Krooninen sairaus

tiivistelmä

kasvain mikroympäristölle on ratkaiseva rooli aikana kasvainten kehittymiseen. Integroitu lääkkeiden yhdistelmää, jotka kohdistuvat kasvain mikroympäristölle on lupaava lähestymistapa syövän hoitoon. Täällä me raportoimme monitoiminen yhdistelmä matala-sytotoksisten lääkkeiden koostuu dipyridamolin, bestatiinia ja deksametasoni (DBDx) joka pääasiallisesti vaikuttaa kasvaimen microenvironment näyttää erittäin voimakkaita antituumorivaikutuksen tehosta

in vivo

. Hiiren hepatooma H22 malli, kolminkertainen lääkeyhdistelmä osoitti synergistisen ja erittäin voimakkaat tuumorin vastaista tehokkuutta. Yhdistelmä indeksien eri yhdistelmien kolminkertainen huumeet olivat välillä 0,2 ja 0,5. DBDx esti kasvua paneelin ihmisen tuumoriksenografteja ja osoittanut mitään selvää systeemistä toksisuutta. Tällä siedetyt annokset, DBDx tukahdutti kasvua ihmisen maksasolusyövän BEL-7402, HepG2, ja keuhkojen A549-ksenograftit mukaan 94,5%, 93,7% ja 96,9%, vastaavasti. Klonogeeniset määrityksessä osoitti, että DBDx osoitti heikkoa sytotoksisuutta. Western blot osoitti, että Flk1 ja NOS3 olivat alas-säännelty DBDx hoidetussa ryhmässä. Proteomiikka-analyysi osoitti, että DBDx vaikuttaa lähinnä aineenvaihduntaa ja immuunijärjestelmää prosessia; Lisäksi angiogeneesiä ja VEGF-signalointireitin vaikutti myös. Lopullisesti, DBDx, monitoiminen lääkkeen yhdistelmä kolmesta matalan sytotoksisten lääkkeiden, näkyy synergistisiä ja erittäin voimakkaat tuumorin vastaista tehokkuutta ilmeisesti välittyy modulaatio kasvaimen microenvironment. Perustuu sen matalan sytotoksiset ominaisuudet ja laaja-alaista antituumorivaikutuksen terapeuttista tehoa, tämä monikäyttöinen yhdistelmä voisi olla käyttökelpoinen hoidettaessa syöpiä, erityisesti tulenkestävä perinteisiin kemoterapeuttisia.

Citation: Liu XJ, Zheng YB, Li Y, Wu SY, Zhen YS (2014) Monitoimilaite Drug yhdistelmä Näyttää erittäin voimakas terapeuttinen teho vastaan ​​Human Cancer ksenoqraftit kateenkorvattomissa hiirissä. PLoS ONE 9 (12): e115790. doi: 10,1371 /journal.pone.0115790

Editor: Ruby John Anto, Rajiv Gandhi Biotekniikan keskus, Intia

vastaanotettu: 04 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 01 joulukuu 2014; Julkaistu: 22 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustusta ”Merkittäviä uusia lääkkeitä kehitys” Major Science and Technology Projects of China (nro 2012ZX09301002, http: //www.nmp. gov.cn) ja National Natural Science Foundation of China (nro 81201665, https://www.nsfc.gov.cn). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on monimutkainen sairaus, johon liittyy muutoksia kasvainsolujen ja kasvaimen mikroympäris- [1]. Kuten raportoitu, kasvain microenvironment muutokset yhdessä kasvainten kehittymiseen ja edistää kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden [2], [3]. Käytöt lääkkeitä, jotka kohdistuvat kasvain microenvironment tarjoavat lupaavan strategian syövän hoidossa [4] – [5]. Lääkeaineiden yhdistelmä, joka kohdistaa kasvain microenvironment on osoittautunut tehokkaaksi syövän hoidossa [6] – [8]. Täällä me raportoimme monitoiminen lääkeyhdistelmä koostuu dipyridamoli (DPM), bestatiinia (BEN) ja deksametasonia (DEX), joka koskee lähinnä kasvain microenvironment ja sen erittäin voimakas terapeuttinen teho.

Dipyridamole, tunnettu anti -thrombotic lääke, on aktiivinen nukleosidi kuljetuksen estäjä. Se voi lisätä antituumorivaikutuksen monia antimetaboliitit, kuten 5-fluoriurasiili ja metotreksaatti [9]. Dipyridamoli voi myös heikentää kasvain microenvironment ja estää rintasyövän etenemisen hiirillä [10]. Bestatiini (ubenimeksi), aminopeptidaasi- estäjä, on osoittanut monipuolinen antituumorivaikutuksia ja immunomodulaarisia toimintaa [11], [12]. Kliinisesti bestatiinia käytetään immmunomodulaattoreina yhdessä kemoterapian tai sädehoidon [13]. Bestatiinia voi estää kasvainsoluproliferaation ja tukahduttaa tuumoriangiogeneesissa [14], [15]. Deksametasoni on laajalti käytetty lääke glukokortikoidin steroidi perheen voimakas tulehdusta ja immunosuppressiivinen vaikutus. Klinikoilla, sitä käytetään usein tulehduksellisten ja autoimmuunisairauksien. Kasvaimen hoidossa, deksametasonia käytetään yleensä lievittää sivuvaikutuksia kemoterapiaa [16]. On raportoitu, että deksametasoni voi myös tukahduttaa kasvaimen angiogeneesiä [17], [18].

Tässä tutkimuksessa suunnittelimme integroitu, monitoiminen yhdistelmä kuten dipyridamoli, bestatiinia ja deksametasoni ja tutkitaan sen antituumorivaikutus erityisesti sen terapeuttinen teho

in vivo

. Tutkimuksemme osoittaa, että DBDx on erittäin tehokas, laajakirjoinen antituumorivaikutuksen yhdistelmä pääasiassa suunnattu kasvain microenvironment.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Dipyridamoli ja deksametasonin saatiin National Institutes for Food and Drug valvonta (Kiina). Bestatiinia tarjosi Apeloa Kangyu (Kiina). Saat kahden tai kolmen yhdistelmät valmisteen aineet sekoitettiin mukaan osoitettuun annoksilla suolaliuosta, sitten maa ja homogenoitiin käyttämällä laastia. Gemsitabiini (Gemzar) hankittiin Lilly, Ranska. Gefitinibi (IRESSA) oli peräisin AstraZeneca. 5-FU oli Shanghaista Xudong Haipu Pharmaceutical Co., Ltd. Kaikki kemikaalit ja biokemialliset aineet käytettiin analyyttistä laatua.

Soluviljely

Human maksasyövän BEL-7402 solut hankittiin Shanghai Institute of Cell Biology, Kiinan tiedeakatemia. Ihmisen maksasyövän HepG2 solut hankittiin ATCC. Ihmisen keuhkon A549-solut ja ihmisen epidermoidikarsinooma A431-solut saatiin Cell Center of Institute of Basic Medical Sciences, Kiinan Academy of Medical Sciences ja Pekingin unionin Medical College. Ihmisen keuhkojen giant cell carcinoma PG-solut saatiin Department of Pathology, Pekingin yliopiston Health Science Center. Kaikki nämä solulinjat kryosäilöttiin laboratoriossamme ja viljeltiin 37 ° C: ssa RPMI-1640-väliaineessa (Gibco BRL Inc.), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Gibco BRL Inc.), 2 mM glutamiinia, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 100 U /ml penisilliiniä kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2.

in vivo hoidon tutkimuksessa

Kaikki Kunming hiiret ja NIH (nu /nu), joilta puuttui kateenkorva hiiret hankittiin Vital River Laboratories (Peking, Kiina).

hiiren hepatooma 22 (H22) malli, naispuolinen Kunming hiiriä (18-22 g) jaettiin satunnaisesti 10 hiirtä kussakin ryhmässä. Päivänä 0, hiiren hepatooma 22 soluja askitesnesteestä tuumoreita kantavaa hiirtä istutettiin ihonalaisesti oikeaan axilla alueella 1,5 x 10

6 solua /hiiri. Päivästä 3 päivään 12, kasvainta kantavaa hiirtä käsiteltiin oraalisesti suolaliuoksella, yksittäisillä aineilla, kahden tai kolmen yhdistelmä, vastaavasti. 5-FU oli hallinnoitava samassa aikataulussa mutta annetaan vatsaonteloon. Päivänä 14 kaikki hiiret tapettiin. Tuumorit punnittiin ja inhibiitionopeudet kasvaimen kasvun laskettiin. Yhdistelmä-indeksi (CI) analysoitiin mukaan Chou ja Talalay menetelmä [19].

hepatooma BEL-7402 ksenograftimallia, ihmisen hepatooma BEL-7402-soluja (1 x 10

7) suspendoitiin 200 ui suolaliuosta istutettiin ihon alle (sc) oikeaan kainaloon naisten NIH

(nu /nu)

kateenkorvattomissa hiirissä (18-22 g). Kun 3 vk, kasvaimet leikeltiin ja paloja kasvainkudoksen (2 mm

3 kooltaan) istutettiin s.c. jonka troakaarin kateenkorvattomiin hiiriin. Kun kasvaimen koko saavutti noin 100 mm

3 (päivä 7), hiiret jaettiin 6 hiirtä ryhmää kohti ja käsiteltiin oraalisesti suolaliuosta tai lääkeyhdisteistä eri annoksilla vastaavasti, kerran päivässä, 5 peräkkäisenä päivänä viikossa 2 viikon ajan . Kasvaimen koon ja painon mitattiin 3-4 päivän välein. Kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla: V = ab

2/2, jossa

edustaa pituus- halkaisija ja

b

kohtisuorassa halkaisijaa. Inhibitioon hinnat kasvaimen kasvun laskettiin tuumorin tilavuuden.

hepatooma HepG2 ksenograftimallissa, keuhkokarsinooma A549 ksenograftimallissa, keuhkokarsinooma PG ksenograftimallissa ja epidermoidikarsinooma A431 ksenograftimallissa, kasvaimet istutettiin kateenkorvattomissa hiirissä kuvatulla BEL-7402 malli. Aikataulut lääkkeen annon kuvattiin tuloksiin.

klonogeeninen määritys

BEL-7402 solut räjähdysmäinen kasvu ympättiin 50 solua kuoppaa kohti 96-kuoppalevyille ja viljeltiin 24 tunnin ajan 37 ° C. Sitten eri pitoisuuksia lisättiin lääkeaineet kolmena kappaleena ja soluja viljeltiin vielä 7 päivää. Pesäkkeitä yli 50 solut laskettiin. Selviytymisen fraktiot lasketaan seuraavan kaavan mukaisesti: hengissäsäilymisosuus (%) = syytettä koemaljojen /laskennat kontrollikuoppa x 100%.

Välitön myrkyllisyys

Kunming hiiriä (18- 22 g, puoli miehen ja puoli naaras) jaettiin satunnaisesti 4 ryhmään 20 hiirtä ryhmässä. DBDx (suhde dipyridamoli, bestatiinia, ja deksametasoni oli 100, 20, ja 1) annettiin oraalisesti yhtenä annoksena 0, 1,28, 1,6 ja 2 g /kg, vastaavasti. Ruumiinpaino hiiristä, neurologiset vaste, ja käyttäytyminen poikkeavuus seurasi tiiviisti 14 päivän ajan.

Western blot-analyysi

H22 mallissa 3 vuorokauden kuluttua kasvaimen implantaation DBDx 242 mg /kg annettiin suun kautta, kerran päivässä 10 päivää. Päivänä 14 kasvaimen kudokset eristettiin, 5 kudosnäytteet otettiin kustakin ryhmästä. Kasvainkudoksessa lyysattiin lyysipuskurissa (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 0,1% SDS, 1% NP-40, 0,5% Natriumdeoksikolaatti, 100 ug /ml fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF), 1 ug /ml aprotiniinia , pH 8,0) ja homogenoitiin kädessä homogenisaattorilla. Lysaatit sentrifugoitiin 12 000 rpm: ssä 10 minuutin ajan ja supernatantit, jotka sisältävät proteiinia, kvantifioitiin käyttäen BCA-proteiinimäärityksellä (Pierce).

Proteiininäytteet ajettiin elektroforeesissa 10% SDS-PAGE ja siirrettiin PVDF kalvo. Jälkeen salvattiin 1% BSA: ta, kalvo inkuboitiin primaarisen vasta-aineen (Santa Cruz) ja HRP-konjugoidulla sekundäärisellä vasta-aineella (Zhongshan Inc.), peräkkäin. Immunoreaktiivinen bändi visualisoitiin Western blot luminolia reagenssia (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), ja kuva on otettu käyttäen kuva-analyysiä järjestelmä (AIO Inc.).

Näytteiden valmistus kaksiulotteisen ero geelielektroforeesilla

BALB /c-kateenkorvattomissa hiirissä, joissa BEL-7402 ksenografteja jaettiin kahteen ryhmään, 5 hiirtä kussakin ryhmässä. Yksi ryhmä hiiriä käsiteltiin 242 mg /kg DBDx, kerran päivässä 10 päivää; toinen ryhmä hiiriä annettiin suolaliuoksella kontrollina. Seuraavana päivänä viimeisen antamisen jälkeen hiiret tapettiin. Kasvainkudoksissa kerättiin ja jäädytettiin nestemäisellä typellä ja säilytettiin -80 ° C: ssa käsittelyyn asti.

Protein näytteen valmistelua, kaksiulotteinen elektroforeesi (2-DE) ja massaspektrometrialla (MS) suoritettiin Beijing Protein innovaatio.

Protein näytteet valmistettiin käyttäen trikloorietikkahappoa (TCA) asetoni netelmällä. Lyhyesti, noin 50 mg tuumorikudosta jäädytettiin nestetypessä aiemmin murskattiin metallisella laasti, ja suspendoitiin sitten 10% TCA asetonia, joka sisälsi 1 mM PMSF: ää, 2 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA) ja 10 mM ditiotreitolia (DTT) ja 2 h. Sentrifugoinnin jälkeen saostunut proteiini pestiin esijäähdytetty asetonilla. Pelletti liuotettiin lyysipuskurissa, joka sisälsi 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 8 M ureaa, 4% 3 – [(3-kolamidopropyyli) dimetyyliammonio] – 1-propaanisulfonaatti (CHAPS), 0,5% Pharmalyte (pH 3-10L ), 10 mM DTT, 1 mM PMSF ja 2 mM EDTA: ta. Lysaattia ultraäänellä 5 min, jota seurasi sentrifugointi 40 000 g 15 minuuttia. Supernatantti proteiini kvantitoitiin käyttäen Bradfordin menetelmällä. ”Yhdistetty proteiini altaat” valmistettiin sekoittamalla yhtä suuret määrät proteiinia 5 kasvain näytettä samasta ryhmästä 2-DE.

2-DE ja kuva-analyysin

”mixed proteiini näytteitä ”(200 ug) sekoitettiin nesteytys puskuria ja laitettiin 18 cm: n lineaarinen IPG nauhat, pH 3-10 (Amersham Biosciences, Ruotsi) .Tämän jälkeen suikaleet altistettiin isoelektrinen fokusointi on IPGphor (Amersham Biosciences, Ruotsi). Kohdennettua liuskat jälkeen pelkistetään 1% DTT: tä ja alkyloidaan 2,5% jodiasetamidilla (IAM) on tasapainotettu puskurissa (6 M ureaa, 30% glyserolia, 2% SDS: ää, ja 50 mM Tris-HCl, pH 8,8). Käsiteltyjä liuskoja siirrettiin 12% SDS-PAGE Ettan DALT II System (Amersham Biosciences, Ruotsi) toissijaisen elektroforeesilla. Analyyttinen geelit värjättiin hopeavärjäyksellä lisäämättä glutaarialdehydiä. Värjätyt geelit skannattiin käyttäen Imagescanner (Amersham Biosciences, Ruotsi), ja kuvat analysoitiin ImageMaster 2-D Platinum versio 3.0 (Amersham Biosciences, Ruotsi).

MS ja proteiinin tunnistamiseen

ero lauseke täplät leikattiin geeleistä ja sijoitettiin Eppendorf-putkissa. Geeli palaset pelkistettiin 10 mM DTT ja alkyloitiin 55 mM IAM. Sitten geelit peräkkäin tasapainotettu 25 mM ammoniumbikarbonaattia, 50% asetonitriiliä (ACN) +25 mM ammoniumbikarbonaattia ja 100% ACN 10 minuutin ajan, minkä jälkeen kuivattu tyhjiössä sentrifugissa 10 min. Kuivatut geelit rehydratoitiin ruuansulatuksessa liuokseen (0,01 ug /ml trypsiiniä liuotettiin 25 mM ammoniumbikarbonaattia) jäissä 30 minuutin ajan, ja niitä inkuboitiin 25 mM ammoniumbikarbonaattia (10-15 ui) yön yli 37 ° C: ssa. Pilkkominen pysäytettiin käyttäen 0,1% trifluorietikkahappoa (TFA). Digestoitu peptidit täpläksi kohde (AnchorChip ™, Bruker, Saksa) ja co-kiteytetään α-syaani-4-hydroksikanelihappo (CHCA, 4 mg /ml 70% ACN, ja 0,1% TFA: ta). Sitten kuivatut matriiseja analysoitiin Ultraflex MALDI-TOF /TOFII MS (Bruker, Saksa) toimi heijastimen moodin m /z-alue 600-4 000 kalibrointi PMF (peptidi massa sormenjälkien) näytteet tehtiin ulkoisesti käyttämällä seos standardin peptidejä ja sisäisesti peptidifragmenttien trypsiiniä autolyysi tuotteita. Mukaan PMF signaaleja, kolme parasta korkeimmat peptidejä suuremmalla tarkkuudella ja suurempi runsaus analysoitiin edelleen MS /MS-tilassa. PMF analysoitiin MASCOT (Matrix Science, U.K.) vastaan ​​NCBInr tietokantaan. Massa tarkkuus toleranssi annettiin 100 ppm. Proteiini tunnistuksiin tehtiin perustuu todennäköisyyksiin perustuvaa Mowse pisteytysalgoritmin luottamustasolla 95% .Tämän jälkeen tunnistetuista proteiineista analysoitiin PANTHER (Protein analyysiin Evolutionary Relationships) luokitusjärjestelmän (www.pantherdb.org) .Järjestelmä suunniteltiin luokitella proteiinit (ja niiden geenit) ja luokittelee ne perheensä mukaan ja alaperheessä molekyyli- toiminto, biologisia prosesseja, ja polkuja.

Ethics lausunto

Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin eettinen komitea eläinten Kokeet instituutin Medicinal Biotekniikan, kiina Academy of Medical Sciences (IMBF20060302). Tutkimuksessa protokollat ​​noudattavat suosituksia asetukseen hallintaviraston Laboratory Animals ministeriön Science and Technology of China.

Tulokset

Triple yhdistelmiä oli parantunut ja yhteisvaikutukset tuumorin vastaista tehokkuutta

antituumorivaikutuksen tehoa kolminkertainen yhdistelmälääkevalmisteiden DPM, BEN ja DEX ensin verrattiin yksittäisinä aineina tai kahden yhdistelmiä hiiren hepatooma- H22 malli. 3 päivän kuluttua kasvaimen implantaation (kasvaimen tilavuus: 250 ± 30 mm

3), lääkkeet annettiin suun kautta, kerran päivässä 10 päivää. 14. päivänä hiiret tapettiin ja kasvaimen paino mitattiin. Osoitetussa annoksilla taulukossa 1, inhibition hinnat vastaavien yksittäisinä aineina vaihteli 22,8%: sta 68,6%. Kaksinkertaisen yhdistelmä, esto hinnat olivat 58,7%: sta 66,3%. CI arvot kaksinkertainen yhdistelmien olivat 0,8-1, ilmoitetaan lisäaineen tai hieman synergiavaikutukset. Sillä kolminkertainen yhdistelmä, 3 x 3 ryhmää yhdistelmiä tutkittiin kuten osoitti taulukossa 1. Kun kolme lääkettä yhdistetään, esto hinnat nousivat jopa 79,2% -89,4%, mikä oli tilastollisesti erilainen kuin asiaan yksittäisinä aineina tai kahden yhdistelmät . Cl-arvot Kaikkien kolmen yhdistelmät olivat välillä 0,2 ja 0,5, osoitti synergistisen antituumorivaikutus. Helpottaakseen lääkeyhdistelmä tutkimuksessa annossuhteessa DPM, BEN ja DEX kiinnitettiin 100:20:1 (massa) ja nimettiin DBDx.

DBDx osoitti erittäin voimakas antituumorivaikutus ihmisen tuumoriksenografteja

antituumorivaikutuksen tehoa DBDx arvioitiin edelleen ihmisen maksasyövän BEL-7402 ksenograftimallissa. Jälkeen 7 päivää kasvaimen istutuksen, eri annoksilla DBDx annettiin suun kautta, kerran päivässä 10 päivää. Suolaliuosta annettiin hiirille kontrolliryhmässä. Päivänä 17, DBDx 121, 242 ja 363 mg /kg inhiboi kasvaimen kasvua 73,0%, 88,1% ja 94,5% arvioitiin kasvaimen tilavuus, vastaavasti, tilastollisesti merkittävästi erilainen kuin kontrolliryhmän (P 0,01, Fig. 1 .A). Erityisesti, avauksen jälkeen, todettiin, että implantoitu kasvain katosi 2 8 hiirestä (Fig. 1 B) kantavassa kasvainten painot on esitetty kuviossa. 1.B Kokeiden aikana kehon painon käsiteltyjen hiirten oli vähemmän kuin 10% verrattuna kehon painon kokeen alusta (Fig. 1.C). Eräässä toisessa erillisellä kokeella, huumeet ylläpitäjä kuten edellä sen jälkeen, kun 10 päivää hoidon pitkän aikavälin antituumorivaikutukset DBDx arvioitiin. Päivänä 60, eli 44 päivää viimeisen hoidon jälkeen, DBDx 242, 363, ja 484 mg /kg inhiboi kasvaimen kasvua 56,4%, 71,9% ja 69,2% arvioitiin kasvaimen tilavuus, vastaavasti (Fig. 1.D), joka oli yhdenmukainen kasvaimen painon tiedot (Fig. 1.E). Kehon paino hoidettujen ryhmien osoittivat vähäistä laskua (10%) hoidon aikana, samalla kun suurempi lopussa kokeiden, mikä osoittaa, että annetut annokset olivat hyvin siedettyjä (Fig. 1.F).

. DBDx inhiboi tuumorin kasvua annoksesta riippuvaisella tavalla. B. Päivänä 17 hiiret lopetettiin. Kasvaimet valokuvattiin ja tuumorit punnittiin. C. ruumiinpainot hiirten aikana 17 päivän kokeilu. D. Pitkällä aikavälillä kokeessa päivänä 60 eli 44 päivää sen jälkeen, kun lopullista käsittelyä, DBDx voisi silti estää kasvaimen kasvua. E. lopussa kokeiden, hiiret tapettiin ja tuumorit punnittiin. F. eläimen kehon paino kaikkien ryhmien aikana 60 päivän kokeilu. (Annos: mg /kg). Tilastollinen merkitsevyys määritettiin Studentin t-testillä; ** P 0,01 verrattuna ohjaus.

Lisäksi tuumorin vastaista tehoa DBDx arvioitiin muiden ihmisen syövän ksenograftien, mukaan lukien ihmisen maksasolusyövän HepG2 ja keuhkojen A549. Lääkeaineet annettava suun kautta kerran päivässä, 5 peräkkäisenä päivänä viikossa 3 viikon ajan (7-11 d, 14-18 d, 21-25 d). HepG2 mallissa, päivänä 28, DBDx 121, 242 ja 484 mg /kg esti kasvaimen kasvua 61,9%, 72,3% ja 93,7% arvioitiin kasvaimen tilavuuden on oltava (Fig. 2 A). Samaan aikaan, 5-FU: 15 mg /kg inhiboi kasvaimen kasvua 42%. Kasvain painot kaikki ryhmät kuvassa. 2.C A549 mallissa, päivänä 28, DBDx 121, 242 ja 484 mg /kg esti kasvaimen kasvua 89,5%, 94,9% ja 96,9% arvioitiin kasvaimen tilavuuden on oltava (Fig. 2.B). Kasvaimen painot on esitetty kuviossa. 2.d. Ilmeisesti hoidettujen eläinten hyvin siedetty kaikkien edellä mainittujen annosten DBDx. Kuten on esitetty kuviossa. 2.E ja F, lopussa kokeen, kuolemia ei esiintynyt, ja laihtuminen oli alle 10% kaikissa käsitellyissä hiirissä eri annosryhmien, mikä osoittaa, että käsiteltyjen eläinten hyvin siedetty kanssa annettiin annoksia DBDx.

A, C ja E. kasvaimen kasvu käyrän, kasvaimen painon kokeen lopussa ja kehon painot hiirten kaikkien ryhmien HepG2 ksenograftimallissa. B, D ja F. kasvaimen kasvukäyrä, kasvaimen painon kokeen lopussa ja kehon painot hiirten kaikkien ryhmien A549 ksenograftimallissa. (Annos: mg /kg). Tilastollinen merkitsevyys määritettiin Studentin t-testillä; ** P 0,01 verrattuna ohjaus.

vertailu antituumorivaikutuksen tehosta DBDx muiden kemoterapiaa huumeita

antituumorivaikutusta on DBDx edelleen verrattiin gemsitabiinin (GEM) ja gefitinibi. Kuten hyvin tiedetään, GEM, antimetaboliitti lääke, jota käytetään yleisesti klinikoilla hoitoon keuhkosyövän, haimasyövän, jne ihmisen keuhkokarsinooma PG ksenograftimallissa, antituumorivaikutuksen DBDx verrattiin GEM. Seitsemän päivää tuumorin implantaation jälkeen, DBDx annettiin suun kautta, kerran päivässä 10 päivää. GEM annettiin i.p. päivänä 7, 10 ja 13, yhteensä kolme annosta. Kuten arvioitiin kasvaimen tilavuuden päivänä 17, GEM esti kasvaimen kasvua 65,2%, kun taas DBDx inhiboi kasvaimen kasvua 82,6%, mikä oli merkitsevästi erilainen kuin GEM (P 0,05, Fig. 3 A). Päivänä 35, DBDx edelleen kohdistuu tuumorin kasvua 57,1%.

. DBDX osoitti vahvempi antituumorivaikutus kuin GEM PG ksenograftimallissa. B. DBDX osoittivat samanlaisia ​​antituumorivaikutus kanssa gefitinibin A431 ksenograftimallissa. C. ruumiinpainot PG ksenograftin kantavien hiirten hoidon aikana. D. ruumiinpainot A431 ksenograftin kantavien hiirten hoidon aikana. (Annos: mg /kg).

Gefitinibiä on EGFR-tyrosiinikinaasi-inhibiittoria. Sillä vertaileva tutkimus, tehoa DBDx ja gefitinibin arvioitiin ihmisen epidermoidikarsinooma A431 ksenograftimallia jossa EGFR on erittäin ilmaistaan. DBDx: n ja gefitinibin olivat vastaavasti annettiin suun kautta, kerran päivässä 10 päivää. Kuten on esitetty kuviossa. 3B, DBDx osoittivat samanlaisia ​​antituumorivaikutuksen kanssa gefitinibin. Päivänä 17, esto korko DBDx 242 mg /kg oli 84,3%, kun taas gefitinibi 100 mg /kg esti kasvaimen kasvua 84,8%, tässä järjestyksessä.

Sekä PG ja A431 malleja, kehon paino menetys käsiteltyjen ryhmien välillä oli vähemmän kuin 11%, ja kehon painon käsiteltyjen hiirten kaikissa ryhmissä lisäsi lopussa kokeen, joka osoittaa, että käsiteltyjen eläinten hyvin siedetty, jossa annokset on DBDx ja gefitinibin (Fig. 3.C, D ).

Toxicopathological tutkimus

HepG2 ksenograftimallia edellä kuvattu, päivänä 28, DBDx 242 mg /kg esti kasvaimen kasvua 72,3%, histopatologinen tutkimus (kohdat värjättiin H E) ei havaittu toksikologisesti vaurioita maksa-, munuais-, maha, ohutsuoli, luuydin, keuhko, sydän, ja perna (Fig. 4).

histopatologinen tutkimus HepG2 ksenograftin kantavien hiirten ohjausyksikön ryhmä ja ryhmä hoidettiin DBDx. Ei patologisia muutoksia havaittiin maksassa, munuaisissa, mahalaukussa, suolistossa, luuydin, keuhko, sydän ja perna DBDx käsiteltyjen eläinten (H kasvutekijäreseptoreita kuten EGFR (EGF-reseptori), Flk1 (VEGF-reseptori 2); proteiinit, jotka liittyvät kasvainsolujen eloonjäämisen ja apoptoosin, kuten Bcl-2 ja surviviiniin; ja joitakin muita proteiineja, kuten NOS3. Tämän seurauksena kaksi proteiinia Flk1 ja NOS3 todettiin alas-säädellä DBDX-käsitellyssä ryhmässä (kuvio. 5).

Viisi kasvainkudoksen näytteitä kustakin ryhmästä hepatoma 22 (H22) siirrettyjen Kunming hiiriä käytettiin.

Seuraavaksi globaali proteiini ero keittosuolaliuokseen ja DBDx hoidetuissa ryhmissä verrattiin 2-DE ja MS. Tuumorikudoksista ihmisen maksasyöpä BEL-7402 ksenograftin kateenkorvattomissa hiirissä käytettiin. Noin 700-proteiinia täplät näkyvät kohti geeliä. Kuva. 6 osoitti edustaja proteiiniprofiili saatu 2-DE. Tilastollinen analyysi normalisoitu tilavuus sovitetun paikoista paljasti 33 proteiinitäplien jonka intensiteetti osoitti 3-kertainen ero suolaliuoksella ja DBDX hoidetuissa ryhmissä. Näiden proteiinien paikkoja, 17 ilmentyvät eri proteiineja tunnistettiin (taulukko 3). Näistä tunnuksilla, 12 olivat ainutlaatuisia kahteen ryhmään, 4 alassäädetty ja 1 säädellään ylöspäin DBDx saaneessa ryhmässä. Muut asiaa koskevat tiedot taulukossa 3 sisältyi NCBI-numerot, fold muuttunut, maskotti pisteet, teoreettisen ja kokeellisen molekyylipaino, teoreettisen ja kokeellisen pl ja järjestys kattavuutta.

erottamisen jälkeen 17 cm, pH 3-10 lineaarinen nauhat ensimmäisessä ulottuvuudessa ja 12% SDS-PAGE toisessa ulottuvuudessa, proteiinit värjättiin hopealla. A. Saline saaneessa ryhmässä. B. DBDx saaneessa ryhmässä. Proteiinitäplät merkitty karttoihin leikattiin irti geeleistä ja peräkkäin tunnistaa MS.

Sitten nämä tunnistaa proteiinit luokiteltiin mukaan biologisen prosessin ja signaalireitin käyttämällä PANTHER luokittelujärjestelmän. Analyysi biologisen prosessin osoittivat, että aineenvaihduntaa (40,6%) ja immuunijärjestelmän prosessi (12,5%) olivat pääasiassa vaikutti DBDx hoitoa. Muut biologinen prosessi vaikuttaa DBDx mukana cell viestintä, cellular prosessi, vastauksena ärsyke, järjestelmä prosessi, liikenne ja apoptoosin ja sukupolvi esiasteen aineenvaihduntatuotteiden ja energia (Fig. 7A). Analyysi solun signalointireittien osoitti, että angiogeneesi, VEGF-signalointireitin ja glykolyysin käsitti 42,9% signalointireittien vaikuttaa DBDx hoitoon (Fig. 7B). Muita vaikuttaa reittejä mukana apoptoosin signalointireitistä, endoteliini signalointireitistä, Huntingtonin tauti, interleukiini-signalointireitin, PI3 kinaasireittiä, Parkinsonin tauti, pyruvaattia aineenvaihduntaa, ja p38 MAPK-reitin.

Keskustelu

Drug yhdistelmiä käytetään yleisesti syövän hoidossa yli puolen vuosisadan ajan. Se on järkevää ja tehokasta strategiaa kasvattaa terapeuttista tehoa, kun taas vähentää myrkyllisyyttä ja voittaa vastustus. Tässä tutkimuksessa, ehdotimme kasvain mikroympäristön suuntautunut, monitoiminen lääkeyhdistelmä strategiaa, joka tähtää erittäin voimakas terapeuttinen teho

in vivo

. Kolminkertainen lääkeyhdistelmä, joka käsittää dipyridamoli, bestatiinia ja deksametasonin suunniteltiin ja sen terapeuttinen tehokkuus on vahvistettu. DBDx, kolminkertainen lääkeyhdistelmä, on ainutlaatuinen käsittäen alhaisen sytostaattien muut kuin perinteiset kemoterapeuttisten ja toteutuksessa merkittävästä terapeuttinen teho on hyvin siedetty annostasoilla. Yleensä tutkiminen terapeuttisen tehokkuuden

in vivo

kokeellisen kasvainten, erityisesti ihmisen syövän ksenograftien kateenkorvattomissa hiirissä, on erityisen tärkeää, että arvioinnin syöpälääkkeiden. Kuten on esitetty, DBDx on erittäin tehokas kasvua vastaan ​​ihmisen maksasolusyövän BEL-7402 ksenografti. Sen lisäksi vähentää kasvaimen kokoa huomattavasti, DBDx hoito aiheutti jopa istutettu kasvain kokonaan kadonnut 2 8 hiirestä.

On huomattava, DBDx näkyy laajakirjoinen antituumorivaikutus. Kun annos DBDX saavutti 484 mg /kg, joka on siedettävä annos, esto hinnat olivat jopa 90% kaikilla testatuilla ksenograftimalleissa, mukaan lukien ihmisen maksasyövän HepG2, keuhkoadenokarsinooma A549, keuhkosyöpä giant cell carcinoma PG, ja epidermoidikarsinooma A431 ksenograftit. Laajakirjoinen antituumorivaikutus tarkoittaa sitä, että DBDx voisi jotka toimivat pääasiassa kautta moduloimalla kasvain microenvironment; näin ollen se on suhteellisen riippumaton kasvaimen tyypistä. Lisäksi yhdistelmä 3 lääkkeitä, joilla on eri vaikutusmekanismit voivat myös tarjota multimodaalisten kattavuus laaja kasvaimia.

lääkeaineen yhdistelmiä, terapeuttinen toiminta ei ole riippuvainen ainoastaan ​​annoksen vahvuus, mutta myös annoksen suhde yhdistetyn komponentteja. Jotkut suhteet yhdistetään lääkkeet voivat olla synergistinen, kun taas muut suhteet saman aineet voivat olla additiivisia tai jopa antagonistisia [20]. Kaikessa testattuja yhdistelmiä, kolme aineet toimivat synergistisesti (CI: 0,2-0,5). Kuten tunnettua, synergistinen yhdistelmä voi lisätä terapeuttista tehoa klo siedettyjen ja hidastaa lääkeresistenssin kehittymisen [21]. On kiinnostava että kolme agentit DBDx yhdistelmä eivät ole tavanomaisia ​​sytotoksisia kemoterapeuttisia; Sen sijaan ne vaikuttavat lähinnä kasvain microenvironment. Siksi tämä monitoiminen lääkeyhdistelmä saattaa kyetä vähentämään syntymistä lääkeresistenssi.

Vaikka DBDx näyttää erittäin voimakkaita antituumorivaikutuksen tehosta

in vivo

, klonogeeniset määritys osoittaa, että tämä yhdistelmä ei näy sytotoksisiksi

in vitro

. Se osoittaa, että tuumorin kasvua DBDx

in vivo

ei pääosin luottaa tappaminen kasvainsolut suoraan; sitä vastoin DBDx voisi käyttää sen antituumorivaikutus etupäässä häiritsee kasvaimen microenvironment. Kuten raportoitu, dipyridamoli on aktiivinen estäjä nukleosidikuljetuksen. Bestatiinia voi kohdistaa aminopeptidaasi N ja estää kasvaimen angiogeneesiä [15]. Dexamethasone voi myös tukahduttaa angiogeneesiä [17]. Mekaanistetulle tutkimukset osoittivat, että DBDx alassäädetty ilmaus Flk1, reseptoria VEGF, ja NOS3, joka voi säädellä verisuonten toimintaa [22]. Sen lisäksi toimii kasvainangiogeneesissä, DBDx vaikuttaa myös immuunijärjestelmään ja tulehdus. Kuten on raportoitu, tulehdus on tärkeä rooli kasvainten synnyssä ja kehitykseen [23], [24]. Bestatiinia on laajalti käytetty immunomodulator vastaan ​​kasvain. Deksametasoni on anti-inflammatorinen lääkeaine. Tuore raportti osoittaa, että dipyridamoli merkittävästi vähentää immuunisolujen infiltraatio ja seerumin tulehduksellisten sytokiinien tasot hiirissä [9]. Vaikutukset DBDx kasvainten mikroympäristölle oli vielä todistaa 2-DE ja seuraava PANTHER analyysi. Luokittelu ilmentyvät eri proteiinien solun signalointireittejä paljasti, että DBDx vaikuttivat lähinnä angiogeneesi ja VEGF signalointireitin. Analyysi biologisen prosessin osoitti, että immuunijärjestelmä prosessi vaikutti.