Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

CD166, joka tunnetaan myös aktivoitu valkosolujen adheesiomolekyyli (ALCAM) , ilmaistaan ​​eri solujen useissa kudoksissa, mukaan lukien syöpä. Kuitenkin rooli CD166 pahanlaatuisia kasvaimia on kiistanalainen, erityisesti haimasyövän. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selventää rooli ja merkitys CD166 ilmaisun haimasyövän.

Methods

Me tehdään immunohistokemiallisesti ja virtaussytometria analysoida ilmentymistä CD166 kirurgisissa haiman kudoksista ja haimasyövän solulinjoissa . Erot eristetty CD166 + ja CD166- haimasyöpäsoluissa analysoitiin hyökkäyksen ja muuttoliike määrityksissä, ja hiiren ksenograftimalleissa. Olemme myös suorittaa kvantitatiivinen RT-PCR ja mikrosirujen joka arvioi ekspressiotasoja CD166 ja liittyvien geenien viljellyissä soluissa.

Tulokset

immunohistokemia paljasti korkea ilmentyminen CD166 haimasyövän kudoksissa (12,2% ; 12/98) verrattuna normaalin haiman valvonta (0%, 0/17) (p = 0,0435). Virtaussytometria osoitti, että CD166 ilmaistiin 33,8-70,2% soluista kirurgisissa haiman kudoksista ja 0-99,5% haimasyövän solulinjoissa. Invasion ja muuttoliike analyysit osoittivat, että CD166- haimasyöpäsoluissa osoitti vahvempi invasiivisia ja muuttavien toimintaa kuin CD166 + syöpäsolujen (p 0,05). Toisaalta, CD166 + Panc-1-soluissa, oli huomattavasti vahvempi pesäkkeiden muodostumisen aktiivisuutta kuin CD166- Panc-1-soluja (p 0,05).

In vivo

analyysi paljasti, että CD166 + solut herättivät merkittävästi suurempi kasvaimen kasvua kuin CD166- soluja (p 0,05) sekä ihonalaisen ja potilaalle tehdä hiiren kasvainmuodoista. mRNA: n ilmentymisen epiteelin-mesenkymaalitransitioon aktivaattori Zeb1 oli yli-ilmentynyt CD166- soluissa (p 0,001). Microarray-analyysi osoitti, että TSPAN8 ja BST2 oli yli-ilmentynyt CD166 + -solujen, kun taas BMP7 ja Col6A1 oli yli-ilmentynyt CD166- soluissa.

Päätelmät

CD166 + haimasyöpä solut ovat voimakkaasti tuumorigeenisiä, kun taas CD166- haimasyövän soluilla suhteellisesti vahvempi invasiivisia ja muuttavat toimintaa. Nämä havainnot viittaavat siihen, että CD166 ilmentyminen liittyy eri toimintoja haiman syöpäsoluissa.

Citation: Fujiwara K, Ohuchida K, Sada M, Horioka K, Ulrich CD III, Shindo K, et ai. (2014) CD166 /ALCAM Expression on ominaista kasvaimien ja invasiivinen ja vaeltavien toiminta haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 9 (9): e107247. doi: 10,1371 /journal.pone.0107247

Editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 08 elokuu 2014; Julkaistu: 15 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Fujiwara et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Microarray tiedot ovat saatavilla Gene Expression Omnibus (GEO) NCBI (hakunumero GSE55294).

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee osittain Grants-in-tukea opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede- and Technology of Japan (Grant numero: 23390327, 24390318, 24390319, 25670584, 25670585, 25670586, 241237) ja Fukuoka Foundation for Sound Health (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/) ( https://www.sukoken.or.jp/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on yksi tappavan ihmisen maligniteettien, jossa on 5 vuoden pysyvyys on alle 5% [1]. Tämä huono tulos johtuu suurelta osin varhainen diagnosointi on harvinaista ja tavanomaisten terapeuttisten kuten kirurginen resektio, kemoterapiaa, ja sädehoitoa ole kovinkaan tehokkaita [1], [2]. Siksi uusia strategioita tarvitaan kiireesti syöpähoitoa varten. Äskettäin käsite syövän kantasoluja (CSCS) on saanut paljon huomiota. CSCS käsittävät hyvin pieni populaatio syöpäsolujen, joilla on kyky käynnistää ja pitää yllä kasvaimen muodostumiseen [3]. Näin ollen, täsmähoitoihin tämä pieni solupopulaation syövän saattavat olla tehokkaampia kuin nykyiset hoidot, mukaan lukien ne, haimasyöpä.

CD166, joka tunnetaan myös aktivoida leukosyyttien soluadheesiomolekyyli (ALCAM), on jäsen immunoglobuliinin superperheen [4]. Se on havaittavissa erilaisia ​​solutyyppejä, mukaan lukien epiteelisoluissa, lymfoidisoluja, myeloidinen, fibroblastit, hermosolujen, maksasoluissa, ja luuytimen soluihin [5]. CD166 on raportoitu olevan markkeri CSCS paksusuolen syöpä ja eturauhasen syöpä, joka osoittaa vahvaa kasvainten muodostumiseen [6], [7]. Lisäksi sen yli-ilmentyminen on raportoitu itsenäisenä prognostinen markkeri joidenkin syöpien [8]. Toisaalta, esto CD166 on osoitettu lisäävän invasiivisia ja muuttavat toimintaa munasarjakarsinooma- ja glioblastoomasolut [9], [10]. Haimasyövän, on ollut raportoidut tiedot suhdetta CD166 ilmaisun ja ennusteen tietoja, mutta se on edelleen kiistanalainen [11] – [13].

Esillä olevassa tutkimuksessa arvioimme merkitys CD166 ilmaisun haimasyövän. Huomasimme, että CD166 + haimasyöpäsoluissa näytteillä vahvempi kasvainten muodostumiseen kuin CD166- soluja, kun taas CD166- haimasyöpäsoluissa näytteillä suhteellisesti vahvempi invasiivisia ja muuttavat toimintaa. Nämä havainnot viittaavat siihen, että CD166 ilmentyminen liittyy eri toimintoja haiman syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Tämä hyväksyi tutkimuksen eettisen komitean Kyushu University (hyväksynnän numero: 24-222) ja noudatetaan sovittuja eettisiä ohjeita Human Genome /Gene Research säätänyt Japanin hallituksen ja Helsingin julistuksen. Kaikki potilaat edellyttäen allekirjoitettu tietoon perustuva suostumus hyväksymisestä käyttöä kudoksiin määrittelemättömistä tutkimustarkoituksiin. Hiiren kokeet hyväksynyt eettinen komitea Kyushu University (hyväksynnän numero: A-24-262-0). Eläimiä pidettiin erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa.

Potilaille ja haiman kudoksista

Haimasyöpä kudokset saatiin potilailta, joille tehtiin haiman resektio meidän laitokselle. Immunohistokemiaa näytteet kerättiin 98 haimasyövän potilaat mukaan lukien 62 miestä ja 36 naista, joiden keski-ikä 65,2 vuotta (vaihteluväli 36-81 vuotta). Kliinis potilaiden ominaisuuksiin on kuvattu taulukossa 1. Yleinen eloonjääminen perustui jona operaation kuolinpäivästä tai Viimeisimmässä seurannassa. Ennusteita määritettiin syyskuussa 2013. Keskimääräinen eloonjäämisaika aika oli 16 kuukautta (vaihteluväli: 1-135 kuukautta). Kuusikymmentäkuusi potilaista ei hengissä seurantaa. Vieressä kudosten arvioitiin näytteet histologisesti kriteerien mukaan Maailman terveysjärjestön. Kasvain vaiheessa arvioitiin luokituksen mukainen unionin kansainvälisen Cancer valvonta. Kuten kontrollisilkkipaperia, saimme 17 normaalissa haima- kudosnäytteitä ehjä pancreases että resekoitiin varten sappitiehyen syöpä, neuroendokriinikasvain tai hyvänlaatuinen solid-pseudopapillary kasvain. Virtaussytometrianalyysiä, haimasyöpä kudokset kerättiin viideltä potilaalta, joista kolme miestä ja kaksi naista, joiden keski-ikä 62,0 vuotta (vaihteluväli = 37-80 vuotta), jota oli resektoitiin meidän laitoksen välillä heinäkuu 2013 ja marraskuun 2013.

immunohistokemiallinen menettelyjä ja arviointi

CD166 havaittiin käyttäen hiiren monoklonaalinen vasta-aine (klooni MOG /07, 1: 450; Novocastra, Newcastle upon Tyne, UK) inkuboimalla yön yli 4 ° C. EnVision järjestelmä (Dako, Glostrup, Tanska) käytettiin visualisoimaan Immunovärjäyksen. Solut katsotaan positiivisesti immunovärjättiin kun kalvo tai solulimassa värjättiin. Kudokset ilman värjäystä tai heikko ja kohtalainen värjäytymisvoimakkuuksia 70% ja 30% soluista, vastaavasti, katsottiin CD166

alhainen. CD166

korkea määrättiin kudoksiin heikkoja ja kohtalainen värjäytymisvoimakkuuksia ≥70% ja ≥30% soluista, vastaavasti. Osiot arvioitiin erikseen kaksi tutkijaa ilman mitään tietoa kliiniset piirteet kunkin tapauksen.

Solut ja viljelyolosuhteet

Ihmisen haiman Solut irrotettiin kirurginen haiman kudoksista käyttäen kasvain dissosiaatio Kit (ihmisen ) ja gentleMACS Dissociator (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden. Välittömästi sen jälkeen dissosiaatio, solut analysoitiin virtaussytometrialla. Lisäksi analysoitiin seuraavat yhdeksän haimasyövän solulinjoissa: BxPC3, CFPac-1, SW1990, AsPC1, ja Capan-2 (American Type Culture Collection, Manassas, Va); Pancin-1 (RIKEN, Tsukuba, Japani); MiaPaCa2, SUIT-2, ja KP-2 (Health Science Research Resources Bank, Osaka, Japani). Analysoimme myös kaksi normaalia haiman kanava epiteelisolujen linjat: ihmisen ensisijainen normaali haiman epiteelisolujen linja, CS-PE (DS Pharma Biomedical Co, Osaka, Japani), ja kuolemattomaksi haimatiehyen epiteelisolujen linja, HPDE6-E6E7 klooni 6 ( lahja Dr. Ming-Sound Tsao, University of Toronto, Toronto, Kanada). Lisäksi, ihmisen haiman tähtisolut (PSC) eristettiin tuoreesta haiman näytteitä käyttäen seuraus menetelmällä [14]. Metastaattista SUIT-2 solulinja on aiemmin osoitettu laboratoriossamme [15]. Samaa menetelmää käytettiin luomaan metastaattista Pancin-1-solulinjassa. Soluja ylläpidettiin kuten aiemmin on kuvattu [16].

virtaussytometrinen analyysi ja solujen erotus immunologista

soluja subkonfluenteista yksikerrosviljelmiä suspendoitiin fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS) ja inkuboitiin monoklonaalisten anti- -ihmisen ALCAM-fykoerytriini (PE) (R BD Biosciences, Bedford, MA) -pinnoitettu siirtokuoppaan kammiot 8 um huokosia (BD Biosciences) kuten aiemmin on kuvattu [16], [17]. Syöpäsolut (5 x 10

4 solua /0,25 ml) ympättiin yläkammioiden ja inkuboitiin 24 tuntia (Panc-1-solut) 48 h (SW1990-soluissa) tai 72 h (SUIT-2-solut). Syöpäsolut, jotka muuttivat alapintaan kalvot kiinnitettiin 70% etanolilla, värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 20-solut laskettiin ja kuvattiin valomikroskoopilla. Koe suoritettiin kahdesti.

adheesiomäärityksellä

Tarttumismääritys suoritettiin kuten on kuvattu aiemmassa tutkimuksessa [12] pienin muutoksin. Solut ympättiin tiheydellä 1 x 10

6 solua /kuoppa 24-kuoppaisille levyille (Becton Dickinson Labware). 60 minuutin jälkeen solut pestiin PBS: llä poistamaan tarttumattomat solut. Liima-solut värjättiin kristallivioletilla ja laskettiin valomikroskoopilla. Kaikki ehdot testattiin neljänä ja koe suoritettiin kahdesti.

In vivo -kokeet

Viisi-viikkoisen naaras-nude-hiiriin istutettiin ihonalaisesti tai ortotooppisesti syöpäsolujen suspendoitiin 100 ul: aan PBS: ää, kuten aiemmin on kuvattu [19]. Kolmiulotteinen halkaisijat mitattiin laskemiseksi kasvaimen tilavuus. Hiiret tapettiin ilmoitettua päivää ja ihon alle tai ortotooppinen kasvaimet leikattiin irti ja punnittiin. Virtaussytometrianalyysiä, kasvaimen solut hajotettiin käyttämällä Kasvaimen dissosiaatio Kit (ihminen) ja gentleMACS Dissociator.

hiljentäminen ja CD166-ilmentymisen pieni häiritsevä RNA

Syöpäsolut noin 90% konfluenssiin transfektoitiin kanssa CD166-7 (SI02780169) sirna (siRNA) (Qiagen, Tokio, Japani) elektroporaatiolla käyttäen Nucleofector System (Lonza, Bazel, Sveitsi) mukaan valmistajan ohjeiden. Voit tarkistaa knockdown spesifisyyden, käytimme ohjaus siRNA (Qiagen). Solut käytettiin seuraavissa kokeissa 24-144 h transfektion jälkeen.

Kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR) B

Kokonais-RNA uutettiin viljellystä soluista käyttämällä High Pure RNA Isolation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa) ja DNaasi I (Roche Diagnostics) mukaisen käsittelyn valmistajan ohjeiden mukaisesti. qRT-PCR suoritettiin käyttäen QuantiTect SYBR Green Reverse Transcription-PCR-kittiä (Qiagen) ja CFX96 Real-Time PCR System (Bio-Rad Laboratories). Alukkeet ostettiin Takara Bio Inc. (Tokio, Japani). Alukesekvenssit on esitetty taulukossa 2. Kukin reaktioseos inkuboitiin ensin 50 ° C: ssa 30 min käänteisen transkription syntetisoimiseksi ensimmäisen juosteen komplementaarinen DNA pohjamaalaamalla kokonais-RNA, jossa geenispesifistä aluketta. PCR aloitettiin inkuboimalla 95 ° C: ssa 15 min aktivoida polymeraasi, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C: ssa 5 s, 60 ° C: ssa 20 s, ja 72 ° C: ssa 30 s. Geenit ekspressiotasoja laskettiin käyttämällä standardikäyrää rakennettu kokonais-RNA Panc-1, SUIT-2, tai erityisiä PSCs. Ilmentymistasojen geenien normalisoitiin kuin β-aktiini sisäisenä kontrollina ja ilmaistiin suhteena kohdegeenin ilmentymisen p-aktiinin ilmentymistä. Kaikki näytteet ajettiin kolmena rinnakkaisena, ja jokainen näyte analysoitiin vähintään kaksi kertaa. Ei havaittavaa PCR-tuotteet monistettiin ilman etukäteen käänteistranskriptio. Tarkkuus ja luotettavuus PCR-tuotteet varmistettiin käyttäen Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Palo Aito, CA).

Microarray analysoi

Suoritimme mikrosirun analyysit CD166 + ja CD166- soluja, jotka ovat peräisin sekä Panc-1 ja SW1990 solulinjat. Laatu RNA-näytteet arvioitiin käyttämällä Agilent 2100 Bioanalyzer. Human HT-12v4 Expression BeadChip (Illumina, San Diego, CA) käytettiin analyyseihin. Data analysoitiin käyttäen BeadStudio ohjelmistoversio 3.2.3 (Illumina).

Tilastollinen analyysi

Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta. Vertailut kahden ryhmän välillä tehtiin käyttämällä Studentin t-testi. Tilastollinen merkittävyys määritettiin p 0,05. Χ2 testillä analysoidaan korrelaatio CD166 ilmaisun ja kliinis ominaisuuksien havaittu immunohistokemiallinen tutkimus. Survival laskettiin Kaplan-Meier-analyysi, ja eloonjäämiskäyrien verrattiin käyttäen log-rank-testi. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen JMP 9.0.2 ohjelmistoa (SAS Institute, Cary, NC).

Tulokset

Kotelot haimasyövän ovat usein CD166

korkea

immunohistokemiallinen värjäys CD166 suoritettiin käyttäen kirurgisesti resektoitiin haiman kudoksista (kuvio 1A). Yhdenmukainen aikaisemmassa tutkimuksessa, löysimme vahvan CD166 värjäytyminen saarekesolujen ja kohtalainen värjäytyminen hermoissa positiivisina verrokkeina [11] – [13]. Joissakin tapauksissa, CD166 ilmaistiin maltillisesti rakkulasoluissa. 17 normaalissa haima- kudosnäytteitä, haimatiehyen epiteelisolujen ei ilmaissut CD166 tai osoittivat heikkoa CD166 ilme. Kaikki normaalit haiman kudokset tunnistettiin CD166

alhainen. Haimasyövässä kudoksissa, jotkut syöpäsolut värjättiin kohtuullisesti CD166, ja tunnistimme 12,2% (12/98) haimasyövän kudoksissa CD166

korkea. Prosenttiosuus CD166

korkea haimasyöpä kudoksiin oli merkittävästi suurempi kuin normaalissa haiman kudoksista (p = 0,0435). Haimasyövän kudoksissa, olemme huomanneet, että CD166-ekspressio liittyy hermoa invaasio (p = 0,037, taulukko S1), mutta ei ennustetta käyttämällä Kaplan-Meier-eloonjääminen analyysi (p = 0,1473, kuvio 1 B).

(A ) immunohistokemiallinen värjäys CD166 suoritettiin käyttäen resektoidun haiman kudoksia. (A) normaali haima, CD166 ilmentyi voimakkaasti kalvon saarekesolujen (mustat nuolet) ja heikosti normaaleissa haimatiehyen soluja (mustat nuolenkärki). (B) Joissakin haimasyöpä kudoksia, syöpäsolut olivat positiivisia CD166. Alkuperäinen suurennus: 200 ×. Upotteet 600 ×. (B) Kaplan-Meier selviytymisen analyysi paljasti, että intensiteetti CD166 ilmentyminen haimasyövän ei korreloi ennusteeseen (p = 0,1473). (C) virtaussytometrinen analyysi CD166 ilmen- tyminen soluissa, erotettiin, perustuen EpCAM ilmentymisen. Positiivinen ilmentymisnopeudessa (%) on tarkoitettu kunkin merkin.

arvioitiin myös CD166expression haiman kudoksista virtaussytometrialla. Haimasyövässä kudoksia, CD166 + vaihteli 15,2-45,3% (keskiarvo = 29,1%). Koska CD166 ilmentyy erityyppisissä soluissa [5], käytimme epiteelisolujen adheesiomolekyyli (EpCAM), joka on ilmaistu yksinomaan epiteeli ja epiteelin johdettu kasvaimet, jättää kuin epiteelikudos analyysistä. Niistä EpCAM + soluja (10-56,5% soluista, keskiarvo = 20,6%), positiivinen nopeus CD166 vaihteli 33,8%: sta 70,2% (keskiarvo = 47,9%) (kuvio 1 C). Ei ollut merkitsevää eroa CD166 ja EpCAM positiivisuusasteet (p = 0,3488).

CD166 ilmentyminen ihmisen haimasyövän solulinjoissa

Seuraavaksi analysoimme CD166 + korko haimasyövän solulinjoissa virtaussytometrialla, ja totesi, että CD166 ilmennettiin monenlaisia ​​soluja (0-99,5%) (kuvio 2A). Erityisesti mitään yhteyttä välillä havaittiin CD166 + korko ja pahanlaatuiset mahdollisuudet, kuten invaasio, muuttoliike ja lisääntymistä, mikä oli linjassa havainnot aiemman raportin (taulukko S2 ja kuva S1) [20]. Arvioitava edelleen merkitystä CD166 ilmentyminen haimasyövän, analysoimme SW1990 ja Panc-1-soluissa joista 77,7-99,3% (keskiarvo = 86,4%) ja 38,5-54,0% (keskiarvo = 46,9%) ilmaistuna CD166, vastaavasti. Erottamisen jälkeen CD166 + ja CD166- -alapopulaatioiksi, pyysimme CD166 ilmentyminen viikoittain vanhempien, CD166 +, ja CD166- solut yli 6 viikon jakson aikana (kuviot 2B, C). CD166 + korko ei merkittävästi muutu CD166 + soluissa, kun taas sekä vanhempien ja CD166- solujen lisääntynyt vähitellen. Huomattavaa on, että emme noudata ilmeisiä morfologisia eroja CD166 + ja CD166- Pancin-1-soluja (kuvio 2D).

(A) CD166 positiivisuusasteet kahdessa normaalissa haimatiehyeeseen epiteelisolujen linjat, haimasyöpä solulinjat, ja haiman tähtisolut (PSCs). (B, C) SW1990 (B) ja Panc-1 (C) solujen (emo-solut) erotettiin perustuu CD166 lauseke (CD166 + ja CD166-) jota AutoMACS PRO erotin. Muutokset CD166 ilmaisun vanhempien ja CD166 +/- -alapopulaatioiksi seurattiin usein virtaussytometrialla yli 6 viikkoa. (D) morfologia Pancin-1-solut erotettiin perustuu CD166 ilme. Alkuperäinen suurennus: 40 ×.

CD166- solujen suuri joko invasiivisia ja muuttavat toimintaa, kun taas CD166 + solujen voimakkaamman pesäkkeiden muodostumisen aktiivisuutta

tutkia vaikutuksia CD166 haimasyövän, eri syöpään liittyvien prosessien testattiin haiman solulinjoja, jotka erotettiin perustuva CD166 ilme. Vertasimme invasiivisen ja muuttavien kyvyt CD166 + ja CD166- solut ovat peräisin sekä SW1990 ja Panc-1 solulinjoissa. CD166- SW1990 ja CD166- Pancin-1-solut osoittivat merkitsevästi suurempi soluinvaasiota kuin heidän CD166 + cell kollegansa (p 0,05, kuvio 3A). Lisäksi, CD166- solut ilmensivät huomattavasti suurentunut vaeltavien potentiaalia verrataan CD166 + -solujen sekä SW1990 ja Panc-1-solulinjoja (p 0,05; kuvio 3B). Käyttämällä proliferaatiomääritys, olemme huomanneet, että CD166 + -solut osoittivat suurempi proliferatiivinen aktiivisuus kuin CD166- solujen SW1990-solulinja (p 0,0001), mutta ei CD166- soluja Panc-1-solulinjassa (kuvio 3C). Vuonna pesäkemuodostusta, CD166 + Panc-1-soluissa, oli huomattavasti vahvempi pesäkkeiden muodostumisen aktiivisuutta kuin CD166- Panc-1-soluja (p 0,05, kuvio 3D). Kun pallo muodostumista ja adheesiomäärityksiä, ei havaittu eroja valmiuksia CD166 + ja CD166- Pancin-1-soluissa (kuvio 3E ja 3F).

(A) Invasion määrityksistä CD166 + ja CD166- solut ovat peräisin SW1990 ja Panc-1-solulinjoja suoritettiin viljelemällä soluja Matrigelillä päällystetty transwell-irto. Sen jälkeen kun ilmoitettu ajat, solut alemmassa kalvon inserttien värjättiin H *,

p

0,05; **,

p

0,01; ***,

p

0,0001; NS, ei merkittävää.

CD166 + solut osoittavat vahvoja kasvainten muodostumiseen hiiren ksenograftimalleissa

vaikutusten arvioimiseksi CD166 on

in vivo

kasvaimen kasvua, me ihonalaisesti CD166 + tai CD166–soluja nude-hiiriin. Olemme havainneet, että CD166 + -solut oli merkittävästi suurempi tuumorigeenisyyden kuin CD166- soluja, jotka ovat peräisin Panc-1-solulinjassa (p = 0,0082; kuvio 4A ja taulukko 3). Samoin, SW1990-johdettu CD166 + -solujen taipumus tuottaa suurempia kasvaimia kuin CD166- soluja, vaikka ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä (kuvio S2 ja taulukko S3). Hiiren potilaalle tehdä ksenograftimalleja, kasvaimet johdettu CD166 + Pancin-1 solut olivat painavampia kuin tuonti CD166- Pancin-1-solut (p 0,05; kuva 4B). Analyysi ihonalaisen ja ortotooppisten ksenograftimalleissa virtaussytometrialla osoitti, että CD166 + korko kasvainten CD166 + soluja oli huomattavasti korkeampi kuin kasvainten CD166- soluja, vaikka immunohistokemia eivät osoittaneet merkittäviä eroja CD166 ilmentyminen (kuviot 4C-F). Ei myöskään ole merkittävää suhdetta kasvainten koon ja CD166 + määrä soluja (kuvio 4G).

(A) Hiiret ihonalaisesti vanhempien, CD166 +, ja CD166- soluja Panc-1 solun line (edustaja kuva), ja kasvainten tilavuudet säännöllisesti mitattiin 7 viikon ajan. (B) Hiiren potilaalle tehdä -tuumoriksenografti mallien myynti tuotettu CD166 + ja CD166- Pancin-1-soluissa. Kasvaimet leikattiin irti ja märkä punnittiin. (C, E) immunohistokemiallinen analyysi CD166 ihon alle (C) ja ortotooppisten (E) kasvaimia, jotka ovat peräisin CD166 + ja CD166- SW1990 ja Panc-1-soluissa. Alkuperäinen suurennus: 100 ×. (D, F) CD166-ekspressiota analysoitiin ihon alle (D) ja ortotooppisten (F) kasvaimia, jotka ovat peräisin CD166 + ja CD166- solujen virtaussytometrialla. (G) analyysi suhdetta kasvaimen painon ja positiivisuus määrä CD166 soluja potilaalle tehdä kasvaimia peräisin CD166 + ja CD166- Pancin-1-soluissa. Kaikki kuvaajat esittävät keskiarvoja ± SD; *,

p

0,05, **,

p

0,01.

CD166- solut yli-ilmentävät epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) aktivaattori Zeb1

Hong et al. raportoitu, että pudotus on CD166, jonka RNA-interferenssi ei ole vaikutusta kasvuun tai invaasion haimasyövän soluja [12]. Olemme myös esti CD166 ilmentymisen RNA häiriöitä haimasyövän solulinja SUIT-2. Tämän seurauksena knockdovvn CD166 ei vaikuttanut hyökkäystä, muuttoliike, leviämisen tai pesäkkeiden muodostumisen toiminta (kuviot 5A, 5B, ja S3A-C). Selvittämiseksi avaintekijöitä korostuu toiminnallisia eroja CD166 + ja CD166- soluja, me seuraavaksi keskittyneet ilmaus merkkiaineita EMT ja haiman CSCS. Arvioimme ilmentymistä EMT merkkiaineiden SW1990 ja Panc-1-soluissa käyttäen qRT-PCR. Klo ensisijainen vaiheessa EMT, solujen menettävät ilmaus epiteelin markkereita, ilmaista mesenkymaalisten markkereita, ja hankkia liikkuvia ja invasiivisia ominaisuuksia [21]. Taso Zeb1 mRNA, EMT aktivaattori, oli suurempi CD166- soluissa kuin siinä, CD166 + -solut, vaikka ei ollut eroja mRNA-tasojen epiteelin marker E-kadheriinin (kuvio 5E). Taso N-kadheriinin mRNA, joka on mesenkymaaliset markkeri, oli suurempi CD166 + soluissa kuin siinä CD166- soluissa. Lisäksi taso metalloproteinaasi 2 (MMP2) mRNA, joka liittyy solun invasiivisuus, lisääntyi CD166- soluissa verrattuna, että CD166 + soluihin [22]. Seuraavaksi analysoimme suhdetta CD166 ilmaisun ja CSC markers CD24, CD44, ja CD133; kuitenkin, emme löytäneet mitään merkittäviä muutoksia niiden ilmaisun välillä CD166 + ja CD166- solut ovat peräisin Pancin-1-soluissa (kuvio 5D) [23], [24].

(A) qRT-PCR-analyysi mRNA tasot CD166 puku-2-soluissa sen jälkeen, kun RNA-interferenssi suoritettiin osoitetuissa päivää transfektion jälkeen. Ohjaus (siControl) tai CD166 vaiennettu soluja (siCD166) analysoitiin (B) pesäkkeiden muodostumisen määritykset ilmoitettuina päivinä transfektion jälkeen. (C) qRT-PCR-analyysi EMT markers E-kadheriinin, N-kadheriinin, Zeb-1, ja MMP2 on CD166 + ja CD166- Panc-1 ja SW1990-soluissa. (D) välisiä suhteita ilmaus CD166 ja CSC markkereita CD24, CD44, ja CD133 in Pancin-1 solut analysoitiin virtaussytometrialla. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD; *,

p

0,05; NS, ei merkittävää.

Microarray analyysi osoittaa yli-ilmentyminen TSPAN8 ja BST2 in CD166 + soluissa, kun taas BMP7 ja Col6A1 ovat yli-ilmaistu CD166- soluissa

tunnistaa muiden keskeisten molekyylejä mukana CD166 ilmaisun teimme mikrosiru analyysit CD166 + ja CD166- solut molemmista Pancin-1 ja SW1990 solulinjoissa. Vertailuja microarray tietojen tunnistettu 26 geeniä, jotka olivat sääteli yli 2-kertaisesti CD166 + soluissa (taulukko S4) ja 11 geenit, jotka sääteli yli 2-kertaisesti CD166- soluissa (taulukko S5). Näistä geeneistä, valitsimme TSPAN8, BST2, BMP7 ja Col6A1 tarkempaa analysointia, koska nämä geenit on raportoitu osallistuvan kasvainten muodostumiseen tai syöpäsoluinvaasiota ja muuttoliike. qRT-PCR-analyysi suoritettiin sitten validoimiseksi microarray tiedot (kuvio 6A) [25] – [29]. Arvioimaan vaikutuksia CD166 pudotus ekspressioon näiden neljän geenien, niiden mRNA-tasot arvioitiin SUIT-2-soluissa sen jälkeen, kun RNA-interferenssi. Tämän seurauksena ei tapahtunut merkittäviä muutoksia ekspressiotasot näiden geenien (kuvio S4).

(A) qRT-PCR: ää käytettiin analysoimaan mRNA tasot TSPAN8, BST2, BMP7, ja Col6A1, jonka todettiin olevan säädelty yli 2-kertaisesti CD166 + ja CD166- solujen vertailuissa microarray data. (B) positiivisuus määrä CD166 metastaattisessa Pancin-1 ja metastaattinen SUIT-2 solulinjoissa mitattiin virtaussytometrialla. (C) qRT-PCR-analyysi oli käytettiin myös tutkimaan CD166 mRNA-tasot on metastaattinen solulinjoissa. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD; *,

p

0,05, **,

p

0,01, ***,

p

0,001.

Tutkitaan onko CD166 on rooli etäpesäke, käytimme kahta aiemmin vahvistettu metastasoituneen haimasyövän solulinjoissa, jotka oli muodostettu maksametastaaseista nude mouse ksenograftimalleissa [15]. Nämä solulinjat, metastaattinen Panc-1 ja metastaattinen SUIT-2, osoitti vahvempaa maksan metastaattinen potentiaali verrattuna niiden kantasolulinjoista. Metastasoituneessa Pancin-1-solulinjassa CD166 ilmentymisnopeudessa lisääntyi merkitsevästi verrattiin emosoluista (99,2% vs. 46,9%, kuvio 6B). Puku-2 solulinjan, useimmat solut ilmensivät CD166 sekä vanhempien SUIT-2-solut (99,3%) ja metastasoituneen SUIT-2-solut (99,4%). qRT-PCR-analyysi osoitti, että tasot CD166-mRNA: n sekä metastaattisen Panc-1 ja metastaattinen SUIT-2-solut olivat merkittävästi suurempia kuin niiden vanhempien solulinjoissa (p 0,0001 ja p = 0,0015 Panc-1 ja SUIT-2,