Krooninen sairaus

tiivistelmä

Taustat

Expression of Livin, jäsen estäjien apoptoosin proteiini perhe, liittyy kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen. Tavoitteet Tämän tutkimuksen oli arvioida, onko Livin vaikuttaa onkogeenisia biologista käyttäytymistä paksusuolisyövän soluja, ja dokumentoida suhdetta sen ilmaisun ja eri kliinispatologiset parametreja peräsuolen syövän.

Methods

Tutkimme vaikutus Livin kasvainsolujen käyttäytymiseen käyttämällä Sirna ja pcDNA3.1 vektorin SW480 ja DKO1 peräsuolen syövän solulinjoissa. Ilmentyminen Livin tutkittiin RT-PCR: llä ja immunohistokemia coloretcal syöpäkudoksissa. Apoptoottisten solujen visualisoitiin TUNEL määrityksen, ja lisääntyvät solut visualisoitiin Ki-67-vasta-värjäystä.

Tulokset

knockdovvn Livin tukahdutti kasvaimen solujen vaeltamiseen ja hyökkäyksen peräsuolen syövän soluissa. Pudotus Livin indusoi apoptoosia jopa säätelevä kaspaasi-3, -7, ja PARP toiminnan ja solusyklin pysähtymisen vähentämällä sykliini D1, sykliini D3, sykliiniriippuvainen kinaasi 4 ja 6, ja indusoimalla p27 ilmentymistä. MAPK signa- merkittävästi estänyt knockdovvn Livin. Sen sijaan yli-ilmentyminen Livin tehostetun kasvainsolun muuttoliikettä ja invaasiota, ja esti apoptoosin ja solusyklin pysähtymiseen. Keskimääräinen apoptoottinen indeksi (AI) arvo Livin kasvaimissa oli merkittävästi pienempi kuin AI Livin syöpäkasvain. Kuitenkin, ei ollut merkitsevää eroa Livin ilmaisun ja Ki-67 merkintöjä indeksi (KI). Livin ilmentyminen oli lisääntynyt peräsuolen syövän ja metastasoituneen imusolmuke kudoksiin verrattuna normaaliin peräsuolen limakalvoon ja ei-metastasoitunut imusolmuke kudosten ja liittyi kasvain vaiheessa lymphovascular invaasio, imusolmuke etäpesäke ja huono selviytymistä.

Johtopäätökset

Nämä tulokset osoittavat, että Livin liittyy kasvaimen etenemistä lisäämällä kasvain solun liikkuvuus ja estämällä apoptoosin peräsuolen syöpä.

Citation: Myung DS, Park YL, Chung CY, Park HC, Kim JS, Cho SB, et ai. (2013) Expression of Livin vuonna peräsuolen syövän ja sen suhteesta Kasvainsolun Käyttäytyminen ja ennuste. PLoS ONE 8 (9): e73262. doi: 10,1371 /journal.pone.0073262

Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 helmikuu 2013; Hyväksytty: 19 heinäkuu 2013; Julkaistu: 02 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Myung et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustus (0720570) National Research Development Program for Cancer Control Ministry of Health Welfare, Korean tasavalta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on yksi johtavista syistä syöpään liittyvien sairastuvuutta ja kuolleisuutta maailmassa. Vaikka on osoitettu, että 5 vuoden eloonjääminen on 90%, kun peräsuolen syöpä diagnosoidaan varhaisessa vaiheessa, 40% tapauksista on diagnosoitu, kun syöpä on edelleen paikallisia [1]. Nopea kehitys ymmärrystämme molekyyli- ja biologinen ominaisuudet paksusuolisyövän on saatu hyödyllistä tietoa osaksi synnyssä peräsuolen syöpä. Biomarkkerit on kehitetty tunnistamaan henkilöitä, jotka hyötyvät eniten syöpään valvonta- ja hallinta [2-5]. Identifiying biomarkkerit, joka voi havaita peräsuolen syövän aikaisemmin tai seurata syövän etenemisen mahdollistaisi personoinnin lääketieteen ja parantaa eloonjäämislukua syöpäpotilailla.

taustalla vaikutusmekanismeja syövän etenemisen on alettu purkaa. Raportoitiin molekyyli- ja biokemiallinen mekanismeja, jotka saattavat edistää fenotyypin muutosten hyväksi Karsinogeneesin ovat esti apoptoosin, tehostetut kasvainsoluproliferaation, lisääntynyt invasiivisuus, häiriön soluadheesion, angiogeneesin edistäminen, ja esti immuunivalvonnan. Nämä tapahtumat voivat edistää ja etenemiseen syövän [6-8].

Apoptosis on tärkeä rooli monissa biologisissa tapahtumissa, kuten morphogenesis, solujen liikevaihdon ja poistaminen haitallisia soluja. Häiriö apoptoosin voivat antaa selviytymisen etu pahanlaatuisten solujen kätkeminen geneettiset muutokset ja edistää siten syövän etenemistä [9,10]. Keskeinen tapahtuma apoptoosin on proteolyyttinen aktivaatio luokan kysteiini aspartyyli-proteaasien, kaspaasit. Aloitteentekijä caspases katkaisevat efek- caspases mikä puolestaan ​​huonontaa useita solunsisäisen proteiinin alustoissa ja siten aiheuttaa ominaisuus morfologinen apoptoosin tuntomerkkejä [11]. Nämä kaspaasi toiminta estyy inhibiittorit apoptoosin proteiinien (IAP: t) perheen. Tähän asti kahdeksan ihmisen IAP: t on tunnistettu, mukaan lukien c-IAP1, c-IAP2, NAIP, XIAP, ILP-2, Bruce, surviviinia ja Livin [12]. Livin tunnistettiin äskettäin olevan uusi anti-apoptoottisen geenin. Livin rekrytoimista kuolema reseptorin signalointi komplekseja, missä se estää kaspaasien aktivaatio vastaa apoptoosin ja suojaa soluja erilaisia ​​proapoptoottisten ärsykkeille. Livin liittyy induktion onkogeenisten fenotyyppejä, mukaan lukien invaasio, liikkuvuuteen, solujen lisääntymisen ja apoptoosin estämiseen ihmisen syöpäsolulinjoissa [13-16]. Lisäksi Livin ilmentyminen useimmissa ihmisen syövissä on parannettu ja korreloi syövän kehittymisen ja etenemisen [17-22]. Hiljentäminen Livin geenin avulla Sirna (siRNA) pienenee kasvaimen tilavuuden indusoimalla apoptoosin ksenograftimallia paksusuolisyövän [23]. Siksi Livin pidetään mahdollisena terapeuttinen kohde hoidettaessa peräsuolen syöpä.

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida, onko Livin vaikuttaa onkogeenisia biologinen käyttäytyminen ihmisen peräsuolen syövän soluja, arvioida Livin ilmentymistä ihmisen peräsuolen syöpä kudoksiin, ja tutkia korrelaatio Livin kanssa apoptoosin, kasvainsoluproliferaation ja kliinis ominaisuuksia, kuten selviytymisen.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

tutkimus hyväksyi Institutional Review Hallitus Chonnam National University Hwasun Hospital (Jeonnam, Korea). Kirjallinen suostumus saatiin jokaisen osallistujan ennen kudoksen hankintaa. Kaikki osallistujat antoivat kirjallisen suostumuksen tietonsa tallennetaan sairaalan tietokantaan ja käyttää tutkimustarkoituksiin.

Potilaiden ja kudosnäytteiden

Kaksikymmentä peräsuolen syöpä kudoksiin ja pariksi normaalin paksusuolen kudokset kerättiin colonoscopic koepala RNA ja proteiini valmisteluja Chonnam National University Hwasun Hospital. Formaliinifiksoidusta ja parafinoidut kudosnäytteitä 161 satunnaisesti valittua potilasta, joille oli tehty leikkaus peräsuolen syöpään Chonnam National University Hwasun Hospital tammikuusta 2004 joulukuu 2004 saatiin immunohistokemiaa. Yksikään potilas ei ollut tehty ennen leikkausta sädehoitoa tai kemoterapiaa. Patologinen raportit ja kliininen historia aikaan leikkauksen tarkistettiin potilastiedot. Kudosblokeista valittiin alkuperäisillä patologinen dioja ja valitsemalla lohkot, jotka osoittivat risteykseen normaalin paksusuolen epiteelin ja kasvaimen alueelle. Kasvaimet järjestetään mukaisesti Amerikan sekakomitean Cancer pysähdyspaikan järjestelmä [24]. Survival mitattiin leikkauksen aikana, kunnes seuranta 31. joulukuuta 2010.

Soluviljely ja siRNA transfektio

SW480 ja DKO1 Ihmisen peräsuolen syövän solulinjat saatiin American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) ja niitä viljeltiin DMEM (Hyclone, lainan, UT, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone), kostutetussa inkubaattorissa 37 ℃ 5% CO

2-ilmakehässä. Livin ja salattu siRNA ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) ja Qiagen (Valencia, CA, USA), tässä järjestyksessä. Livin cDNA subkloonattiin pcDNA3.1-vektoriin (Invitogen, Carlsbad, CA, USA). Livin rakentaminen varmistettiin sekvensoimalla. Erityinen geeni transfektoitiin käyttäen Lipofectamine

TM RNAiMAX ja Lipofectamine

TM 2000 (Invitrogen) mukaan valmistajan suositusten ja sitten inkuboitiin 48 tuntia. Lisäksi solut, jotka on transfektoitu pcDNA3.1-vektori käsitellään selektiivisesti 5-fluorourasiili (5-FU) (10 ug /ml, Choong-Wae, Chung-Nam, Korea) 48 tuntia.

Käänteinen transcription- polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) B

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen) ja käänteiskopioitiin kanssa MMLV transkription reagenssien (Invitrogen) mukaisesti valmistajan suositusten mukaisesti. PCR-monistus cDNA tehtiin käyttämällä geenispesifisiä alukkeita ja Go Taq

® DNA-polymeraasia (Promega, Madison, WI, USA). Seuraavat erityiset alukkeita; Livin 5′-CACACAGGCCATCAGGACAAG-3 ’/5′-ACGGCACAAAGACGATGGAC-3′; GAPDH 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ’/5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’.

Western blotting

Solulysaatit valmistettiin käyttämällä M-PER

® Mammalian Protein Extraction reagenssia (Thermo, Rockford, IL, USA) Halt

TM fosfataasinestäjällä ja Halt

TM proteaasiestäjäseostabletit (Thermo). Yhteensä proteiinit siirrettiin sähköllä PVDF-kalvoja (Millipore, Bedford, MA, USA), ja tietyt proteiinit blotattiin primaarisen vasta-aineen. Seuraavia vasta-aineita käytettiin: vasta-aineita Livin, X-kromosomin sitova IAP (XIAP), surviviinia ja β-tubuliinia ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Vasta-aineita ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi (ERK), fosfo-ERK, p38, ja fosfo-p38, c-Jun NH

2-terminaali kinaasin (JNK), fosfo-JNK, fosfo-Akt, Akt, fosfo-p65 , pilkottiin kaspaasi (3, 7, ja 9), lohkaistaan ​​poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP), sykliini-riippuvaisen kinaasin 4 (CDK4), CDK6, sykliini D1, sykliini D3, sykliini B1, p21, p27, p57, p15, p16 ja toinen mitokondrioiden johdettuja aktivaattori kaspaasien /suora IAP sitovan proteiinin kanssa matala pl (SMAC /DIABLO) ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Immunoreaktiivisia proteiinit visualisoitiin parannetun kemiluminesenssidetektiolla järjestelmä HRP-substraattia (Millipore) ja LAS-4000 luminoiva kuva-analysaattori (Fujifilm, Tokio, Japani).

Cell invaasiomääritys

Invasiivisen kyky laskettiin useissa solujen kautta kulkeneiden TranswellTM suodatinkammioihin (Corning Inc., Corning, NY, USA) 8 um huokosia. Transwell-suodattimet päällystettiin 1% gelatiinia yli yön ja kuivattiin huoneen lämpötilassa (RT). Solut ympättiin elävää solua 2 x 10

5 0,2% BSA väliaine ylemmässä kammiossa. Ihmisen plasman fibronektiinin (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) lisättiin kemoattraktantti 0,2% BSA: ta väliaineen alempaan kammioon. Sen jälkeen, kun 24 tunnin inkubaation tunkeutuneet solujen alapinnan Transwell värjättiin Diff-Quik-liuosta (Sysmex, Kobe, Japan), ja laskettiin viidessä valitussa aloilla valomikroskoopilla. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta solujen määrä /kentän kolmessa erillisessä kokeessa.

Cell migraatiokokeessa

solujen migraatiomääritys suoritettiin käyttämällä Culture-Insertit (2 x 0,22 cm

2; Ibidi, Regensburg, Saksa). Voit luoda haava aukko, solut ympättiin Kulttuuri-Inserts, jotka varovasti poistetaan sen jälkeen 24 tunnin inkuboinnin steriilejä pinseteillä. Edistymistä haavan valokuvattiin käännettyä mikroskooppia. Välinen etäisyys rakojen normalisoitiin 1 cm ottamisen jälkeen kolmesta satunnaisissa kohdissa.

Solujen elinkelpoisuus

Solujen elinkyky määritettiin EZ-CyTox (tetratsoliumsuolojen, WST-1) solunelinkykyisyysmääritys kit (Daeil Lab Inc., Seoul, Korea). Levittämisen jälkeen WST-1-reagenssia 37 ℃, solujen elinkelpoisuus mitattiin käyttämällä mikrolevyjen lukijaa (Infinite M200, Tecan, Austria GmbH, Wien, Itävalta) kanssa Magellan V6 tietojen analysointi ohjelmistot (Tecan). Rinnakkaiseen koloon käytettiin kussakin kokeessa ja kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolmena kappaleena.

Virtaussytometrinen analyysi

Transfektoidut solut trypsinoitiin, kerättiin PBS: ssä ja suspendoitiin uudelleen 1 x sitomispuskurissa (BD Biosciences , San Diego, CA, USA). Solususpensioita inkuboitiin APC anneksiini V ja 7-amino-aktinomysiini D (BD Biosciences) huoneenlämpötilassa. Sillä solusyklin analyysi, soluja inkuboitiin 10 ug /ml ribonukleaasi A: ta (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ja 50 ug /ml propidiumjodidia (PI) huoneenlämpötilassa pimeässä. Väestön anneksiini-V-positiivisten solujen ja solusyklin vaihe analysoitiin käyttämällä BD Cell Quest

® versio 3.3 väline (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) ja WinMDI versio 2.9-ohjelmisto (Scripps Research Institute, San Diego, CA, USA).

immunohistokemia

Parafiini kudosleikkeiden potilailta poistettiin parafiini, vedettömät ja noutaa haku puskurilla. Kudoksia käsiteltiin Peroxidase-Estoliuos (Dako, Carpinteria, CA, USA) estää endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus ja inkuboitiin polyklonaalisella kanin anti-humaani Livin primaarisessa laimenninliuosta (Invitrogen) yön yli 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen TBST, kudokset värjättiin Dako, Real

TM Kuvitella HRP /DAB tunnistusjärjestelmä (Dako). Stained kudokset katsottuna ja valokuvattiin valomikroskoopilla.

arviointi Livin ilmaisun

immunovärjättiin arvioitiin näytteet itsenäisesti kaksi tarkkailijaa tietämättä kliinis datan. Jos oli ristiriita, yksimielisyys saavutettiin lisäarviointia. Intensiteetti positiivisten syöpäsolujen luokiteltiin asteikolla neljä: 0, mitään värjäytymistä syöpäsolujen; 1, heikko värjäytyminen; 2, kohtalainen värjäytyminen; 3, vahva värjäytyminen. Prosenttiosuus värjätään syöpäsolujen myös arvostellaan asteikolla neljä: 0, ei mitään; 1, 10%; 2, 10-50%; 3, 50%. Intensiteetti luokitus kerrottiin prosenttia tahra rating saada yleisarvosanaksi. Keskimääräinen yleinen pistemäärän 161 kasvainten analysoitu oli 4,0. Siten keskimääräinen yleisarvosanaksi 4,0 valittiin rajakohta erotteleva Livin ilmentymistilanne. Yksilöt, joiden pistemäärä 4 pidettiin positiivisina, ja ne, joilla on pisteet ≤ 4 pidettiin negatiivinen ilmaus.

arviointi kasvainsoluproliferaation

Lisääntyvät kasvainsoluja näkyviin värjäämällä immunohistokemiallisesti käyttäen anti-Ki-67-vasta-ainetta (MIB-1, joka oli laimennettu 1: 150; Dakopatts, Glostrup, Tanska). Selvät ydinaseiden Ki-67 immunoreaktiivisuus pidettiin positiivisena. Ki-67 merkintöjä indeksi (KI) esitetään useita Ki-67-positiivisia ytimet /1000 kasvainsolujen ytimiä. KI on käytetty arvioimaan proliferatiivinen kyky syöpäsolujen.

Terminal deoksinukleotidyylitransferaasia (TdT) -välitteisen deoksiuridiinista trifosfaatiksi (dUTP) nick end merkinnät (TUNEL) määritys

apoptoottiset solut ja elimet olivat havaitaan käyttämällä DeadEnd

TM Kolorimetrinen TUNEL System (Promega, Madison, WI, USA), mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, kudosleikkeet poistettiin vaha ja sammutettua kautta arvostellaan alkoholia sarja. Läpäiseväksi sitten suoritettiin proteinaasi K -liuosta 15 minuutin ajan. Leimaus suoritettiin lisäämällä entsyymin TdT- reaktio sekoita kudosleikkeiden dioja 60 minuutin ajan 37 ℃ kosteassa kammiossa. Leimatut solut kehitettiin käyttämällä streptavidiini HRP ja 3,3-diaminobentsidiini entsyymin substraatti. Kvantitatiivinen laskentamenetelmä apoptoottisia soluja käytettiin kaksi riippumatonta patologia. Kaikki kohdat tutkittiin HPF (suurennus 40 x 10). Kentät valittiin korkein merkitty alue tapauskohtaisesti. Apoptoottiset indeksi (AI) ilmaistiin positiivisten tumien kuten apoptoottisten kappaleiden joukossa 1000 kasvainsolujen ytimeksi.

Tilastollinen

Tiedot vähintään kolmen erillisen kokeen käytettiin vertaamaan ryhmien välillä . Data esitetään keskiarvoina ± standardipoikkeamat. Opiskelijan

t

-testi määrittämiseen käytettiin tilastollista merkitystä intergroup vertailuja. Χ

2-testi ja Fisherin testiä tarvittaessa käytettiin vertaamaan Livin ilmaisun eri kliinis parametreja. Väliset suhteet Livin ilmaisun ja KI tai AI arvioitiin Studentin

t

-testi. Vakuutusmatemaattiset eloonjäämisluvut potilaille, joilla on positiivinen tai negatiivinen Livin lauseke arvioitiin mukaisesti Kaplan-Meier menetelmällä, ja erot testattiin log-rank-testi. Tilasto-paketti Social Sciences (SPSS /PC + 15,0, Chicago, IL, USA) käytettiin kaikissa analyyseissä. P-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Vaikutus Livin on hyökkäystä, maahanmuuttoa ja leviämisen ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja

tutkimiseksi funktio Livin on onkogeenisiä biologisesta käyttäytymisestä peräsuolen syövän solut, Livin siRNA tai pcDNA3.1-Livin käytettiin ohjaamaan endogeenisen Livin geeniekspression SW480 ja DKO1 ihmisen paksusuolen syövän solulinjat. Livin geeniekspressio kaikilla testatuilla soluissa, osoitti erityistä vähennystä mRNA ja proteiini tasoilla transfektoimalla Livin siRNA ja tietty nousu transfektoimalla pcDNA3.1-Livin. Numerot hyökkäävän Livin siRNA-transfektoiduissa SW480 ja DKO1 solut 30,2 ± 3,1 ja 55,3 ± 11,0, kun taas 51,8 ± 9,5 ja 115,3 ± 10,3 solua havaittiin salattujen siRNA-transfektoiduissa soluissa. Solut mitattiin kuusi sattumanvaraisesti 0,5 x 0,5 mm

2 mikroskooppikentästä käyttäen 10 ug /ml fibronektiiniä kuin kemoattraktantti. Välinen ero kahden solutyypin oli merkittävä (p = 0,015 ja p 0,001, vastaavasti). Sen sijaan, useita hyökkääviä solujen määrä oli lisääntynyt pcDNA3.1-Livin transfektoitujen SW480 ja DKO1 soluja verrattuna tyhjään-pcDNA3.1 transfektoiduissa soluissa (p = 0,024 ja p = 0,012, vastaavasti) (kuvio 1A). Keinotekoinen haavan aukon levyt salattu siRNA-transfektoiduissa soluissa tuli huomattavasti kapeampi kuin että Livin siRNA-transfektoiduissa soluissa 48 h SW480 ja 24 h DKO1 solujen (p = 0,012 ja p = 0,016, vastaavasti). Keinotekoinen haavan aukon pcDNA3.1-Livin transfektoitujen SW480-solut tuli huomattavasti kapeampi kuin tyhjissä-pcDNA3.1 transfektoitujen solujen 24 ja 48 tuntia (p = 0,034 ja p = 0,008, vastaavasti) (kuvio 1 B). Solulisäkasvumääritykselle suoritettiin 2, 3, 4, ja 5 päivää transfektion jälkeen Livin siRNA tai pcDNA3.1-Livin käyttää potentiaalin Livin soluproliferaatioon. Lisääntyvien solujen, kuten määritettiin absorbanssilla, väheni merkittävästi Livin siRNA-transfektoiduissa SW480-soluissa verrattuna salattu siRNA-transfektoiduissa soluissa 3, 4 ja 5 päivää (p = 0,005, 0,001 ja 0,022, vastaavasti), mutta ei merkitsevä ero havaittiin DKO1 soluissa. Lisäksi kaikilla testatuilla soluissa, ei ollut merkittävää eroa solujen lisääntymisen välillä pcDNA3.1-Livin ja tyhjä-pcDNA3.1 transfektoiduissa soluissa (kuvio 1C).

(A) vaikutus Livin on hyökkäyksen peräsuolen syövän soluja. Hyökkäys määritys käyttämällä siRNA tai pcDNA3.1-transfektoiduissa soluissa suoritettiin. Värjättiin tunkeutuvat solut laskettiin ja esitetään graafisesti ryhmien välillä. Määrä LS-transfektoituja soluja, jotka tunkeutuivat oli merkittävästi alhaisempi kuin SS-transfektoitujen solujen. Määrä tunkeutumaan solujen oli merkitsevästi korkeampi LV-transfektoiduissa soluissa verrattuna EV-transfektoiduissa soluissa (keskiarvo ± keskivirhe [SE], n = 6; * p 0,05). (B) vaikutus Livin siirtolaisuudesta paksusuolisyövän soluja. Haavanparantamislaite määritys käyttämällä siRNA tai pcDNA3.1-transfektoiduissa soluissa suoritettiin ja kuvaajat solumigraation näytetään suhteellisena paranemista matkoja. Solumigraation merkittävästi häiriintynyt LS-transfektoiduissa SW480 ja DKO1 solujen ja kasvoi LV-transfektoiduissa SW480-solujen (keskiarvo ± SE, n = 3; * p 0,05). (C) Vaikutus Livin proliferaatioon paksusuolisyövän soluja. Absorbanssi osoittaa lisääntyvien elävien solujen vähentynyt LS-transfektoitujen SW480-solujen, mutta ei ollut merkittävää eroa solujen lisääntymisen välillä LV ja EV transfektoidut solut (keskiarvo ± SE, n = 3, * p 0,05). SS; ryntäily siRNA, LS; Livin siRNA, EV; Tyhjä-pcDNA3.1, LV; pcDNA3.1-Livin.

Vaikutus Livin on apoptoosin ihmisen peräsuolen syövän solut

Suoritimme virtaussytometristen analyysien vaikutusten arvioimiseksi Livin apoptoosiin. Solu apoptoottinen korko aiheuttama transfektiolla Livin siRNA kasvoi merkittävästi, verrattuna aiheuttama transfektiolla salattu siRNA (6,9

vs.

19,6%) vuonna SW480-soluissa mutta Livin knockdown oli minimaalinen vaikutus apoptoosiin (11,3

vs.

16,7%) in DKO1 soluissa (kuvio 2A). 5-FU on hyvin tiedetään indusoivan apoptoosia ja vaikuttaa solusyklin syöpäsoluja. Yliekspressio Livin transfektoimalla pcDNA3.1-Livin esti apoptoosin SW480-solujen vaste 5-FU, mutta yliekspressio Livin oli minimaalinen vaikutus apoptoosin DKO1 soluissa (kuvio 2A). Tutkimme lisäksi kaspaasin erityistoimia määrittää kaspaasien aktivaatio aikana knockdown ja yliekspressio Livin. Lohkaista caspases-3 ja -7 ja PARP ilmaisut olivat ajan säännelty SW480 ja DKO1 solujen jälkeen Livin Knockdown ja alassäädetty jälkeen yliekspressio Livin (kuvio 2B). Kuten kuviossa 2C on esitetty, Surviviiniproteiini taso väheni johtuen Livin pudotus on SW480 ja DKO1 soluja, mutta XIAP ja SMAC /DIABLO proteiinin tasot eivät muuttuneet vasteena Livin pudotus. Lisäksi surviviinin, XIAP ja SMAC /DIABLO proteiinin tasot eivät muuttuneet sen jälkeen, kun yli-ilmentyminen Livin.

(A) osuus apoptoottisten solujen aiheuttama transfektiolla LS oli suurempi kuin se, minkä indusoivat transfektiolla SS (6,9 vs. 19,6%) vuonna SW480-soluissa mutta Livin knockdown oli minimaalinen vaikutus apoptoosiin (11,3 vs. 16,7%) vuonna DKO1 soluissa. Yliekspressio Livin transfektoimalla LV esti apoptoosin SW480-solujen vaste 5-FU, mutta yli-ilmentyminen Livin oli minimaalinen vaikutus apoptoosin DKO1 soluissa (B) ekspressio pilkottiin kaspaasi-3, -7, -9, ja PARP proteiineja. Kaspaasi-3, -7, ja PARP ekspressio lisääntyi SW480 ja DKO1 soluissa, sen jälkeen Livin pudotus, ja laski sen jälkeen, kun yli-ilmentyminen Livin (C) Expression of apoptoosin säätelyproteiineja. Surviviiniproteiini taso laski seuraavat Livin Knockdown in SW480 ja DKO1 soluja, mutta XIAP ja SMAC /DIABLO proteiinin tasot eivät muuttuneet vastauksena Livin knockdown. Lisäksi Surviviinivasteita, XIAP ja SMAC /DIABLO proteiinin tasot eivät muuttuneet, kun yliekspressio Livin. PARP; Poly (ADP-riboosi) polymeraasi, XIAP; X-kromosomi sitova IAP, SMAC /DIABLO; Toinen mitokondrion johdetut aktivaattori kaspaasien /suora IAP sitovan proteiinin kanssa matala pl, SS; ryntäily siRNA, LS; Livin siRNA, EV; Tyhjä-pcDNA3.1, LV; pcDNA3.1-Livin, 5-FU; 5-fluorourasiili, 7-AAD; 7-amino-aktinomysiini D.

Vaikutus Livin solusyklin pysähtymisen ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja

Suoritimme virtaussytometristen analyysien tunnistaa, onko Livin voisi muuttaa solusyklin jakeluun. Livin Knockdown johti solusyklin pysähtymisen G0 /G1 vaiheessa SW480-solujen ja S-vaiheen DKO1 soluja (kuvio 3A). 5-FU indusoi solukierron pysähtymisen vuonna subG1 vaiheessa SW480 ja G0 /G1 vaiheessa DKO1 soluja. Yliekspressio Livin esti 5-FU aiheuttama solukierron pysähtymisen SW480-soluissa ja oli hyvin vähäinen vaikutus DKO1 soluissa (kuvio 3A). Seuraavaksi arvioitiin vaikutuksia Livin eri CDK: n estäjät (CDKIs) osallistuu solusyklin pysähtymisen ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja. Kuten kuviossa 3B p27-proteiinin taso nousi merkittävästi Livin Knockdown, ja laski yliekspressio Livin in SW480 ja DKO1 soluja. Kuitenkin p21, p57, p15 ja p16-proteiinin tasot eivät muuttuneet vastauksena pudotus ja yliekspressio Livin. Sykliinit ja CDK negatiivisesti säännellään CDKIs. Siksi tutkimme vaikutus Livin on ilmaissut tasoilla sykliini D1, sykliini D3, sykliini B1, CDK4 ja CDK6. Kuten kuviossa 3C on esitetty, sykliini D1, sykliini D3, CDK4 ja CDK6-proteiinin tasot olivat merkitsevästi väheni Livin pudotus, ja lisäsi sykliini D1 ja CDK4: n yli-ilmentyminen on Livin in SW480 ja DKO1 soluja.

( A) Livin knockdown johti solusyklin pysähtymisen G0 /G1 vaiheessa SW480-solujen ja S-vaiheen DKO1 soluja. 5-FU indusoi solukierron pysähtymisen vuonna subG1 vaiheessa SW480 ja G0 /G1 vaiheessa DKO1 soluja. Yliekspressio Livin esti 5-FU aiheuttama solukierron pysähtymisen SW480-soluissa ja oli hyvin vähäinen vaikutus DKO1 soluissa. Yksi edustava koe kolmesta itsenäisestä kokeesta on esitetty. (B) Expression of sykliiniriippuvaisen kinaasin (CDK) estäjä proteiineja. P27-proteiini taso lisääntyi merkitsevästi Livin Knockdown ja laski yliekspressio Livin in SW480 ja DKO1 soluja. Kuitenkin p21, p57, p15 ja p16-proteiinin tasot eivät muuttuneet vastauksena pudotus tai yliekspressio Livin. (C) Expression Sykliinien ja sykliini-riippuvaisen kinaasin (CDK) proteiineja. Sykliini D1 sykliini D3, CDK4 ja CDK6 proteiinin tasot olivat merkitsevästi väheni Livin Knockdown ja lisäsi sykliini D1 ja CDK4 yliekspressiolla Livin in SW480 ja DKO1 soluja. SS; ryntäily siRNA, LS; Livin siRNA, EV; Tyhjä-pcDNA3.1, LV; pcDNA3.1-Livin.

Vaikutus Livin solunsisäisiin signalointireitteihin osallisena apoptoosin ja solukierron pysähtymisen ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja

Tutkimme vaikutus Livin on stimulaation solunsisäinen signalointi johtavia reittejä apoptoosin ja solukierron pysähtymisen SW480 ja DKO1 solujen tutkimaan mahdollisia mekanismeja apoptoosin ja solusyklin pysähtymiseen. Fosforylointireaktio tasot ERK1 /2, JNK ja p38 ovat alaspäin säädeltyjä Livin knockdowned SW480 ja DKO1 soluja (kuva 4). Mutta Akt ja p65 fosforylaation pysyivät ennallaan Livin knockdown. Lisäksi ERK1 /2, JNK, p38, Akt ja p65 fosforylaation pysyivät ennallaan yliekspressiolla Livin.

fosforylaatio tasot ERK1 /2, JNK ja p38 lasku seurasi Livin knockdovvn SW480 ja DKO1 soluja. Mutta Akt ja p65 fosforylaation tasoja osoittanut mitään muutosta seuraavan Livin knockdown. Lisäksi, ERK1 /2, JNK, p38, Akt ja p65 fosforylaation tasoa ei muutettu yliekspressio Livin. SS; ryntäily siRNA, LS; Livin siRNA, EV; Tyhjä-pcDNA3.1, LV; pcDNA3.1-Livin.

Livin ilmentymistä ihmisen peräsuolen syövän ja metastasoituneen imusolmuke kudosten

Vahvista tulokset peräsuolen syövän solulinja tutkimuksissa arvioimme Livin lauseke on RNA: n ja proteiinin tasot RT-PCR: llä, Western-blottauksella ja immunohistokemia ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän kudoksissa, pariksi normaali peräsuolen limakalvon, ja metastaattisen ei-metastaattinen imusolmuke kudoksia samojen potilaiden otettu colonoscopic biopsia ja kirurgisista näytteistä. Vuonna colonoscopic biopsianäytteistä, olemme vahvistaneet up-regulation of Livin ilmentymisen syöpäkudoksiin verrattuna, että pariksi normaali limakalvo on RNA: n ja proteiinin tasot (p = 0,035 ja p = 0,020, vastaavasti) (kuvio 5A, B). Kun parafiini kudoksen osaan, Livin proteiini ei ole tai ovat vain heikosti immuno- normaalissa paksusuolen ja peräsuolen limakalvon (kuvio 6A). Immunovärjäystä Livin proteiinin pääasiassa tunnistettu ytimet syöpäsolujen, mutta ei ollut havaittavissa kasvaimen strooman (kuvio 6A). Immunovärjäys Livin metastaattisessa imusolmukkeessa kudoksissa oli huomattavasti voimakkaampi kuin ei-metastaattinen imusolmuke kudoksissa (kuvio 6B). Kokonaisarvosana Livin immunovärjäyty- metastaattisessa imusolmuke kudoksissa oli merkittävästi suurempi kuin vuonna nonmetastatic imusolmuke kudoksissa (

P

0,001) (kuvio 6C).

(A) Livin mRNA ilmaisun (B) Livin proteiinin ilmentymisen. Expression of Livin ylössäädellään syövän kudoksissa verrattuna pariksi normaaliin limakalvoon mRNA ja proteiini tasoilla tuoreen colonoscopic biopsianäytteistä. Kukin pylväs edustaa keskiarvoa ± SE 20 tapausta. * P 0,05 ja normaalissa peräsuolen limakalvo. T; peräsuolen syöpä kudosta, N; pariksi normaali peräsuolen limakalvo.

(EN) Livin proteiini pääasiassa immuno- tumissa syöpäsolujen mutta ei tai vain heikosti immuno- normaalissa peräsuolen limakalvo (x 100). (B) toinen immuno- Livin metastaattisessa imusolmukkeessa kudoksissa oli huomattavasti voimakkaampi kuin ei-metastaattinen imusolmuke kudoksissa (x 100). (C) kokonaisarvosana Livin immunovärjääminen metastaattisessa imusolmuke kudoksissa oli merkittävästi suurempi kuin ei-metastasoituneen imusolmuke kudokset (* p 0,001). T; peräsuolen syöpä kudosta, N; pariksi normaali peräsuolen limakalvon, NL; ei-metastaattinen imusolmukekudoksesta, ML; metastaattinen imusolmukekudoksesta.

väliset korrelaatiot Livin ilmaisun ja kasvainsolujen proliferaatiota ja apoptoosia ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syöpiä

Ki-67 immunoreaktiivisuus havaitaan pääasiallisesti ytimet syöpäsolujen (kuvio 7A ). Ki 161 kasvainten vaihtelivat 21,9-85,6 ja keskiarvo KI 52,8 ± 15,1. Mitään merkittävää eroa ei havaittu Livin ilmaisun ja KI: a (p = 0,504) (taulukko 1). Standard morfologiset kriteerit apoptoottiset solut TUNEL määritystä ovat läsnä helmillä tai näivettynyt kromatiinin ja apoptoottiset kappaleet, joilla on selkeä halo (kuvio 7B). AI varten 161 kasvainten vaihtelivat 0,6-30,0 ja keskiarvo AI 8,8 ± 5,6. Keskimääräinen AI arvo Livin-positiivisia kasvaimia oli 6,4 ± 3,7, mikä oli merkitsevästi pienempi kuin AI Livin-syöpäkasvain (p = 0,009) (taulukko 1).

(A) immunovärjäys Ki-67 . Immunovärjäystä Ki-67 osoittaa vahvaa ydinvoiman positiivisuuden syöpäsoluissa mutta on harvoin myönteinen normaalissa peräsuolen limakalvo (x 200). (B) Detection apoptoottisten solujen (nuoli) TUNEL värjäys. Apoptoottisia soluja klassiset piirteet DNA tiivistymistä on osoittanut, on halo koostuu pyknotic tuma ja kutistunut sytoplasmassa (nuoli pää) kolorektaalisyövässä kudoksissa mutta TUNEL värjäytyminen ei ole positiivinen normaalissa peräsuolen limakalvo (x 400). TUNEL, terminaali deoksinukleotidyylitransferaasi (TdT) -välitteisen deoksiuridiinista trifosfaatiksi (dUTP) nick end merkintöjä. T; peräsuolen syöpä kudosta, N; pariksi normaali peräsuolen limakalvo.

Indeksit

Yhteensä (n = 161) B Livin ilmaisu

p-arvo

Negatiivinen (n = 86) B positiivinen (n = 75)

KI (keskiarvo ± SD) 52,8 ± 15.151.1 ± 14.754.3 ± 15.60.504AI (keskiarvo ± SD) 8,8 ± 5.611.3 ± 6.46.4 ± 3.70.009Table 1 . väliset korrelaatiot Livin ilmaisun ja kasvainsoluproliferaation ja apoptoosin kolorektaalisyövissä.

KI, Ki-67 merkintöjä indeksi; AI, apoptoottiset indeksi;