Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tausta ja Tavoite

Aberrant hypermetylaatiota syöpään liittyvien geenien on noussut lupaavaksi kehittämisstrategiaa diagnostisten, prognostisia ja ennakoivan biomarkkereita ihmisen syövässä, mukaan lukien peräsuolen syöpä (CRC). Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää suorittaa järjestelmällinen ja kattava analyysi paneelin CRC-geenejä mahdollisina diagnostisia, prognostisia ja ennustavan biomarkkerit suuri, väestöpohjainen CRC kohortti.

Potilaat ja menetelmät

metylointi tilan

SEPT9, TWIST1, IGFBP3, GAS7, ALX4 ja miR137

geenit tutkittiin kvantitatiivisen bisulfiitti pyrosekvensointi in väestöpohjaisen kohortin 425 CRC potilaista.

tulokset

metylointi taso kaikkien geenien analysoitiin olivat merkittävästi korkeammat kasvaimen kudoksissa verrattuna normaaliin limakalvoon (p 0,0001); kuitenkin, syöpään liittyvä hypermetylaation oli useimmin havaittu

miR137

(86,7%) ja

IGFBP3

(83%) CRC potilailla. Metyloituvuutta käyttäen näiden kahden geenien osoitti suurinta tarkkuutta tunnistamiseksi koolonikasvainten (herkkyys 95,5%, spesifisyys 90,5%). Alhainen

IGFBP3

promoottori metylaation tullut itsenäinen riskitekijä ennustamiseen huono taudista vapaan eloonjäämisen vaiheen II ja III CRC potilasta (HR = 0,49, 95% CI: ,28-+0,85, p = 0,01). Tuloksemme osoittavat myös, että vaiheen II III CRC potilailla, joilla on korkea

IGFBP3

metylaatio eivät hyödy adjuvanttia 5FU kemoterapiaan.

Johtopäätös

Analysoimalla suuri, väestöpohjainen CRC kohortti, me osoittaa mahdollinen kliininen merkitys

miR137

ja

IGFBP3

hypermetylaation lupaaviksi diagnostisia biomarkkereita CRC. Tuloksemme paljasti myös, että

IGFBP3 hyper

metylaatio voi toimia itsenäisenä prognoosi- ja ennakoivan biomarkkereiden vaiheessa II ja III CRC potilaita.

Citation: Perez-Carbonell L, Balaguer F, Toiyama Y, Egoavil C, Rojas E, Guarinos C, et ai. (2014)

IGFBP3

metylointi on uusi diagnostinen ja Ennakoiva biomarkkereiden kolorektaalisyövässä. PLoS ONE 9 (8): e104285. doi: 10,1371 /journal.pone.0104285

Editor: Hassan Ashktorab, Howard University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 04 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 07 heinäkuu 2014; Julkaistu: 15 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Perez-Carbonell et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä työ tukivat apurahan R01 CA72851 ja CA181572 National Cancer Institute, National Institutes of Health ja varojen Baylor Research Institute. Lucia Perez-Carbonell on vastaanottaja 2012 tohtorintutkinnon apurahan Fundación Alfonso Martín Escuderon. Francesc Balaguer on vastaanottaja avustusta Instituto de Salud Carlos III (PI10 /00384). CIBEREHD rahoittaa Instituto de Salud Carlos III. Carla Guarinos on vastaanottaja avustusta Valencian (Väli + D Acif /2010/018). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Ajay Goel on PLoS One Editorial Board Member. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One Pääkirjoitus politiikan ja kriteerit.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmistä syövistä länsimaissa, ja on toinen johtava syöpään liittyvien kuolemien aikuisilla [1]. Kertyvät todisteet osoittavat, että epigeneettisellä muutokset on keskeinen rooli patogeneesissä CRC. Poikkeava DNA: n metylaatio on yksi eniten tutkittu epigeneettiset muutos, ja se on hyvin selvää, että tuumorisuppressorigeeneille usein vaiennetaan metylaation CpG-saarekkeiden mikä tavallinen asuvat 5 alueille noin puolet kaikista ihmisen geeneistä [2], [3 ], [4]. Transkription vaiennettu tuumorisuppressorigeeneille on tullut tärkeä askel vaiheittainen prosessi peräsuolen syövän synnyn. Epigeneettiset vaihtoehtoja, erityisesti DNA hypermetylaation, voidaan käyttää varhaiseksi havaitsemiseksi premalignien leesioiden, mukaan lukien adenomatous polyypit paksusuolessa, ja on läsnä ei-neoplastiset kudokset vieressä adenomatoottisten polyyppien ja syöpien paksusuolessa [5], [6] . Sen lisäksi niiden käyttö diagnostisten biomarkkereita, epigeneettiset muutokset ovat lupaavia määrittäjinä syövän ennustetta sekä biomarkkereita vastauksena tiettyihin chemotherapies [7], [8].

CRC, systemaattinen genominlaajuisten lähestymistapoja ovat tunnistaneet useita geenejä, jotka osoittavat kasvaimen promoottori hypermetylaation jotka voidaan mahdollisesti kehittynyt kliinisesti merkittäviä diagnostisia, prognostisia ja ennakoivan biomarkkereita. Yhteydessä CRC, useita tällaisia ​​biomarkkerit on viime aikoina kuvattu mahdollisesti lupaavien diagnostisia biomarkkereita, kuten:

SEPT9

(septin 9), jäsen septin perheen mukana sytokineesiin ja solusyklikontrollin [9], [10], [11];

ALX4

(Homeobox proteiini aristaless kaltaiset 4), transkriptiotekijä mukana kallo ja raajojen kehitystä [12], [13];

TWIST1

(Twist homologi 1), antiapoptoottista ja pro-metastasoitunut transkriptiotekijä [14], [15];

IGFBP3

(Insuliinin kaltainen kasvanut tekijä sitova proteiini 3), jäsen insuliinin kaltaisen kasvutekijää sitova proteiini perhe [16];

GAS7

(kasvun pysähtymisen-spesifinen 7), jolla on oletetun rooli hermosolujen kehitykseen [17], [18]; ja

miR137

, ei-koodaavan microRNA, joka on upotettu CpG-saarekkeen [17], [19], [20], [21]. Tähän mennessä yksikään näistä metylaation markkereita ovat läpikäyneet järjestelmällisen validointi suuressa kohortissa CRC potilaiden täysin selville niiden mahdollisuuksia kliinisesti käyttökelpoisia diagnostisia, prognostisia tai ennakoivaa biomarkkereita. Tästä syystä me jonka tarkoituksena oli selvittää diagnostinen, prognostisen ja ennustearvo

SEPT9, TWIST1, ALX4, IGFBP3, GAS7

, ja

miR137

promoottori hypermetylaation suuri, hyvin tunnettu, väestöpohjainen CRC kohortti. Lisäksi tutkimme assosiaatioita metylaatiostatuksen yksittäisiä merkintöjä ja niiden yhdessä kliinis näissä ensisijainen CRC, ja ensimmäistä kertaa raportin, että

IGFBP3

hypermetylaation on lupaava diagnostinen ja ennakoivan biomarkkereiden CRC potilailla.

Materiaalit ja menetelmät

potilaat

Tähän tutkimukseen osallistui 425 CRC potilasta, jotka otettiin osana Epicolon-I hanke, joka on väestöpohjainen tutkimus CRC kuin aiemmin on kuvattu [22], [23], [24]. Koska tässä tutkimuksessa haluttiin selvittää ennustetekijöiden ja ennustavan potentiaalia metylaation biomarkkereiden, potilaan näytteet mukana tässä tutkimuksessa valittiin satunnaisesti aikaisemmin kuvatun kohortin potilaista, joille seuranta oli saatavilla [7], [25], [26 ]. Demografiset, kliininen ja kasvaimeen liittyvien ominaisuuksien probands sekä yksityiskohtainen suvussa, saatiin käyttäen aikaisemmin määritettyyn kyselylomakkeeseen [22]. Kliinis ja molekyylitason ominaisuudet potilaista näissä tutkimuksissa on kuvattu taulukossa S1. Tutkimuksen hyväksyi eettinen komitea kaikkien osallistuvien sairaaloiden EPICOLON kohortin (Hospital 12 de Octubre, Madrid, Hospital Clinic, Barcelona, ​​Hospital Clínico Universitario, Zaragoza, sairaala Cristal-Pinor, Complexo Hospitalario de Ourense, Parc de Salut Mar, Barcelona, ​​Hospital Donostia, CIBERehd, University of Maa baski, San Sebastian, Hospital General Universitario de Alicante; Hospital General de Granollers; Hospital General de Vic; Hospital General Universitario de Guadalajara ja Fundación para la Formación e Investigación Sanitarias Murcia; Hospital General Universitario de Valencia), ja kirjallinen tietoinen suostumus saatiin kunkin potilaan. Promoottori metylaatiostatuksen kuuden geenin (

SEPT9, TWIST1, IGFBP3, GAS7, ALX4

ja

miR-137

) analysoitiin kaikkiaan 425 CRC-potilailla, sekä normaalissa paksusuolen limakalvoa 21 terveet yksilöt, joilla on normaali kolonoskopia.

DNA: n eristämistä ja bisulfiittimodifikaatio

Perimän DNA uutettiin parafinoidut kasvainkudoksen (FFPE) näytettä kattava Epicolon-I tutkimus. Ohjattuna Tutkimuksen patologi, kudosleikkeiden tutkittiin huolellisesti, kasvaimeen rikastettu alueet tunnistettu ja huolellisesti hajoaviksi DNA: n eristämiseksi. Sen jälkeen parafiini poisto ksyleeniä, DNA eristettiin käyttäen QIAamp DNA Mini sarjat, kohti valmistajan ohjeiden (Qiagen, Valencia, CA). Saatu genominen DNA muutettiin natrium-bisulfiitin avulla EZ Metylointi Gold Kit (Zymo Research, Orange, CA).

DNA metylointianalyysi

bisulfiittimodifiointi pyrosekvensointi suoritettiin kvantitatiivinen metylointianalyysi kuten aiemmin kuvataan (kuvio S1) [7], [25], [26]. Käytetyt alukkeet suunniteltiin käyttäen PyroMark 1,0 suunnittelun ohjelmistot, ja pyrosekvensointi määritykset ajaa bisulfiitti-muunnettu DNA (taulukko S2 ja Information S1). Keskimääräinen prosenttiosuus metylaatio kaikkien CpG-sivustot jokaisessa määrityksessä laskettiin kunkin geenin /merkki. Metylointi cut-off-arvot määritettiin jokaiselle merkki keskiarvon perusteella metylaatiotasoilla havaittu normaalissa paksusuolen limakalvo terveistä yksilöistä +2 keskihajonnat. Lisävarmistusmenetelmää metyloituvuutta varten

IGFBP3

myös tekemä määrällinen MSP (qMSP) määritys promoottori /exon1 CpG-saarekkeen käyttäen alukkeita ja PCR-olosuhteita kuten aikaisemmin on kuvattu [27].

CpG Island Methylator Fenotyyppikuvaus (CIMP) ja mikrosatelliitti Epävakaus (MSI) tila

CIMP tila CRC näytteitä Epicolon-I kohortti aiemmin määritetään käyttäen bisulfiitin pyrosekvensointi on CIMP merkkiaineiden

CACNAG1

,

SOCS1

,

RUNX3

,

NEUROG1

, ja

MLH1

, kuten on raportoitu aiemmin [7]. CRC pidettiin CIMP-positiiviseksi, jos ainakin 3/5 promoottorit metyloitiin [7]. Mikrosatelliitti epävakaus (MSI) testaus suoritettiin käyttäen BAT26 ja NR24 quasimonomorphic markkereita, kuten aikaisemmin on kuvattu [28]. Kasvaimet luokiteltiin MSI-positiivinen, kun joko markkeri oli mutatoitunut, ja katsottiin microsatellite vakaa (MSS), kun kumpikaan merkki osoittanut mitään todisteita geneettinen epävakaus.

BRAF

mutaatio

läsnäolo

V600E BRAF

mutaatio CRC näytteissä havaittiin käyttäen TaqMan-koettimet ja ABI Prism 7500 Sequence Detection järjestelmän (Applied Biosystems, Foster City, CA), jossa on alleelinen syrjintää, kuten aiemmin on kuvattu [29].

tilastollinen analyysi

Jatkuva muuttujat ilmoitetaan keskiarvona + keskihajonta (SD), kun taas kategorinen muuttujia mainitaan taajuus tai prosentteja. Tilastoeroja lähtötilanteesta ryhmien välillä analysoitiin käyttäen χ

2 testi kategorisen datan, jonka jälkeen soveltamalla Yates korjauksen ja U-testi kvantitatiivista data-analyysi. Ensisijainen tuloksia tässä tutkimuksessa olivat kokonaiselinaika (OS) ja taudista vapaan eloonjäämisen (DFS). Analyysit Molempien tulokset tehtiin koko CRC kohortti, ja erikseen osajoukko vaiheen II ja III CRC potilaita, jotta nimenomaan arvioida vaikutuksia metylaatiostatuksen ennusteeseen ja vastaus adjuvanttihoitoa. OS määriteltiin aika ilmoittautuminen kuolemaan, ja DFS määriteltiin aika ilmoittautuminen kuolema mistä tahansa syystä tai ensimmäinen uusiutumisen. Tiedot OS ja DFS sensuroitiin 1100 päivää syövän diagnoosin. CRC kasvaimet luokitella korkean ja matalan metylaatiostatuksen ryhmiä käyttäen Receiver Operating Ominaisuudet käyrä (ROC) analyysi. Kaplan-Meier-analyysi suoritettiin arvioida jakaumat DFS ja OS vaiheen II ja III potilaiden. Elossapysymisaikajakaumat verrattiin käyttäen log rank testi. Monimuuttuja-analyysissä määrittämiseen riskisuhteita kuolemasta tai kasvaimen uusiutumisen tehtiin käyttämällä useita muuttujia, kuten, imusolmuke etäpesäke, TNM, MMR tila, kasvaimen erilaistumiseen laatu, ikä ja adjuvanttihoitoa. Lisäksi analyysit suoritettiin käyttäen Coxin suhteellisten riskien regression vaiheittain testata vaikutusta metylaatiostatuksen tietyn geenin /markkeri DFS ja sen vuorovaikutusta kemoterapiaa. Hazard suhde ja 95%: n luottamusväli (95% CI) kuolema laskettiin käyttäen Coxin selviytymisen mallinnus. Kaikki raportoidut p-arvot ovat kaksipuolisia, ja p-arvot 0,05 pidettiin merkittävinä. Kaikki laskelmat suoritettiin käyttäen SPSS 10.0 tai GraphPad Prism 4.0 tilastollisia ohjelmistoja.

Tulokset

Meidän sarjassa 425 CRC tapauksissa keskiarvo ± SD potilaan iästä oli 70,4 + -11 vuotta, ja oli enemmän miespotilailla kuin naisilla (252/425; 60,3%). Niistä 425 kasvaimia, 117 (27,9%) sijaitsi proksimaalisessa paksusuolessa, 151 (36,2%) oli distaalisessa paksusuolessa, ja 150 (35,9%) sijaitsi peräsuolessa. Noin 12,8% tapauksista oli vaihe I, 33,7% vaihe II, 39,7% vaiheessa III, ja 13,7% vaihe IV kasvaimia. Olemme havainneet, että 35/425 (8,2%), CRC oli MSI, 90/303 (29,7%) oli CIMP-positiivisia, ja 21/191 (10,9%) kanna somaattisen V600E mutaatio

BRAF

geenin. Kuten odotettua, CIMP-positiivinen fenotyyppi useammin liittyy MSI ja läsnäolo

BRAF

V600E mutaatio (22,3% vs. 2,3%, p 0,0001 MSI fenotyypin, ja 31% vs. 1,5% , p 0,0001

BRAF

V600E mutaatio).

Diagnostic merkitys metylaation merkkiaineiden CRC

keskimääräinen metylaatiotasoilla kunkin geenin ensisijainen CRC kudokset: 23,8 % for

SEPT9

, 50,5% ja

TWIST1

, 44,9% ja

IGFBP3

, 50,2% ja

GAS7

, 36,5% ja

ALX4

, ja 35,3% ja

miR137

. Kuten kuviossa 1, metylaatiotasoilla kunkin geenin olivat merkittävästi korkeammat CRC ja normaalissa limakalvoa terveillä koehenkilöillä (

p

0,0001

p

0,0005 kaikille vertailut). Nämä tulokset osoittavat, että syöpä-spesifisyys hypermetylaation näiden geenien ja luoda niiden toimintaperiaatteista hyödyntämiseen mahdollisina diagnostisia biomarkkereita CRC, kun otetaan huomioon, että kaikki 6 markkereita osoitti hypermetylaation kaikissa vaiheissa CRC (kuva 2).

bisulfiittimodifiointi pyrosekvensointi tulokset metylaation

SEPT9

(A),

TWIST1

(B),

IGFBP3

(C),

ALX4

(D),

GAS7

(E) ja

miR137

(F) geenit verrataan normaalin limakalvon terveiden verrokkien (N-N) ja ensisijaisen kasvaimia CRC potilaista.

bisulfiittimodifiointi pyrosekvensointi tulokset metylaation

sept9

(a),

twist1

(b),

IGFBP3

(c),

alx4

(d),

gas7

(e) ja

mir137

(f) verrataan normaalin limakalvon terveillä potilailla (nn) ja ensisijaisen kasvaimia CRC potilaiden kaikkien TNM vaiheissa i-iv. n (joukko aiheita); mediaani metylaatio (%).

Jotta voidaan arvioida, miten kukin metylaation markkerin erikseen CRC diagnoosin, metylointi tulokset analysoitiin kategorisena muuttuja. Vastaavasti kukin geeni oli luokiteltu metyloitu, kun keskimääräinen metylaatiotasoilla olivat korkeammat kuin 7,1% ja

SEPT9

, 35,7% ja

TWIST

, 27,5% ja

IGFBP3

, 53,5% for

GAS7

, 28,5% ja

ALX4

, ja 11,9% ja

miR137

. Perustuu Näiden analyysien useimmin metyloitu merkkiaineiden CRC kudoksissa olivat

miR-137

geeni (302/344, 87,7%), jonka jälkeen

IGFBP3

(289/348, 83% ),

TWIST1

(269/356, 75,6%),

SEPT9

(244/346, 70,5%),

ALX4

(214/350, 61,1%), ja

GAS7

(164/378, 43,3%). Jotta lisäksi arvioitava yhdistelmä markkereita parantaa entisestään diagnostinen tarkkuus määrityksen, analysoimme yhdistelmä markkeripaneelit ja totesi, että

miR137

+

IGFBP3

yhdistelmä tuotti diagnostinen tarkkuus 86% , jonka jälkeen

TWIST1

+

IGFBP3

(82,7%) ja

TWIST1

+

miR137

(78,5%). Lisäksi olemme havainneet, että yhdistelmä

miR137

+

IGFBP3

+ TWIST1 metylaatio oli suurin diagnostinen tarkkuus, 92%, kuten on esitetty taulukossa 1.

kliinis piirteitä liittyy metyloinnin biomarkkerit

vieressä tutkittiin suhdetta eri kliinis ja molekyylitason ominaisuuksia ja niiden yhteydessä poikkeavaan metyloinnin kaikista kuudesta geenistä analysoitiin tässä tutkimuksessa. Kliinis olivat muun muassa ikä, sukupuoli, TNM lavastus ja kasvaimen sijainti, ja molekyylitason tekijöitä olivat MMR tila, CIMP fenotyyppi ja

BRAF

mutaatiostatuksesta riippumatta. Kasvaimen sijainti ja TNM vaiheissa ei yhdistää metylaatiostatuksen tahansa geenin markkereita. Kummallista,

SEPT9

metylaatio merkitsevästi yhteydessä miessukupuoli (p 0,05; taulukko S3). Kun metylaatio analysoitiin jatkuvana muuttujana, havaitsimme suuntaus korkeampi metylaation

TWIST1

,

IGFBP3, ALX4

, ja

GAS7

(p 0,05) ja vanhemmat potilailla, joilla on CRC; kuitenkaan emme löytäneet positiivinen korrelaatio normaalin paksusuolen limakalvo metylaation näiden geenien ja ikä terveillä henkilöillä (kuviot 3 4).

Mitä tulee molekyylien yhteenliittymiä,

TWIST1

metylaatiotasoilla olivat korkeampia MSS verrattuna MSI CRC (51% vs. 40,3%; p 0,05) (taulukko 2). Metyloinnin neljästä geenistä,

ALX4, IGFBP3, GAS7

, ja

miR137

, korreloi merkitsevästi CIMP-positiivisia kasvaimia (p 0,001). Lisäksi, kuten taulukossa 2 on esitetty, CRC, jossa

ALX4

ja

IGFBP3

metylaatio oli useammin liittyy somaattisen

BRAF

V600E mutaatio (13,5% vs. 1,8%, p 0,05

ALX4

, ja 12,4% vs. 0%, p 0,05

IGBFP3

).

Aberrant hypermetylaatiota geenien ja sen vaikutuksesta CRC potilasennuste

mediaani seuranta-sarjalle 425 potilasta mukana tässä tutkimuksessa oli 1268 päivää (3,4 vuotta alue 0-2204päivä). Lopussa seurannan aikana 169 potilasta oli kuollut (39,7%), ja seuranta-ajan mediaani tälle ryhmälle oli 671 ± 513 päivää (1,8 ± 1,4 vuotta). Tiedot kuolinsyynä oli saatavilla 99 potilasta; 67,7% (67/99) kuoli komplikaatioihin syövän etenemisen, 18,2% (18/99) kuoli komplikaatioihin kemoterapiaa, ja 14,1% (14/99) sortunut muista syistä johtuvat kuolemat, mukaan lukien leikkauksen jälkeisiä komplikaatioita. Kasvaimen uusiutumisen havaittiin 116/370 potilaalla (31,3%), mediaani ajan kesto 644 ± 448 päivää (1,7 ± 1,2 vuotta) leikkauksen.

määrittämiseksi ennustetekijöiden merkitys metylaatiostatus varten jokainen geeni, kaikki CRC luokiteltiin kahteen ryhmään niiden metylaatiotasoilla (huipulla matala), ja annos-vaste-suhde aste metylaation ja tapahtuman elinaika tutkittiin ROC käyrä analyysi. Kaiken korkea metylaation

GAS7

(ennuste cut-off-arvo = 52.62%, korkea-metylaatio: 43,3%, matala-metylointi: 56,7%; χ

2 p = 0,03) ja

ALX4

geenejä (ennuste cut-off-arvo = 25,8%, korkea-metylaatio: 67,1%, matala-metylointi: 32,9%; χ

2 p = 0,005) liittyy huono DFS CRC potilailla (dataa ei esitetty). Sen sijaan alhainen

IGFBP3

metylointi osoittaneet yhdessä merkittävästi huonompi DFS mukaan oikaisematon analyysi (ennuste cut-off-arvo = 53,1%, korkea-metylaatio: 30,9%, matala-metylointi: 69,1%; χ

2 p = 0,01, kuviot 5A ja B). Sen jälkeen monimuuttuja Coxin regressioanalyysiä, jossa useat muuttujat analysoitiin, vain pieniä määriä

IGFBP3

metylaation tullut itsenäinen riskitekijä köyhien DFS vaiheessa II ja III CRC potilasta (HR = 0,49, 95% CI: 0.28- 0,85, p 0,01). Lisäksi metylaatiostatuksen

IGFBP3

geeni oli ainoa tilastollisesti merkittävä riskitekijä vaiheen II CRC, säätämisen jälkeen muista ennustetekijöiden tekijät kuten ikä, adjuvanttia 5-FU (5-fluorourasiili) kemoterapiaa tai MSI tila (HR = 0,28, 95% CI: 0,12-0,70, p = 0,006; taulukko 3).

(a) Tautivapaa elinaika potilailla, joilla on vaiheen II ja III CRC mukaan

IGFBP3

metylaatiostatuksen (korkea metylaatio, n = 73, (30,3%) alhainen metylaatio, n = 168, (69,7%). (b) Tautivapaa elinaika potilaiden vaiheen II tauti, mukaan

IGFBP3

metylaatio (korkea metylaatio, n = 45, (32,4%), alhainen metylaatio, n = 94, (67,6%). (c) Tautivapaa elinaika potilailla, joilla on vaiheen II ja III sairaus, korkea

IGFBP3

metylaatio kasvaimia perustuu adjuvanttihoitoa (kemoterapia, n = 20, (22,5%), ei kemoterapiaa, n = 69, (77,5%). (d) Tautivapaa elinaika potilailla, joilla on vaiheen II ja III tauti, matalan

IGFBP3

metylaatio kasvaimet mukaan adjuvanttihoitoa (Chemotherapyc n = 83, (52,7%); NO Kemoterapia, n = 74, (47,2%).

Aberrant geeni hypermetylaation ja sen vaikutusta potilaiden eloonjäämiseen kemoterapian jälkeen hoidon

kemoterapian annettiin 257/425 potilaalla (60,5%), lähinnä käyttämällä 5FU + leukovoriiniin (236; 91,8%: lla potilaista). Niistä koko kohortin 315 potilasta (74,1%) oli joko vaiheen II tai III sairaus, ja 155 (49,2%) näistä sai 5FU kemoterapiaa liitännäishoitona. Vain 9 vaiheen II ja III potilaat saivat muiden kemoterapia hoitojen, ja jätettiin pois lisäanalyysiä. Mediaanin seuranta 1221 päivää (3,3 vuotta), 92 (31,2%) potilailla, joilla on vaiheen II ja III osoittivat kasvaimen uusiutumisen sekä lopussa seuranta-aikana, 101 (34,2%) potilaista näistä ryhmistä oli kuoli.

adjuvanttihoitoa tarjotaan merkittävää parannusta OS vaiheessa II ja III CRC potilailla verrattuna potilaisiin, jotka eivät saaneet kemoterapiaa (kemoterapia: 49,1%, ei-kemoterapia: 50,9%; χ

2 p = 0,0001). Nämä erot OS olivat läsnä myös monimuuttujamenetelmin joissa valvottavia iän, sukupuolen, imusolmuke etäpesäke, MMR, ja CIMP fenotyypin tila (HR = 0,55, 95% CI: 0,36-0,85, p = 0,007).

Mielenkiintoista, joukossa kaikki 6 metylaatio markkereita tutkittu, vain

IGFBP3

metylaatiotasoilla olivat ennustavat vastaus 5FU-kemoterapiaan. Saamiemme tulosten, potilaat, joilla on alhainen

IGFBP3

metylaatiotasoilla oli enää OS (p = 0,0007) ja DFS (p = 0,05), kun he saivat kemoterapiaa. Sitä vastoin potilailla, joilla on korkea

IGFBP3

metylaatio, adjuvanttihoitoa ei parantunut OS (p = 0,4) tai DFS (p = 0,3, kuvio 5C ja D). Monimuuttujamenetelmin Coxin regressioanalyysiä (taulukko 4), potilailla, joilla on matalan

IGFBP3

metylaatio, adjuvanttihoitoa itsenäisesti ennusti paremmin OS (HR = 0,49, 95% CI: +0,29-+0,80, p = 0,004); kuitenkin, se ei merkittävästi vaikuttanut DFS (p = 0,08). Toisaalta, MMR tila oli ainoa muuttuja, joka itsenäisesti ennusti OS (p = 0,05) ja DFS (p = 0,04) potilailla, joilla on korkea

IGFBP3

metylointi (taulukko 4). Vuonna potilaan kohortin käsiteltiin 5-FU adjuvanttihoitoa,

IGFBP3

metylaatiostatuksen ei itsenäisesti ennustaa OS ja DFS. Sen sijaan, DFS vaikutti positiivisesti

IGFBP3

metylaatiostatuksen potilailla, jotka eivät saaneet adjuvanttihoitoa (HR = 0,41, 95% CI: +0,18-0,91, p = 0,02).

keskustelu

viime vuosina useita lupaavia geenin metylaatio-pohjainen diagnostinen biomarkkerit kuten

SEPT9, TWIST 1, IGFBP3, GAS7, ALX4

, ja

miR137

on ehdotettu varhaiseen toteamiseen paksusuolen neoplasia. Kuitenkin suurin osa näistä on annettu pohja rajoittuu ensimmäistä pienimuotoisia löytö tutkimuksia, ja ei ole kehittynyt kliininen käytännössä niitä ei ole systemaattisesti validoitu suuri, itsenäinen ikäluokat CRC potilaista. Tämän aukon tiedon, suunnittelimme tämän tutkimuksen vahvistaa diagnostisten mahdollisuuksia näiden biomarkkereiden, ja selvittämään niiden prognoosi- ja ennustava arvoja CRC. Lisäksi olimme kiinnostuneita tutkimaan assosiaatioita poikkeava hypermetylaation näiden geenien ja kliinis-analysoimalla suuri, hyvin tunnettu, väestöpohjaisia ​​kohortti CRC potilaista.

Koska meillä kvantitatiivinen metylointianalyysi, kaikki kuusi geeniä kuulustellut täyttivät mahdollisten kliiniseen käyttöön diagnostisia biomarkkerit CRC. Nämä kriteerit olivat: a) metylointi kunkin geenin tapahtui kasvaimen-spesifisellä tavalla; b) metylaatiotasot kunkin geenin neoplastiset kudokset olivat merkittävästi korkeammat kuin normaalissa paksusuolen limakalvossa; ja c) yksikään geenit osoittivat ikäriippuvaista kasvu DNA: n metylaation normaalissa paksusuolen limakalvon [30], [31]. Metylaatiotasoilla kunkin geenin pystyimme luokittelemaan peräsuolen kudoksiin normaalina tai neoplastisia. Kaikista markkereita tutkittu,

IGFBP3

ja

miR137

metylaatiotasoilla osoitti korkeinta diagnostinen tarkkuus yksittäisinä geenimerkkejä tunnistamiseksi ensisijaisen CRC (83% ja 78,3%, tässä järjestyksessä). Tämä diagnostinen tarkkuus parannettiin edelleen yhdistämällä metylaatiostatuksen kaksi geenimerkkejä; Erityisesti metylaatiostatuksen

IGFBP3 + TWIST1

tai

IGFBP3

+

miR137

oli suurin tarkkuus arvot 86% ja 82,7%: lla, herkkyys ja spesifisyys arvot 80%.

tutkineet molekyyli piirteitä liittyy kasvaimen metylaatiotasoilla näistä geeneistä. Tämä oli erityisen kiinnostava, koska molekyyli luokittelu perustuu MSI ja CIMP asema on tullut entistä tärkeämmäksi [32] sen ennustetekijöiden [33], [34], [35] ja ennakoivan roolin CRC potilailla [7], [34], [ ,,,0],36]. Tässä tutkimuksessa neljä kuudesta geenien positiivisesti liittyvät CIMP fenotyyppi (

ALX4, IGFBP3, GAS7

, ja

miR137

). Lisäksi positiivinen korrelaatio

BRAF

V600E mutaatio ja metylaation

ALX4

ja

IGFBP3

geenejä liittyi CIMP-korkea CRC [37], [38] . Kuten odotettua, metylaatio

ALX4

ja

IGFBP3

geenejä liittyi läsnäolo

BRAF

geenimutaatio.

TWIST1

metylaatiotasoilla olivat korkeampia potilailla, joilla MMR-taitava kasvaimissa verrattuna MSI kasvaimia; kuitenkin, meidän kohortin vain pieni osa CRC olivat MMR-puutosta (5%), ja korrelaatioita MMR aseman ja metylaatio markkereita on voinut kadota analysoitaessa ryhmää kokonaisuudessaan.

vaiheessa II ja III CRC joille on tehty mahdollisesti parantava resektio, ennuste riippuu tauti uusiutuu, joka liittyy ensisijaisesti kaukainen etäpesäke. Lisäksi hyötyvät adjuvanttihoitoa, erityisesti II vaiheessa CRC potilailla on säilynyt alueen ristiriitoja ja kemoterapeuttisen kestävyys on edelleen merkittävä ongelma näillä potilailla. Siksi löytö uusien prognostisia ja ennakoivan biomarkkerit, jotka voivat auttaa tunnistamaan vaiheen II ja III potilaat, jotka ovat suuri riski toistumista ja etäpesäke, voi parantaa nykyistä strategiaa CRC potilaan kerrostuminen ja hoidonhallintaohjelmisto. Parhaan tietomme mukaan ole aikaisempaa tutkimusta on tutkinut suhdetta metyloinnin

SEPT9, IGFBP3, TWIST1, GAS7, ALX4

, ja

miR137

geenien kanssa ennusteeseen potilailla, joilla on CRC, sekä kykyä näiden biomarkkereiden ennustaa vaste 5-FU-pohjainen adjuvanttihoitoa. Perustuen tuloksemme tässä suuri, hyvin tunnettu väestöpohjaisia ​​kohortti, vaiheen II ja III CRC potilailla, joilla on alhainen

IGFBP3

promoottori metylaatio oli huonompi OS ja DFS verrattuna, joilla on korkea DNA hypermetylaation. Mitä tulee vastaus kemoterapiaa, kun 5-FU kemoterapiaa liitännäishoitona annettiin vaiheen II ja III CRC potilaita, vain ne potilaat, joilla on alhainen

IGFBP3

metyloitu kasvaimia vaikuttivat positiivisesti, jolloin pidempään DFS ja OS kertaa, mikä osoittaa, että hyöty kemoterapia rajoitu tähän ryhmään CRC potilailla. Kummallista, tämä vaikutus

IGFBP3

metylaatio oli riippumaton CIMP tila. On kuitenkin tärkeää korostaa, että vaikka

IGFBP3

metylaatiostatuksen noussut ainoa riippumaton tekijä, joka ennusti huono DFS todennäköisyys joukossa vaiheen II CRC potilaille, uuden riippumattoman kliiniset tutkimukset on todistettava, että

IGFBP3

metylaatiotasoilla CRC voisi olla potentiaalinen rutiini testi ennustus CRC potilaiden ja hallinnon parantamista potilaista, joilla oli paikallinen sairaus yhdistettynä nykyiseen kliinis ja molekyylitason työkaluja.

Muut tutkimukset ovat havainneet suhde korkea tasot

IGFBP3

metylaatio ja huono kliinistä tulosta keuhko- ja munasarjasyövät [39], [40], ja hiljattain CRC potilailla [27]. Poikkeavia raportteja metylaatio markkereita voi johtua Eri menetelmien ja analysointi eri sekvenssi paikoista CpG saarilla. Tässä tutkimuksessa käytimme bisulfiitin pyrosekvensointi varten metylointianalyysi, joka on luotettava kvantitatiivinen lähestymistapa vankka DNA metylointianalyysi verrattuna tavanomaiseen metylaatiospesifisen PCR (MSP), josta puuttuu määrällisesti tarjoamat bisulfaatti pyrosekvensointi [27], [39], [40]. Lisäksi edelleen tarkkuuden varmistamiseksi meidän metylointituloksia, myös toteutettiin kvantitatiivisen-MSP (qMSP) analyysi sisällä CpG saarialueen aikaisemmin tutkittu CRC [41]. Kuten kuviossa 6 on esitetty, olemme vahvistaneet, että bisulfiitti pyrosekvensointi metylaatio tulokset korreloivat positiivisesti saatuihin tuloksiin sisällä CpG-saarekkeen alueen tutkittu aiemmin [27], [39], [40].

(a) Kaavamainen katsaus insuliinin kaltaisen kasvanut kertoimella sitova proteiini 3: sta (IGFBP3) geenin. eksonit edustaa siniset laatikot, intronit sininen linjat, ja promoottorialueen sinisen katkoviivoilla.

IGFBP3

geeni on yksi sytosiini-fosfaatti-guaniini (CpG) saari promoottorialueella ja exon1 korostamalla mahdollisuuksia muuntavan geenin ilmentymisen avulla CpG hypermetylaation, ja tämä edustaa vihreän laatikon. suoritimme kaksi eri määrityksiä kattaa sekä CpG: t saaria (merkitty vihreällä nuolilla) kahdella kvantitatiivisia menetelmiä: pyrosekvensointi ja qmsp jotta korreloivan metylaatiotasoilla näistä kahdessa paikassa. (B) Lineaarinen regressioanalyysi verrataan

IGFBP3

metylaatiotasoilla mukaan pyrosekvensointi (% metylaatio) vuonna 348 potilaan näytteitä ja qmsp (PMR) määritykset CRC kudoksissa (n = 197).

Vaikka on olemassa joitakin eroja tähän tutkimukseen ja aiemmin julkaistu tutkimuksia, uskomme, että tämä työ on vakaampi ja kattava, koska meidän työllistää suurimman potilaan kohortin on väestöpohjainen, ja sisältää kontrolliryhmän ei-käsiteltyjen CRC potilaista vertailuun. Biologisen roolin ja ajoitus

IGFBP3

metylaatio CRC ymmärretään huonosti; Kuitenkin viime aikoina

in vitro

tutkimusten mukaan metylaatio aiheuttama vaiennettu

IGFBP3

voivat johtaa merkittäviin vastustuskykyä sisplatiinihoitoon keuhkosyövässä [42], [43].