRNA muutoksia, jotka suoraan edistävät aloittamista ja varhainen eteneminen näistä syöpäsairauksia. Esillä olevassa tutkimuksessa käytimme in vitro malli järjestelmä tutkia miRNA muutokset välittyvät tupakansavun kondensaatti (CSC) normaaleissa ihmisen hengitysteiden epiteelin, ja keuhkosyöpä peräisin olevien solujen tupakoitsijoiden sekä tupakoimattomilla. Tässä raportoimme, että CSC indusoi ilmentymisen miR-31 kohdistaminen useita Wnt signaloinnin antagonisteja, mukaan lukien Dickkhopf-1 (DKK-1) ja DACT3 normaaleissa ihmisen hengitysteiden epiteelin sekä keuhko- syöpäsoluja. Nämä havainnot tarjoavat suoran mekanistinen yhteys tupakansavun ja aktivoimalla oncomir tukahduttaa antagonisteja kantasolujen signaloinnin aikana tupakan aiheuttamaa keuhkojen syövän synty.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja käsittelyolosuhteet

Kaikki keuhkosyöpä linjat saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), ja pidettiin RPMI-10% FCS: ää, 10 mM glutamiinihappoa, ja 1% penisilliini /streptomysiiniä. Ensisijainen normaaleja ihmisen pienten hengitysteiden epiteelisoluissa (SAEc) ja normaalin ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen (NHBE) saatiin Lonza, Inc (Frederick, MD), ja niitä viljeltiin per myyjän ohjeita. Kuolemattomiksi ihmisen keuhkoputken epiteelisolut (HBEC) oli jalomielinen lahjoitus John D. Minna (UT Southwestern, Dallas, TX), ja viljeltiin täydellisessä Keratinosyyttien-SFM-media (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 5 ug /L epidermaalinen kasvutekijä ( EGR) ja 50 mg /l naudan aivolisäkeuutteella (BPE). Tupakansavun kondensaatit (CSC), jotka ovat peräisin Kentucky Viite 3R4F tutkimuksen sekoitus savukkeiden (University of Kentucky) valmistettiin, kuten on kuvattu [23], ja suspensoitiin uudelleen konsentraationa 1 mg tervaa /ml RPMI, joka on määritelty 10%: CSC [24 ]. Savua altistuminen kokeissa soluja viljeltiin 10-cm ruokia sopiva normaalissa media (NM) kanssa tai ilman CSC (1%). Medium vaihdettiin päivittäin lisäämällä tuoretta CSC. Soluja jatkoviljeltiin tarvittaessa ja korjattu eri ajankohtina analysoitavaksi.

Ihmiskudokset

Ensisijainen keuhkosyöpää yksilöitä ja viereisen histologisesti normaalin keuhkoparenkyymistä kerättiin leikkauksen aikana potilailta, joille suoritetaan mahdollisesti parantava asemointia NIH sisäisen arvioinnin hallituksen hyväksymä protokollia, jotka edellyttävät kirjallista lupaa. Kaikki kudokset välittömästi snap-pakastaa osan kanssa korjattu kudosta lähetetään välittömästi histologista vahvistusta riippumaton, anatominen patologi pidennetyn tavalla. Dosnäytteistä viivakoodilla ja tallennetaan rintakehä Oncology Laboratory, Surgery Branch, NCI. Sillä microRNA eristäminen ja ilmaisun analyysin pieni RNA jae eristettiin kanssa RT2 qPCR-Grade miRNA Isolation (Qiagen, Valencia, CA), ja miRNA ilmentyminen kvantifioitiin qRT-PCR miRNA Detection Kit (ABI, Carlsbad, CA) .

miRNA yli-ilmentymisen ja esto

esiasteet ja inhibiittoripastojen miRNA pMiR-H31PA-1, pCDH-CMV-MCS-EF 1-copGFP negatiivinen kontrolli, MZIP31-PA-1, pGreenPuro Sekoita Hiuspinni negatiivisen kontrollin ostettiin SBI (System Biosciences, Mountain View, CA). miRNA esiasteita tai estäjien (sekä 50 nM) transfektoitiin soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Reporter vektoreita ja DNA-konstrukteja

3 ’UTR: t on Dkk1 (850 bp) ja DACT3 (2461 bp) amplifioitiin PCR-menetelmällä ihmisen SAEC cDNA, ja lisätään alavirtaan CMV-ajettu tulikärpäsen lusiferaasi kasetti pMIR-REPORT vektori (Ambion, Austin, TX) välillä

Hind III

ja

Spel

sivustoja. Mutant toimittaja plasmidit (3 ’UTR of Dkk1 ja DACT3) luotiin käyttäen Quikchange mutageneesi Kit (Stratagene, Wilmington, DE). Kaikki inserttifragmentit varmistettiin suoralla sekvensoinnilla.

Luciferase miRNA tavoite toimittaja määrityksissä

miRNA tavoite validointi, noin 2 x 10

4 SAEC solua per kuoppa 24-kuoppalevyille olivat lyhytaikaisesti transfektoitu 25-50 ng kutakin tulikärpäsen lusiferaasi reportteri-konstrukti (Promega, Madison, WI), 150-175 ng pcDNA3 tyhjän vektorin, 200 ng pRTK-Luc (Promega) sisäisenä kontrollina, ja 30 pmol pre-miR-31 (SBI, Mountain View, CA). Renilla sivektorissa normalisointiin käytettiin transfektiotehokkuuden. Noin 24 tuntia transfektion jälkeen, tulikärpäsen ja Renilla Lusiferaasiaktiivisuudet määritettiin. Normalisoitu suhteellinen valo yksiköitä edustavat tulikärpäsen lusiferaasi aktiivisuuden /Renilla lusiferaasiaktiivisuutta.

Proliferaatiomääritykset

Solut maljattiin pitoisuudella 5 x 10

4 solua per kuoppa 24-kuoppalevyille ja viljellään NM tai ilman CSC plus plasmiditransfektiolla. Rinnakkaiseen koloon kerättiin ja laskettiin trypaanisiniekskluusiolla tekniikoita.

Kvantitatiivinen RT-PCR

mRNA kokonais-RNA valmistettiin käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen), ja genominen DNA on eliminoitu TURBO DNA- vapaa Kit (Ambion). Yksi ug kokonais-RNA: ta käänteiskopioitiin käyttäen iScript käänteistranskriptaasia (Bio-Rad). Poisjättäminen käänteistranskriptaasi toimi negatiivisena kontrollina. cDNA monistettiin käyttämällä Platinum PCR SuperMix (Invitrogen). PCR suoritettiin seuraavasti: 5 min 94 ° C: ssa, 35 sykliä 60 s 94 ° C: ssa, 60 s 57-60 ° C: ssa, ja 60 s 72 ° C: ssa, minkä jälkeen 5 min 72 ° C: ssa. Reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi suoritettiin, kuten on kuvattu [25] käyttämällä DKK-1, DACT3, SFRP1, SFRP4, WIF-1, ja β-aktiini-alukkeet Applied Biosystems tai Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Sillä microRNA eristäminen ja ilmaisun analyysin ilmaus miRNA eristettiin RT2 qPCR-Grade miRNA Isolation (Qiagen) kvantifioitiin qRT-PCR miRNA Detection Kit (ABI).

Kromatiini immunosaostuksella (chip)

Solut silloitettu 1% formaldehydiä, hajotettiin ja sonikoitiin jäillä tuottaa DNA-fragmenttien, joiden keskimääräinen pituus on 200-800 bp [26]. Sen jälkeen pre-clearing, 1% kutakin näytettä tallennetaan tulo murto. Immunosaostus suoritettiin käyttäen vasta-aineita, jotka tunnistavat spesifisesti H3K4me3, H3K9Ac, H3K14Ac (Abcam), RNA-polymeraasi II (Upstate) tai IgG-ohjaus. DNA eluoitiin ja puhdistettiin komplekseja, ja sen jälkeen PCR-monistus LOC554202 promoottorin käyttämällä alukkeita ja olosuhteita, kuten on kuvattu [27].

siRNA ja shRNA pudotus

Calu-6 ja H841-soluja väliaikaisesti transfektoitu siRNA kohdistaminen C /EBP-α ja C /EPB-β, tai sham siRNA sekvenssit (Dharmacon, Lafayette, CO) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Kohdegeenin pudotus vahvistettiin RT-PCR: llä ja western blot tekniikoita.

Western blot-analyysi

Protein uutteet tuotettu kuten aiemmin on kuvattu [26]. Näytteet eroteltiin 4-12% Tris-glysiini-SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla geelit ja blotattiin Immobilon P-membraanille (Millipore, Billerica, MA); proteiinit havaittiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssidetektiolla reagenssit (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Vasta-aineita käytetään western-analyysi tehtiin vuohen anti-DKK-1, hiiren anti-DACT3, ja vuohen anti-β-aktiini (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA).

RT-PCR paneelit

Wnt signalointia RT-PCR super-taulukot (PAH-043A) saatiin SABiosciences (Frederick, MD). 1 ug kokonais-RNA: ta käytettiin käänteistranskriptioon ja koko cDNA reaktio laimennettiin ja jaettava 96 kuoppaan super-array levy. Reaktiot suoritettiin RT

2 SYBR Green /ROX PCR Master Mix (SABiosciences). Tulokset analysoitiin käyttämällä ohjelmistoa, jonka myyjä https://www.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php.

MicroRNA mikrosiruanalyysi

Pienimolekyylipainoinen RNA: t (pieniä RNA: t) on uutettu solun levyillä käyttäen Mirvana ™ miRNA eristyspakkausta (Ambion, Austin, TX) käyttämällä miRNA rikastamiseen mukainen menetelmä valmistajan protokollaa. Kolmesataa nanogrammaa pieniä RNA: iden kudosnäytteet leimattu suoraan N-koodi miRNA -leimauskittiä (Invitrogen) per myyjän protokollia. Lyhyesti, kypsä miRNA pienessä RNA-näytteet ensin pyrstö poly (A); poly (A) pyrstö miRNA sitten koodattu talteenotto, jota seuraa hybridisaatio Cy5 /Cy3-leimattua 3DNA dendrimeerejä. Sillä microarray tietojenkäsittely- ja normalisointi, mikrosirujen sirut skannattiin käyttäen GenePix 4000B skanneri (Axon Instruments, Union City, CA) ja mediaani spot intensiteetit luotiin käyttäen GenePix 5,0 (Axon Instruments, Union City, CA). Microarray tiedot käsiteltiin ja normalisoitu (50%) käyttäen GeneSpring (Agilent, CA). Tilastolliset ja klustereiden analyysit suoritettiin käyttäen GeneSpring ohjelmistoa. Ekspressiotasot miRNA tehtiin 2-tie varianssianalyysi (ANOVA) CSC käsitellyn vs käsittelemättömän edellytykset eri solulinjoissa.

Ago CLIP (tunnistetiedot AGO-1-liittynyt mRNA: t) B

Solut kerättiin ja CLIP kokeet suoritettiin käyttäen joko anti-AGO perheen tai elF2C vasta-aineita, kuten on kuvattu (28). Lyhyesti, solut ristisilloitettuna säteilytys 400 mJ /cm

2 ja vielä 200 mJ /cm

2 Stratalinkeriä, ja hajotettiin tuottamaan RNA /proteiini (AGO) kompleksit [28] – [30]. Sen jälkeen pre-clearing, 1% kutakin näytettä tallennetaan tulo murto. Immunosaostus suoritettiin käyttäen spesifisiä vasta-aineita vastaan ​​joko AGO perhe (Millipore, Billerica, MA), tai elF2C (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) tai kontrolli-lgG. RNA eristettiin ja puhdistettiin komplekseista, jota seuraa PCR-monistus ja 3 ’UTR: t on miR-31 tavoitteet.

Hiiren vierassiirrekokeissa

Calu-6 ja H358-solut transfektoitiin pCDH-CMV-MCS -EF1-copGFP vektori ohjaus ja pMiR-H31PA-1 suspendoitiin PBS: ään konsentraatiossa 1 x 10

6 solua /100 ui, ja inokuloitiin subkutaanisesti contralateral kylkiin kateenkorvattomia nude-hiiriä (10 hiirtä per hoitoryhmä koetta kohti ). Hiiriä tarkkailtiin kahdesti viikossa ja kasvainten tilavuudet laskettiin perusteella kohtisuorassa halkaisijat. Noin 21 päivää ja 35 päivää myöhemmin Calu-6 ja H358 kokeiluja, vastaavasti, hiiret lopetettiin, ja arvioitiin prosenttia kasvain ottaa, ja massa leikattiin ksenograftien. Sen jälkeen, kasvaimen kudokset jäädytettiin nopeasti nestemäisessä typessä, ja niitä säilytettiin tulevaa analyysiä varten. Kaikki eläin menettelyt hyväksyttiin National Cancer Institute Animal Care ja käyttö komitea, ja oli mukaisesti NIH Guide for Care ja koe-eläinten käytön.

Tilastollinen analyysi

Erot Hyväksytty näytteet samoilta keuhkosyöpäpotilaita, kuten kasvain ja normaali kudos testattiin allekirjoitettu-rank-testi. Ryhmiä verrattiin Wilcoxonin-Mann-Whitney testi. Luottamusväli erot medians kahden ryhmän välillä oli laskettu bias-korjattu ja kiihtyi bootstrapping menetelmiä. Erot kasvainten tilavuudet vastakkaisten kylkien kasvainta kantavien hiirten testattiin Wilcoxonin allekirjoitettu rank testi 5 päivän välein.

P

arvot korjattiin useita testausta täydellinen resampling [31]. Luottamusväli mediaani kylki eroja lasketaan tarkka epäparametrinen kaksitahoiset luottamusvälit perustuu Wilcoxonin-rank-testiä.

alukesekvensseissä

Lähettäjä kuin Taulukko S1.

tulokset

Up-regulation of miR-31 viljellyissä soluissa altistuvat CSC

Alustavat kokeet, joissa käytetään array tekniikoita suoritettiin tutkimaan miRNA ekspressioprofiileja paneelissa normaalin hengitysteiden epiteelin ( SAEC ja NHBE), ikuisti ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen (HBEC) ja keuhkosyövän soluja (Calu-6, H841, H1299, H1650, ja H1975) viljeltiin normaalissa median kanssa tai ilman CSC. Tämä analyysi paljasti ainutlaatuinen pohjapinta miRNA ekspressioprofiileja osuvat histologia (normaali vs pahanlaatuinen). Lisäksi keuhkosyöpä linjat johdettu tupakoitsijoiden (Calu-6, H1299, H841) olivat selvästi erottaa ne peräisin tupakoimattomien (H1650, H1975) (M. Yang, käsikirjoitus valmisteilla).

Erityisen kiinnostavaa , edellä mainittu mikro-array kokeita ehdotti, että CSC indusoi ilmentymistä miR-31 normaalissa hengitysteiden epiteeli sekä keuhko- syöpäsoluja. Tutkia tätä ilmiötä, kvantitatiivinen RT-PCR: llä (qRT-PCR) suoritettiin kokeita tutkia miR-31 ilmentyminen SAEc, HBEC, Calu-6, ja H841-soluja viljeltiin normaalin media (NM) kanssa tai ilman CSC 5päivä . Nämä kokeet (kuvio 1A) osoitti, että käsittelemätöntä Calu-6 ja H841cells oli korkeampi endogeenisten tasojen miR-31 suhteessa SAEc ja HBEC soluja; lisäanalyysi paljasti, että 5 päivää CSC altistus sääteli miR-31 ilmentyminen 5,5 kertaiseksi ja 3,6-kertaisesti SAEC ja HBEC vastaavasti suhteessa kontrolleihin. Samanlaisia ​​hoito lisäsi miR-31 ilmentyminen 3.1 ja 6.5 kertaisesti Calu-6 ja H841-soluissa, vastaavasti (kuvio 1 B). Kokeet, paljasti säätely ylöspäin miR-31 SAEC ja H841-soluissa 24 tunnin aloittamisen jälkeen CSC altistuksen, jossa ilme korkeimmillaan ja tasaantumisesta noin 96 tuntia myöhemmin (kuvio 1 C). Mielenkiintoista, säätely ylöspäin miR-31 CSC kesti 20 päivää poiston CSC soluviljelymediumeista (kuvio 1 B).

A) qRT-PCR-analyysi endogeenisen miR-31 ilmentyminen normalisoitunut ohjaus miRNA ( RNU44) in SAEC, HBEC, Calu-6, ja H841cells. Pohjapinta tasoilla miR-31 ovat korkeammat keuhkosyövässä suhteessa viljeltyihin normaali tai kuolemattomaksi ihmisen hengitysteiden epiteelisolujen. B) qRT-PCR-analyysi miR-31 ilmentyminen SAEc, HBEC, Calu-6, ja H841cells viljeltiin normaalissa media (NM) kanssa tai ilman CSC 5 päivää. Lisääntynyt miR-31 ilmentyminen oli ilmeistä 20 päivää lopettamisen CSC hoidon. C) qRT-PCR-analyysi osoittaa, ajasta riippuva aktivointi miR-31 SAEC ja H841cells viljeltiin NM tai ilman CSC 0, 12, 24, 48, 72, 96, ja 120 tuntia. D) qRT-PCR-analyysi osoittaa, miR-31 ilmentyminen ihmisen keuhkosyövässä suhteessa pariksi viereiseen normaaliin keuhkojen kudoksiin. miR-31 tasot kasvaimia olivat korkeammat kuin vastaavassa normaalissa keuhkossa. Lisäksi miR-31-tasot olivat merkitsevästi korkeammat keuhkosyövässä aktiivisesta /entiset tupakoitsijat verrattuna peräisin koskaan tupakoineet.

miR-31 ilmentyminen ensisijainen keuhkosyövän yksilöitä

Muita qRT-PCR-kokeet suoritettiin tutkimaan miR-31 ekspressiotasot satunnaisesti valittuja ensisijaisen ei-pienisoluisen keuhkosyövän ja viereisen histologisesti normaalin keuhkoparenkyymistä (kliiniset ja patologinen tiedot esitetty taulukossa 1). Kuten kuviossa 1D, miR-31-ekspressio lisääntyi (keskiarvo 4,13-kertainen, välillä 1,47-12,46 kertaisesti) keuhkosyövässä suhteessa pariksi normaalin keuhkojen kudoksiin. Mielenkiintoista, miR-31 tasot keuhkosyövässä tupakoitsijoiden olivat korkeammat kuin tupakoimattomilla (5,2 vs 1,65 kertaiseksi; p 0,01). Yhdessä nämä tiedot vahvistivat alustavat kokeet osoittavat korkeampaa miR-31 ilmentyminen keuhko- syöpäsoluja suhteessa viljeltiin normaalin hengityksen epiteelissä (kuvio 1A), ja ehdotti, että aktivointi miR-31 voi olla biologisesti merkityksellisiä ilmiö aikana ihmisen keuhkojen karsinogeneesiin.

Effects of miR-31 antagonistit WNT signaloinnin

Software-ohjattu analyysi osoitti, että useat antagonistit Wnt signalointia kuten DKK-1 [32] ja DACT3 [33] olivat mahdollisia miR-31 tavoitteita. Näiden tulosten vahvistamiseksi, SAEC, HBEC, Calu-6, ja H841-solut transfektoitiin ohimenevästi miR-31. Kvantitatiivinen RT-PCR-kokeet paljastivat -12-kertaisesta miR-31 ilmentyminen miR-31-transfektoitujen solujen suhteen vektori kontrolleihin (kuvio 2A). Yli-ilmentyminen miR-31 väheni DKK-1 sekä DACT3 (~5-8 kertainen ja ~1.5-7 kertaiseksi, suhteessa kontrolleihin) näiden neljän solulinjoissa (kuviot 2B). Näitä vaikutuksia esiintyi jonkin verran voimakkaampia normaalissa SAEC ja kuolemattomaksi HBEC, johtuen mahdollisesti alhaisempi endogeenisen miR-31 ja korkeampaa DKK-1 ja DACT3 näissä soluissa verrattuna Calu-6 ja H841 keuhkosyövän soluja.

A) miR-31 oli yli-ilmentynyt SAEC, HBEC, Calu-6, ja H841-solujen kautta lyhytaikaista transfektiota ensiarvoisen miR-31 konstruktioita. qRT-PCR-analyysi vahvisti korkean tason miR-31 ilmentyminen miR-31-transfektoitujen suhteessa kontrolliin soluihin. B) qRT-PCR-analyysi DKK-1 ja DACT3 ekspressiotasot SAEc, HBEC, Calu-6, ja H841-solujen kanssa tai ilman yli-ilmentyminen miR-31. Yli-ilmentyminen miR-31 väheni DKK-1 ja DACT3 kaikissa neljässä solulinjoissa. C) qRT-PCR-analyysi osoittamalla alentuneet endogeenisen miR-31 SAEc, HBEC, Calu-6, ja H841-soluissa ohimenevän transfektion antisense-miR-31 (Zip-miR-31) rakentaa suhteessa kontrolleihin. D) qRT-PCR-analyysi DKK-1 ja DACT3 ekspressiotasot SAEC, HBEC, Calu-6 ja H841-solujen kanssa tai ilman alas-säätely miR-31. Knock-down of miR-31 lisää pohjapinta tasoilla DKK-1 ja DACT3 näissä soluissa. E) qRT-PCR-analyysi osoittaa, että knockdovvn miR-31 osittain estää CSC välittämää pienenee DKK-1 ja DACT3 in SAEC. F) Western blot-analyysi DKK-1 ja DACT3 ilmaisun vanhempien ja vektorisäädön SAEC ja Calu-6 solua, sekä SAEC ja Calu-6 solua, joilla konstitutiivinen ilmentyminen tai knock-down of miR-31. Densitometria arvot on normalisoitu b-aktiinin ohjaus. DKK-1 ja DACT3 taso oli laskenut, tai jonkin verran parannettu näissä soluissa yli-ilmentyminen tai knock-down Mir-31, vastaavasti.

Seuraavat kokeet tehtiin sen määrittämiseksi, ehtyminen endogeenisten miR-31 vaikutti ilmentymistä DKK-1 ja DACT3 viljellyissä hengitysteiden epiteelisoluissa. Kuten kuviossa 2C on esitetty, miR-31 ilmentyminen tasot alenivat ~7-10 kertaiseksi SAEc, HBEC, Calu-6, ja H841-soluja transfektoitiin väliaikaisesti antisense-miR-31 (Zip-miR-31) rakentaa suhteessa vektori valvontaa . Vähentäminen miR-31 ilmentyminen lisääntyi DKK-1 sekä DACT3 ilmentymistä näissä solulinjoissa (~1.47-8 taittaa ja ~4.7-9 kertaiseksi, kuvio 2D). Tämän jälkeen tehdyt tutkimukset paljastivat, että knockdovvn miR-31 vaimensi merkittävästi CSC välittämää pienenemistä DKK-1 ja DACT3 vuonna SAEC sekä H841-soluissa (kuvio 2E). Yhdenmukainen edellä mainittujen tulosten, western blot-analyysi osoitti, että DKK-1 ja DACT3 proteiinin tasot SAEC ja Calu-6-solut vähenivät yli-ilmentyminen miR-31 (kuvio 2F). Sen sijaan, knock-down endogeenisen miR-31 näytti lisäävän DKK-1 ja DACT3 proteiinin tasot SAEC ja Calu-6 solua, vaikka nämä muutokset eivät korreloineet tarkasti muutoksia mRNA ilmaisun, mahdollisesti osittain proteiineihin vakaus ja vasta taipumuksia. Yhdessä nämä kokeet erittäin suositeltavaa, että miR-31 moduloi DKK-1 ja DACT3 kautta post-transkriptionaalisen ja translationaalisen-estävä mekanismeja viljellyissä normaalin hengityksen epiteelin ja keuhkojen syöpäsoluja.

Super-paneelit käytettiin tutkimaan edelleen vaikutukset miR-31 Wnt signalointia SAEC ja Calu-6 solua. Tämä analyysi paljasti 7-14 taitettava-säätely DKK-1, sekä muita antagonisteina Wnt signalointia kuten SFRP1, SFRP4, ja WIF1, sekä 5-kertainen nousu CTNNB1, TCF7 ja Wnt-5a (saatavilla tietoa pyyntö). Myöhemmät qRT-PCR vahvistivat, tukahduttaminen SFRP1, SFRP4, ja WIF-1, ja ajan Wnt-5a SAEC ja Calu-6 solua yli-ilmentävät miR-31 (kuvio S1A). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-31 aktivoi Wnt signalointia viljellyissä keuhkosyöpää ja normaali hengitys epiteelisolujen.

DKK-1 ja DACT3 ovat suoria kohde ehdokkaita miR-31

lisäkokeita sitoutunut tarkastelemaan jos miR-31 suoraan vuorovaikutuksessa 3 ’UTR DKK-1 ja DACT3. Lyhyesti, RNA cross-link immunosaostuksella (CLIP) tekniikoita käytettiin havaitsemaan vuorovaikutusta miR-31 kanssa nämä mahdolliset tavoitteet SAEC soluissa [28]. Kuvio 3A esittää mahdollisia miR-31 sitoutumiskohtien 3 ’UTR: t DKK-1 ja DACT3 transkriptit. RT-PCR-analyysi paljasti, että AGO perhe-vasta-aine saostui DKK-1 ja DACT3 transkriptien sytoplasmassa käsittelemättömien SAEc (kuvio 3B). Selvää, kasvaa vastaavien PCR-tuotteiden 3’-UTR DKK-1 ja DACT3 havaittiin SAEc yli-ilmentävät miR-31; tätä ilmiötä ei havaittu miR-31-köyhdytettyä SAEC soluissa. Näissä kokeissa, β-aktiini toimi negatiivisena kontrollina, koska mitään sekvenssejä voidaan kohdistaa miR-31 (kuvio 3B). Koska miR-21 on havaittu suoraan kohdistaa 3 ’UTR: PDCD4 ihmiskudosten [34], immunosaostettiin RNA SAEc solut yli-ilmentävät miR-21 toimi positiivisena kontrollina CLIP (tuloksia ei ole esitetty). Yhdenmukainen edellä mainittujen Wnt SuperArray tuloksia, ylimääräisiä CLIP kokeet osoittivat vuorovaikutusta miR-31 kanssa SFRP4 (kuva S1B).

A) Oletetut kohdesivustot Mir-31 sisällä DKK-1 3 ’UTR (ylhäällä) ja DACT3 3 ’UTR (alhaalla). B) miRNA kohdistetut transkriptien RISC saostettiin AGO perheen vasta sen jälkeen, kun UV aiheuttama silloittuminen RNA: iden niiden sitovia proteiineja, jonka jälkeen RT-PCR-monistus. Yli-ilmentyminen miR-31 lisäsi merkittävästi saostumisen DKK-1 ja DACT3 tavoite transkriptien SAEC soluissa. β-aktiini toimi negatiivisena kontrollina, koska ei sekvenssit 3 ’UTR, joka voidaan kohdistaa miR-31. C) Luciferase määritykset osoittavat vähenemistä lusiferaasiaktiivisuuden SAEc transfektoitu pMiR-Report vektorien kanssa tai ilman lisäys 3 ’UTR tai mutatoituja 3’ UTR: WNT signaloinnin antagonisteja.

Muita kokeita suoritettiin käyttäen pMiR- raportti vektorien paino- tai mutantti 3 ’UTR DKK-1 tai DACT3, ohimenevästi kotransfektoitiin miR-31 ensisijainen rakentaa tai kontrollivektoreihin osaksi SAEC. Kuten kuviossa 3C on esitetty, lusiferaasiaktiivisuudet paino- 3 ’UTR: t DKK-1 ja DACT3 alennettiin -70% verrattuna vektorisäätö tai mutatoituja 3’ UTR: t, vastaavasti. Yhdessä nämä kokeet viittaavat vahvasti siihen, että miR-31 suoraan vuorovaikutuksessa 3 ’UTR DKK-1 ja DACT3.

Epigeneettiset muutoksia samanaikaisesti kun CSC aktivaatio miR-31

Viimeaikaiset ChIP analyysi of leviämismallit H3K4Me3, H3K9 /14Ac ja H2AZ ehdotti, että isäntä geeni miR-31 on LOC554202 [35]. Sinänsä lisäkokeita suoritettiin tutkia, jos CSC moduloitu ilmentymisen LOC554202 in SAEc. Yhdenmukainen tulosten kanssa, jotka liittyvät miR-31 (kuvio 1A), 5 päivän CSC hoidon indusoima LOC554202, joka pidettiin 20 päivää poistamisen jälkeen CSC soluviljelymediumeista (kuvio 4A); nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​liittyvät CSC välittämää säätely ylöspäin miR-31 (kuvio 1). qRT-PCR kokeet osoittivat, että 6 7 ensisijaisen keuhkosyövän yksilöt ilmentävät ≥2 kertainen miR-31 tasoa suhteessa pariksi normaalin keuhkojen kudoksiin oli myös yli-ilmentyminen LOC554202 (kuvio 4B).

A) RT- PCR-analyysi osoittamalla säätely ylöspäin LOC554202 ilmentymisen SAEC seuraavan 5 päivän CSC altistumista. Yhdenmukainen tietoon säätely ylöspäin miR-31 CSC, ilmaus LOC554202 kesti 20 päivää lopettamisen CSC altistumista. B) qRT-PCR-analyysi osoittavat ilmentymisen tasoja LOC554202 perusterveydenhuollossa keuhkosyövässä suhteessa viereisiin normaaliin keuhkojen kudoksia. C) Kaaviokuva LOC554202, oletetun isäntä geenin miR-31. A, B, C, ja D, edustavat kannat pariksi käytetyt alukkeet ChIP analyysiä. D) pelimerkin analyysi kuvaa H3K4Me3 ja H3K9 /14 asetylointi tasot neljän alueilla LOC554202 promoottorin (~ 1 kb, 2 kb, 3 kb, ja 5 kb päässä TSS) in SAEC viljellyissä tai ilman CSC. Lisääntynyt aktivointi tavaramerkit havaittiin proksimaalisen promoottorin jälkeen alueen CSC altistuksen.

sekvenssianalyysi paljasti ei klassista CpG saari promoottorialueen LOC554202, mikä viittaa siihen, että tämä isäntä geeni ei säännellä ensisijaisesti kautta DNA: n metylaatio mekanismien (tuloksia ei ole esitetty). Myöhemmät ChIP kokeet osoittivat kohonneeseen H3K4Me3 ja H3K9 /14Ac aktivointi merkkien proksimaalisen promoottorialue (0–1,5 k) on LOC554202 (joka oletettavasti sisältää säätelyelementtejä miR-31) in SAEC seuraavissa CSC altistuksen (kuviot 4C ja D ). Mielenkiintoista, nämä aktivointi merkkien LOC554202 promoottorialueen SAEC olivat edelleen läsnä 20 päivää lopettamisen CSC hoidon. Nämä löydökset olivat yhdenmukaisia ​​RT-PCR-tuloksiin kuviossa 4A.

rooli C /EBP-β CSC aktivaatio miR-31

Muita kokeita suoritettiin edelleen tutkia mekanismeja jolla CSC välittää aktivoinnin LOC554202. Alustava ohjelmisto analyysi paljasti ominainen XRE sekvenssit 5 kb oletetun transkription aloituskohdasta (TSS) varten LOC554202, mikä viittaa siihen, että säätely ylöspäin LOC554202 CSC ei välittyy pääasiallisesti kautta aryylihiilivetyreseptori signalointi [36]. Kuitenkin, kuten on esitetty kuviossa 5A, tämä analyysi paljasti useita mahdollisia sitoutumiskohtia C /EBP-β, joka on aiemmin osoitettu välittävän up-regulation of Bcl-x L rintasyöpäsoluissa altistettiin tupakansavulle [37]. Sinänsä ylimääräisiä kokeita suoritettiin selvittämään, onko tämä transkriptiotekijän osaltaan CSC-aktivaatioon miR-31 viljellyissä hengitysteiden epiteeli.