Krooninen sairaus

tiivistelmä

syövän estäjä proteiini 2A (CIP2A-proteiinia) on onkogeenisessä tekijä, joka stabiloi C-Myc-proteiinin. CIP2A-proteiinia yli-ilmentynyt useissa kasvaimissa, ja ekspressiotasot ovat riippumattomia markkeri pitkän aikavälin tulos. Sen määrittämiseksi, onko

CIP2A-proteiinia

ilmentyminen on kohonnut paksusuolensyöpä ja voisiko se toimia ennustetyövälineenä merkkiaine selviytymisen, analysoimme

CIP2A-proteiinia

mRNA: n ilmentymisen reaaliaikaisella PCR 104 paksusuolensyöpä näytteitä.

CIP2A-proteiinia

mRNA yli-ilmentyy paksusuolensyöpä näytteiden ja

CIP2A-proteiinia

ekspressiotasoja korreloivat merkitsevästi kasvaimen vaiheessa. Huomasimme, että

CIP2A-proteiinia

toimii itsenäisenä prognostinen merkkiaine taudista vapaan ja kokonaiselossaolo. Lisäksi tutkimme CIP2A-proteiinia riippuvia vaikutuksia taan C-Myc, Akt ja soluproliferaatioon kolmella koolonsyöpäsolulinjaa hiljentämällä CIP2A-proteiinia käytetään pieniä häiritseviä (SI) ja lyhyt hiusneula (sh) RNA: iden. Ehtyminen CIP2A-proteiinia merkittävästi esti kasvua paksusuolen solulinjojen ja vähensi c-Myc tasoilla vaikuttamatta ilmentymisen tai toiminnan alkupään sääntelyä kinaasi, Akt. Expression of CIP2A-proteiinia havaittiin olevan riippuvainen MAPK toimintaa, joka yhdistää kohonnut c-Myc ilmaus vapautettiin signaalitransduktion paksusuolen syöpä.

Citation: Wiegering A, Pfann C, uthe FW, Otto C, Rycak L, Mäder U, et ai. (2013) CIP2A-proteiinia Vaikutteet Survival in Colon Cancer ja on kriittinen ylläpito Myc Expression. PLoS ONE 8 (10): e75292. doi: 10,1371 /journal.pone.0075292

Editor: Gnanasekar Munirathinam, University of Illinois, Yhdysvallat

vastaanotettu 23. huhtikuuta 2013. Hyväksytty: 12 elokuu 2013; Julkaistu: 01 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Wiegering et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: AW on rahoitusta yliopiston Würburg varten näytön verrattuna APC rahoituksen määrä on: IZKF B-186. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen tätä tutkimusta. Tämä julkaisu on rahoitettu Saksan Research Foundation (DFG) ja University of Wuerzburg vuonna rahoitusohjelman Open Access Publishing. Ei nykyinen ulkoinen muista rahoituslähteistä tälle tutkimukselle.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kaikkein yhteinen maha maligniteetti. On noin 664000 uutta tapausta vuosittain maailmanlaajuisesti. Puolet näistä potilaista kuolee tämän kohdunkaulan [1]. Nykyisin standardi hoito on ensisijainen leikkaus ja riippuen kasvaimen vaiheessa vielä kemoterapian [2]. Koska korkea toistumisen määrä, uusia mahdollisia kohteita ja ennustetekijöitä markkereita tarvitaan tunnistaa potilaat, jotka todennäköisesti hyötyvät lisähoitoa.

Vuonna 2007 Junttila ja Westermarck tunnistaa syövän estäjä proteiinia 2A (CIP2A-proteiinia) ihmisenä onkoproteiini. CIP2A-proteiinia yli-ilmennetään pään ja kaulan okasolusyöpää ja paksusuolikarsinoomat [3]. CIP2A-proteiinia estää proteiini 2A (PP2A). PP2A puolestaan ​​on ratkaiseva rooli liikevaihdon c-Myc onkoproteiinin, koska PP2A defosforyloi c-Myc at seriini-62 (S62). Defosforylointia S62 tarvitaan ubikinaation c-Myc, jonka ubikitiinipromoottori ligaasilla Fbw7 ja siksi käynnistää hajoamista c-Myc [4]. Yliekspressio CIP2A-proteiinia estää PP2A aktiivisuutta ja siten vakauttaa c-Myc. Näin ollen, tämä aiheuttaa immortalisaatio ja pahanlaatuisiin ihmisen soluihin [3]. c-Myc itse edelleen tärkein onkogeeninen kuljettaja kolorektaalisyövässä [5].

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että CIP2A-proteiinia yli-ilmentyy useissa ihmisen syöpäsairauksia. CIP2A-proteiinia ekspressiotasoja korreloivat yleinen (OS) ja sairauksien elinaika (DFS) in mahakarsinoomat, vuonna vakavien munasarjasyövän, munuaissolukarsinoomassa ja rintasyövässä [6]; [7]; [8]; [9]. Vuonna krooninen myelooinen leukemia (KML),

CIP2A-proteiinia

ilmaisu ajanhetkellä diagnoosi on ennustetyövälineenä markkeri kehittämään blastikriisipotilaista myöhemmin [10]. Lisäksi jotkin onkogeeniset tekijät, kuten

Helicobacter pylori

ja papilloomavirusta 16 E7, ylössäätävät ilmaus CIP2A-proteiinia, ja tämä voi olla kriittinen niiden kasvaimia synnyttävän aktiivisuuden [11]; [12].

Äskettäin kaksi ryhmää raportoitu ristiriitaisia ​​tuloksia koskien ennustetekijöiden vaikutuksista CIP2A-proteiinia kolorektaalisyövässä [13], [14]. Böckelman et ai. tutkittu 752 potilaalla, mutta ei määritellä mitään ennustetekijöiden merkitystä; toisin Teng et ai. tutkittiin 167 potilasta ja tunnistettu CIP2A-proteiinia ilmentyminen kuin ennustetekijä varten paksusuolen syöpä.

tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli käsitellä merkitystä CIP2A-proteiinia ilmaisun paksusuolensyöpä. Ensin analysoimme ilmaus

CIP2A-proteiinia

kohortin 104 paksusuolensyöpä potilaalla on dokumentoitu seurantaa ja vahvisti yli-ilmentymisen. Toiseksi tutkimme yhdistyksen välillä

CIP2A-proteiinia

mRNA ilmaisun ja kliinisiä-patologinen muuttujia; Lopuksi, me haluttiin selvittää molekyylitasolla reittejä, jotka säätelevät CIP2A-proteiinia ilmaisun ja säätelee CIP2A-proteiinia. Meidän tiedot tukevat käsitystä, että vapautettu ilmaus CIP2A-proteiinia on kriittinen kasvaimia synnyttävän tapahtuman paksusuolen syöpä.

Potilaat ja menetelmät

Potilasnäytteet

Sataneljä potilailla, joilla peräsuolen syöpä olivat mukana tutkimuksessa. Kaikki potilaat leikattiin yliopistollisessa sairaalassa of Wuerzburg, Saksa, vuosina 2003 ja 2012. Kukaan potilaista oli saanut kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen leikkausta. Hoidot leikkauksen jälkeen suoritettiin ohjeiden mukaisesti hoitoon peräsuolen syöpä. Diagnoosi vahvistettiin histopatologinen tutkimus yksilöiden. Leikkauksen jälkeen, kasvaimen näytteet kerättiin ja varastoitiin nestemäisessä typessä. Kliiniset tiedot kaikista potilaista kerättiin sairaalasta kirjaa ja myöhemmin kirjaa kerättiin kautta Kattava Cancer keskuksen Mainfranken.

Ethics lausunto

Eettinen hyväksyntä Tutkimuksen saatiin Tutkijavoimavarojen eettinen komitea yliopiston Würzburg. Kaikki potilaat, jotka tarjotaan kasvainkudoksen ja normaalin paksusuolen kudosnäytteiden Tutkimuksen allekirjoittivat suostumuslomakkeen ennen kirurginen poisto suoliston syöpä.

Solulinjat ja Cell Culture

Caco2, HCT116, ja SW620 solut hankittiin American Type Culture Collection. Kaikki solut viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia und 1% penisilliini /streptomysiiniä.

Reaaliaikainen määrälliset Käänteinen transkriptio-PCR-analyysi

Geenien ilmentyminen on

CIP2A-proteiinia

analysoitiin käyttäen reaaliaikaista PCR. Solun totaali-RNA uutettiin tuumorinäytteistä ja solulinjoissa RNeasy Minikit (Qiagen, Hilden, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Alukesarjat (Qiagen), että kohdennettu

CIP2A-proteiinia

RNA suunnitellut Biomers (Ulm, Saksa). Vastaavat ihmisen koolonin cDNA: ta (Pharmingen, Heidelberg, Saksa) toimi positiivisena kontrollina, standardoitu lähtötasoon. Housekeeping-geenit, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (

GAPDH

) ja beeta-2-mikroglobuliini (

b2MG

) käytettiin sisäisinä standardeina suhteellinen kvantifiointi ja cDNA laadunvalvontaa. Kaikki PCR-reaktiot suoritettiin DNA Engine Opticon 2 System (MJ Research, Biozym; Oldendorf, Saksa). Suhteellinen kvantitointi, joka perustuu kertainen ero, laskettiin kynnyksen (Ct) menetelmä, ilmoitettuna 2

-ΔΔCt (Primer sekvenssi taulukossa S1).

immunoblot-analyysi

viljellyt solut huuhdeltiin kolme kertaa jääkylmällä PBS: llä, kerättiin ja lyysattiin suoraan RIPA näytepuskurissa immunoblot-analyysi. Solujätteet poistettiin sentrifugoimalla 12000 g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja supernatantti käytettiin proteiinin kokonaismäärän lysaattia. Kustakin näytteestä 10 ug kokonaisproteiinia lysaattia käsiteltiin 10% natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-Page), jota seurasi immunoblot-analyysi. Immunoblotit koetettiin vasta-aineita CIP2A-proteiinia (A301-454A; Bethyl Laboratories), c-Myc C33 (C33, # 42; Santa Cruz), beeta-aktiini (AC-15 /A5441, Sigma), vinkuliini (V9131, Sigma), AKT, Pakt

473 (cs-9271), GSK3 (cs-9315), pGSK seriini-9 (cs-9336), S6 (cs-2212), PS6 (cs-2215); pmTOR (cs-2917), ja mTOR (cs-2972). Kaikki vasta-aineet olivat peräisin Cell Signalling, ja niitä käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Blotit visualisoitiin sekundaarisia vasta-aineita (GE Healthcare) vastaan ​​hiiren (NA9310) tai kanin (NA9340) primaaristen vasta-aineiden.

immunohistokemia

CIP2A-proteiinia vasta-aine oli sama kuin immunoblot-analyysi, isotyyppikontrollilla vasta-aine hankittiin eBioscience (San Diego, USA). Sekundaarinen vasta-aine oli Cy3-konjugoitu AffiniPure anti-kani-IgG: tä, jonka 1:200 laimennus. CIP2A-proteiinia värjäys suoritettiin kryostaattileikkeiden snap-jäädytetty paksusuolensyöpä yksilöt ilmaista erilaisia ​​CIP2A-proteiinia mRNA naapureina normaalin paksusuolen kudosta ja 10 normaalin paksusuolen yksilöitä. Kryostaattileikkeitä (5 um) inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineen tai kontrollivasta-aineella, jota seuraa inkubaatio sekundaari- Cy3-konjugoidun vasta-aineen. Objektilasit vastavärjättiin DAPI (4 ’, 6-diamino-2-phenylindoldihydrochlorid) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Saksa) ja peitetään polyvinyylialkoholiin kiinnitysväliaine (DABCO, Sigma-Aldrich) ja analysoitiin käyttäen Zeiss kamera (Oberkochen, Saksa).

siRNA transfektio

hiljentää geenien ilmentyminen, solut transfektoitiin pieniä häiritseviä RNA: ita (siRNA: t). Paikan tavoite plus SMART-allas (Dharmacon) siRNA kohdistaa CIP2A-proteiinia (L-014135-01-005) ja ohjaus siRNA (D-001810-10-05) käytettiin. SiRNA-altaat (lopullinen pitoisuus 100 nM) transfektoitiin soluihin kanssa RNAimax mukaisen pakkauksen valmistajan protokollaa. Solut kerättiin 72 tuntia myöhemmin; proteiinien ekspressiota määritettiin immunoblot-analyysi.

shRNA ja Lentivirus

hiljentäminen CIP2A-proteiinia mRNA: n ilmentymisen kanssa lyhyen hiusneula-RNA (shRNA) sekvenssit, kohdistaminen

CIP2A-proteiinia

kloonattiin lentiviruksen vektori (plko1 puro), mukaisesti valmistajan protokollaa. Vektori transfektoitiin väliaikaisesti HEK293T soluihin yhdessä paketin plasmideihin. Sen jälkeen, kun 48 ja 72 tuntia, supernatantit, jotka sisältävät virus otettiin talteen ja suodatettiin. Paksusuolen syövän solulinjat infektoitiin CIP2A-proteiinia lentivirus ja 24 tuntia myöhemmin, infektoidut solut valittu puromysiini. Kokeet suoritettiin valittujen solujen.

Colony muodostumisen määritys

2,5 x 10

3-soluja infektoitiin shRNA CIP2A-proteiinia tai Scr. maljattiin kuusi kuoppalevyille. Pesäkkeet värjättiin 0,5% kristallivioletilla 20% etanolia. Kuvat otettiin ja suhteellinen tiheys määritetään ImageJ.

Tilastollinen analyysi

Univariate analyyseja määrittämään yhdessä selviytymisen arvioitiin Kaplan-Meier käyrät, ja vertailut suoritettiin U-testi. Monimuuttuja analyysit suoritettiin Coxin suhteellisen vaarat regressiomallin. P-arvot 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

ilmentäminen CIP2A-proteiinia ja kliinis muuttujat Colon Cancer Potilaat

Expression of

CIP2A-proteiinia

mRNA alun perin arvioitiin käyttämällä ilmaisua aineistoja johdettu julkaistun mikrosiruanalyysi, joka suoritettiin alunperin tunnistaa ennustetekijöitä merkkiaineita peräsuolen karsinoomat mukaan imusolmuke etäpesäke asema [15]. Täydellisiä tietoja (DFS, kasvain vaiheita), verrataan

CIP2A-proteiinia

mRNA ilmaisun karsinooma sen, että Hyväksytty viereisten kudosten, oli käytettävissä 226 karsinoomat.

CIP2A-proteiinia

ilmentyminen testattiin käyttämällä kahta itsenäistä antureista läsnä tässä array. Emme löytäneet korrelaatiota

CIP2A-proteiinia

ilmaisun ja ikä diagnoosin, tai sukupuoli tässä perustietoja, mutta

CIP2A-proteiinia

mRNA ilmentyi korkeammalla tasolla peräsuolen syövän kudoksissa kuin sovitetussa viereisten kudosten sekä koetinsarjojen (tuloksia ei ole esitetty). Kiehtovan, korkea

CIP2A-proteiinia

mRNA ilmaisu korreloi merkittävästi pienemmällä tautivapaan elinajan (DFS) (Fig. S1A, B). Erillisissä analyysit potilaista Union for International Cancer valvonta (UICC) vaihe I (kasvain tunkeutumisen muscularis propriaan), II (kasvain tunkeutuminen pidemmälle muscularis proprialle) tai III (imusolmuke etäpesäke), vain potilaita vaiheessa UICC III osoitti merkittävää korrelaatiota välillä

CIP2A-proteiinia

ilmaisun ja DFS. Vertailun vuoksi potilaat vaiheessa UICC I ja II oli vain niukasti korrelaatio alhainen

CIP2A-proteiinia

ilmaisun ja pidensi elinaikaa jotka eivät saavuttaneet tilastollista merkittävyyttä. Tämä saattaa johtua siitä, että pieni määrä näytteitä ja vähemmän uusiutumisen tapahtumia verrattuna potilaisiin vaiheessa UICC III (Kuva. S2A-C). Koska DFS ei päästy vaiheessa UICC IV (etäispesäkkeitä), ei ollut mahdollista analysoida korrelaatio

CIP2A-proteiinia

ilmaus selviytymisen potilaiden vaiheessa UICC IV tämän tietojoukon.

analysoidaan tarkemmin

CIP2A-proteiinia

mRNA tasoilla riippumaton sarja 104 kolorektaalisyövän kudosnäytteitä käyttäen RT-QPCR lähestymistapaa. Ilmaus

CIP2A-proteiinia

mRNA on määritetty suhteessa kaksi siivous geenejä, beeta-2-mikroglobuliini (

b2MG

) ja glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (

GAPDH

). Ekspressiotasoja verrattiin mediaani

CIP2A-proteiinia

mRNA: n ilmentymisen normaalissa limakalvokudokseen.

CIP2A-proteiinia

ilmaisun suhteen

b2MG

tai suhteessa

GAPDH

osoitti korkeaa korrelaatiota (R

2 = 0,86) (kuvio. S3). Yhdenmukaisia ​​aiempien päätelmien CIP2A-proteiinia ilmentyminen syövässä, löysimme

CIP2A-proteiinia

mRNA: n ekspression 93 104 (89,4%) syöpänäytteissä oltava vähintään neljä kertaa suurempi kuin normaalissa paksusuolen limakalvon kudoksissa. Lisäksi

CIP2A-proteiinia

ilmentymisen taso korreloi merkittävästi UICC vaiheessa imusolmuke etäpesäke, etäinen etäpesäke, ja histologinen kasvaimen luokittelu (Fig. 1). Emme löytäneet yhdistyksen välillä

CIP2A-proteiinia

ilmaisun ja potilaan iän, sukupuolen tai syövän sijainti (oikealla vs. vasen paksusuoli) (taulukko S2).

Paneelit osoittavat laatikko ja hiuksenhienosti tonttien dokumentointi suhteellinen

CIP2A-proteiinia

mRNA-tasoja kasvaimissa ryhmiteltynä UICC vaiheessa (A) (UICC I vs. II p 0,0001; II vs. III p = 0,0046; III vs. IV p = 0,0002), mukaan imusolmukkeiden etäpesäke (B; N- vs. N + p 0,0001), mukaan etäpesäkkeiden (C; M0 vs. M1 p 0,0001), ja mukaan histologinen luokitus (D: G2 vs. G3 p = 0,0084) .

CIP2A-proteiinia mRNA Expression ja Leikkauksen jälkeiset Survival of Colon Cancer Potilaat

Kokonaiselossaoloaika (OS) käytettiin selviytymisen analyysiä. Kokonaiselossaoloaika määriteltiin välistä aikaa leikkauksen ja kasvaimeen liittyvän kuoleman. Univariate 1-, 3- ja 5-vuoden OS analyysit paljastivat, että potilailla, joilla on kehittynyt primäärikasvain vaiheessa, imusolmuke etäpesäke, kaukainen etäpesäke, edistyksellinen UICC-vaiheessa, ja korkea histologinen laadut oli pahin tulokset (taulukko 1). Lisäanalyysiä, potilaat jaettiin kahteen ryhmään, joissa

CIP2A-proteiinia

Edellä mainitulla yhtälöllä (korkea) tai alle (pieni) mediaanin. Potilaat, joilla on korkea

CIP2A-proteiinia

mRNA ilmaisu oli huomattavasti pienempi OS kuin ne, joilla on alhainen

CIP2A-proteiinia

mRNA: n ilmentymisen (Fig. 2A, B). Verrattaessa potilaita UICC vaiheissa I-IV erikseen korkean ja matalan

CIP2A-proteiinia

mRNA ilmaisun vasta UICC III vaiheessa, potilailla, joilla on korkea

CIP2A-proteiinia

tasoilla oli alentunut OS (Fig. 2C, D). Lisäksi Monimuuttuja-analyysi osoitti, että edistyksellinen UICC-vaiheessa ja korkea

CIP2A-proteiinia

lauseke (

CIP2A-proteiinia

edellä mediaani ja

CIP2A-proteiinia

ilmaisua käytetään jatkuvana merkki) olivat riippumattomia ennustavat tekijät huono tulos, jos potilaalla on paksusuolen syöpä (taulukko 2).

käyrät Kaplan-Meier käyrät OS mukaan

CIP2A-proteiinia

mRNA ilmaisun. (Punainen:

CIP2A-proteiinia

mRNA ilmaisun alle mediaanin kertainen ilmaisun arvo 10,5 normaalia kudosta), vihreä:

CIP2A-proteiinia

mRNA ilmaisun yläpuolella mediaani kertainen ilmaisun arvon 10,5 yläpuolella normaalia kudosta) (A B) Kaikki potilaat suhteen

CIP2A-proteiinia

mRNA ilmaisun normalisoida taloudenhoito geeni (n = 75) (A: b2MG; B: GAPDH) (C) potilaat vaiheessa UICC II suhteen

CIP2A-proteiinia

mRNA ilmaisun normalisoida taloudenhoito geeni GAPDH (n = 29) (D) Potilaat vaiheessa UICC III suhteen

CIP2A-proteiinia

mRNA ilmaisun normalisoitu taloudenhoito geeni GAPDH (n = 21).

Voit testata, onko

CIP2A-proteiinia

mRNA ilmentyminen korreloi CIP2A-proteiinia proteiinin ilmentymistä CRC kymmenen normaali limakalvo kudosleikkeiden, neljä CRC kudosnäytteet ilmentävät matalan

CIP2A-proteiinia

mRNA-tasojen ja viisi kudosnäytteiden ilmentävät korkea

CIP2A-proteiinia

mRNA värjättiin CIP2A-proteiinia proteiinin ilmentymisen. Normaalissa limakalvon kudosleikkeiden, enintään vain hyvin heikko värjäys CIP2A-proteiinia ei voitu todeta (tuloksia ei ole esitetty). Ilmentävien syöpien alhainen

CIP2A-proteiinia

mRNA osoitti heikkoa värjäytymistä varten CIP2A-proteiinia proteiinia, kun taas ilmentävien syöpien korkea

CIP2A-proteiinia

mRNA osoittivat vahvaa värjäytymistä CIP2A-proteiinia proteiinia. Tämä tulokset osoittavat, että CIP2A-proteiinia proteiinia ja mRNA-tasot korreloivat läheisesti

in vivo

. (Fig. 3).

paneelit esittävät edustavia esimerkkejä Immunofluoresenssivärjäystä osoittaa CIP2A-proteiinia proteiinin ilmentymistä syöpäsoluissa potilailla, joilla on alhainen (A + B) tai korkea

CIP2A-proteiinia

(C + D ) mRNA: n ilmentymisen (A + C x100, B + D x200 suurennus).

Effects of CIP2A-proteiinia väheneminen solun kasvuun ja Myc ilmentäminen CRC

lisäksi halusimme selventää vaikutuksen of CIP2A-proteiinia sen tavoite proteiinien CRC solulinjoissa. Proteiinin ilmentyminen CIP2A-proteiinia oli huomattavasti vähentää kolmella paksusuolen solulinjoissa (Caco2, HCT116 ja SW620) käsittelyn jälkeen erityisiä siRNA vastaan ​​

CIP2A-proteiinia

. Lisäksi CIP2A-proteiinia knockdown johti huomattavaan vähentämiseen c-Myc tasoa kaikissa kolmessa solulinjoissa (Fig. 4A; n = 3 kullekin solulle-line). Tämä johtui posttranskriptionaalisella sääntelyä c-Myc-proteiinin tasot, koska emme havainneet mitään muutosta

MYC

mRNA: n ilmentymisen (Fig. 4B; n = 3). Aiemmat tutkimukset osoittivat, että CIP2A-proteiinia knockdown johti alhaisempaa Akt, osoittama alentunut fosforylaatio seriinillä 473 (Pakt

473), ja siten, estivät PI3K /mTOR kautta. Emme kuitenkaan ei havaittu merkittäviä muutoksia fosforyloidun Akt jälkeen CIP2A-proteiinia knockdovvn vuonna Caco2, HCT116 tai SW620-soluissa. Lisäksi fosforylaatiota loppupään Akt tavoitteita, mukaan lukien pmTor, PS6, ja pGsk3, ei muuttunut merkittävästi sen jälkeen, kun knockdovvn CIP2A-proteiinia (Fig. 4C; n = 3 kullekin solulinja). Kaiken kaikkiaan tämä osoittaa, että c-Myc-proteiinia on valvonnassa CIP2A-proteiinia CRC, kun taas PI3K /mTOR näyttää olevan riippumaton CIP2A-proteiinia.

(A) immunoblot-analyysi CIP2A-proteiinia ja c-Myc-proteiinin ilmentymisen Caco2, HCT116 ja SW620-solut transfektoitu siRNA kohdistamista CIP2A-proteiinia tai kontrolloida siRNA. Solut kerättiin talteen 72 h transfektion jälkeen (n = 3 kullekin solulinja). (B) Reaaliaikainen PCR-analyysi

CIP2A-proteiinia

ja

c-Myc

mRNA: n ekspression HCT116-soluissa, jotka on transfektoitu siRNA kohdistamista CIP2A-proteiinia tai ohjata siRNA (n = 3). (C) ehtyminen CIP2A-proteiinia ei muuta aktivointia asemaa AKT tai sen loppupään tavoitteita. Paneelit osoittavat immunobloteista ilmoitettu proteiinien ja fosforyloidut proteiinit (p) Caco2, HCT116 ja SW620-solut transfektoitiin siRNA: lla kohdistamista CIP2A-proteiinia tai valvoa siRNA kuten edellä (n = 3 kullekin solulinja).

koska siRNA tyypillisesti menetetään ajan myötä, ja poissulkemiseksi vaikutuksia, testasimme kaksi erilaista shRNAs kohdistaminen

CIP2A-proteiinia

arvioida kasvua estävä vaikutus CIP2A-proteiinia knockdown. HCT116-solut infektoitiin lentiviral vektoreilla kuljettavat shRNAs vastaan ​​

CIP2A-proteiinia

. Immunoblot analyysit osoittivat huomattavaa knockdovvn CIP2A-proteiinia proteiinin vastaava vähennys c-Myc-proteiinin tasot (Fig. 5A; n = 2). Näin ollen solujen lisääntyminen oli merkittävästi muuttunut infektoiduissa soluissa shRNA vastaan ​​

CIP2A-proteiinia

(Fig. 5B; n = 2).

(A) immunoblot-analyysi CIP2A-proteiinia ja c-Myc-proteiinin ilmentymisen HCT116-solut infektoitiin lentiviraalinen kanssa shRNA kohdistamista CIP2A-proteiinia tai ctr. shRNA. Numeroita viivat osoittavat c-myc-proteiinin ilmentymisen suhteen c-myc tasot kontrollisolut (n = 2). (B) Colony muodostumista HCT116-solujen jälkeen 7 päivää. (

Top), tiheys pesäkkeiden värjättiin kristallivioletilla; (

pohja

), edustaja osoitti viljelmät (n = 3).

CIP2A-proteiinia Expression on alavirtaan MEK-kinaasin CRC

tunnistamaan mahdollisia ylävirtaan sääntelyviranomaisten on

CIP2A-proteiinia

ilme, käsittelimme Caco2, HCT116 ja SW620-solujen kanssa UO126, hyvin kuvattu MEK1 /2-estäjä [16]. Hoidon UO126 24 tuntia johti huomattavaan vähenemiseen

CIP2A-proteiinia

mRNA ja CIP2A-proteiinia proteiinin ilmentyminen verrattuna DMSO käsiteltyjen solujen (kuvio. 6A, B; n = 3 kullekin solulinja). Tämä vaikutus oli selvempi soluissa että kanna MAPK-reitin mutaatio, kuten SW620 (

KRAS

) ja HCT116 (

KRAS

), kuin Caco2 solut, jotka ovat villityypin varten

KRAS

.

Caco2, HCT116 ja SW620-soluja käsiteltiin DMSO: lla tai MEK-inhibiittorin UO126 24 (n = 3 kullekin solulinja). (A) immunoblottianalyysi CIP2A-proteiinia ja p-ERK proteiinin ilmentymistä Caco2, HCT116 ja SW620. (B) Reaaliaikainen PCR-analyysi

CIP2A-proteiinia

mRNA ilmaisu (* 0,05; ** 0,005).

Keskustelu

Äskettäin ” Cancer Genome Atlas Network ”osoitettiin, että sääntelemätön c-Myc ilme on tunnusmerkki lähes kaikki CRC, riippumaton joukko erityisiä mutaatioita, jotka ovat läsnä jokaisessa kasvain [5]. Esimerkiksi mutaatiot tuumorisuppressorin

APC

ja onkogeenin

KRAS

johtaa säätelyä

MYC

mRNA [5]. On posttranskriptionaalisella tasolla, menetys miR34 perheen hypermetylaation, jota esiintyy yli 90% kaikista CRC, stabiloi

MYC

mRNA [17], [18]. Lisäksi hiirimallissa paksusuolensyöpä ohjaavat menetys

APC

osoittaa, että paksusuolen kasvaimen muodostumisen riippuu jatkuvasta c-Myc ilmaisun [19].

Toistaiseksi tiedetään vähän translaation jälkeisestä sääntely c-Myc tasot CRC. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme osoittaneet, että

CIP2A-proteiinia

ilmentyminen on kohonnut paksusuolen karsinooma näytteissä, verrattuna sen ilmentymistä normaalissa, paksusuolen kudosta, ja että

CIP2A-proteiinia

ilmentyminen korreloi negatiivisesti sekä OS ja kliinisiä patologisia parametrit. Koska ei ole validoitu katkaisurajapisteet varten

CIP2A-proteiinia

ekspressiotasoja selventää korkea vs. heikkoa ilmentymistä ryhmiä, käytimme mediaani mRNA: n ilmentymisen tasoa kuin cut-off-piste. Huolimatta suhteellisen pieni määrä potilaita Tutkimuksessamme ja siksi suhteellisen pieni määrä syöpään liittyviä kuolemantapauksia alaryhmäanalyyseissa, voisimme osoittaa merkittävän korrelaatio

CIP2A-proteiinia

tasoilla kasvaimeen liittyvien selviytymistä.

Kaksi aiemmissa tutkimuksissa analysoitiin ilmentymisen tasoja CIP2A-proteiinia CRC ja osoitti kohonneiden tasojen CRC suhteessa normaaliin limakalvolle, sopusoinnussa tässä raportoidut tulokset [13], [14]. Lisäksi läheinen korrelaatio CIP2A-proteiinia ja Myc tasolla on huomattu ennen [3], [13] ja osoitamme tässä, että kohonneet CIP2A-proteiinia vaaditaan pitämään Myc ilmentymistä CRC solulinjoissa. Yllättäen, korrelaatio OS nähtiin vain yksi aiempien tutkimusten [14]. Vaikka emme tiedä tarkkaa syytä ristiriita voidaan todeta, että molemmat Teng et al. [14] ja tutkimuksessamme osoitettu suhteellisen suuri osuus potilaista alhaisen ilmentymisen ryhmässä (68 ja 50% vastaavasti), kun taas Böckelman et al. [13] on määritelty vain 15%: lla potilaista alhaiset CIP2A-proteiinia ilmentyminen kasvaimissa. Ehdotamme, että nämä erot kerrostuminen potilaiden mukaan CIP2A-proteiinia pitoisuudet voivat selittää erilaisia ​​tuloksia. Käsitys, että CIP2A-proteiinia yli-ilmennetään paksusuolensyöpä, mikä parantaa Myc-proteiinin tasot ja vaikuttaminen kasvain liittyvä selviytymisen, on yhdenmukainen aiempien tulosten muissa kiinteitä kasvaimia [6]; [7]; [8]; [9]. Mahdollinen tutkimus tarvitaan sen selvittämiseksi, CIP2A-proteiinia ilme mRNA tai proteiini tasolla voi toimia ennakoiva merkki selviytymisen potilaalla on CRC.

On osoitettu aikaisemmin, että CIP2A-proteiinia stabiloi c-Myc estämällä sen PP2A -välitteisen hajoamisen kasvainsoluissa [3]. Tämän mukaisesti mallissa Esillä oleva tutkimus osoittaa, että downregulation c-Myc-proteiinin havaitaan, kun CIP2A-proteiinia vaiennetaan siRNA: illa tai shRNAs peräsuolen syöpä soluissa. Johtuen siitä, että käytimme solulinjat kätkeminen eri mutaatioita onkogeeniselle reitin yleisesti mutatoitunut CRC (Caco2: APC

mut, KRAS

paino, PI3K

paino; HCT116: APC

paino, p- kateniinin

mut, KRAS

mut, PI3K

mut; SW620: APC

mut, KRAS

mut, PI3K

paino), me olettaa, että riippuvuus c- Myc-proteiinin ilmentymisen on CIP2A-proteiinia ei riipu läsnäolo mutaatioiden WNT, PI3K /mTOR tai MAPK-väyliä, mutta tämä on arvioitava edelleen. Olemme myös havainneet, että shRNA välittämää ehtyminen CIP2A-proteiinia in HCT116 koolonkarsinoomasoluja lyhensi niiden kasvupotentiaalia. Tämä on sopusoinnussa raportit että CIP2A-proteiinia esto johtivat kasvun pysähtymisen ja vähentynyt klonogeeniset potentiaali useilla muiden pahanlaatuisten kasvainten [6]; [7]; [8].

PP2A defosforyloi Pakt ja CIP2A-proteiinia parantaa PI3K /mTOR signalointi estämällä PP2A välittämän defosforylointia Pakt vuonna maksasolukarsinoomat (HCC) [20]; [21], [22]. Tuloksemme osoittavat, että ehtyminen CIP2A-proteiinia ilmaisun kolorektaalisyövässä soluissa ei vaikuta Akt signalointia, toisin kuin havainnot HCC-soluissa. Olemme myös löytäneet tai vain vähäisiä muutoksia Pakt tasot tai tiedossa Akt alavirtaan tavoitteita. Todennäköisesti siksi PP2A aktiivisuutta joitakin sen substraattien (Akt) vaihtelee eri kudoksissa.

tiedetään vain vähän taustalla oleva mekanismi parannettu ilmaus CIP2A-proteiinia pahanlaatuisia soluja. Mahasyövän,

Helicobacter pylori

infektioita säätää ylös

CIP2A-proteiinia

niilmentymisen Src /Erk riippuvaisen reitin [11]. Ihmisen papilloomavirus 16E7 onkoproteiinia ylössäätelee

CIP2A-proteiinia

kohdunkaulan syövän [12]. Tällä hetkellä on epäselvää, mitä edesauttaa CIP2A-proteiinia yli-ilmentymisen paksusuolen syöpä. Kaksi havainnot tukevat olettamusta, että CIP2A-proteiinia ilmentyminen paksusuolensyöpä on alavirtaan MAPK-reitin. Ensinnäkin, edellinen työ osoitti, että CIP2A-proteiinia ilmentyminen korreloi positiivisesti EGFR [13]. MAPK reitti on yksi tärkeimmistä tavoitteista EGF-signalointia. Toiseksi osoitimme että CIP2A-proteiinia vaimentua jälkeen estämällä MAPK-reitin kolmessa paksusuolen sinoomasolulinjoja; downregulation solulinjoissa kätkeminen

KRAS

mutaatio (HCT116, SW620) on voimakkaampi kuin Caco2 ei kätkeminen MAPK-reitin mutaatio. Induktio CIP2A-proteiinia voi siis olla kriittinen välittäjänä, joka yhdistää vapautettu solusignaalivälitysteitä tehostetusti c-Myc ilmaisun CRC.

Yhteenvetona tämän tutkimuksen tulokset osoittavat, että

CIP2A-proteiinia

liittyy jossa peräsuolen syöpään liittyvät selviytymisen. Korkea ilmaus

CIP2A-proteiinia

mRNA korreloi pienemmällä DFS ja käyttöjärjestelmä. Näin ollen,

CIP2A-proteiinia

edustaa uutta ennustetekijä diagnoosi paksusuolen syövän. Lisäksi CIP2A-proteiinia voi olla lupaava terapeuttinen kohde kehitettäessä hoitoja paksusuolisyövän.

tukeminen Information

Kuva S1.

Kaplan-Meier -käyrät taudista vapaan eloonjäämisen kaikki potilaat (n = 226) suhteessa

CIP2A-proteiinia

mRNA ilmentymistilanne julkaistuissa mikrosiruanalyysillä. (A B) DFS kaikkien potilaiden mukaan microarray koetinsarjaa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0075292.s001

(EPS) B Kuva S2.

Disease elinaika potilailla, joilla on paksusuolen syövän UICC I-III vaiheessa ryhmitelty

CIP2A-proteiinia

mRNA ilmentymistilanne. (A) UICC I; (B) UICC II; (C) UICC III.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0075292.s002

(EPS) B Kuva S3.

Lineaarinen regressioanalyysi suhteellisen

CIP2A-proteiinia

mRNA ilmaisun normalisoitu kahta housekeeping geenejä, b2MG ja GAPDH (n = 104; R

2 = 0,86). Lineaarinen regressio on erittäin merkitsevä (p 0,001).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0075292.s003

(PSD) B Taulukko S1.

Alukesekvensseillä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0075292.s004

(DOCX) B Taulukko S2.

Ominaisuudet potilaalla on CRC ja yhdistyksen välillä

CIP2A-proteiinia

ilmaisun ja ennusteeseen viittaavia muuttujat (lymphovascular hyökkäyksen ja sijainti dokumentoitiin 100 potilasta).

doi: 10,1371 /journal.pone.0075292.s005

(DOCX) B

Kiitokset

Kiitämme Christian Jurowich, Christoph Isbert ja Andreas Thalheimer keräämiseen kasvainnäytteestä.