Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

p63 kuuluu p53 perhe, joka on ollut mukana ylläpitoon epiteelin kantasolujen osastoihin. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että p63 on vaimentua lihaksessa-invasiivisia virtsarakon syöpien, mutta suhde p63 ilmaisun ja selviytyminen ei ole selvä.

Menetelmät /Principal Havainnot

Käytimme reaaliaikaisia ​​PCR luonnehtia p63 ilme ja useita geenejä sekaantunut epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) ihmisen virtsarakon syövän solulinjoissa (n = 15) ja ensisijaisen kasvain (n = 101). Olemme korreloi tuumorimarkkeri ilmaisutapoja vaiheessa tautikohtaisia ​​(DSS), ja kokonaiseloonjääminen (OS). Expression of E-kadheriinin ja p63 korreloivat suoraan toisiinsa ja käänteisesti ekspressiota mesenkymaalisten markers Zeb-1, Zeb-2, ja vimentiinin. Non-lihas-invasiivisia (Ta ja T1) virtsarakon syöpien tasaisesti ilmaistuna korkea E-kadheriinin ja p63 ja alhainen mesenkymaaliseen markkereita. Mielenkiintoista on, että osajoukko lihas-invasiivisen (T2-T4) kasvaimet ylläpidetään korkea E-kadheriinin ja p63 ilmentymistä. Kuten odotettua, oli vahvasti merkittävä korrelaatio EMT merkki ilmaisun ja lihasten invaasio (p 0,0001). Kuitenkin OS oli lyhyempi, jos potilaalla on lihas-invasiivisen kasvaimet että säilytetään p63 (p = 0,007).

Johtopäätökset /merkitys

tiedot vahvistavat, että molekyylimarkkereita EMT ovat koholla lihas-invasiivisia virtsarakon syövät, mutta kiinnostavaa, säilyttäminen ”epiteelin” merkki p63 lihaksessa-invasiivisia kasvaimia liittyy huonompi tulos.

Citation: Choi W, Shah JB, Tran M, Svátek R, Marquis L, Lee IL, et ai. (2012) p63 Expression Määrittää tappava osajoukon Muscle-Invasiivinen virtsarakon syövät. PLoS ONE 7 (1): e30206. doi: 10,1371 /journal.pone.0030206

Toimittaja: Wafik S. El-Deiry, Penn State Hershey Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 12 joulukuu 2011; Julkaistu: 10 tammikuu 2012

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Cancer Center Support Grant (CA016672) ja MD Anderson SPORE in Genitourinary Cancer (CA091846). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syövät kehittää kahdella ”kappaletta” tuottavien kasvainten hyvin erilaisia ​​kliinisiä piirteitä [1]. Yksi johtaa muodostumista papillaarisen kasvainten korkea uusiutuminen että harvoin etäispesäkkeitä tai aiheuttaa kuoleman, kun taas toinen johtaa kehitystä ei-papillaarisen, lihas-invasiivisia kasvaimia, joista osajoukon etenee nopeasti ja on kohtalokasta. Tällä hetkellä on mahdotonta prospektiivisesti tunnistaa tappava lihas-invasiivisia kasvaimet; kuitenkin, varaamiseen todisteet osoittavat, että molekyyli uudelleenohjelmointi ominainen kehitysprosessiin kutsutaan epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) on mukana. Lihas-invasiivisia syöpiä on tunnusomaista downregulation E-kadheriinin ja p63, kaksi ”epiteelin” markkereita tasaisesti ilmentyy normaaleissa uroteeliin ja muiden lihasten-invasiivisia syöpiä [2] – [5]. Nämä muutokset ovat mukana säätelyä mesenkymaalisten markers Zeb-1, Zeb-2, vimentiinistä, ja MMP-9, mikä lisää hyökkäyksen ja muuttoliike. Rooli EMT ajamaan virtsarakon syövän eteneminen ja metastaasit on sopusoinnussa suuri määrä todisteita syntymässä muiden kiinteiden kasvainten, erityisesti rintasyövän [6] – [8]. Lisäksi täytäntöön ilmentyminen EMT sääntelyviranomaisten voi aiheuttaa muutoksia mieleen kuin havaitut syövän kantasoluja [8] – [10]. Koska syövän kantasoluja näyttävät yleensä olevan vastustuskykyisiä tavanomaisen kemoterapian välinen yhteys EMT ja ”stemness” tarjoaa lisää tukea ajatukselle, että EMT myötävaikuttaa kuolemaan.

nyt vireillä olevan tutkimuksen suoraan testata hypoteesia, jonka mukaan EMT markkereita voitaisiin tunnistaa osajoukon lihas-invasiivisen kasvaimet näyttämällä aggressiivista kliinistä käyttäytymistä. Ihmisen virtsarakon syövän solulinjoissa, havaitsimme suora korrelaatio E-kadheriinin ja p63 ilmaisun, ja käänteinen korrelaatio näiden markkereiden ja Zeb-1, Zeb-2, ja vimentiinistä, mikä osoittaa niiden klusterin yksilöllisiksi ”epiteelin” ja ”mesenkymaaliset ”osajoukot. Tuloksemme vahvistavat, että mesenkymaaliset markkereita (Zeb-1, Zeb-2, MMP, ja vimentiinistä) ilmaistaan ​​lähes yksinomaan lihas-invasiivisen kasvaimet [11], [12], osajoukon virtsarakon syövän huonompi tulos. Mielenkiintoista, meidän tiedot osoittavat myös, että tämän lihas-invasiivisia osajoukko, kasvaimet säilyttäen p63 (joka näyttää olevan ”epiteelin” merkki), näyttö merkittävästi huonompi selviytyminen kuin lihas-invasiivisen kasvaimet näyttää enemmän tyypillinen ”mesenkymaalisten” fenotyyppi. Puhumme mahdollisia selityksiä välinen yhteys p63 ja köyhien selviytymisen lopputulokseen.

Tulokset

ilmentäminen EMT merkkiaineiden julkaistuissa geeniekspression aineistot

Ensin tarkasteltiin ilmentymisen EMT merkkiaineiden kahdessa julkisesti saatavilla geeniekspressioprofilointi aineistot [13], [14]. Molemmissa, valvomattoman hierarkkinen klusterointi erottaa pinnallinen lihas-invasiivisen sairauden [13], [14]. Pinnallinen kasvaimet ilmaisivat korkeampi ”epiteelin” merkki E-kadheriinin kuin lihas-invasiivisia kasvaimet; päinvastoin, lihas-invasiiviset kasvaimet ilmaisivat korkeampi ”mesenkymaaliset” markkereita (kuvio 1A-B).

A B: Kaikki EMT markkerigeeni on merkittäviä eroja eri ilmaisua (P 0,001) 2 itsenäistä julkisesti saatavilla aineistoja. In-house cDNA microarray kanssa 10368 koettimien käytettiin [13]. HU-133A Affymetrix alusta käytettiin B [14].

väliset suhteet EMT merkkiaineita ihmisen virtsarakon syövän solulinjoissa

vieressä mitattu ilmentymistä EMT merkkiaineiden 15 virtsarakon syöpäsolulinjojen kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä. Tulokset viittasivat siihen, että on olemassa 2 dikotomisten osajoukkoja kasvainten, yksi näyttämällä ”epiteelin” kuvio tunnettu ilmentyminen E-kadheriinin ja p63; toinen tunnettu siitä, että ilmaus ”mesenkymaalisten” markkereita Zeb-1, Zeb-2, ja vimentiinin (kuvio 2A-B). Kvantitointi sekä p63-mRNA: n (kuvio 2B) ja proteiini (tuloksia ei ole esitetty) tasojen osoitettu se ilmaistiin yksinomaan E-kadheriinin-positiivinen ”, epiteelin” solulinjoja, ja että ilmentyminen Dn-p63-isoformien ylitti ilmentymisen TA -p63 isoformien useita kertaluokkia (kuvio 2B). Vastoin odotuksia, MMP2 ja MMP-9 tasot eivät olleet tiiviisti EMT meidän solulinjoissa (kuvio 2C); Kuitenkin pieni määrä solulinjoja, joita varten MMP kohotettiin vaikutuksia merkitystä tämän havainnon. Tärkeää on, aiemmat tutkimukset totesi, että ”mesenkymaaliset” virtsarakon syövän solut ovat ryhmänä erittäin invasiivisia ja kestävät säteilyä ja EGFR-terapiasta [11], [12], [15] – [17], mikä viittaa siihen, he saattavat hallussaan epäsuotuisa biologiset ominaisuudet .

(A) mRNA: n ilmentymisen E-kadheriinin, Zeb-1, Zeb-2 ja vimentiinin mitattiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä. Käänteinen korrelaatio E-kadheriinin ja Zeb-1 /Zeb2 havaittiin yli solulinjoissa. (B) mRNA ilmentymä koko p63, TAp63 ja Dn-p63-isoformit mitattiin isoformispesifisiä alukkeita. (C) Suhteellinen mRNA ilmentymä MMP2 ja MMP-9 virtsarakon syövän soluissa. Esitetyt tiedot ovat keskiarvo ± SEM kolmesta näytteestä.

EMT merkki ilmaisun uusia rakkokasvaimista

Sitten mitataan geeniekspression EMT merkkiaineiden RT-PCR: llä ensisijainen virtsarakon syövät (n = 101, taulukko 1). Yhdenmukainen julkiset tiedot (kuvio 1) ja muita raportteja [11], [12], reaaliaikainen PCR tietojen mukaan pinnalliset kasvaimet ilmaisivat korkeampi epiteelin merkkiaineiden E-kadheriinin ja p63, kun taas lihas-invasiivisen kasvaimet ilmaisivat korkeampi mesenkymaalisten markkereita (vimentiinin, Zeb1, Zeb2, MMP2, MMP9) (kuvio 3 A ja B). Kuten kuviossa 3 on esitetty, pinnallinen kasvaimet ryhmänä johdonmukaisesti ilmaistaan ​​E-kadheriinin ja p63 [3], [4], [18] – [23] kuin ei lihas-invasiiviset kasvaimet (p-arvo 0,0001, kuvio S1A) . Samoin meidän solulinjaan data, Dn-p63 oli pääisomuoto p63 läsnä ensisijainen kasvainkudoksessa (kuvio 3C). Kääntäen, lihas-invasiivisia kasvaimia useammin ilmaisseet mesenkymaaliset markkereita (Zeb-1, Zeb-2, vimentiinistä) kuin pinnallinen kasvain (kaikki kolme p-arvot 0,0001, kuva S1B). Kuten oli havaittu solulinjoissa, ilmentyminen E-kadheriinin oli suoraan liittynyt ilmentymistä p63 (Spearmanin korrelaatiokerrointa rho = 0,32, p = 0,0028) ja käänteisesti ilmentymistä Zeb-1 (rho = -0,37, p 0,0001) , Zeb-2 (rho = -0,48, p 0,0001), ja vimentiinistä (rho = -0,49, p 0,0001). Toisaalta, vaikka MMP2 ja MMP-9 ilmaistiin myös korkeammalla tasolla lihas-invasiivisen kasvaimet verrattuna pinnallinen kasvaimet (sekä p-arvot 0,0001, kuvio S1C), emme tarkkailla niin vahva korrelaatioita ilmaus MMP2 ja MMP-9 ja ilmentyminen p63 joko koko joukko kasvaimia (Spearmanin korrelaatio rho = -0,17, p = 0,08, välillä p63 ja MMP-9, ja rho = -0,24, p = 0,01 välillä p63 ja MMP2), tai alaryhmä lihas-invasiivisia potilailla (rho = -0,15, p = 0,21, välillä p63 ja MMP-9, ja rho = -0,23, p = 0,065 välillä p63 ja MMP2). Kuitenkin vahva käänteinen korrelaatio E-kadheriinin ja MMP-9, ja MMP2 oli silti edelleen (rho = -0,46, p 0,001 kanssa MMP-9, rho = -0,38, p 0,001 kanssa MMP2) yleisessä ryhmässä, ja saman yhdistysten havaittiin lihas-invasiivisia potilailla (rho = -0,45, p 0,001 kanssa MMP-9; rho = -0,39, p = 0,002 kanssa MMP2).

(A) Expression of core E-kadheriinin liittyviä EMT markkereita (E-kadheriinin, p63, Zeb-1, ja Zeb-2) in 101 ensisijainen rakkokasvaimista arvioitiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä. (B) Expression of MMP2, MMP9 ja vimentiinistä. (C) Expression of TAp63 ja Dn-p63 on edustavaa otosta näytteitä. Kaikki näytteet kussakin kuvassa näkyvät samassa järjestyksessä.

Korkeampi p63 ja MMP-9 liittyy haitallisia OS potilailla, joilla on lihas-invasiivisen sairauden

Lopuksi korreloi EMT merkki ilmentyminen mitattuna RT-PCR: llä selviytymistä. Koska ryhmänä, potilailla, joilla on pinnallinen kasvaimia hengissä kauemmin kuin lihasten-invasiivisen kasvaimet, ilmaus EMT fenotyypin ominaista menetys E-kadheriinin ja p63 liittyi huonoon ennusteeseen, paljolti seurauksena kyky osittaa potilaiden välillä pinnallinen ja lihas-invasiivisen sairauden (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin, kun ainoastaan ​​lihas-invasiivisia osajoukko kasvaimia, olemme havainneet, että säilyttäminen p63-ilmentyminen liittyy vahingollisia (kuvio 4A-B). Cutoff pisteen kohonnut p63 1,60 saatiin regressiotekniikoilla puu analyysiä. Erityisesti kohonnut p63 liittyi huomattavasti huonompi mediaani 8 kuukauden (95% luottamusväli 4 140 kuukautta), kun taas potilailla, joilla on alhaisempi p63 oli parannettu mediaani 27 kuukauden (95%: n luottamusväli 17, 85 kk, log-rank p = 0,007). Analyysit tulokset DSS tulokset olivat samanlaisia ​​kuin OS lopputulokseen. Kohonnut p63 liittyi mediaani DSS 8 kuukautta ja 95%: n luottamusväli (19, 140) kuukautta, kun taas potilailla, joilla on alhaisempi p63 oli parannettu mediaani DSS 41 kuukautta (95% CI: 19, 140 + kuukautta , log-rank p-arvo = 0,004). Jopa lihas-invasiivisia ryhmä, ylläpito p63 korreloivat suoraan ilmentymistä epiteelin markkerit (E-kadheriinin rho = 0,34, p = 0,006), ja kääntäen mesenkymaalisten markkereita (vimentiinista: rho = -0,35, p = 0,0047; zeb -1: rho = -0,36, p = 0,003, ja zeb-2: rho = -0,39, p = 0,0014, vastaavasti). Mielenkiintoista, säilyttäminen p63 potilailla luokiteltiin T1 kasvaimia liittyi myös merkittäviä haitallisia selviytymisen lopputulokseen. Potilaat, joilla T1 taudin korkeampi p63, oli keskimääräinen eloonjäämisaika 58 kuukautta, kun taas ei ollut sairautta liittyvien kuolemien potilailla, joilla on alhaisempi p63 tässä osajoukko (tietoja ei esitetty).

Kaikki p- antamat arvot ovat 2-puolinen, käyttäen log-rank-testi. V: Kohonnut p63 liittyi vahingollisia potilailla, joilla on lihas-invasiivisen syövän (mediaani 8 kuukautta, 95%: n luottamusväli 4 140 kuukautta), koska verrata alentaa ilmentymistä p63 (mediaani 27 kuukautta, 95%: n luottamusväli 17 85 kuukautta) log-rank p = 0,007. B: Kohonneet p63 liittyi haitallisia DSS potilailla, joilla on lihas-invasiivisen syövän (mediaani DSS 8 kuukautta, 95%: n luottamusväli 19, 140), kun taas potilailla, joilla on alhaisempi p63 oli parannettu mediaani DSS 41 kk (95% CI 19 , 140 + kk, log-rank p = 0,004). C: Kohonneet MMP-9 liittyi haitallisia tulokset (mediaani 10,2 kuukautta, 95% CI i4.9, 26,6) verrattuna alhaisempi MMP-9 (mediaani 35,4 kuukautta, 95% CI 19,3, 107,9, p = 0,003). D: Kohonneet MMP-9 liittyi haitallisia DSS (mediaani 10,3 kuukautta, 95% CI: 4,9, 140+) verrattuna alhaisempi MMP-9 (mediaani DSS 140, 95% CI: 19,3, 140 + kk, p = 0,01). E (OS) ja F (DSS): Käyttämällä monimuuttuja Coxin regressiomallia, p63 ja MMP-9 ovat riippumattomia ennustajia haitallisia tulos lihas-invasiivisia sairauksia. Potilaat jaettiin 1 piste kullekin joko kohonnut p63 tai MMP9 (0 = ei koholla, 1 = joko kohonnut, 2 = molemmat koholla). Huonoin eloonjäämistä havaittiin, kun molemmat markkerit olivat koholla, ja parhaiten, kun kumpikaan nostettiin (mediaani 0, 1, tai 2: = 69, 10 kuukautta, ja 8 kuukautta, jossa on 5-vuoden käyttöjärjestelmä tai 55%, 8 %, ja 0%: lla).

aikaisemmassa tutkimuksessa osoitimme, että alhainen E-kadheriinin /MMP-9-suhde liittyi myös haitallisia selviytymisen lopputulokseen. Siksi me myös arvioinut suhdetta MMP-9 ilmaisun ja OS tässä kohortissa (kuvio 4C ja D). Yhdenmukainen aiempien tietojen korkea ilmentyminen MMP9 liittyi lyhyempi OS (mediaani OS 10.2 kuukautta, 95% CI 4,9, 26,6) verrattuna niihin ilmentävien kasvainten pienempiä määriä MMP-9 (mediaani 35,4 kuukautta, 95% CI 19,3, 107,9, p = 0,003, kuvio 4C). Samoin mediaani DSS oli lyhyempi korkean tason ilmentymisen MMP-9 (mediaani DSS 10,3 kuukautta, 95% CI 4,9, 140 + kuukautta) ja verrattuna ilmentävät pienempiä määriä MMP-9 (mediaani DSS 140, 95% CI 19,3, 140+ kk, p = 0,01, kuvio 4D).

vahvisti myös yhdistyksen välillä koholla p63 ja huono eloonjäämisen lihas-invasiivisia uroteelisyöpä käyttäen riippumaton geenien ilmentyminen aineisto (GEO Liittymisnumero GSE13507 [24]) käyttäminen regressio-puu analyysi, cut-off-piste p63 korkeus saatiin. Kohonnut p63 liittyi merkittävästi huonompi OS ja DSS (log-rank p = 0,012 ja 0,002, vastaavasti, kuvio S2). Muita yrityksiä kudoksen vahvistusta käyttäen immunohistokemia lihas-invasiivisia virtsarakon syöpä kudos microarray eivät olleet ratkaisevia, paljolti seurauksena spesifisyyden puute kaupallisesti saatavilla 4A4-vasta varten Dn-p63, toteamus vahvistaa myös ulkopuolinen ryhmä [25].

p63 ja MMP-9 ovat riippumattomia ennustajia OS

Coxin monimuuttuja regressio mallia käytettiin arvioimaan samanaikaisesti vaikutuksen ilmentymisen kahden tai useamman EMT markkereita RT-PCR ja taudin vaiheessa OS. Ei ole yllättävää, että tauti vaiheessa oli tilastollisesti merkittävä ennustaja OS (HR = 2,15 invasiivisia vs. pinnallinen, p = 0,05). Mielenkiintoista, sekä jatkuva p63 ja MMP-9 olivat riippumattomia ennustajia OS (p63: HR = 1.69 varten p63, p = 0,004, log MMP9: HR = 1,25, p = 0,013) lisäksi taudin vaiheessa kaikkien 101 potilasta. Muut merkki ilmaisuja ei liittynyt OS lopputulokseen monimuuttujakalibrointiin mallissa. Huolimatta myös muita kasvainten ominaisuuksiin, kuten läsnäolo /poissaolo squamous histologia, taudin vaihe, ja ikä diagnoosin monimuuttujakalibrointiin regressiomalli, sekä p63 ja login MMP-9 pysyi riippumaton ennustajia OS (p63: HR = 1,54, p = 0,017 ; log-MMP-9: HR = 1,26, p = 0,011). Sekä p63 ja log muutosta MMP-9 oli myös riippumattomia ennustajia DSS (p63: HR = 2,04 p63, p = 0,0006, log MMP9: HR = 1,31, p = 0,006) lisäksi taudin vaiheessa kaikkien 101 potilasta. Mukaan lukien ilman /squamous histologia, taudin vaihe, ja ikä diagnoosin monimuuttujakalibrointiin regressiomalli, sekä p63 ja login MMP-9 pysyi riippumaton ennustajia DSS (p63: HR = 1,63, p = 0.022; log-MMP-9: HR = 1,35, p = 0,003). Kun rajoitettu meidän monimuuttuja merkkianalyysit lihaksen-invasiivisia kasvain (n = 67, alkaen 101 näytteistä käytettiin RT-PCR), sama suuntaus mutta hieman lisääntynyt riskisuhteita OS sekä p63 ja MMP-9 havaittiin (p63: HR = 2.17, p = 0,0003, log-MMP-9: HR = 1,31, p = 0,007), mikä viittaa siihen, että sekä p63 ja MMP-9 ovat riippumattomia ennustajia haitallisia selviytymisen lihas-invasiivisia sairauksia. Sama suuntaus havaittiin myös hieman lisääntynyt vaara tunnusluvut DSS (p63: HR = 2,40, p = 0,0018, log-MMP-9: HR = 1,37, p = 0,003) verrattuna OS. Määrittäminen potilaat 1 piste kunkin joko kohonnut ilmentyminen p63 tai MMP9 (0 = ei koholla, 1 = joko kohonnut, 2 = molemmat koholla), kerrostunut selviytymisen pahin selviytymisen kun molemmat olivat koholla (kuva 4E ja F), ja paras eloonjääminen kun kumpikaan nostettiin (mediaani 0, 1, tai 2: = 69, 10 kuukautta, ja 8 kuukautta, jossa on 5-vuoden OS 55%, 8% ja 0%: lla). Suhteelliset vaarat oletuksia kunkin riskitekijä täyttyy regressiomallin joko 67 lihas-invasiivisia potilaita, tai 101 primaarisessa virtsarakon syöpään.

Keskustelu

Aiemmat tutkimukset todettiin, että menetys p63 on liittyy lyhyempi selviytymisen virtsarakon syöpä [3], [20]. Sen sijaan, tulokset viittaavat siihen, että ylläpito p63: n ilmentyminen liittyy haittavaikutuksia potilailla, joilla on lihas-invasiivisen virtsarakon syöpä. Pinnalla meidän tulokset näyttävät ristiriidassa näiden muiden tutkimusten. Kuitenkin epäilemme tämä näennäinen ristiriita johtuu osittain sisällyttäminen pinnallinen syöpien näyttää tasaisen hyvää selviytymistä ominaisuudet aiemmissa analyyseissä vastakohtana nykyinen keskittyä niiden vaikutusta lihasten-invasiivisia sairauksia. Ryhmänä kaikkein pinnallinen virtsarakon syövät on erinomainen pitkäaikainen eloonjääminen (lähes 100%), ja tasaisesti ilmaista korkea E-kadheriinin ja p63. Toisaalta, menetys p63 on rajoitettu osajoukko lihas-invasiivisia kasvaimia, ja lihas-invasiivisia sairauksia liittyy tyypillisesti huonompi kliinisiä tuloksia verrattuna pinnallinen, ei-invasiivisia syövän. Siksi sisällyttäminen pinnalliset kasvaimet tasaisesti näyttämällä ”epiteelin” fenotyyppi voisi laimentaa ulos haitallinen vaikutus, jonka ”epiteelin” fenotyypin lihas-invasiivisia kohortti. Lisäksi kaupallinen vasta-aine (4A4), joka on yleisimmin käytetty mittaamaan p63 kudosleikkeissä ei voi erottaa toisistaan ​​kaksi suurta p63-isoformeja (TA ja Dn), joten suhde Dn p63 ilmentymistä ja huono tulos lihas-invasiivisia virtsarakon syöpä voi ei tunnusteta aiemmissa IHC perustuvat tutkimukset, jotka työskentelevät tätä reagenssia [4], [20]. Yritimme vahvistaa meidän mRNA-pohjainen tuloksia käyttämällä 4A4 on kudossiruina ja tulokset olivat vakuuttavia (tuloksia ei ole esitetty). Tätä päätelmää, kun taas meidän käsikirjoitus valmisteltiin jättämisen Cordon-Cardo ryhmä tuotti anti-p63-vasta-aine, joka on spesifinen Dn isoformeja ja käyttää sitä riippumattomaan kohortti lihas-invasiivisen kasvaimet osoittaa, että Dn p63-proteiinin tasot myös tunnistaa tappava alaryhmä syöpien, kun taas niiden tulokset kanssa 4A4-vasta olivat tuloksettomia [25]. Lopulta mahdollisille tutkimuksia tarvitaan tiukasti testata kliinistä merkitystä näiden havaintojen.

Työ suoritetaan viime 5 vuoden aikana on uutta kiinnostusta rooli EMT syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden. Yksi vaikuttaja tutkimus osoitti, että isogeeninen metastaattinen variantteja hiiren rintasyövän solulinjan yli-ilmentyy E-kadheriinin repressori, Twist, ja että kohonnut Twist ilmentyminen tarvitaan etäpesäkkeiden [7]. Myöhempi työ osoitti, että täytäntöön Twist ilmentymistä normaaleissa nisäepiteelisoluissa laukeaa EMT ja samanaikaisesti voimistunut ilmentyminen rintasyövän kantasolujen merkkiaineita [26]. Parallel tutkimukset muiden ovat vahvistaneet käsitystä, että EMT ajaa kasvainprogression, etäpesäkkeitä, lääkeresistenssin ja ”varsi-like” fenotyyppi [10], [27]. Osalta virtsarakon syöpien, viimeaikaiset tutkimukset sekaantunut EMT sairauden etenemisessä, invaasio /muuttoliike ja Säteilynsietotestin ja täsmähoitoihin [11], [12], [15] – [17]. Näiden havaintojen mielessä, odotimme, että mittaus EMT markkeri ilmaisu olisi tunnistaa kaikkein vaarallisin osajoukko lihas-invasiivisia virtsarakon syöpiä. Tuloksemme vahvistavat, että EMT markkereita kohosivat lihas-invasiivisia syöpiä. Silmiinpistävän kuitenkin lisääntynyt p63 ilmentyminen liittyi haittavaikutuksia sekä lihas-invasiivisia ja T1 kasvaimissa.

Useat viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että EMT ja ”varsi-like” fenotyyppi säätelee mikro-RNA: t (asennuspalveli- 205 ja miR-200 perhe) [28] – [31]. miR-205 ja miR-200 perhe voi ylläpitää epiteelin fenotyypin tukahduttamalla ilmaus mesenkymaalisten transkriptiotekijöiden (Zeb-1 ja Sip1) ja käyttöönotto miR-205 ja miR-200 osaksi mesenkymaaliset solut voidaan kääntää mesenkymaalisten solujen morfologia kohteena on epiteelin fenotyyppi [30]. Kiinnostavaa kyllä, olemme äskettäin havainnut, että ΔNp63 välittömästi tukevaa miR205 lauseke (M. Tran, käsikirjoitus valmisteilla), joka tarjoaa selityksen tiukan korrelaation ilmaisua ΔNp63 ja epiteelin merkkiaineiden virtsarakon syövän solulinjoissa ja primäärikasvaimissa.

Selvitämme myös ΔNp63 vaikutuksista virtsarakon syöpä solubiologian, jotta voidaan paremmin ymmärtää, miksi sen ilmentyminen korreloi huono potilaan selviytymistä. Vaikka rakenteellisesti samankaltaisia ​​p53, p63 on fylogeneettisesti vanhempi kuin sen serkku ja näyttää paljon suurempi lajien välisten säilyttäminen [32], [33]. Lisäksi vaikka p53 ja p63 vuorovaikutuksessa samankaltaisia ​​DNA-sekvenssin motiivia, useimmat p63-isoformit eivät transaktivoida p53 kohdegeenien, vaan voi toimia määräävän negatiiviset tukahduttaa p53-riippuvaisen transaktivaation [33]. P63 ilmentyy korkeilla tasoilla pohjapinta kerrokset, jotka sisältävät normaalia kantasolujen osastojen monissa eri epiteelikudoksissa, kuten uroteelin. Kohdennettu ablaatio p63 ilmaisun häiritsee normaalia virtsarakon eriyttäminen hiiressä, mikä johtaa pohjapinta /suprabasaalisissa kerros selektiivisten säilyttämistä ns ”sateenvarjon” soluihin [34]. Nämä havainnot ovat johtaneet monet tutkijat ehdottaa, että p63 on olennainen ylläpitämiseksi itseuudistumisen ja /tai selviytyminen normaalien kantasolujen [35]. Näin ollen, p63 ekspressiota lihaksen-invasiivinen sairaus voi liittyä sekä epiteelin fenotyyppi ja ”stemness” [36] – [38]. Kuitenkin, solujen normaalin uroteelin ilmaista TAp63 (ei ΔNp63), joiden odotetaan olevan hyvin erilaisia ​​vaikutuksia solubiologian. Silmiinpistävän, alustavien tutkimusten mukaan vakaa knockdovvn ΔNp63 virtsarakon syövän soluissa aiheuttaa voimakkaita lisäkasvun estäminen, vaikutukset, jotka liittyvät downreguliation c-Myc-mRNA ja proteiinin ilmentyminen (L. Marquis et ai, käsikirjoitus tarkistettavana), Siksi tällä hetkellä suosivat ajatus, että ΔNp63 n merkitys negatiivisena prognostinen markkeri liittyy sen vaikutuksia kasvainsoluproliferaation. Muita mekaaniset tutkimukset on määriteltävä välisiä suhteita EMT fenotyyppi, ”stemness”, leviämisen, huumeiden herkkyys, ja etäpesäkkeiden kokeellisissa malleissa ja ensisijainen kasvaimia.

Johtopäätökset

pinnallinen (non lihas- invasiivisia) kasvaimet ilmentävät korkeampia tasoja epiteelin merkkiaineiden E-kadheriinin ja p63, kun lihas-invasiivisen kasvaimet ovat suurempia ilmaus mesenkymaalisten merkkiaineiden Zeb1, Zeb2, vimentiinistä, MMP2 ja MMP-9. Siitä huolimatta on olemassa osajoukko lihas-invasiivisen syövän joka on haitallinen ennusteen asettaminen kohonnut p63 ilmaisua. Tämä korkeus p63 liittyy säilytetään ilmaus E-kadheriinin ja alentuneesta mesenkymaalisten markkereita kuten vimentiinista, Zeb1 ja Zeb2, mikä viittaa siihen, että kytkentä p63 ilmaisun ja ”epiteelin” fenotyyppi säilyy läsnä osajoukko lihas-invasiivisia syöpiä. MMP-9 ilme näyttää olevan riippumaton p63 ennustamisessa haittavaikutuksia, mikä viittaa sääntelyn riippumattomien mekanismien. Molekyylimekanismeja ajo lihas hyökkäys kasvaimissa näyttämällä ”epiteelin” fenotyyppi ja rooli EMT kemoterapiassa reagointikykyä ja etäpesäkkeiden on enemmän täysin tutkittu tulevissa tutkimuksissa.

Materiaalit ja menetelmät

käyttäminen julkisen geenin ilmentyminen aineistot me määritetään, onko vähentynyt ilmentyminen ”epiteelin” marker E-kadheriinin ja lisääntyneen ilmentymisen useita ”mesenkymaaliset” markkereita (E-kadheriinin repressors Zeb-1, Zeb-2, ja Twist, matriisin metalloproteaasien MMP2 ja MMP9 fibronektiini, ja vimentiinistä) oli etenemiseen liittyvä lihas-hyökkäystä. Sitten käytimme paneeli virtsarakon syövän solulinjoista onko ilmaus ”epiteelin” ja ”mesenkymaalisten” merkkiaineet olivat toisensa poissulkevia näyttämällä erillinen ”epiteelin” ja ”mesenkymaalisten” fenotyyppejä. Käyttämällä kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR testasimme onko suhde EMT ja lihas-invasiivisen taudin esiintyi uuden kohortin virtsarakon syöpä ja korreloivat EMT merkki ilmaisun kanssa selviytymisen.

Analyysi EMT Markers in Public Gene Expression Profilointi aineistot

Kaksi julkista ihmisen virtsarakon syöpä geeniekspressiota aineistoja käytettiin analysoitaessa EMT markkereita. Tiedot Blavari et al ja Carbayo ym ladattiin Gene Expression Omnius (GEO Liittymisnumero GSE-1827 [13]) ja Journal of Clinical Oncology [14], tässä järjestyksessä. BRB ArrayTools versio 4.2, jonka on kehittänyt NCI [39] käytettiin analysoimaan tietoja [13], [14]. Valitseminen geenit ilmentyvät differentiaalisesti kahden eri alaryhmien (pinnallinen ja lihas-invasiivisia kasvaimet), luokka vertailu välineenä BRB ArrayTools käytettiin laskemiseen merkitys havaintojen (eli

P

0,001 laskea kahden otoksen t-testi väärän löytö määrä (FDR) alle 0,1). Tarkkailla malleja EMT geenin ilmentymisen, jokaisen geenin arvoa, säädettiin keskimäärin nolla, käytettiin klusterointi kanssa Cluster ja TreeView [40].

Solulinjat

Solulinjat saatiin MD Anderson Virtsarakon SPORE kudospankki, ja niiden identiteetit vahvistanut DNA-sormenjälkien avulla AmpFlSTR® Identifiler® Amplification (Applied Biosystems, Foster City, CA) tai AmpF

l

STR® Profiler® PCR Amplification (Applied Biosystems), suorittamat MD Anderson Ominaista Cell Line Core, tai itse, tässä järjestyksessä. Nämä sormenjäljet ​​löytyvät MD Anderson virtsarakon SPORE verkkosivuilla. Solulinjoja viljeltiin modifioidussa Eaglen MEM, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, vitamiineja, natriumpyruvaattia, L-glutamiinia, penisilliiniä, streptomysiiniä, ja ei-välttämättömiä aminohappoja 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa.

Human yksilöitä

kliiniset tulokset tietojen ja potilaan näytteitä reaaliaikaisia ​​PCR saatiin 101 potilasta MD Anderson urogenitaalinen syöpien tutkimusta tietokantaan. Tuore kudokset saatiin meidän SPORE Tissue Core. Näytteet kerättiin macrodissection keskittyen alueilla, joilla on vähintään 80% tuumorin konsentraatio. Kaikki potilaat olivat aiemmin allekirjoittanut tietoisen suostumuksen mahdollistaa kokoelma niiden kudoksen ja kliiniset tiedot meidän urogenitaalinen tutkimustietokantaan. Ylimääräinen IRB hyväksytty protokolla saatiin erityisten analyysien kuvattu tässä asiakirjassa. Kaikki kudosnäytteet tarkistaa patologi. Potilaat luokiteltiin lihas-invasiivisia kasvaimen kasvua osaksi muscularis propria; muuten, ne luokiteltiin pinnallinen (ei lihas-invasiivisia). Kokonais-RNA ihmisen näytteet eristettiin käyttäen Mirvana ™ miRNA eristyspakkausta (Ambion, Inc.).

Reaaliaikainen käänteiskopioijaentsyymi- PCR-analyysillä

EMT markkereita analysoitiin Taqman-pohjainen reaaliaikainen PCR (ABI PRISM 7500; Applied Biosystems). Vertaileva CT menetelmä [41] käytettiin määrittämään suhteellinen geenin ilmentymisen kunkin kohdegeenin; syklofiliinistä geeni oli käytetyn sisäisen kontrollin normalisoimiseksi määrän monistettavissa RNA (määritys ID-numerot: E-kadheriinin, Hs00170423_m1, ZEB1; Hs00232783_m1, ZEB2; Hs00207691_m1, vimentiinin, Hs00185584_m1, MMP2, Hs00234422_m1, MMP-9, Hs00957562_m1 ja Syklofiliiniesimerkkeihin A; Hs99999904_m1). Alukkeet ja fluoresoivat koettimet p63-isoformit suunnitellut Primer Express 3.0 (Applied Biosystems), jolla on seuraavat sekvenssit: TAP63 forward-aluketta 5′-TGCAGGACTCGGACCTGAGT-3 ’, käänteinen aluke 5′-TGTTCAGGAGCCCCAGGTT-3′, koettimet 5′-ACCCCATGTGGCCAC-3 ”; Dn-p63 eteenpäin aluke 5’-GGAAAACAATGCCCAGACTCA-3 ’, käänteinen aluke 5’TGTTCAGGAGCCCCAGGTT-3′, antureista 5’-TTTAGTGAGCCACAGTACAC-3 ’. Alukkeita ja koettimia p63-isoformien validoitiin käyttäen standardikäyrää menetelmiä (tuloksia ei ole esitetty).

tilastolliset menetelmät

Tilastolliset analyysit tietojen perusteella 101 potilasta. Ensisijainen tavoitteena oli selvittää korrelaatioita merkki ilmaisun ja taudin vaiheessa ja arvioida yhdistyksen välillä merkki ilmaisun ja yleinen (OS) ja tautikohtaista eloonjäämisen (DSS). Tauti vaiheessa ositettiin kuin pinnallinen (Ta tai T1) tai lihaksia invasiivisia ( = T2). Expression verrattiin välillä pinnallinen ja lihas-invasiivisia virtsarakon syöpä käyttäen Wilcoxonin summa testi. Korrelaatiot joukossa ilmaus merkkiaineiden kvantitoitiin käyttäen Spearmanin rho kertoimia. Kaplan-Meier arvio selviytymisen jakautuminen näkyi Tutkittujen biomarkkereiden ilmaus luonnehtia korkea ja matala (esim. P63, MMP-9), jossa cutoff pisteen määrittämään korkean ja matalan saatiin regressio puu analyysien [42]. Log-rank-testiä käytettiin vertaamaan elossapysymisaikajakaumat ryhmien välillä. Suhteellinen riskien mallia käytettiin vaikutusten arvioimiseksi useiden merkkiaineiden ja kasvaimen vaiheessa DSS ja käyttöjärjestelmän. Suoritimme logaritminen muutosta MMP-9 ilmaisun arvojen takia skewedness tietojen. Kaikki p-arvot ovat 2-puolinen.

tukeminen Information

Kuva S1.