Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

Rypäle procyanidins (PC) ovat flavan-3-oli oligomeerit ja polymeerit tunnetaan biologinen aktiivisuus suolistossa. Rypäleiden siemenet ote (GSE) on raportoitu vähentävän suoliston loukkaantumisen rottamallissa mukosiitin. Olemme pyrkineet tutkimaan vaikutuksia puhdistetun PC jakeet eroavat keskimääräinen polymerisaatioaste (MDP) yhdistettynä 5-fluorourasiili (5-FU) kemoterapian elinkelpoisuudesta koolonkarsinoomasoluissa (Caco-2).

Suunnittelu

SixPC jakeet (F1-F6) eristettiin Cabernet Sauvignon siemenistä kahdessa kypsyyden vaiheessa: pre-veraison raakoja (epäkypsä) ja kypsiä (kypsä), hyödyntämällä vaihe kaltevuus, alhainen paine Sephadex LH-20 hartsi. Fraktiot testattiin Caco-2-solut, yksin ja yhdessä 5-FU. Eluoidut fraktiot karakterisoitiin phloroglucinolysis ja geelipermeaatiokromatografialla. Solujen elinkelpoisuus määritettiin 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyyli-liumbromidi) (MTT).

Tulokset

Kaikki eristetyt fraktiot vähensi Caco-2-solujen elinkelpoisuus kontrolliin verrattuna (P 0,05), mutta F2 ja F3 (MDP 2-6) olivat aktiiviset fraktiot (epäkypsä F2 = 32% MDP 2,4, F3 = 35% MDP 5,8 ja kypsä F2 = 13 % MDP 3,6 ja F3 = 17% MDP 5,9, elinkelpoisten solujen prosentuaalinen jäljellä) on Caco-2-soluilla. Yhdistettynä 5-FU, epäkypsä jakeet F1-F3 tehosti solun myrkyllisyyttä 5-FU 27-73% (

P

0,05). Kypsiä PC fraktiot (F1-F4) paransi merkittävästi toksisuutta 5-FU 60-83% vastaan ​​Caco-2-solut (

P

0,05). Lisäksi jotkin jakeet yksin olivat tehokkaampia vähentämään elinkelpoisuuden Caco-2-solut (

P

0,05; epäkypsä jakeet = 65-68% ja kypsä jakeet = 83-87%) verrattuna 5-FU yksin ( 37%).

Johtopäätökset

PC MDP 2-6 (epäkypsä F1-F3 ja kypsä F1 ja F4) paitsi parantaa vaikutusta 5-FU tappavilla Caco-2-solut, mutta myös ylitti standardi 5-FU kemoterapia syövän agent.The bioaktiivisuutta PC on näin ollen johtuvan pääasiassa alhaisen molekyylipainon PC.

Citation: Cheah KY, Howarth GS, Bindon KA, Kennedy jA, Bastian syyskuu (2014) pienimolekulaarisella Prosyanidiinit rypäleiden siemenet tehostamiseksi 5-fluoriurasiili Kemoterapia on

Caco-2

ihmisen koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 9 (6): e98921. doi: 10,1371 /journal.pone.0098921

Editor: Rajeev Samant, University of Alabama at Birmingham, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 marraskuu 2013; Hyväksytty: 7. 2014; Julkaistu: 06 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Cheah et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Professori Gordon Howarth tukee Etelä-Australia terveys tutkimuslaitos Cancer neuvoston Senior Research Fellowship. Nykyinen tutkimus suoritettiin alla yhteistyötä Wine Science and Business Group, The University of Adelaide ja Australian Wine Research Institute (AWRI). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tekijät ovat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on toiseksi korkein kuolleisuus, ja on neljänneksi yleisin diagnosoitu syöpä Yhdysvalloissa [1]. Ensisijainen hoito paksusuolen syöpä liittyy kirurginen suolen resektiota ja kemoterapia, useimmiten 5-fluorourasiili (5-FU) [2]. Valitettavasti kemoterapia ei voi erottaa normaali ja syöpäsolujen, ja se kohdistuu aloihin, joilla solut korvataan suurella nopeudella, kuten suussa ja suolistossa [3]. Tämä johtaa kehitystä mukosiitin (ruoansulatuskanavan toksisuutta). Nykyiset mukosiitti hoidot ovat suurelta osin tehottomia, sillä ne kohdistuvat vain oireita, mutta ei patogeneesiin ehto [3]. Näin ollen on tärkeää etsiä uusia vaihtoehtoisia hoitoja, jotka eivät ainoastaan ​​kohdistaa mukosiitti mutta myös parantaa kemoterapeuttisen toimintaa vaarantamatta hyvinvointia potilaista.

Yhä viinirypäleensiemenuutteen (GSEs) tutkitaan, koska niiden raportoitu terveyshyötyjä erilaisten sairauksien, kuten syövän [4], sydän- ja verisuonisairaudet [5], [6] ja haavainen koliitti [7], [8]. Suotuisat vaikutukset GSEs on katsottu johtuvan polyphenolic procyanidins (PC) [9], joka sisältää flavan-3-oli alayksiköistä. Polymeerin pituus PC kuvataan polymeroitumisaste (DP). Koska niiden polymeroidun rakenne, solu imeytyminen on rajoitettu oligomeerejä alemman DP, jättäen suuremmat DP molekyylien adsorptio suolistossa onteloon suun kautta annettuna [10], [11]. Useat tutkimukset ovat raportoineet polymerointi ja galloylation tietokoneiden olevan vastuussa niiden anti-proliferatiiviset vaikutukset transformoitujen solujen [9], [12], [13].

On yhä enemmän näyttöä siitä, GSEs ovat tehokkaita vähentämään syöpäsolujen lisääntymistä ilman, että normaaleille soluille sytotoksiset [14]. Lisäksi GSE osoitti osittaista paranemisen suolivauriota rottamallissa suoliston mukosiitin ja pienentänyt ruoansulatuskanavan solujen myrkyllisyyttä kemoterapiaa normaaleissa IEC-6 suoliston soluista [15]. Kuitenkin bioaktiiviset komponentit GSE ole tiedossa. Ensisijaisena tavoitteena olevassa tutkimuksessa oli tunnistaa kemiallisen koostumuksen bioaktiivisten PC jakeet, ja tutkia niiden mahdollisia yhdessä 5-FU kemoterapiaa, niiden vaikutuksia elinkelpoisuuden koolonkarsinoomasoluissa. Kun yhdessä 5-FU, tietyt PC jakeet entisestään lisääntynyt toksisuus paksusuolen syöpäsoluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethic lausuntoja

Cabernet Sauvignon rypäleen näytteitä saatiin kaupallisista viinitarhoja, Accolade Viinit (Orlando) on Langhorne Creek kasvava alue Etelä-Australian, joka on leveysasteen 35 ° 16’11.56 ”S ja pituutta 139 ° 00’14.47” E, joiden korkeus on noin 28 m merenpinnan yläpuolella. Ei luvat tarvitaan kuvatun tutkimuksen, jotka täyttivät kaikki olennaiset vaatimukset.

Grape näytteenotto- ja valmistelu

Grape kerättiin eri vaiheissa kypsyys: epäkypsä (preveraison, vihreät siemenet) ja Aikuiset (25-26 ° Brix, ruskea siemenet) vuoden 2009 kasvukauden. Rypäleen marjat valmistettiin aiemmin kuvatulla menetelmällä [16], jossa viinirypäleet kerättiin ja pidettiin pakastettuna -20 ° C: ssa. Vaikka vielä jäätynyt, siemenet poistettiin liha veitsellä. Siemenet Sitten pyyhkiä puhtaaksi lihaa paperipyyhkeellä ja uudelleen jäädytettiin -20 ° C: ssa ennen uuttamista.

valmistelu ja louhinta siementen procyanidins (PC) B

PC louhinta alkoi uuttamalla siemenet (100 g) yön yli 18 tuntia 70% asetonia (200 ml, v /v) ja askorbiinihappoa (1 g /l). Uute konsentroitiin alennetussa paineessa 35 ° C: ssa (HeidolphLaborota 4011 pyöröhaihduttimella, John Morris Scientific, Adelaide, Australia), ja lyofilisoitiin kuivaksi jauheeksi (Dynavac FD3 pakastuskuivuria Dynavac Pty Ltd, Sydney, Australia). Tuotos kullekin näytteet olivat: epäkypsiä 6,31 g ja kypsä 10,29 g. PC siementen jauhe (5 g) liuotettiin 50 ml: aan metanolia (60%, v /v), joka sisälsi trifluorietikkahappoa (TFA) (0,05%, tilavuus /tilavuus) ja sen jälkeen levitetään (~18.3 ml /min) on 300 mm x 21 mm: n lasikolonniin (Michel-Miller, Vineland, NJ, USA), joka sisälsi Sephadex LH20 kromatografiaresiiniin (Amersham, Uppsala, Ruotsi) ja noin petitilavuudella 93 ml, ja pestiin pois 250 ml: ssa metanolia (60%, v /v), joka sisälsi TFA: ta (0,05%, tilavuus /tilavuus) poistamaan matalan molekyylipainon monomeerejä. PC sitten talteen 150 ml: aan asetonin vesiliuosta (70%, v /v), ja uutteet konsentroitiin pyöröhaihduttimella 35 ° C: ssa asetonin poistamiseksi. Vesipitoinen liuos uutettiin heksaanilla jäljelle jääneen lipofiilisen aineen avulla erotussuppiloon. Vesipitoinen uute kylmäkuivattiin jauhe ja takaisin määrä kahden uutteita; kehittymätön, 2,5 g ja kypsä, 0,9 g vastaavasti. Jauheet pidettiin typen alla ja -20 ° C: ssa ennen fraktiointia.

fraktiointi tietokoneita, siementen PC jauhetta (0,5 g) liuotettiin metanoliin (60%, v /v), joka sisälsi TFA: ta (0,05% , v /v) ja laitettiin samassa sarakkeessa identtisissä olosuhteissa. PC siemen uutetta fraktioitiin mukaan step-gradienttieluointi edellä kuvatun menetelmän [16] tuottaa 6 jakeet yhä keskimääräinen polymerointiaste (MDP) ja molekyylipaino on tietokoneita nimetty F1 F6. Eluoidut fraktiot konsentroitiin paineen alaisena 35 ° C: ssa orgaanisten liuottimien poistamiseksi ja edelleen lyofilisoida kuivan jauheen. Eristetyt fraktiot säilytettiin -20 ° C: ssa ennen analyysiä. Rypäleiden siemenet ote oli antelias lahja Tarac Technologies (GraPex siemenet tanniini, North Adelaide, South Australia) ja sisällytettiin tutkimukseen kontrollina. GSE (1 g) liuotettiin metanoliin (60%, v /v), joka sisälsi TFA: ta (0,05%, tilavuus /tilavuus) ja fraktioitiin vastaavasti.

Acid katalyysin PC-ylimäärän läsnä floroglusinolia (Phloroglucinolysis)

Phloroglucinolysis käytettiin määrittämään alayksikköä koostumuksen, MDP ja galloylation PC. Pholoroglucinolysis suoritettiin aikaisemmin kuvatun menetelmän [16]. Seed fraktiot liuotettiin metanoliin (10 mg /ml, tilavuus /tilavuus) ja yhtä suuret tilavuudet (25 ui) uutetta ja floroglusinoli-liuosta (0,2 N HCl: n ja 100 g /l floroglusinoli ja 20 g /l askorbiinihappoa), jolloin saatiin lopullinen PC pitoisuus 5 g /l. Phloroglucinolysis Reaktio suoritettiin 50 ° C: ssa 25 min ja analysoitiin RP-HPLC: llä käyttämällä (-) – epikatekiinia (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), kuten määrällisiä vakiona.

geelipermeaatiokromatografialla ( GPC) B

Geelipermeaatiokromatografia suoritettiin perustuen aiemmin kuvatun menetelmän [16]. GPC-tekniikalla luonnehtii tietoa kokojakauma PC kunkin osan. Fraktioitu näytettä (10 mg /ml) liuotettiin metanoliin ja laimennettiin edelleen 4 tilavuutta HPLC liikkuvan faasin (

N, N

dimetyyliformamidia, joka sisälsi jääetikkaa (1%, v /v), vedellä (5 %, v /v) ja 0,15 M litiumkloridia). Virtausnopeus pidettiin 1 ml /min kolonnin lämpötilassa 60 ° C ja eluointia tarkkailtiin 280 nm: ssä. Enimmäismäärä PC injektoitiin pylvääseen oli 40 ug. PC siemenet jakeet aiemman tutkimuksen [17] käytettiin standardeja kalibrointiin. Kalibrointikäyriä hajanaisten tietokoneita niiden kumulatiivinen massan jakautuminen piirrettiin ja keskimääräinen molekyylimassa jakeiden ennustettiin 50%.

Rauta vähentää antioksidantti tehon (FRAP) määritys

Tämä määritys suoritettiin out jälkeen modifioitua protokollaa [18]. Lyhyesti, FRAP reagenssi valmistettiin (300 mM asetaattipuskuria, pH 3,6, 10 mM 2,4,6-tri [2-pyridyyli] -s-triatsiini (TPTZ) liuos 40 mM HCI, 20 mM ferrokloridi; in 10: 01:01 v /v) ja pidetään pimeässä 37 ° C: ssa ennen analyysiä. Fraktiot liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) (0,1 mg /ml) ja 15 ui lisättiin 96-kuoppaisille levyille. 15 ui FRAP reagenssia lisättiin kuoppiin, jotka sisältävät fraktiot ja levy luettiin 593 nm: ssä jälkeen 4 min (Multiskan Spectrum, Therma Electron Corporation, Vantaa, Suomi) käyttäen Skanit ohjelmiston 2.2. Ferrosulfaattia (0,1-1 mM) käytettiin rakentamaan standardikäyrän ja FRAP-arvot koeyhdisteiden ilmaistiin mMFe (II) /g näytettä. Kukin käsittely testattiin kolmena kappaleena, ja koko koe toistettiin kolme kertaa. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM 3 riippumattomasta kokeesta.

Cell valmistelu ja kokeellinen hoito

Ihmisen paksusuolen syövän solulinja, Caco-2 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA). Soluja pidettiin Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 37 ° C: ssa ja 5% CO

2-inkubaattorissa. Media uusittiin kahdesti viikossa. PC fraktiot liuotettiin DMSO: hon ja säilytetään -20 ° C: ssa ennen analyysiä. Caco-2-soluja ympättiin 1000 solua /kuoppa 96-kuoppaisille kudosviljelylevyille (Grenier Bio-oni, Victoria, Australia) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 48 h, jotta kiinnitys. 48 tunnin kuluttua inkubaation media korvattiin eri pitoisuuksilla siementen fraktiot liuotettiin DMEM (ug /ml), joka sisälsi 0,025% (v /v) DMSO: ta ja 5-FU (100 uM) (DBL, Mayne Pharma Pty . Ltd., Victoria, Australia). Soluja inkuboitiin edelleen 37 ° C: ssa, 5% CO

2 24, 48 ja 72 tuntia.

MTT-määritystä

(3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli ) -2,5-difenyyli-liumbromidi) (MTT) suoritettiin perustuen aiemmin kuvattua menetelmää, jossa vähäisiä muutoksia [19]. Altistumisen jälkeen hoitoja (siementen tiivisteet ja 5-FU), 50 ui MTT: tä (1 mg /ml Dulbeccon fosfaattipuskuroitu suolaliuos), lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin edelleen 37 ° C: ssa, 5% CO

2 4 h. 4 tunnin kuluttua väliaine aspiroitiin ja 100 ui DMSO: ta lisättiin liuottamaan formatsaani. Levyt laitettiin ravistusinkubaattorissa 15 minuuttia ja luettiin 570 nm: ssä UV-spektrofotometrillä. Kukin käsittely testattiin kolmena kappaleena, ja koko koe toistettiin kolme kertaa. Tiedot esitetään keskiarvo ± SEM 3 riippumattomasta kokeesta. Data ilmaistiin elinkelpoisten solujen lukumäärä verrattuna prosentteina kontrollista käsiteltyjen solujen seerumitonta DMEM: ää. Kontrollisoluja ovat joko käsitelty solu seerumitonta DMEM: ää ainoastaan ​​tai solun käsiteltiin 100 uM 5-FU.

Tilastollinen analyysi

Jokainen solu-pohjainen koe suoritettiin vähintään 3 kertaa. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen XLSTAT versio 12.0 for Windows tai PASW tilastotieto versio 18. Tilastollinen analyysi määritettiin kaksisuuntaista ANOVA Tukeyn

post-hoc

testi.

Pearsonin korrelaatiokerrointa laskettiin määritellä suhde elinvoimaisten solujen, PC koostumus ja antioksidantti arvoa. Tilastollinen merkitsevyys harkita

P

0,05.

Chemicals

asetoni, askorbiinihappoa, metanoli, trifluorietikkahappo (TFA), floroglusinoli, (-) – epikatekiinia, N, N-dimetyyliformamidi, litiumkloridia, natriumasetaattia (CH3COONa), 2,4,6-tri [2-pyridyyli] -s-triatsiini (TPTZ), ferrokloridia ja metanoli hankittiin Sigma Chemical Co. Ltd, St Louis , MO. Suolahappoa (HCI), jääetikkaa, Folin-ciocalteau reagenssin ja ferrosulfaattia ostettiin AnalaR, BDH, Merck, Pty. Ltd., Australia. Kudosviljelmässä ratkaisuja ovat Dulbeccon modifioitu Eaglen Minimum Essential Medium (DMEM), Dulbeccon fosfaattipuskuroitu suolaliuos, dimetyylisulfoksidi (DMSO) ja 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyyli-liumbromidi) (MTT) oli hankittiin Gibco BRL, Life Tehnologies Pty Ltd, Australia.Pty. Ltd

instrumentointi

Agilent malli 1100 HPLC (Agilent Technologies Australia Pty Ltd, Melbourne, Australia) käytettiin ChemStation ohjelmisto kromatografisten analyysien.

Tulokset

karakterisointi PC jakeet

GSE sisällytettiin nykyiseen tutkimuksessa kontrollina. PC koostumus GSE on kuvattu taulukossa 1. Verrattuna Cabernet Sauvignon siemeniä otteita, GSE oli alhainen massa muuntaminen (23,8% w /w) ja myös alempi molekyylipaino, mitattuna phloroglucinolysis ja GPC. PC-päätelaite alayksiköiden GSE käytti enimmäkseen hallitsi (-) – epicatechin-3-

O

-gallate. Koska ilmeisesti alhainen osuus tietokoneiden GSE, me eristetty PC tuoreesta Cabernet Sauvignon siemenet talteen eri vaiheissa kuin edellinen raportit osoittivat korkeaa massa muuntaminen käsittelemätöntä rypäleenkivien [16].

vertailu puhdistettu PC molemmista siemennäytettä, kehittymätön siemen oli korkeammat massa muuntaminen (87%) verrattuna kypsä siemenet (71%) (taulukko 2). Puhdistettu PC fraktioitiin edelleen 6 jakeet yhä MDP tai moolimassa. Massan muuntaminen tuotto muuntamiseksi PC tunnettujen PC oli 49%, lukuun ottamatta korkein MDP F6 (noin 37%). Suurimmat erot epäkypsiä ja kypsiä siemeniä fraktiot että kypsä jakeet oli suurempi osuus (-) – epicatechin terminaali alayksiköt (9-30%) verrattuna kehittymätön jakeet (2-11%). Sekä kypsät ja epäkypsät siemenet jakeet oli saman suuntainen alenevassa (-) – epikatekiinia terminaali alayksiköt yhä ess. Mielenkiintoista, korotukset polymerointi- tai molekyylipainoltaan pääosin hallinnassa (-) – epicatechin-3-

O

-gallate laajennus alayksiköistä. Galloylation kehittymätön jakeet vaihteli 15-35% ja kypsän jakeet vaihtelevat 9-24%. Epäkypsä F2 oli korkein galloylation (35%), pääasiassa osuus on suuri (-) – epicatechin-3-

O

-gallate (88%).

Antioksidantit kapasiteetti siementen jakeet

antioksidanttien siementen jakeet mitattiin FRAP määrityksessä (kuvio 1). GSE, joka sisälsi seosta, oligomeerit ja polymeerit PC, otettiin mukaan positiivisena kontrollina sen määrittämiseksi, antioksidantti siemenen fraktioita. Verrattuna GSE (5 mM /g), kaikki fraktiot olivat korkeampia FRAP arvot, jotka vaihtelevat 5,4-8,8 mm /g. Antioksidantti kapasiteetti jakeiden väheni enemmän polymeroidun PC jakeet. FRAP arvot korreloivat negatiivisesti MDP (r

2 = -0,81,

P

0,05).

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM 3 riippumattomasta kokeesta. Tilastollinen analyysi määritettiin yksisuuntaisella ANOVA Tukeyn

post-hoc

testi. Arvot eri kirjaimia (a, b, c) kussakin sarakkeessa ovat tilastollisesti erilaisia ​​P 0,05.

Effects siementen jakeet elinkelpoisuudesta Caco-2-solujen

sytotoksisia vaikutuksia siementen jakeet Caco-2-soluja määritettiin MTT-määritystä (kuvio 2). Caco-2-solut altistettiin siemeniä jakeet 72 tuntia ja data ilmaistiin IC

50, määritellään kunkin yhdisteen annos, joka inhiboi solujen elinkelpoisuuden 50%, joka edustaa keskiarvoa kolmesta itsenäisestä kokeesta. Kaikki jakeet osoittivat myrkyllisyysvaikutuksensa kuten vähentynyt absorbanssiarvot. IC

50value (keskiarvo kolmesta itsenäisestä kokeesta) epäkypsiä siementen fraktiot (F1-F6) vaihteli 17,7-70,2 ug /ml (kuvio 2A). Lukumäärä elinkelpoisten solujen korreloi positiivisesti MDP kehittymätön siemen jakeet (r

2 = 0,48,

P

0,05) eli jakeet korkeimpien MDP (F5 ja F6) olivat vähemmän myrkyllisiä Caco-2-soluihin. Samanlaisia ​​suuntauksia kannalta sytotoksisia vaikutuksia havaittiin myös sovellettaessa Kypsiä jakeet (kuvio 2B), jossa elävien solujen lukumäärä oli niinikään korreloi MDP fraktioiden (r

2 = 0,50,

P

0,05). Kypsiä fraktiolla oli voimakkaampi sytotoksisuus verrattuna kypsymättömiä siementen fraktiot (kuvio 2A ja 2B).

Data esitetään IC

50 tai annoksen (ug /ml) vähentää solujen elinkelpoisuuden 50% (keskiarvo ± SEM ) 3 riippumattoman kokeen. Tilastollinen analyysi määritettiin yksisuuntaisella ANOVA Tukeyn

post-hoc

testi. Arvot eri kirjaimia (a, b, c) kunkin sarakkeen olivat tilastollisesti erilainen P 0,05.

yhdistetty vaikutus eristetyn siementen murtolukuja ja 5-FU elinkelpoisuudesta Caco-2-solut

yhdistetty vaikutus siementen murtolukuja ja 5-FU Caco-2-solut tutkittiin (kuva 3). Kypsymättömille siementen jakeet, elinkelpoisuutta Caco-2-solujen inhiboitui merkittävästi kaikkien siementen fraktiot (kuvio 3A). Verrattuna GSE (67%), F2 ja F3 ovat kypsymättömiä siementen uutteet olivat myrkyllisiä Caco-2-soluja (F2, 32% ja F3, 35% vertailuarvosta,

P

0,05). Kuitenkin, kun siemen fraktiot olivat läsnä 5-FU: ta (100 uM), kasvua estäviä vaikutuksia 5-FU oli merkittävästi parannettu (

P

0,05) (kuvio 3A). 5-FU vähensi solujen elinkelpoisuuden 62% verrokkiarvoista (

P

0,05). F1-F3 tehostaa merkittävästi kasvua inhiboivaa aktiivisuutta 5-FU: ta (27%, 73% ja 56% vastaavasti verrattuna 5-FU-ohjaus;

P

0,05). F2 voisi näin ollen pitää voimakkaampi kemoterapia agentti kuin fraktioimaton kaupallisesti saatavilla GSE, mikä tehosti kasvua estävää vaikutusta 5-FU 55% (

P

0,05, verrattuna 5-FU ohjaus). Lisäksi olemme myös havainneet, että epäkypsä F2 (32%) ja F3 (35%) oli voimakkaampi kuin 5-FU (62% vertailuarvosta;

P

0,05) vähentämään Caco-2 elinkelpoisuus.

Data esitetään prosentteina solujen elinkelpoisuuden suhteen elinkelpoisuuden kontrollisoluihin. Data esitetään keskiarvo ± SEM 3 riippumattomasta kokeesta. Tilastollinen analyysi määritettiin kaksisuuntaista ANOVA Tukeyn

post-hoc

testi. Arvot eri kirjaimia (a, b, c) kunkin sarakkeen olivat tilastollisesti erilainen P 0,05. * Tarkoittaa merkitsevää eroa 5-FU: lla käsitellyssä ryhmässä verrattuna 5-FU-ohjaus.

Kypsät siementen jakeet käyttäytyi samalla tavalla kuin kehittymättömät siementen fraktiot (kuvio 3B). Kypsiä jakeet vähensi solujen elinkelpoisuuden (

P

0,05). F2 ja F3 olivat sytotoksisia Caco-2-soluja (13% ja 17%,

P

0,05) kuin GSE (47%) (kuvio 3B). Kun solut altistettiin siemeniä jakeet ja 5-FU, kaikki siemenet jakeet tehostettu kapasiteetti 5-FU vähentää solujen elinkykyä. GSE tehostaa merkittävästi kasvun inhibitio 5-FU: 49%. Kuitenkin, F1-F4 tehostaa merkittävästi kasvua estävä vaikutus 5-FU: ta (62%, 83%, 80% ja 60% vastaavasti verrattuna 5-FU-ohjaus;

P

0,05). Lisäksi F2 (13%), F3 (17%) ja F4 (50%), fraktioita oli tehokkaampia kuin 5-FU yksinään (65% vertailuarvosta;

P

0,05) (kuvio 3B ).

keskustelu

Rypäle tietokoneissa on raportoitu aiheuttavan terveyttä edistäviä ominaisuuksia, erityisesti suolistossa [14], [15], [20], [21]. Lisäksi sen syövän tehoa, GSE on osoitettu vähentävän gastrointestinaalisen toksisuuden kemoterapian jälkeen hoidon terveille eläimille ja suoliston normaalin soluihin [15]. Vaikka on yhä enemmän näyttöä tukemaan kemoterapeuttisen ominaisuuksia GSE paksusuolen syöpä, tunnistaminen bioaktiiviset ainesosat vastuussa määrittelemätön.

Nykyisessä tutkimuksessa, PC jakeet eristetään kaupallisesti saatavilla GSE osoitti eri mDPs ja molekyylien koot. Nämä fraktiot oli erittäin alhainen konversio saannot ( 37%), mikä osoittaa, että vähemmän kuin 40%: n fraktiot tunnettu siitä, käyttäen valittua analyysitekniikoita, joka oli mahdoton hyväksyä tätä tutkimusta varten. Selitys alhainen muuntaminen tuotto PC fractionsmay johtuneen hapettumisen aikana esiintyvien sukupolven GSEs peräisin viininvalmistuksen prosessi. Niinpä päätettiin eristää PC jakeet tuoreista rypäleistä kerättiin eri maturiteeteissa: epäkypsä (pre-veraison) ja kypsä (kypsä). Päätös perustuu havaintoon, että raakoja siemeniä on suurempi muuntaminen tuotto kuin kypsät siemenet [22], joiden tueksi Nykyisessä tutkimuksessa. Lisäksi tuleva tehtyjen tutkimusten massaspektrometriaa perusteltua määritellä tarkemmin puhtaudesta tietokoneita eristetty rypäleen siemenistä.

sytotoksisia vaikutuksia PC jakeet syöpäsoluihin on raportoitu aikaisemmin [9], [12], [13 ]. Kuitenkin myös nämä vaikutukset tapahtunut solun ulkopuolisilla signalointi tai seuraava otto PC ei yritetty. Tämä tutkimus osoitti, että aktiivisimmat jakeet vaikuttavat elinkelpoisuutta Caco-2-solut sisälsivät pienempiä oligomeerejä: F2 ja F3. Mitä enemmän voimakas sytotoksinen havaitut vaikutukset Cabernet Sauvignon siemen jakeet verrattuna GSE saattanut johtua alemman PC saanto GSE (~24%) verrattuna PC eristettiin tuoreista rypäleistä (-60%).

imeytyminen PC solukalvojen läpi oli suuresti riippuvainen niiden mDPs [23], [24]. Vain tietyt alempi ess tietokoneiden imeytyvät kuljetuksen aikana suolistossa, jättäen suuremmat MDP tietokoneet (MDP 7) talletetaan suolen onteloon. Tämä tulos tukee nykyisten tietojen jolloin F2 ja F3 (MDP 2-6) ja todennäköisesti imeytyä poikki solukalvojen olivat tehokkaampia kuin jakeiden korkeammalla ess, jotka aiheuttavat pinnan vaikutus vain. Kuitenkin F2 ja F3 olivat bioaktiivisia kuin F1, mahdollisesti johtuen niiden suurempi osuus galloylation ja osuus epicatechin-3-

O

-gallate kuten terminaali- alayksiköitä, verrattuna F1. Tämä tulos on yhtäpitävä muissa tutkimuksissa, joissa PC jakeet korkeammat galloylation olivat sytotoksisia kuin PC jakeet pienemmillä galloylation testattaessa koolonkarsinoomasoluissa [9], [25]. Kuitenkin todellinen mekanismi tietokoneiden solun kasvuun edelleen tuntematon. Absorboitunut PC voi olla tärkeä rooli häiritsee solun signalointi polkuja. PC on raportoitu olevan estäjiä androgeenireseptoreita eturauhassyöpäsoluissa [26], [27], ja epidermaalista kasvutekijää reseptoreihin paksusuolen syöpäsoluissa [28]. Lisäksi tietokoneet ovat tunnettuja vaimentamaan PI3-kinaasi (seriini /treoniini proteiinikinaasi) reitti [14], jotka voivat johtaa solusyklin pysähtymisen G1-vaiheessa [20] ja aktivointi apoptoosin indusoiva reitti [29]. Tulevaisuuden tutkimukset tutkivat päätepisteet solujen kasvua ja apoptoosin kuten PI ottoa, kaspaasi 3: n aktiivisuuden ja sub-G1 DNA-pitoisuus ovat perusteltuja.

Aiemmat havainnot ovat osoittaneet, että sytotoksiset vaikutukset PC: t ovat riippuvaisia ​​ess [9] , [13]. Kuitenkin nykyinen tutkimus osoitti, että fraktiot, joilla on korkeampi MDP (7-16) ei kohdistamaan sytotoksisia vaikutuksia paksusuolen syöpäsoluissa. Kuitenkin nykyinen tutkimuksessa käytettiin erilaista liuotinjärjestelmää eristää PC jakeet verrattuna muihin tutkimuksiin [9], [30]. Tämä liuotin järjestelmä eristää PC jakeiden useampia molekyylimassa (619-6063 g /mol) ja MDP (2-9) verrattuna muihin menetelmiin (moolimassa 552-1232 g /mol, MDP 1-4); mikä tarkoittaa, että aiemmissa tutkimuksissa mitataan vain rajoitettu PC jakeet ( 1200 g /mol) niiden biologista aktiivisuutta.

antioksidanttien tietokoneita on suuresti riippuvainen niiden polymeroitumisaste ja galloylation [9]. Vähentäminen metalli-ionit, mitattuna FRAP määrityksen, uskotaan korreloi positiivisesti hydroksyyliryhmien lukumäärä läsnä molekyylejä, ja että kiinnityskohdat siirtyminen metalli-ionien flavonoidi molekyylit ovat

o

-catechol ryhmä rengas B [31]. Kuitenkin tämä ei ollut nykyisessä tutkimuksessa. PC jakeiden korkeampi ess olivat heikompia antioksidantteja, joka on yhtäpitävä aiempien tutkimusten kanssa [32], [33]. Jakeet suurempia alayksiköiden yleensä itse aggregaatin ja aiheuttavat stereokemiallinen esteenä [33], [34], mikä altistaa vähemmän hydroksyyliryhmää radikaalinsieppausaktiivisuus toimintaan. Jatkotutkimuksissa tulisi suorittaa käsittelemään antioksidanttisia ominaisuuksia rypäleiden siemenet tietokoneiden lukien vaikutus solujen antioksidanttitilaan.

Nykyinen tutkimus suoritettiin perustuen perusteella aiemman tutkimuksen GSE ja kemoterapia elinkelpoisuudesta paksusuolen syöpäsolut [35]. Annokset rypäleiden siemenet jakeiden olevassa tutkimuksessa oli valittu sen perusteella, tämän edellisen tutkimuksen. 5-FU on anti-metaboliitti lääkkeitä, jotka estävät DNA-synteesiä estämällä tymidylaattisyntaasin [3] .Kun siemenuutetta fraktiot yhdistettiin 5-FU, ne eivät ainoastaan ​​parantaa vaikutusta 5-FU: n tappaminen Caco-2-solut, mutta myös ylitti 5-FU kuin syöpälääkkeen. Nykyisessä tutkimuksessa vaikutuksia PC murtolukuja ja 5-FU Caco-2 solujen elinkelpoisuus tutkittiin yli 24-72 tunnin ajan. 5-FU (100 uM) vähensi merkittävästi syöpäsolujen elinkelpoisuutta 60-80%, gastrointestinaalisen toksisuuden syöpäpotilailla. Altistuminen PC jakeen ja 5-FU soluihin 24-48 tunnin ajan ei käynyt ilmi suuntaus synergistinen vaikutus, mutta ei ollut merkitsevä (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi suurempi valotusaika (72 h) ja PC jakeet ja 5-FU johti suurin vähennys solujen elävyyden. Nykyinen tutkimus osoitti myös, että kypsä siemen jakeet olivat parempia kuin kypsymättömiä siemeniä murtolukuja kemoterapia-aineina paksusuolensyöpä

in vitro

. Kemiallinen profiili Kypsiä jakeet osoittivat, että nämä vaikutukset voivat ohjaavat niiden suurempi osuus (-) – epikatekiinia kuten terminaali alayksiköitä verrattuna kehittymätön siemen uutetta. Toinen mahdollinen selitys voisi olla jakautuminen kussakin osa suurempi osa alhaisen molekyylipainon materiaalin kypsä siemenet kuin raakoja siemeniä.

Nykyinen tutkimus osoitti, että useimmat aktiiviset fraktiot vaikuttavat elinkelpoisuutta Caco-2- olivat F2 ja F3. Kuitenkin myös nämä vaikutukset tapahtunut solun ulkopuolisilla signalointi tai seuraava ottoa PC ei ole tiedossa. Lisätutkimukset ovat perusteltuja määrittää imeytymistä suolistossa PC jakeiden suoliston normaalin solulinjoissa. TheMTT määritys on epäsuora mitta solujen elinkelpoisuuden perustuvan aineenvaihdunta. Vähentäminen solujen elinkelpoisuuden havaittu nykyisessä tutkimuksessa voisi johtua vaikutusta solusyklin tai solujen lisääntymistä. Siksi lisätutkimukset tutkivat solusyklin, solujen lisääntymisen ja solukuoleman toiminta (anneksiini V /PI-värjäys, LDL vapautumisen määrityksellä, kaspaasi-3: n ja Bcl-2 määrällinen) voidaan saada näyttöä vaikutuksesta tiettyjen kokojen tietokoneiden oncell signalointi. Testaus PC jakeet muissa paksusuolen solulinjoissa (normaali ja neoplastisia) Poissuljettavien yleistä toksisuutta ja lisänäyttöä PC mahdollisia.

Yhteenvetona lisätutkimuksia perusteltua selvittää molekyylitason mekanismi F2 ja F3 solureiteillä liittyvä paksusuolen neoplasia. Kypsiä PC otteet eivät vain ole mahdollisia käyttötarkoituksia ihmisten terveydelle, mutta alsoin turn lisäarvon viiniä tuotantosektorista, kuten kypsä rypäleiden siemenet ovat tärkeimmät sivutuotteet viininvalmistuksen. Tuloksemme antaa vakuuttavia todisteita, että yhdistämällä PC jakeet ja 5-FU, voi olla mahdollinen kemopreventatiivisille aineena paksusuolensyöpä hoito-ohjelmissa; kuitenkin lisää vahvistavia

in vitro

tutkimuksia edellytetään eri luokkiin kemoterapiaa huumeita seurasi

in vivo

syövän malli tutkimuksissa määritellä paremmin mahdollista roolia rypäleiden siemenet tietokoneita vastaan ​​paksusuolen syöpä.