Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Nopeasti kasvava ala kohdennetun tuumoriterapian usein käytetään vasta-ainetta, joskus koodattu kasvain -ablating materiaalia kuten radioisotooppi kohdistuu tietty molekyyli.

Menetelmät /Principal havainnot

Tässä raportissa kuvataan löytö yhdeksän uusia dekapeptidejä jotka voidaan leimata radioaktiivisesti, sitoutuvat, ja toimittaa

32P paksusuolen syöpäsoluja. Dekapeptidien vaihtelevat toisistaan ​​yhdestä kolmeen aminohappoja ja osoittaa hyvin erilaisia ​​sitovia kykyjä. Kaikkein innokkaasti sitova dekapeptidi voi pysyvästi tuottaa erittäin korkeita radioisotooppien on adenokarsinooma syöpäsolulinjoissa tehokkuudella 35-150 kertaa suurempi kuin useita muita solutyyppejä, mukaan lukien solulinjat, jotka ovat peräisin muiden syöpien tai normaalista kudoksesta.

Johtopäätökset /merkitys

Tällä kokeellinen lähestymistapa on uusi esimerkki strategiasta, jota kutsutaan peptidi sitova terapiaa, että mahdollinen hoito paksusuolen ja muiden adenokarsinoomia.

Citation: Abraham JM, Sato F, Cheng Y, Paun B, Kan T, Olaru A, et al. (2007) Novel dekapeptidien sitovien innokkaasti ja Toimita Radioisotooppinen Colon Cancer Cells. PLoS ONE 2 (10): e964. doi: 10,1371 /journal.pone.0000964

Academic Editor: Mikhail Blagosklonny, Ordway Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 heinäkuu 2007; Hyväksytty: 12 syyskuu 2007; Julkaistu: 03 lokakuu 2007

Copyright © 2007 Abraham et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia 2RO1CA095323-14, 2RO1CA077057-09, 1R01CA001808-05 ja 7R21 /R33CA106763 National Cancer Institute.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

sairauden ja kuoleman takia peräsuolen ja ruokatorven syöpä muodostavat monumentaalinen terveydenhuollon haaste Yhdysvalloissa ja muualla maailmassa [1], [2]. Nykyiset hoidot ovat sädehoito, kirurgian ja kemoterapia. On olemassa useita immunoterapioiden hyväksytty käytettäväksi hoidettaessa erilaisia ​​syöpiä (

esim.

Herceptin, Rituxin, Avastin, ja muut) [3] – [6]. Kaikki nämä immunoterapioiden käyttää monoklonaalista vasta-ainetta vastaan ​​suunnattu tietyn solun molekyylin [7], [8]. Tuhoisa toimia kasvainsoluja vastaan ​​ajatellaan kuuluvan ADCC (vasta-aine-riippuvainen soluvälitteinen sytotoksisuus), solujen hajoaminen kautta komplementtireittiä, tai apoptoosin induktion [9], [10]. Avastin on monoklonaalinen vasta-aine kohdistuu VEGF (verisuonten endoteelin kasvutekijä) ja on hyväksytty hoitoon kolorektaalisyövän [11] – [13].

Lisäksi Non-Hodgkin-lymfooman (NHL) on jo hoidetaan kaksi hyväksyttyä radioimmunotherapeutic hoito: Bexxar ja Zevalin. Molemmat hyödyntävät monoklonaalinen vasta-aine suunnattu B-solujen markkeri CD20 ja voi toimittaa joko

131I (Bexxar) tai

90Y (Zevalin) isotooppeja kohdistaa lymfoomasoluilla [14], [15]. Beta-hiukkaset (elektronit) syntyy näiden isotooppien voivat syvästi tunkeutua soluihin ja vahinkoa DNA, mikä johtaa solun kuolemaan. Kuitenkin tällä hetkellä ole radioimmunotherapies hyväksytty hoitoon potilailla, joilla on peräsuolen syöpä.

dekapeptidien Tässä kuvatut sitoutuvat ja siirto isotooppi (

32P) ja solulinjoissa useista peräsuolen karsinoomat. Samoissa koeolosuhteissa, hyvin vähän (

so.,

Vähemmän kuin 1% koolonsyöpäsolulinjoissa ”hinnat) tehokkaimmat

32P-leimattua dekapeptidien sitoutuvat solulinjoja perustetaan eri muut syövät tai normaalin paksusuolen, munuaisten, tai ruokatorven soluja.

tulokset

Olemme tunnistaneet yhdeksän dekapeptidejä, jotka eroavat toisistaan ​​vain muutaman aminohapon, että kun merkitty

32P voi sitoutua useita kolorektaalikarsinoomasolulinjaa linjat. Kaikki dekapeptidien sisältävät proteiinikinaasi A: substraatti sekvenssi ja on nimetty MAs (Modified adjuvantti). Kuvio 1 on kaavamainen esitys tuotannon

32P-leimattua peptidejä ja kokeellisen suunnittelun määrityksiä sitoutumisen mittaamiseen peptidejä solulinjoissa.

bakteeri rekombinanttiekspressiolla tuottamassa erilaisia ​​gluthathione-S- transferaasi dekapeptidi fuusioproteiineja, jotka olivat sitoutuneet gluthatione ja merkitty

32P käyttäen proteiinikinaasi A pesun jälkeen leimatut dekapeptidien otettiin talteen sen jälkeen, kun trombiinidigestiolla ja inkuboitiin eri aikoina useita erilaisia ​​solulinjoja.

Kuva 2 näyttää määrä

32P laskee per minuutti (cpm) jäljelle jääneet sitoutuneet kahdeksaantoista eri solulinjojen ja nollakoekuoppien jälkeen kahden tunnin inkubaation MA5, tehokkain sitova dekapeptidi (katso alla). Caco-2 paksusuolen adenokarsinoomasolulinjan säilytti suurimman määrän radioaktiivista laskee jälkeen kahden tunnin inkubaation ja myöhemmät pesua täydellisessä elatusaineessa, keskiarvo kolmen kuopan equaling 298639 cpm per 10,000 solua. HCT116 paksusuolen adenokarsinoomasoluja säilytti keskiarvon 131998 cpm per 10,000 solua. Nollakoekuoppien ja nonbinding solulinjoissa oli keskiarvot alle 550 cpm; baareja edustavat arvoja ei ole näkyvissä mittakaavassa käytetty kuviossa 2. Esimerkiksi HeLa S3 kohdunkaulan syöpäsolut vain säilytti keskimäärin 534 cpm per 10000, HT1080 fibrosarkoomasoluissa säilytetään 367 cpm, ja ihmisen alkion munuaisen solulinjassa 293H säilytetään 429 cpm per 10000 soluja.

32P leimattu dekapeptidi MA5 inkuboitiin kaksi tuntia 10000 solut, pestiin kolme kertaa, ja radioaktiivinen laskee solujen määritetään tuikelaskennalla. Seitsemän solulinjat osoittivat innokas sitoutumisen MA5 ja esitetään pylväskaaviot keskiarvon ja keskihajonnan kolmesta kaivosta. Muut yksitoista solulinjat, sekä yksi tyhjä hyvin keskimäärin vain 365 cpm. Nämä arvot ovat niin pieniä, että ei olla näkyvissä mittakaavassa käytetään tässä kuvassa. Lisätietoja yksittäisistä solulinjat annetaan lisätietokohtaan.

Seitsemän kahdeksantoista solulinjojen osoitti erittäin vahva radioaktiivisuuden retentio kun inkuboidaan MA5 (Modified adjuvantti radioaktiivinen peptidi), jossa on viisi näistä on paksusuolen adenokarsinooma solulinjoja (Caco-2, HCT15, HCT116, LoVo, HT29), joista toinen on ruokatorven adenokarsinoomasolulinja (SEG1), ja yksi on Barrettin ruokatorvi solulinja (QHTRT). Sen sijaan, yksitoista nonbinding solulinjat olivat enimmäkseen squamous johdetut solulinjat karsinoomat kohdunkaula (HeLa S3), paksusuolen (RKO), keuhkojen (1271, A549), ruokatorven (KYSE-70), joka on fibrosacroma (HT1080) tai soluja viljellään normaalista munuainen (293H), paksusuoli (1459), tai ruokatorven (HEEpiC). Nonbinding solulinjat mukana T84, joka on johdettu paksusuolen adenokarsinooma metastaattinen keuhkosyöpä, ja SK-BR-3, joka on eristetty rintojen adenokarsinooma. Suhde cpm säilytettävä Caco-2 (298639) keskimääräiseen yhdentoista nonbinding solulinjoja (365) oli 818:1. Caco-2-solut säilytetään noin 18% kaikista radioaktiivisen laskee läsnä inkubaation hyvin kahden tunnin inkuboinnin jälkeen.

yhdeksän MA variantit analysoitiin sitoutuminen Caco-2-soluihin kahden tunnin inkuboinnin jälkeen. Suhteellisen sitoutumisen tason ja aminohappokoostumus kunkin MA variantin näkyy kuviossa 3A. Muuttaminen ainoa kolmen aminohapon sisällä peptidi johti säilyttäminen eroja suurempi kuin 70-kertainen,

esim

variantti MA2

vs.

Variantti MA5.

(A) Yhdeksän

32P-leimattu eri dekapeptidejä, jotka vaihtelevat toisistaan ​​ainoa kolme aminohappoa, inkuboitiin Caco-2-soluja kaksi tuntia, solut pestiin kolme kertaa, ja lukemia jäljelle jääneet sitoutuneet soluihin ovat on esitetty prosentteina kokonaismäärästä laskee kunkin dekapeptidi käyttää. Aminohapposubstituutiot kunkin variantin (suhteessa MA1) on alleviivattu ja lihavoitu. (B) variantit, MA1, MA4, ja MA5 inkuboitiin Caco-2-solujen väliajoin vaihtelevat viidestä minuutista kahteen tuntiin, pestään, kiinnittyneet solut liuotetaan geelilatauspuskuria ja näytteestä ajettiin 10% -20% kaltevuus polyakryyliamidi-SDS-geelillä. Kolme kaistaa on merkitty ”24” (kaistat 5, 10, ja 15) inkuboitiin kunkin leimatun dekapeptidien (MA1, MA4, MA5) kaksi tuntia, pestiin, ja soluja inkuboitiin täydellisessä elatusaineessa 24 tuntia. Soluja käsiteltiin kuten on kuvattu muiden kaistat tämä luku.

tutkimaan, kuinka nopeasti

32P isotooppi voidaan siirtää peptidivariantteja ja osaksi solun proteiinien, kolme kaikkein ahnaasti sitova MA (katso kuvio 3A) lisättiin jäljitellä kuoppiin, jotka sisältävät Caco-2-soluihin, sitten pestään pois vaihtelevin aikavälein, ja solut ja supernatantti analysoitiin. Kuten kuviossa 3B on esitetty, merkittävä prosenttiosuus näistä

32P-leimattu muunnos dekapeptidien sitoutuu solujen vain muutaman minuutin, ja suuria määriä radioaktiivisesti solun proteiinien esiintyvät kaksi tuntia sen jälkeen, kun altistamalla solut leimattu peptidejä. Erityisesti rinnakkainen kokeesta, jossa olosuhteet on kuvattu kuviossa 3 monistettiin, mutta pestään soluja inkuboitiin

yön yli

täydellisessä alustassa (tuloksia ei ole esitetty), ilmeni edelleen samalla tasolla

32P-dekapeptidi release ja säilyttäminen kaikkien yhdeksän suurkaupunkialueet kuvatulla MA5 kuvassa 2.

peptidi sitova, pesu- ja määritys koe on kuvattu kuvassa 2 toistettiin sitten vuonna seitsemän eniten ahnaasti sitovia solulinjoja käyttämällä MA5, paitsi että kolmen pesun keskipitkän, 200 ui täydellistä väliainetta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja soluja inkuboitiin

yön

37 ° C: ssa. Kuvio 4A esittää cpm säilyttää solujen tai vapautuu väliaineeseen tämän jälkeen yön yli inkuboinnin jälkeen. Noin 88% MA5 radioaktiivisen laskee aluksi säilytettävä koolonsyöpäsolulinjaa vapautui keskipitkällä, kun taas noin 12% alun perin säilytetty radioaktiivisen lukemat jäivät soluja. Kaksi ruokatorven solulinjoja, jotka alun perin säilyttää suuria määriä radioaktiivisia laskee, QH-TRT ja SEG1, säilytti 39% ja 37% alkuperäisestä laskee, vastaavasti, sen jälkeen kun oli inkuboitu yön yli. Caco-2-soluja säilytti suurimman määrän laskee keskimäärin 58305 cpm triplikaattikaivoissa sisältävä 10,000 solua kutakin. Tämä luku vastaa noin 5,8 cpm, tai 348 määrä tunnissa, per solu (

eli

Ekstrapoloituina yli potentiaalinen 2 viikon altistuksen aikana, mikä vastaa yli 87000 määrä solua kohti).

(EN)

32P-leimattua dekapeptidi MA5 inkuboitiin kaksi tuntia seitsemän eri solulinjojen, solut pestiin, ja täydellistä alustaa lisättiin. Jälkeen 24 tunnin inkubaation, määrä laskee per minuutti vapautuu elatusaineeseen (R), sekä useita laskee jäljellä sitoutunut soluihin (B) määritettiin. Kukin pylväs esittää keskiarvoa ja yksi keskihajonta kolmen rinnakkaisen kaivoja. (B) ajan funktiona vapauttamista ja säilyttämistä

32P-leimattua dekapeptidi MA5. MA5 inkuboitiin kaksi tuntia Caco-2-solut, solut pestiin, ja cpm vapautetaan (katkoviiva) sekä jäljelle jääneet sitoutuneet (yhtenäinen viiva) soluihin määritettiin aikavälein jälkeiseen pesuun. Kukin piste esittää keskiarvoa plus /miinus yksi standardipoikkeama kolminkertaisten määritysten. C) Radioaktiivinen hyvin sisältö kuvattu sidottu (yhtenäinen viiva) kuviossa 4B ajettiin 16,5% polyakryyliamidi-SDS-geelille ja valotettiin filmille. Heti pesun jälkeen (

so.

0 tuntia), suurin osa lasketaan visualisoitiin kuin

32P-peptidi. Seuraavan 48 tunnin peptidi lukemia suuresti vähentynyt, jossa suurin osa sitoutuneen radioaktiivisuuden sisällytetty solun proteiinien. (D): n eriä sisältävä väliaine vapautetaan (katkoviiva)

32P-peptidi MA5 määritettiin aikavälein pesun jälkeen, kuten on kuvattu kuviossa 4B. Ajan myötä, enemmän

32P-peptidi vapautettiin saavuttaen tasanteen 24 tunnin pesun jälkeen.

Kuviossa 4B ajankul- vapauttamista MA5 peräisin Caco-2 adenokarsinoomasolulinja yli 48 tunnin ajan. Suurin osa koko laskee julkaissut yli 48 tunnin aikajakson vapautuu yhdeksän tunnin inkubaation. Luvut 4C ja 4D koostuvat kahdesta autoradiogrammien esittäen sijainteja radioaktiivisen molekyylien on kuvattu kuviossa 4B on polyakryyliamidi-SDS-geeleihin. Koot solun radioaktiivisten, soluissa on esitetty kuviossa 4C;

32P-leimattua MA5 vapautuu väliaine on esitetty kuviossa 4D. On ilmeistä sopimus jakelusta ja yleistä radioaktiivisuuden verrattaessa kuviossa 4B ja Kuviot 4C ja 4D. Heti kun kaksi tuntia käyttöönoton jälkeen radioaktiivisen peptidin, huomattava osa isotoopin näyttää siirretty suurempi molekyylipaino proteiineja.

Keskustelu

Tässä raportissa kuvataan löytö dekapeptidien jotka voidaan leimata paljon energiaa (1,7 Mev) beeta-säteilijä (

32P) ja voivat sitoutua ahnaasti useisiin eri adenokarsinooma solulinjat tehokkaasti tuottamaan näitä mahdollisuuksia kasvaimeen ablatoimiseksi materiaalin soluihin. Dekapeptidejä, kutsutaan MA Modified adjuvantti, ovat proteiinikinaasi alustoille. Aikaisemmin ei ole koskaan osoitettu tai epäillään olevan Tämän alustan, kun leimattu kasvaimeen ablatoimiseksi materiaalista, kuten

32P, voivat sitoutua ja siirtää radioisotooppi solulinjaan jälkeen yhdestä kahteen tuntia inkubaation jälkeen. Lisäksi olemme osoittaneet ensimmäistä kertaa, että siirto isotoopin näistä dekapeptidien rajoittuu solutyyppejä johdetut paksusuolen ja ruokatorven adenokarsinoomien. Esimerkiksi altistuminen tietyille koolonsyöpäsolulinjaa

(esim

. Caco-2) kaikkein innokkaasti sitova leimatun peptidin, MA5, kahden tunnin ajan johti siirtoon radioaktiivisen annoksen yli 29 cpm per solu jälkeen kahden tunnin inkuboinnin, pese, ja välitön määritys säilytetään radioaktiivisuudesta.

inkubointi

32P-leimattu dekapeptidi tiettyjen solulinjojen johti suuria määriä peptidin säilytetään jälkeen kahden tunnin inkuboinnin, mutta merkittävä osa tämän sitoutuneen peptidin julkaistiin yön yli inkuboinnin jälkeen. Esimerkiksi inkuboinnin jälkeen leimatun variantin MA5 kanssa Caco2-soluissa kaksi tuntia, kolme Pesuvaiheiden, ja inkuboimalla yön yli väliaineessa, 88%: n alun perin säilyttää

32P-isotoopilla julkaistiin. Kuitenkin 12%, joka oli säilytettävä solut oli yhä 5,8 cpm solua kohti, ekstrapoloimalla yli 8300 iskuina solua per päivä. Lisäksi radioaktiivisuus, joka oli vielä säilyttää soluissa, sen jälkeen yli yön väliaine inkuboitiin sisällytetään pysyvästi eri solun proteiinien, kuten on osoitettu polyakryyliamidigeelielektroforeesilla altistuksen jälkeen solulysaateista

Niistä 18 solulinjojen määrittää niiden kyvyn sitoa dekapeptidien, seitsemän osoittautuneet äärimmäisen säilyttäminen isotooppia kahden tunnin inkubaation. Vaikka kaikki näistä seitsemän riviä vapautuu 63%: sta 88% tästä radioaktiivisuudesta jälkeen yli yön inkubaation määrä isotooppia, joka oli säilytetty yön yli oli vielä huomattava. Näistä seitsemästä solulinjoista, viisi olivat peräisin peräsuolen adenokarsinoomat, yksi ruokatorven adenokarsinooma, ja yksi päässä Barrettin metaplasiaa yksilö. 11 solulinjat, jotka eivät sido radioaktiivisesti leimatun dekapeptidin MA5 olivat peräisin eri kudoksista peräisin. Näitä olivat levyepiteelikarsinoomien kohdunkaula, keuhko-, rinta-, ja fibrosarkooma, sekä normaali munuainen, paksusuoli, ja ruokatorven kudoksia.

Suurin hyväksyttyjen immunoterapeuttisen hoito syöpään liittyy vasta-aine on suunnattu tiettyyn cellular molekyyli [16]. Nämä aineet voivat toimia sitoutumalla solun pinnan ja voi käyttää ADCC, komplementin aktivaation, tai solujen apoptoosin. Vasta-aineita voidaan myös kytkeä kasvaimeen ablatoimiseksi ainetta, kuten toksiinien tai radioisotooppien [17] – [21]. Lisäys isotoopin peptideihin, ja niiden käyttö sekä diagnostisia ja terapeuttisia tarkoituksia varten, on aktiivinen alue biolääketieteellisen tutkimuksen [22] – [25]. Työmme käytetään proteiinikinaasi A: alustoille merkitty

32P isotooppia. Korkean energian beeta-lähettävä radioisotooppi johtaa elektronin väyläpituutta kantomatka on jopa 5 mm, joka mahdollistaa merkittävän tunkeutumisen kiinteiden kasvainten. Koska ennustettu ”sivullinen” vaikutus, yksi beta-hiukkasen tunkeutuu satojen tai tuhansien solujen kasvain, vaikka ne eivät ole suoraan sitovia dekapeptidin. Lisäksi koska molekyylipainot näiden minuscule dekapeptidien proteiinit ovat paljon alhaisemmat kuin poissulkevaa molekyyli- painorajan suodatuksen munuaiset, näitä peptidejä olisi nopeasti erittyy virtsaan, mikä vähentää systeemistä toksisuutta. Näin ollen pitäisi olla mahdollista sekä radioaktiivisen annoksen ja sitoutumattoman radioaktiivisuuden, joka on poistettava helposti ja suhteellisen lyhyessä ajassa. Oletamme, että muita tunnettuja entsyymin substraatteja voidaan lopulta tunnistaa mahdolliset ajoneuvojen toimitusajat kasvainten vastaisten aineiden syöpäsoluja ja että mahdolliset syöpää terapeuttisia hoito-ohjelmia, jotka käyttävät tämän peptidin tai muita vastaavia aineita, voi olla uusin strategia peptidin sitoutumisen terapiassa.

Materiaalit ja menetelmät

Tuotanto

32P-leimattua dekapeptidien: eri DNA oligomeerit kloonattiin pGEX-4T-1 (GE Healthcare), joka saadaan eri dekapeptidien jälkeen trombiinikatkaisun nimetty MA1 kautta MA9 (Modified adjuvantti). Proteiinin sekvenssit ovat: MA1, GSRRASVGSA; MA2, GSRGASVGGA; MA3, GSRRGSVGSA; MA4, GSRRGSVASA; MA5, GSRRASVASA; MA6, GSRRASVGSG; MA7, GSRGGSVGSA; MA8, GSRGGSVASA; MA9, GSRGGSVGSG. DH5-α bakteerit, jotka sisältävät näitä klooneja kasvatettiin yön yli LB-(joka sisälsi 100 ug /ml ampisilliinia), laimennettuna 1/10 LB-Amp ja kasvatettiin 37 ° C: ssa kahden tunnin ajan. IPTG: tä lisättiin 1 mM ja viljelmää kasvatettiin 37 ° C: ssa viisi tuntia. Kymmenen ml kutakin viljelmää sentrifugoitiin, ja solupelletti suspendoitiin uudelleen 1 X TBS, joka sisälsi 100 ug /ml lysotsyymiä. Kahden syklin jäädytys-sulatus-lysaatti sentrifugoitiin ja supernatanttia sekoitettiin 100 ui Sepharose-Glutathione kaksi tuntia huoneenlämpötilassa. Kukin pelletti pestiin kolme kertaa 1 X TBS, ja sitoutunutta yhdistelmä-fuusioproteiinien leimattiin

32P käyttäen proteiinikinaasi A: n ja

32P-γ-ATP mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Sigma, St. Louis, Mo .). Pelletti pestiin neljä kertaa 1 X PBS: llä, ja leimattu dekapeptidin pilkottiin ja supernatanttiin vapautuneen trombiinin kanssa (GE Healthcare).

määritys sitoutumisen

32P-leimattua dekapeptidien ja solulinjat: solulinjoja kasvatettiin täydellisessä alustassa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (lämmöllä inaktivoitu). Kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaisella levyllä, 10000 soluja eri solulinjoja kasvatettiin yön yli täydelliseen alustaan. Kymmenen ui leimatun peptidin 1 X PBS: ssä ja 90 ui täydellistä alustaa lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 37 ° C: ssa eri aikoina enintään kaksi tuntia. Peptidi-väliaine poistettiin ja yksi ui lisättiin 100 ul geelilatauspuskuria ja laskettiin nestetuikelaskennalla koettimen valvontaa tai ajetaan polyakryyliamidi-SDS-geelissä (Biorad) kantavassa kiinnittyneet solut olivat lyhyesti ja kevyesti pestiin täydellistä elatusainetta kolme kertaa ja jotkut kaivot analysoitiin välittömästi lisäämällä 100 ui geelilatauspuskuria kuhunkin kuoppaan ja ajettiin geelillä tai lasketaan tuikelaskimessa. Muut kuopat oli 100 ui täydellistä alustaa lisättiin ja inkuboitiin vielä ajan. Näytteet joko laskettiin nestetuikelaskurilla tai ajaa polyakryyliamidi-SDS-geeleissä, altistettiin röntgenfilmille, ja filmi kehitetään.

Kiitokset

Kiitämme tohtori Yutaka Shimada (Hyogo College of Medicine, Japani) lahjasta solulinjan KYSE-70.