Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tämän tutkimuksen tarkoituksena on selvittää geneettisen taajuus Gnas aktivoivia mutaatioita peräsuolen syövän ja vastaava patologia Gnas mutantti kasvaimia. Onkogeeninen mutaatiot Gnas on kuvattu useita kasvaimia, mukaan lukien ne, aivolisäkkeen, munuaisen, haiman, ja viime aikoina, paksusuolen syöpä. Sen varmistamiseksi taajuus paksusuolensyöpä käytimme herkkä pyrosekvensointi alustan mutaation havaitsemista R201C ja R201H Gnas kuormittajat Tuumorinäytteissä edustavat kaikkien kliinisten vaiheissa. Olemme lisäksi analysoitiin KRAS ja BRAF mutaatioita kuin aiemmissa raporteissa on osoitettu, että nämä usein yhteistyössä esiintyä aktivoivia Gnas mutaatioita. On 428 paksusuolen kasvaimet analysoitiin mutaatiot Gnas oli läsnä 10 näytettä (2,3%), mikä osoittaa, tämä on merkittävä, vaikkakin harvoin, mutaatio ja peräsuolen kasvaimia. Yhdeksän Gnas mutantti kasvaimia (90%) kanna samanaikaisesti aktivoivia mutaatioita joko KRAS tai BRAF onkogeeni, joka oli merkittävästi suurempi kuin Mutaatiofrekvenssi näiden geenien kasvaimen väestöstä (56%, p 0,0305). Kaikki kymmenen Gnas mutantti kasvaimia syntyi oikeaan (proksimaalinen) paksusuoli (p 0,007), ja 7 8 tarkastellaan tapauksia ilmeni selvästi villous morfologia. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että Gnas mutantti koolontuumoreissa yleisesti on synkroninen mutaatioita KRAS tai BRAF, ovat oikeanpuoleinen paikkaan, ja ovat yhteydessä villous morfologia.

Citation: Fecteau RE, Lutterbaugh J, Markowitz SD, Willis J, Guda K (2014) Gnas Mutaatiot määritellä tietyt oikeanpuoleinen, RAS Mutant, villous Colon Syövät. PLoS ONE 9 (1): e87966. doi: 10,1371 /journal.pone.0087966

Editor: Robert Oshima, Sanford Burnham Medical Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu 17. lokakuuta 2013 Hyväksytty: 31 joulukuu 2013; Julkaistu: 30 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Fecteau et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee PHS avustuksia 1P50CA150964 (SDM, JW, KG), CA148980 (KG), P30CA43703, T32GM007250 (REF) ja CA059366 (REF) ja lahjoja Marguerite Wilson Foundation (SDM), Leonard ja Joan Horvitz Foundation (SDM ). Richard Horvitz ja Erica Hartman-Horvitz Foundation (SDM), ja National peräsuolen syövän Research Alliance (SDM) Rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen kasvainten synnyssä on ominaista peräkkäin geneettisiä poikkeavuuksia, jotka muuttavat normaalin paksusuolen epiteelin osaksi kohdunkaulan syöpä [ ,,,0],1]. Olemme aiemmin määritellyt 140 geenejä, jotka käyvät läpi toistuvia somaattisia mutaatio kolorektaalisyövässä (CRC), mikä viittaa siihen, nämä ovat todennäköisesti kuljettajien syövän etenemisen [2], [3]. Yksi näistä geeneistä oli Gnas, jossa me sai toistuvaa mutaatiot kodonissa 201, joka muuttaa erittäin konservoituneita Arg

201 joko kysteiini (R201C) tai histidiini (R201H) [2], [3]. Gnas on tunnettu onkogeeni, joka on ensimmäiseksi kuvattu kasvuhormonia erittävät aivolisäkkeen adenoomien ja on sittemmin todettu olevan mutatoitunut lukuisissa kasvainten, pääasiassa kodonissa 201 hotspot [4] – [7]. Gnas kodonissa 201 mutaatiot ovat erityisen yleisiä intrapapillary mucinous neoplasiat (IPMN) haima, jossa 67%: ssa tapauksista ovat mutantti [8]. Päätuote on Gnas lokuksen Gsα alayksikön heterotrimeeristen G-proteiinien, toimii signaalien muuntamiseksi G-proteiiniin kytkettyjen recptors (GPCR: t) on Vaikuttajaentsyymien adenylaattisyklaasin G stimuloivaa (Gs) reitti, joka johtaa tuotannon syklisen AMP (cAMP). Sekä R201C ja R201H mutaatiot johtavat konstitutiivisen aktivaation Gsα ja autonomisten cAMP-tuotantoa [9], [10].

IPMNs, Gnas mutaatiot usein liittyy mutaatioiden KRAS, jossa 51% Gnas mutantti tapauksissa myös laakeri mutaatiot KRAS [8]. Aktivoivat mutaatiot KRAS, ja vähäisemmässä määrin, sen alavirtavaikuttajainhibiittorit BRAF, ovat yleisiä tapahtumia paksusuolensyöpä. Lisäksi täysi exome sekvensointi paksusuolisyövän näytteiden ryhmämme ja yhteistyökumppanit paljasti päällekkäisiä Gnas ja KRAS mutaatioita pienessä kohortin paksusuolen kasvaimista, mikä osoittaa Gnas mutaatiot koolonsyöpien voi usein liitettävä mutaatiot KRAS ja /tai BRAF [2] .

Raportoitu taajuudet Gnas aktivoivia mutaatioita CRC ollut erilainen keskuudessa eri ryhmien, jotka vaihtelevat niin vähän kuin 0,5%: sta 9% [2], [11] – [13]. Tässä tutkimuksessa käytimme herkkä pyrosekvensointi alustan sekvensoida kodonin R201 mutaatiostatuksesta hotspot kohortin 428 satunnaista paksusuolen kasvaimet selvittää tarkemman taajuuden CRC. Olemme myös määritettiin mutaatiot KRAS ja BRAF määrittää esiintyvyys samanlainen Gnas /KRAS tai Gnas /BRAF mutaatioiden meidän kasvain kohortissa. Kliiniset ja patologinen tietojen tarkasteli onko Gnas mutantti kasvaimia liittyy ainutkertaisia ​​kliinisiä tai morfologisten fenotyyppejä. Tässä osoitamme, että Gnas mutantti koolontuumoreissa satamaan toistuvia KRAS tai BRAF mutaatioita, kohdistaa anatominen proksimaalinen ”oikeanpuoleinen” paksusuoli, ja näytteille villous morfologia.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

kasvainnäyte suoriteperusteinen protokollaa nimeltä ”CWRU 7296: Colon epiteelikudosta Bank”, hyväksyttiin yliopistollisen sairaalan asia Medical Center Institutional Review Board for Human Investigation osoitettuun UH IRB numero 03-94-105. Tämän pöytäkirjan hävittää kudos saatiin läpi kirjallinen lupa potilailta tutkimuskäyttöön.

kasvain näytteet

Kasvaimen näytteet saatiin pakastetusta arkistosta, joka koostui 428 valitsemattomat peräsuolen syöpiä ilman raportoitu perhe historia (jäljempänä satunnaista peräsuolen adenokarsinooman) kertyneet edellä mainituissa protokollaa. Kliiniset tiedot saatiin kootut yksilöllisten patologian tapausselostuksissa kunkin kasvaimen. Mikroskooppinen tarkastelu kasvain morfologia valitut näytteet suoritettiin anatominen patologi (J.W.). Kaikki näytteet analysoitiin mutaatiot Gnas kodonissa 201, KRAS kodonien 12, 13, 61, ja 146, ja BRAF kodonissa 600 käyttämällä sekä Sangerin sekvensointia ja pyrosekvensointi.

DNA: n uutto ja MSI testaus

genomi-DNA: n uutto tuumorinäytteistä suoritettiin käyttäen joko standardia guanidiinitiosyanaatti-protokollaa [14], tai DNeasy Blood and Tissue Kit (QIAGEN). Testaus MSI asema genomisen lokuksen BAT26 ja BAT40 suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [15].

pyrosekvensointi

pyrosekvensointi analyysi Gnas kodonin 201 tehtiin kaikista näytteistä. Pyrosekvensointi määritykset suunniteltiin käyttäen PSQ Assay Design -ohjelman (QIAGEN, Chatsworth, CA), joka sisälsi Gnas kodoni 201, KRAS kodonit 12 ja 13, KRAS kodoni 61, KRAS kodoni 146, ja BRAF kodonin 600. Kutakin määritystä varten, yksi PCR alukkeiden biotinyloitu 5′-päässä ja puhdistettiin käyttäen korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa. Alukesekvenssit ovat seuraavat. Gnas: For: 5′-biotiini-TTGGCTTTGGTGAGATCCATTG-3 ’, Rev 5’CACCTGGAACTTGGTCTCAAAGAT-3’, SEQ 5’TTCCAGAAGTCAGGACA-3 ’; KRAS kodonit 12 ja 13 varten 5’TCGATGGAGGAGTTTGTAAATGA-3 ’, Rev 5′-biotiini-TTCGTCCACAAAATGATTCTGA-3′, SEQ 5’-CTTGTGGTAGTTGGAGC-3 ’; KRAS kodoni 61: For 5’CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTCA-3 ’, Rev 5′-biotiini-TCCTCATGTACTGGTCCCTCATTG-3’, SEQ 5’ATATTCTCGACACAGCAG-3 ’; KRAS kodonissa 146: For 5’-AGGCTCAGGACTTAGCAAGAAGTT-3 ’, Rev 5′-biotiini-GCCCTCTCAAGAGACAAAAACAT-3′, SEQ 5’-AATTCCTTTTATTGAAACAT-3 ’. BRAF kodonin 600: For 5’TTCATGAAGACCTCACAGTAAAAA-3 ’, Rev 5′-biotiini-CCACAAAATGGATCCAGACA-3’, SEQ 5’TGATTTTGGTCTAGCTACA-3 ’. Kaikki PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen Fast Start Taq (Roche) ja aluketta pitoisuudet 0,2 uM. Sykliolosuhteita sisältyy ensimmäinen denaturaatiovaiheen 95 ° C: ssa 4 minuutin ajan, ja 49 sykliä 95 ° C 15 s, 54 C: ssa 30 s, ja 72 ° C 20 s. PCR-monistustuotteet sekvensoitiin on PyroMark MD pyrosekvensointi välineen (QIAGEN), ja mutaation analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [16].

Sanger Sequencing

Sangerin sekvensointia käytettiin vahvistaa kaikki mutaatioiden havaita pyrosekvensointi analyysi. Eristetty genomi-DNA tuumorinäytteistä käytettiin PCR-monistukseen alueesta, jotka kodonin 201 Gnas, Kodonit 12, 13, 61, ja 146 KRAS, ja kodonin 600 BRAF. Forward- ja reverse-alukkeita, joita käytetään PCR-monistuksen jotka on merkitty 5 ’M13 eteenpäin (5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′) ja 5 ”M13 reverse (5’-caggaaacagctatgac-3 ’) yleispohjamaaliksi sekvenssi, vastaavasti. Alukesekvenssit olivat seuraavat. Gnas: For 5’GTTGGCAAATTGATGTGAGC-3 ’, Rev 5’CCCTGATCCCTAACAACACAG-3′; KRAS Kodonit 12 ja 13: For 5’- TGGTGGAGTATTTGATAGTGTA-3 ’, Rev 5’CATGAAAATGGTCAGAGAA-3’; KRAS kodoni 61: For 5’TCCAGACTGTGTTTCTCCCT-3 ’, Rev 5’AACCCACCTATAATGGTGAATATCT-3′; KRAS kodonissa 146: For 5’- AGAAGCAATGCCCTCTCAAG-3 ’, Rev 5′-GGACTCTGAAGATGTACCTATGGTC-3’ BRAF kodonin 600: For 5’TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3 ’, Rev 5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3’. Kaikki reaktiot suoritettiin käyttäen 0,4 uM pitoisuutena kutakin aluketta ja FastStart Taq-polymeraasia (Roche, Indianapolis, IN). Sykliolosuhteita kaikki alukeparia koostui alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 4 min, jota seurasi 39 sykliä 95 C 30 s, 58 C 30 s, 72 ° C 30 s, ja lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 3 min .

tilastollinen analyysi

Fisherin testiä käytettiin arvioitaessa erojen osuus Gnas mutantti kasvainten luokkien välillä sukupuolen, etnisen alkuperän, KRAS /BRAF tila, mikrosatelliitti vakauden tila, kliiniseen vaiheeseen, ja kasvain sijainti. Kahden pyrstö P-arvo on alle 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Taajuus Gnas Hotspot Mutaatiot peräsuolen syövän

pyrosekvensointi havaittu aktivoivat mutaatiot Gnas kodonin 201 kymmenes 428 (2,3%) ja peräsuolen adenokarsinoomat (taulukko 1). Kukin näistä mutaatioista on myös validoitu käyttämällä Sangerin sekvensointia (Fig. 1). Kymmenen Gnas kodonin 201 mutaatiot havaitaan, olemme määritelleet seitsemän p.R201H ja kolme p.R201C aminohapposubstituutioita, jotka kaikki olivat toisensa poissulkevia (taulukko 2). Seitsemän näistä mutaatioista havaittu syntyi yksi 377 mikrosatelliitti vakaa kasvaimia testattiin (1,9%), ja kolme nousi joukossa 41 kasvaimien microsatellite epävakaus (7,7%). Tihennetystä Gnas mutaatioiden microsatellite epävakaa kasvaimissa oli tilastollisen merkitsevyyden rajoilla (p = 0,065). Mutaatiofrekvenssi kodonissa 201 0,0063 per diploid emäsparia on merkittävästi korkeampi kuin taustan mutaatio oli 1,2 x 10

-6 mutaatiot kohti emäsparia, joka on ominaista mikrosatelliittimerkkien vakaa koolonsyöpien (P = 3E (-36)) [3 ].

edustajan kromatogrammit (vasemmalla) ja pyrograms (oikealla) Gnas villityypin, Gnas R201C, ja Gnas R201H mutaatiot havaitaan paksusuolen syöpä. Nuolet kromatogrammit osoittavat mutantti, heterotsygoottinen huiput. Boxed huiput pyrograms korosta Mutanttialleelit. Prosenttiosuudet osoittavat alleelifrekvenssit laskettu pyrogram huippuintensiteetit.

Gnas mutaatiot ovat yhteydessä villous morfologia

Pathology tarkastelun Gnas mutantti kasvainten paljasti näkyvä villous morfologia seitsemässä kahdeksasta (88%) tapauksista luettavissa. Näistä viidessä tapauksessa Gnas mutantti syöpien syntyi yhtenäinen villoosinen adenooma. Kahdessa näistä tapauksista syövät itse osoitti erittäin epätavallinen villous arkkitehtuuria (kuvio 2). Villous adenoomia ovat alatyypin adenomatoottisten polyyppi, noin 5-15% of adenoomien [17]. Villous syövät ovat kuitenkin tällä hetkellä ole tunnustettu erityinen alaluokkiin CRC, vaikka tutkimukset osoittavat, että villous adenokarsinooman voi selittää noin 9% CRC tapauksista [18], [19]. Tuloksemme osoittavat, että Gnas mutantti kasvaimia lähellä yksinomaan syntyy yhdessä villous morfologia läsnä joko syövän tai edeltäjä adenooma.

H 0,0305, Fisherin tarkka testi). Yleinen esiintyvyys KRAS ja BRAF mutaatioiden meidän kasvain väestö oli noin 56% (44% KRAS, 12% BRAF), joka on yhtäpitävä aiempien tutkimusten kanssa [20]. Kun tutkittiin anatominen sijainti koolonissa, kaikki kymmenen Gnas mutantti näytteen havaittiin olevan peräisin primaarisyöpien että alkunsa proksimaalisessa paksusuolessa, välillä umpisuoli ja pernan taipeet, vaurioiden yleisesti kutsutaan oikeanpuoleista (P 0,007, Fisherin tarkka testi). Mukana meidän kasvain kohortissa olivat molemmat microsatellite stabiileja (MSS) ja mikrosatelliitti epävakaa (MSI) koolontuumoreissa, MSI tapaukset johtuvat pääasiassa oikealla puolella. Koska kolme Gnas mutantti kasvaimet olivat myös MSI kasvainten, on mahdollista, että myös MSI syövät vinouttaa yhdistys Gnas mutaatioiden kanssa proksimaalisessa paksusuolessa. Kuitenkin, kun kaikki MSI syövät pois analyysistä, yhdistys Gnas positiivisia syöpiä proksimaaliseen paksusuolen edelleen merkittävä (P 0,044) B

On mielenkiintoista huomata, että vaikka kaikki Gnas mutantti syövistä olivat oikeanpuoleista , Gnas mutantti adenoomia havaittiin koko paksusuoli (taulukko 4). Merkittäviä eroja ei havaittu Gnas mutantti kasvaimissa kun analysoitiin sukupuolen, etnisen alkuperän, kliinisessä vaiheessa tai Mikrosatelliittimarkkerien tila.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme huomanneet, että Gnas mutaatiot assosioitua erilliset alaluokka koolonsyöpien joka on tyypillistä paikalla proksimaalisessa paksusuolessa, saamalla sattumaan KRAS tai BRAF-mutaatio, ja yhdessä villous morfologia. Vaikka taajuus Gnas mutantti koolonsyöpien on 2,3%, löydämme nämä kasvaimet muodostavat erilliset molekyyli-patologinen alaluokka paksusuolensyöpä. Tietääksemme tämä analyysi 428 paksusuolen tuomrs on laajin analyysi näistä mutaatioista, jotka on tehty. 2,3% taajuus Gnas mutaatioiden tässä kohortissa, on suurempi kuin mitä viimeksi Idziaszczyk ja kollegat vuonna 2010, vaikkakin vähemmän kuin alun perin havaittu aiemmassa pienempi tutkimus me ja yhteistyökumppanit [2]. Kiehtovan, Gnas mutantti syöpiä ei löydy distaalisessa paksusuolessa, kun taas Gnas mutantti villous adenoomia syntyy koko paksusuoli, nostamalla mahdollisuus, että Gnas mutantti adenoomia edetä nopeammin syöpä proksimaalisessa paksusuolessa tai ovat todennäköisesti tulla oireenmukaista ja havaitaan, kun paikalla distaalisessa paksusuolessa. Näitä kysymyksiä on oltava vielä osoitettu kokeellisesti erottaa nämä kaksi mahdollisuutta.