Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vaikka lääkärit voivat ennustaa, mitkä potilaat ovat vaarassa kehittää etäpesäkkeitä, perinteiset hoitomuodot usein osoittautuvat tehottomiksi ja etäpesäkkeitä on ensisijainen syy syövän potilaan kuoleman Näin ollen on olemassa tarve kehittää anti-metastaattinen hoitoja, joita voidaan antaa pitkiä aikoja estämään spesifisesti motiliteettia syöpäsoluja.

Withania

somnifera

root uutteet (WRE) on anti-proliferatiivista aktiivisuutta, ja aktiivinen komponentti, Withaferin A, estää pro-metastaattinen proteiinin, vimentiinistä. Vimentiinista on välissä hehkulamppuja proteiinia ja on osa epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) edistämiseksi etäpesäkkeitä. Täällä me määrittää, onko WRE standardoidun Withaferin A (sWRE) jolla on anti-metastaattisen aktiivisuuden ja onko se estää syövän peristaltiikan estoa vimentiinista ja EMT ohjelmaa. Useita formulaatioita sWRE luotiin rikastamiseksi Withaferin A kantaliuosta sWRE EtOH voisi elpyä yli 90% Withaferin löydetyn alkuperäisessä uute jauhe. Tämä sWRE muotoilu esti rintasyöpä soluliikkuvuus ja invaasiota pitoisuuksina alle 1 uM, kun ottaa merkityksetön sytotoksisuutta tällä annoksella. sWRE käsittely häiriintyy vimentiinista morfologian solulinjoissa, vahvisti vimentiinistä estävää vaikutusta. Sen määrittämiseksi, sWRE estyy EMT, TGF-β synnyttämiseen käytettiin EMT vuonna MCF10A ihmisen rintarauhasen epiteelisolujen. Tällöin sWRE esti EMT induktio ja esti 3-D pallomainen hyökkäystä. Nämä tutkimukset otettiin ihmisen ksenograftin ja hiiren nisäkarsinooman malli. Molemmissa malleissa sWRE ja Withaferin osoitti annoksesta riippuvaa kasvaimen kasvun inhibition ja metastaattisen keuhkosyövän kyhmy muodostumista minimaalisella systeemistä toksisuutta. Yhdessä nämä tiedot tukevat hypoteesia, että pieniä pitoisuuksia sWRE estää syövän etäpesäkkeiden mahdollisesti kautta EMT eston. Lisäksi nämä annokset sWRE on lähes mitään toksisuutta normaaleissa hiiren elimissä, mikä viittaa mahdolliseen kliiniseen käyttöön suun kautta annettavan WRE-kapseleita.

Citation: Yang Z, Garcia A, Xu S, Powell DR, Vertino PM, Singh S, et ai. (2013)

Withania

somnifera

juuriuutetta Estää rintasyöpä etäpesäke ja epiteelikasvaimet sen mesenkymaalitransitioon. PLoS ONE 8 (9): e75069. doi: 10,1371 /journal.pone.0075069

Editor: Michael Klymkowsky, University of Colorado, Boulder, Yhdysvallat

vastaanotettu: 1 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 9. elokuuta 2013. Julkaistu: 12 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat jota R21 National Center for täydentävä ja vaihtoehtoinen lääketiede (1R21AT005231) myönnetään tarkoitusta varten Godfrey Charitable Trust, ja Golffarin syöpää vastaan. Tätä työtä tukee myös P30 CCSG myönnetty Winship Cancer Institute (3P30CA138292). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Rintasyöpä on yksi yleisimmistä syövistä naisilla Yhdysvalloissa ja toiseksi suurin syy naisten syöpäkuolemien [1]. Suurempi kuin 90% rintasyöpään potilaiden kuolemat ovat johtuvan etäpesäkkeitä jossa ensisijainen kasvain on vallannut kaukaisiin kohtiin. Koska nämä metastaattinen solut ovat usein erittäin aggressiivisia, vaikea havaita, ja solunsalpaajaresistentti [2], yksi terapeuttinen strategia voisi olla estää etäpesäkkeitä sijaan hoitaa sitä, kun se tapahtuu.

metastaattinen prosessi voidaan jakaa kolmeen stages- kasvainsolun invaasiota osaksi ympäröivää kudosta, intravasation vereen tai imusuonten ja ekstravasaatio uuteen vastaanottavaan ympäristöön [3-5]. Monissa tapauksissa metastaattisen solut läpikäyvät epiteelisolujen-to-mesenkymaalitransitioon (EMT), jos geneettinen ja epigeneettiset tapahtumat aiheuttavat polarisoitunut epiteelisolujen tulla muuttavien ja invasiivisia [6]. Molekyylitasolla, EMT aiheuttaa voitto vimentiinista ja fibronektiinin ilmaisun, ja menetys E-kadheriinin at solukalvon [7,8]. Kertyvät todisteet osoittavat, että EMT on tärkeä mekanismi ajo rintasyövän etenemisen ja etäpesäkkeiden [9-13].

Withania

somnifera

(Ashwagandha) kasveja käytetään laajalti Itä Indian lääketiede. W. somnifera juuriuutetta (WRE) koostuu 14 yhdisteitä tunnetaan withanolides, jossa Withaferin A: n ollessa näkyvin [14-16]. Withaferin A on steroideihin laktoni, joka indusoi apoptoosia ja estää kasvaimen kasvua kohdistamalla signalointi proteiineja, kuten P53, FOXO3A, Notch-1, Hsp90 ja STAT3 [17-22]. Withaferin Hoito johtaa solusyklin pysähtymiseen, lisääntynyt reaktiivinen oksidatiivisen stressin [23-26], estämällä JAK /STAT-reitin [27], angiogeneesin estäminen [28], ja modifioitu solu muoto ja toiminta [29]. Withaferin myös hallussaan voimakas anti-invasiivisen toiminnan, jotka saattavat johtua sen vuorovaikutusta pro-muuttavien proteiinin vimentiinista.

vimentiinista on tyyppi III väli hehkulamppuja ja klassisen EMT proteiinimarkkeri [30]. Vaikka vimentiinista toiminnot ylläpitämisessä solurakenne, se on myös erittäin dynaaminen polymeeri, joka kokoaa ja dissembles on liikkuvia solussa. Kun solut läpikäyvät EMT, vimentiinistä ilmentyminen lisääntyy ja tämä on ajateltu antavan käyttöön solut enemmän mesenkymaalisten, pro-liikkuva fenotyyppi [31]. Tarkka rooli vimentiinista aikana EMT ja kehitys on epäselvä, koska vimentiinistä hiiri tyrmäys malli ei osoittanut vakavia kehityshäiriöitä vikoja [32]. Lisätutkimukset kuitenkin meni päälle osoittamaan, että nämä hiiret olivat alentunut fibroblasti haavan paranemista, ja alennettua tehdä sopimuksia kollageenin verkosto [33].

Withaferin A ehdotetaan sitoutuvan vimentiinista kautta kovalenttinen muokkaus kysteiinin 328 [34], mikä johtaa muutoksiin vimentiinista morfologiassa ja fosforylaatio [29]; kuitenkin muut tiedot osoittavat, että mutaatio kysteiinin 328 ei vaikuta Withaferin A-aiheuttama vimentiinista esto [29]. Kun annetaan vatsakalvonsisäisesti (IP), Withaferin tehokkaasti estää rintasyövän etäpesäke ja on lähes mitään havaittavaa myrkyllisyyttä [35].

Vähemmän tiedetään antituumorivaikutuksen on Withaferin Sukulainen juuriuutetta, WRE . Samanlaisia ​​vaikutuksia havaitaan kasvaimen kasvuun, solusyklin ja angiogeneesin WRE hoitoa [36-40] yhdessä immunomodulaarisia vaikutuksia paksusuolen ja keuhkosyövän [41,42]. Kuitenkin suoraan vertaamalla WRE kohteeseen Withaferin ei ole tehty, ja sen anti-metastaattinen aktiivisuus ei ole hyvin tutkittu. Lisäksi WRE hallussaan useita etuja verrattuna Withaferin A, koska sitä voidaan antaa suun kautta kapselin, ja aktiivinen withanolides voisi olla farmakologisia synergiaa; Siksi halusimme selvittää antimetastaattisia tehoa WRE standardoitu (sWRE) puhtaan aktiivisen komponentin, Withaferin A, rintasyövän. Olemme osoittaneet, että sWRE voi estää ihmisen rintasyöpäsolujen invaasiota

in vitro

ja etäpesäkkeiden sekä allograftin ja ksenograftin rintasyöpä hiiri malleja, samalla tavoin kuin puhdas pieni molekyyli Withaferin A. sWRE indusoi vimentiinista uudelleenjärjestely ja morfologisia solumuutoksia ihmisen rintasyöpäsoluissa ja mikä tärkeintä, estää EMT induktio normaaleissa ihmisen maitorauhasen epiteelisolujen. Tuloksemme valottavat potentiaalia sWRE uutena täydentävä vaihtoehtoisen lääketieteen käytetään antimetastaattisia ennaltaehkäisevää hoitoa suuren riskin rintasyöpäpotilailla.

Methods

reagenssit ja vasta

WFA ostettiin Chromadex (Irvine, CA) ja WRE saatiin Verdure Sciences (Noblesville, IN) todistuksen analyysin siitä, että se on vapaa raskasmetalleja, bakteerit, ja sientä. Vasta-aine vimentiinista ostettiin Sigma (St. Louis, MO), E-kadheriinin BD Biosciences (Bedford, MA), fibronektiinin Abcam (Cambridge, MA), ja GAPDH peräisin Cell Signaling (Beverly, MA).

sWRE valmisteen

100%: ista etanolia, kuumennettiin 60 ° C: seen ja sekoitetaan sitten WRE pitoisuuteen 250 mg /ml 30 minuutin dekantterilasiin. Tislattua H

2O lisättiin sitten hitaasti alentaa etanolipitoisuus 90%, ja sekoittamista jatkettiin vielä 30 minuuttia. Seosta sentrifugoitiin sitten 4000 rpm sentrifugissa 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja supernatantti otettiin talteen. Supernatantti vietiin sitten 0,22 pm suodattimen, jaettiin eriin ja pidettiin -80 ° C: ssa myöhempää käyttöä varten.

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

Ihmisen MDA-MB-231 (ATCC # HTB -26), MCF-7 (# HTB-22) ja T47D (# HTB-133) rintasyövän solulinjat hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Hs578-T, HCC1806 ja MDA-MB-468 ihmisen rintasyövän solulinjat saatiin Dr. O, Regan (Emory University [45]). Ihmisen MCF10A rintaepiteelisolulinja-solulinja saatiin Dr. Vertino (Emory University [45]). Hiiren rintasyöpä 4T1-solut saatiin Dr. Dewhirst (Duke University [35,45]). T47D ja HCC1806 kasvatettiin RPMI 1640: ssä, jossa oli 10% FBS: ää. MDA-MB-231, MCF-7, Hs578-T, MDA-MB-468 ja 4T1 kasvatettiin DMEM 10% FBS: ää. MCF10A soluja kasvatettiin DMEM /F12, johon oli lisätty 5% FBS: ää, 20 ng /ml EGF: ää, 0,5 ug /ml hydrokortisonia, 100 ng /ml koleratoksiinia, ja 10 ug /ml insuliinia. Kaikkia solulinjoja pidettiin kosteutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa 5% CO

2 ilmakehässä.

Sytotoksisuusmääritvs

Promega CellTiter 96

® vesipitoinen Non-Radioactive soluproleferaatiomäärityksessä (MTS) suoritettiin määrittämiseksi

in vitro

sytotoksisuuden sWRE. Lyhyesti, soluja viljeltiin 96-kuoppalevyillä yön yli ja sitten sitä käsiteltiin sWRE on osoitettu pitoisuus 72 tunnin ajan. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin määrittämällä absorbanssi 490 nm: ssä, kuten valmistaja on kuvannut (Promega, Madison, WI). Solujen elinkelpoisuus ilmaistiin A

exp ryhmä /A

ohjaus x 100.

In vitro haavan paranemista määritys

solujen vaeltamiseen haavoittaen määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [43 ]. Soluja viljeltiin 6 kuoppiin levyä 100% konfluenssiin. Haavoittamisen jälkeen, jossa pipetin kärki, solut pestiin PBS: llä ja uusi media vastaavien pitoisuus sWRE lisättiin. Sitten solut annettiin kulkeutua 24 tuntia 37 ° C: ssa. Kuvia solut otettiin ajankohtana 0 ja 24 tuntia Olympus IX51 Widefield mikroskooppi (Center Valley, PA) 5x suurennus Hamamatsu Orca ER CCD-kamera.

Matrigel invaasiomääritys

Cell invaasio määritettiin käyttäen Roche xCelligence RTCA DP (Real-Time Cell Analyzer Dual Plate) Instrument (Indianapolis, IN). DMEM, jossa 10% FBS: ää lisättiin pohjaan kammion CIM-Plate 16. 250 pg /ml matrigeeliin (BD Biosciences) polymeroitiin kuoppiin yläkammioon 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Seerumivapaassa lisättiin yläkammioon, inkuboitiin 30 minuuttia 37 ° C: ssa, ja taustan mittaus tehtiin. Soluja esikäsiteltiin eri pitoisuuksia sWRE seerumittomassa median yli yön. Nämä solut lisättiin sitten yläkammioon ja levyä inkuboitiin 37 ° C: n xCelligence levylukijalla. Impedanssin mittaukset tehtiin pohjassa hyvin ja impedanssin nousu korreloi yhä enemmän siirtynyt soluja. Muutokset impedanssi, joka heijastuu soluinvaasion indeksin arvot, seurattiin vähintään 24 tuntia.

Western blotting

Proteiinitasot solulysaateista olivat toimenpide käyttämällä standardia BCA-määrityksellä. Solulysaatit näytepuskurissa erotettiin 10% SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin PVDF-kalvoille (Bio-Rad, Hercules, CA). Kun oli salvattu 5% rasvaton maito sisältävät TBST, kalvot erikseen inkuboitiin vasta-aineiden kanssa ja vimentiinin, E-kadheriinin, fibronektiiniä, ja GAPDH huoneenlämpötilassa 2 tunnin ajan. Sitten membraanit pestiin ja niitä inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi konjugoitu sekundäärisen vasta-aineita 1 tunti. Vyöhykkeet havaittiin käyttäen Amersham ECL Plus reagenssien ja sitten valotettiin filmille.

konfokaali kuvantamisen

Soluja viljeltiin lasipeitelevyihin ja käsitelty sWRE 24 tuntia. Solut kiinnitettiin sitten ja käsitellään immunofluoresenssimikroskoopilla kuten aiemmin on kuvattu [35]. Solut värjättiin käyttämällä ensisijaista anti-vimentiinin vasta-aineen ja toisen Alexa 488-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG. Peitelaseja asennetaan dioja ja kuvataan useilla Zeiss LSM510 META -konfokaalimikroskoopilla kanssa 40X Plan-NEOFLUAR öljy tavoite (NA 1,3).

Reaaliaikainen PCR

Yhteensä-RNA eristettiin soluista käyttämällä RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA) ja esikäsitelty DNaasi I sitten cDNA syntetisoitiin käyttäen satunnaisia ​​heksameerialukkeita ja MMLV- käänteistranskriptaasia. Target-spesifisiä alukkeita käytettiin monistamaan cDNA kolmena kappaleena käyttäen reaktioseosta, joka sisälsi 1 ui sopivasti laimennettua cDNA näytteestä, 0.2μmol /l alukkeita ja 12.5μl IQ SYBR Green SuperMix (Bio-Rad). 18S rRNA monistettiin samasta näytteistä sisäisenä kontrollina. Reaktio altistettiin hot start 3 min 95 ° C: ssa ja 40 sykliä 95 ° C, 10 s; 55 ° C (18S) tai 63 ° C (vimentiinista), 30 sek. Alukkeet reaaliaikainen PCR-analyysi olivat vimentiinista: 5 ’AATGGCTCGTCACCTTCGTGAA3’ ja 5 ’CAGATTAGTTTCCCTCAGGTTCAG3 ”ja 18S, 5’ GAGGGAGCCTGAGAAACG G3 ’ja 5’ GTCGGGAGTGGGTAATTT GC3”

Kolmiulotteinen pallomainen invaasiomääritys

agaroosi-päällystetyille levyille tehtiin kuormittamalla kuhunkin kuoppaan 0,75%: isessa DMEM: ssä, jossa oli 10% FBS: ää. Geeliytymisen jälkeen, MCF10A-soluja lisättiin kuoppiin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa. Cell sferoidia muodostunut 3-5 päivässä. 5-10 sferoidit sekoitettiin matrigeelin DMEM tai DMEM plus sWRE. Seos sijoitettiin keskelle 35 mm kuvantamisen petrimaljaan a # 1.5 peitelasi (MatTek Corporation) ja sitten alumiinifoliota päälle ylimääräinen kansi luistaa. Astia laitettiin sitten 37 ° C: ssa inkubaattorissa 30 minuutin ajan, jotta Matrigel polymerointiin, sitten 2 ml DMEM, jossa 10% FBS: ää lisättiin. Astia siirrettiin elävien solujen PerkinElmerin Ultraview ERS spinning disk -konfokaalimikroskoopilla [44] ja kuvat hankittiin käyttäen 20X Zeiss tavoite (NA 0,75) 20 minuutin välein 24 tunnin ajan Hamamatsu Orca ER kamera.

In vivo sWRE toksisuustutkimus

Kahdeksan viikkoa vanhoja Balb /c-hiiriä ostettiin Harlan ja sijoitettu Winship Cancer Animal Models laitos mukaan meidän hyväksytyn IACUC protokollaa. Hiiret pidettiin viiden ryhmissä häkkiä kohti ja ruokittiin AIN76A ohjaus ruokavalion ja vesi

halun

. Hiiret satunnaistettiin 3 ryhmään 3 hiirtä ryhmää kohti ja käsitellään suun kautta letkuruokinnalla joko vehikkeliä (9% etanolia) tai vehikkeliä, joka sisälsi sWRE 4, ja 8 mg /kg kehon painoa, 3 kertaa viikossa 4 viikon ajan. Hiiret kehon paino rekisteröitiin aina kun letkulla suun kautta. Sen jälkeen kun 4 viikkoa hoidon jälkeen hiiret tapettiin ja elinten (sydän, keuhkot, maksa, perna ja munuaiset) kerättiin ja lähetettiin patologisen analyysin. Myrkylliset vaikutukset arvioitiin sokkona eläinlääkäri patologi perustuu tulehduksen, kuolion ja fibroosia käyttämällä asteikolla normaalista (1+) tai keskivaikea (3+).

rintasyöpä malli

kaikki hiiri tutkimukset suoritettiin mukaisesti meidän hyväksyttyjen Emory University Institutional Animal Care ja käyttö komitea protokollaa. Kahdeksan viikon ikäisiä Balb /c-hiirtä jaettiin satunnaisesti 4 ryhmään, joissa oli 10 hiirtä kussakin ryhmässä. 10

6 4T1 soluja PBS injektoitiin ihonalaisesti utarerasvaa pad kunkin hiiren. Yksi viikko injektion jälkeen, sWRE annettiin oraalisella letkuruokinnalla joko ajoneuvo tai ajoneuvoyhdistelmä, joka sisältää sWRE 1, 4, ja 8 mg /kg ruumiinpainoa 3 kertaa viikossa 4 viikon ajan. Withaferin A intraperitoneaalisesti liuottamalla 10% DMSO, 20% Cremophor-EL, ja 50% PBS: ssä 1, 4, ja 8 mg /kg 3 kertaa viikossa 4 viikon ajan. Kasvaimen tilavuus tallennettiin ennen kautta käyttämällä jarrusatulat tilavuus = (leveys)

2 x pituus /2. Hiiret tapettiin sen jälkeen, kun 4 viikkoa hoidon ja metastaattisen keuhkosyövän kyhmyt laskettiin alla preparointimikroskooppia. H 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

WRE Standardization, liukoisuus, ja Sytotoksisuus

WRE jauhe liuotettiin H

2O tai 90% etanolia ( EtOH) eri pitoisuuksilla määrittämään optimaaliset olosuhteet standardoida WRE (sWRE) puhdasta pienimolekyylinen Withaferin A. pitoisuus Withaferin A kussakin sWRE muotoilussa mitattiin HPLC (kuvio 1A) ja kierrätysaste Withaferin jälkeen solubulization oli lasketaan kullekin näytteelle (kuvio 1 B). Sisällön Withaferin verrattuna muihin withanolides käyttäen HPLC on esitetty taulukossa 1. Kun sWRE on 250 mg /ml, liuotettiin veteen, Withaferin elpyminen oli 4%. Suurin prosentuaalinen saanto Withaferin A vesi oli 16%, havaittiin aloitusannos 10 mg /ml sWRE. Sen sijaan kun WRE jauhe liuotettiin 90% EtOH Withaferin Saantokoe vaihteli 80-92%. Nämä tulokset osoittavat, että uudelleen liuottaminen sWRE 90% EtOH on selvästi parempi kuin vuonna H

2O. Arvioida pitkän aikavälin stabiilisuus WRE kantaliuoksesta 90% EtOH, HPLC-analyysi tehtiin WRE 6 ja 12 kuukauden varastoinnin -80 ° C: ssa. Tulokset osoittavat, että noin 90% alkuperäisestä Withaferin A voidaan havaita 6 kuukauden kuluttua, ja noin 80%, kun 12 kuukautta (kuvio 1C, D).

sWRE jauhe liuotettiin eri liuottimiin ja pitoisuus ( A) ja hyötykäyttöaste (B) Withaferin A sWRE mitattiin HPLC: llä. Vakautta Withaferin A sWRE (90% EtOH kantaliuoksesta) ajan näkyy pylväskaaviona kanssa absoluuttinen (C) ja suhteellinen (D) Withaferin Keskittymä.

Withanolides

Pitoisuus (mg /ml) B Prosentti (%) B Withaferin A5.8879.03Withanoside V0.3564.7812-Deoxywithastramonolide1.0614.25Withanolide A0.1361.83Withanolne0.01370.18Total Withanolides7.44100.00Table 1. Withanolides in WRE-HPLC.

CSV Download CSV

arvioimiseksi sytotoksisuuden, rintasyövän solulinjat käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla Withaferin A-standardoitu WRE (sWRE) 24 ja 72 tuntia (kuvio 2A, B). Kuudesta testatuissa solulinjoissa, neljä (MDA-MB-468, HCC 1806, Hs587-T, ja MDA-MB-231) ovat kolmen rintasyöpä solulinjat [45]. Koska Withaferin A on vimentiinista-kohdistamisaineena [30,34], vimentiinistä ilme yhdessä muiden EMT markkereita arvioitiin solulinjoissa. Kaksi neljästä triple negatiivinen solulinjoissa, (Hs578-T ja MDA-MB-231) oli vimentiinin-positiivisia ja kaikki muut solulinjat olivat vimentiinista-negatiivinen. Nämä vimentiinista positiivisissa solulinjoissa myös näytteillä EMT induktio, koska ne näkyvät E-kadheriinin menetys ja olivat fibronektiiniä positiivisia (kuvio 2C). Mielenkiintoista on, että eri herkkyys sWRE havaittiin yli kuuden solulinjoissa, jossa kaksi herkin solulinjat, Hs578-T ja MDA-MB 231, oli vimentiinin-positiivisia 72 tunnin IC

50 0,5 uM ja 0.4μM vastaavasti (kuvio 2B). Vimentiinista-negatiivinen solulinjoissa oli IC

50-vuotiaat, jotka vaihtelivat 1.2μM ja 4,0pm. Koetin tämän sytotoksisuuden määritykset suoritettiin isogeenisiin ohjaus ja vimentiinin siRNA köyhdytettyä MDA-MB 231 soluja. Tässä tapauksessa, vimentiinistä köyhdytettyä solut osoittavat vähäistä laskua sWRE sytotoksisuuden verrattuna isogeenisiin kontrollisoluihin (kuvio 2D).

(A ja B) Line kaavioita% selviytymisen kuuden rintasyövän solulinjoissa käsiteltiin lisäämällä pitoisuudet sWRE 24 (A) ja 72 (B) tuntia. (C) Western blot, joka osoittaa EMT merkkiaineita eri rintasyövän linjat. Triple rintasyöpä solulinjoissa on merkitty tähdellä. (D) (vasemmalla) Western blot, joka osoittaa onnistuneen vimentiinista siRNA ehtyminen (oikealla) Cytotoxciity määrityksessä käytetään sWRE vuonna isogeenisiin ohjaus ja vimentiinista siRNA köyhdytettyä soluja.

sWRE estää rintasyövän solun liikkuvuus ja invaasio, ja häiritsee vimentiinistä morfologia

Olemme aiemmin osoittaneet Withaferin estää rintasyövän soluliikkuvuus ja etäpesäkkeiden [35]; Siksi pyrimme onko sWRE esitetään anti-invasiivisen tehoa. Vaikutus sWRE solun motiliteettia kolmen rintasyöpäsolujen (ihmisen MDA-MB-231 ja hiiren 4T1) testattiin käyttämällä haavan paranemista määrityksessä. WRE estää solun liikkuvuus annoksesta riippuvalla tavalla 24 tunnin kuluttua hoidosta 0,5 uM molemmissa solulinjoissa (kuvio 3A, B). Laajennettu koe alemmilla annoksilla MDA-MB 231 soluja näyttää inhibition soluliikkuvuus 0,25 uM sekä (kuva S1). Sitten halusimme selvittää, miten sWRE vaikutukset soluliikkuvuus kun vimentiinista proteiini puuttuu. Tämä koe oli ensimmäinen yritetty MCF7 ja MDA MB 468 rintasyöpäsoluihin, jotka molemmat ei ole havaittavissa vimentiinista western-blottauksella; kuitenkin näissä tapauksissa solut eivät myöskään liikkuvia niin koe ei voitu suorittaa (tuloksia ei ole esitetty). Sen sijaan käytimme keuhkon epiteeli- solulinjan, BEAS-2B, jossa ei ole vimentiinistä (kuvio S1-B), ja osoittaa jonkin verran liikkuvuutta. sWRE oli 24 tunnin antiproliferatiivinen IC

50 2.9μM ja 48 tunnin IC

50 1,9 uM (kuva S1-C). Vuonna haavoittaen määrityksessä pienempiä annoksia sWRE (0,125-1 uM) alapuolella IC

50 ollut lähes mitään vaikutusta solun liikkuvuus (Kuva S1-D). Vasta hoitoa 2 uM sWRE joka on lähellä 24 tunnin antiproliferatiivisia IC

50, ei vietämme tuntuvia esto liikkuvuutta (kuva S1-D).

(A ja B) Cell loukkaantumisesta määritystä (A) MDA-MB-231 ja (B) 4T1-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla sWRE 24 tuntia. (C ja D) Line käyrä, joka esittää solujen invaasion välityksellä Matrigel upotettu Boyden kammion (C) MDA-MB-231 ja (D) 4T1-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla sWRE. (E) konfokaali immunofluoresenssimenetelmällä kuvantaminen vimentiinista (vihreä), aktiini (punainen), ja DAPI (sininen) in MDA-MB-231-solujen käsitelty 9% EtOH ohjaus, 0,5 uM tai 1,0 um sWRE.

anti-invasiivisen aktiivisuuden sWRE testattiin käyttämällä reaaliaikaista Matrigel invaasiomääritys on Boyden kammiossa. sWRE oli taas pystynyt merkittävästi estävät solujen invaasiota molemmissa solulinjoissa niin alhaisina annoksina kuin noin 0,25 in 4T1 ja 0,5 uM MDA-MB-231-solujen (kuvio 3C, D). Nämä tulokset osoittavat, että sWRE estää solun liikkuvuus ja on anti-invasiivisia kolminkertainen rintasyöpäsolujen.

Koska Withaferin estää vimentiinista [30,34], tutkimme, sWRE on samanlainen vimentiinista häiritsevinä kyky. Vimentiinista immunofluoresenssilla ohjaus MDA-MB-231-solut osoittavat, että vimentiinista on verkotettu koko kara-muotoinen sytoplasmaan; kuitenkin, kun sWRE hoitoa (0,5 uM ja 1,0 um) 16 tunnin ajan, solut eivät olleet yhtä pitkänomainen ja vimentiinin verkon poistettiin (kuvio 3E). Sen sijaan, vimentiinistä kertynyt kuin perinuclear nippu useimmissa soluissa, joka on samanlainen vaikutus puhtaan Withaferin [35]. Lisäksi sWRE ei vähennä solun kokonaisproteiinia tasoilla, kunnes 48 tuntia hoidon jälkeen (kuvio S2), mikä viittaa siihen, että tämä ei johdu viasta yhteensä proteiinisynteesiä. Siksi näihin havaintoihin perustuen voimme päätellä, että sWRE myös hallussaan vimentiinista estoaktiivisuus pienillä annoksilla.

sWRE estää TGFli aiheuttamaa EMT

Koska vimentiinista on keskeinen rooli EMT, halusimme testata jos sWRE voisi estää EMT ja EMT aiheuttama potevilla rintasyöpä. Tämän testaamiseksi käytimme MCF10A soluja, jossa hoito 4 ng /ml TGF aiheuttaa nämä solut tehdään EMT, joka arvioidaan lisääntyminen mesenychmal merkkiaineiden vimentiinista ja fibronektiiniä, ja menetys epiteelin merkki, E-kadheriinin [8,9 ]. Nämä tiedot osoittavat, että sWRE estää MCF10A motiliteetin haavan paranemista määrityksessä TGF (kuvio 4C) samansuuruisina annoksina, joita käytetään 4T1 ja MDA-MB-231cell linjat (kuvio 3). Arvioimaan, kuinka sWRE vaikutukset EMT, MCF10A soluja käsiteltiin TGF läsnä ollessa sWRE tai Withaferin A. TGFp yksinään indusoi vimentiinista ja fibronektiiniä proteiinin ilmentymiseen ja laski E-kadheriinin proteiinin tasot osoittaa onnistuneen EMT induktio. Sitä vastoin käsittely 500 nM sWRE tai 500 nM Withaferin voimakkaasti inhiboivat TGF-indusoidun EMT pitämällä vimentiinista ja fibronektiinin ennalta induktion tasosta ja lisäämään E-kadheriinin tasoilla (kuvio 4A, B). Voit selvittää tämän tapahtuu transkription tasolla, reaaliaikainen PCR on vimentiinista transkriptin tehtiin ja nämä tulokset osoittivat, että TGFli lisääntynyt vimentiinista mRNA odotetusti, mutta sWRE ei vaikuttanut vimentiinista mRNA (kuvio 4D), samanlainen kuin käytetään Withaferin [30]. Näin ollen tulokset osoittavat, että sWRE ei estä vimentiinista ekspressiota mRNA-tasolla vaan proteiinin tasolla.

(A) Western blot vimentiinista in TGFp 1-stimuloiduissa MCF10A soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla sWRE. (B) Western blot vimentiinin, fibronektiinin, ja E-kadheriinin in TGFp 1 stimuloi MCF10A solut, joita käsiteltiin 500 nM sWRE tai Withaferin A. (C) Cell maahanmuuttoa haavan paranemista määrityksessä kasvavien pitoisuuksien kanssa WRE. (D) Suhteellinen vimentiinista mRNA-tasot havaittiin reaaliaikaisella PCR: TGFp 1-stimuloiduissa MCF10A solut, joita käsiteltiin 500 nM sWRE tai WFA. (E) elävien solujen Viivästys kuvia MCF10A 3D pallosia upotettu Matrigel ja stimuloidaan TGFp 1. Cell käsiteltiin 9% EtOH ohjaus, tai 100 nM tai 500 nM sWRE.

Nämä tutkimukset olivat sitten siirtyi pallomaista mallin hyökkäyksen onko sWRE estää EMT aiheuttamaa hyökkäystä. Tässä mallissa TGFli aiheuttama voimakas invaasion matrigeelin soluväliaineen käyttämällä elävien solujen kuvantamisen visualisoimiseksi invaasiota (kuvio 4E, Elokuva S1); kuitenkin, käsittelemällä niinkin alhaisella annoksella kuin 100 nM sWRE, invaasio oli esti voimakkaasti (kuvio 4E, elokuva S2). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että sWRE voi estää EMT ja EMT aiheuttama liikkuvuutta ja invaasio.

sWRE in vivo myrkyllisyys

Tutkia antimetastaattisia tehoa sWRE

in vivo

, sWRE myrkyllisyys arvioitiin aluksi normaaleissa BALB /c-hiirestä. Hiirille annettiin joko 4 tai 8 mg /kg sWRE 9% EtOH ja keskimääräinen painonnousu sen jälkeen, kun 35 päivää käsitellyissä hiirissä eivät olleet merkittävästi erilaisia ​​kuin kontrolliryhmässä annettiin 9% EtOH yksinään (kuvio 5A). Neljän viikon hoidon jälkeen histologia sydämen, keuhkojen, maksan, pernan ja munuaisten luokiteltiin varten fibroosia, kuolion ja tulehdus. Histologinen tiedot osoittavat merkittävää eroa sWRE-testi- ja kontrolliryhmien (kuvio 5B, C).

(A) Suhteellinen painon vehikkelillä hoidetut hiiret, tai sWRE on 4 mg /kg ja 8 mg /kg. (B) Histologinen luokittelu tulehdus, fibroosi, ja kuolion elinten hiirille on ajoneuvon (9% EtOH) tai sWRE klo 8 mg /kg. (C) edustaja kuvia H 0,05 kontrolliin verrattuna). (C) Kuvat ovat primäärisen tuumorin sWRE tai WFA käsitellyissä hiirissä. (D ja E) Pylväsdiagrammi, joka osoittaa keskimääräinen lukumäärä metastaattisen keuhkosyövän kyhmyt (D) sWRE tai (E) WFA-käsiteltyihin hiiriin (* p 0,05 kontrolliin verrattuna). (F) edustaja H kaksi esimerkkiä on esitetty. (G) Kuvat ovat keuhkojen etäpesäkenystyröiden (mustat nuolet) hiirillä, joille ajoneuvon ohjaus (9% EtOH) tai sWRE tai WFA klo 8 mg /kg.

edelleen testata antimetastaattisia tehoa of sWRE samankaltainen koe käyttäen ksenograftimallia ihmisen metastaattisen rintasyövän MDA-MB-231-soluja suoritettiin. Solut ihonalaisesti utarerasvaa pad naisten kateenkorvattomia nude-hiirissä. Hiiret ylläpitäjä sWRE letkulla suun kautta ja Withaferin A i.p. injektio pitoisuutena 1, 4, ja 8 mg /kg 3 kertaa viikossa 4 viikon ajan. Ensisijainen kasvaimen estyi sWRE 4 ja 8 mg /kg annoksilla.