Krooninen sairaus

tiivistelmä

Useat tutkimukset korostavat roolia tulehdusmarkkereiden verisuonitukosten sekä syövän. Kuitenkin, niiden yhteenlaskettu rooli syöpään liittyvä syvä laskimotukos (DVT) ja molekyylitason mekanismit, mukana sen patofysiologiaan, tarvitsee lisätutkimuksia. Esillä olevassa tutkimuksessa C-reaktiivisen proteiinin, interleukiini-6 (IL-6), tuumorinekroositekijä-α (TNF-α), interleukiini-1 (IL-1β), matriksimetalloproteaaseja-9 (MMP-9), verisuonten endoteelikasvutekijä (VEGF), kudostekijän (TF), fibrinogeenin ja liukoisen P-selektiinin, analysoitiin plasman ja monosyyttien näytettä 385 syöpäpotilailla, joista 64 oli samanaikaisesti vaikuttaa DVT (+). Kaikki nämä merkit olivat korkeammat syöpäpotilailla DVT + kuin ne DVT-. Niinpä huomattavasti korkeampi NF-kB vaikutus havaittiin syöpäpotilailla DVT + kuin DVT-. Merkittävä korrelaatio saadut plasmassa ja monosyyttien näytteitä havaittiin. NF-kB esto liittyi alentuneet kaikkien molekyylien sekä syövän DVT + ja DVT-. Edelleen osoittaa osallistumista NF-kB aktivaation edellä mainittujen molekyylien, käsittelimme monosyyteistä peräisin terveiltä luovuttajilta, joiden yhdistetyistä seerumeista syöpäpotilaista ja ilman DVT. Nämä koesarjaa edelleen ehdottaa merkittävää roolia joidenkin molekyylien säätelee NF-kB, ja havaitut syöpäpotilailla DVT. Meidän tiedot tukevat käsitystä, että NF-kB voidaan pitää terapeuttisena kohteena syöpäpotilaille, erityisesti monimutkaista DVT. Hoito NF-kB estäjät voivat edustaa mahdollista strategiaa ehkäistä tai vähentää DVT syöpäpotilailla.

Citation: Malaponte G, Signorelli SS, Bevelacqua V, Polesel J, Taborelli M, Guarneri C, et al. (2015) kohonneet NF-kB-Dependent Markers in Cancer-Associated Syvän laskimotromboosin. PLoS ONE 10 (7): e0132496. doi: 10,1371 /journal.pone.0132496

Editor: Yves St-Pierre, INRS, CANADA

vastaanotettu: 14 maaliskuu 2015; Hyväksytty: 15 Kesäkuu 2015; Julkaistu: 20 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Malaponte et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat vapaasti saatavilla paperi- ja tukeminen Information tiedostoja.

rahoitus: kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

suhteellinen riski syvä laskimotukos (DVT) on noin seitsemän kertaa suurempi syöpäpotilailla [1,2] viittaa kaksisuuntaisen korrelaatio verisuonitukoksen ja tulehdusta syöpä. Kemoterapia on yksi tärkeimmistä riskitekijöistä lisääntynyt riski DVT [3,4]. Tromboosi ja syöpä ovat sidoksissa lukuisat patofysiologista mekanismeja, jotka yleensä liittyvät isännän vaste syöpään. Nämä mekanismit sisältävät aktivointi hyytymisen ja fibrinolyyttisen järjestelmän, akuutin vaiheen reaktio, tulehdus, ja sytokiinien tuotanto [5]. Systeeminen aktivaatio hyytymisen jota esiintyy maligniteetti on hyvin tunnettu ja on kuvattu nimisenä Trousseau oireyhtymän [6,7]. Systeeminen tulehdus on voimakas protromboottisten ärsyke, joka johtaa ylössäätöä prokoagulanttitoiminnan tekijöistä, alas säätely antikoagulantteja ja eston fibrinolyyttinen aktiivisuus [8,9]. Krooninen tulehdus on usein liittyy lisääntynyt syöpäriski [10,11]. Rudolf Virchow osoitti leukosyyttien läsnäololle kasvaimet ja ehdotti, että kasvaimet syntyvät kohdissa, kroonisen tulehduksen ja tulehduksen välittäjäaineita, tehostamalla solujen proliferaatiota, voidaan käyttää kasvaimen promoottorit [12]. Tulehdussolujen, sytokiinien pahanlaatuisia kasvaimia vaikuttaa strooman microenvironment, mikä viittaa siihen, että tulehdus ja syöpään voidaan toisiinsa kautta angiogeenisen prosessin [13-15]. Tulehduksen aikana, angiogeneesi on usein sama kuin tulehduksellisten solujen, kuten neutrofiilien, monosyyttien /makrofagien, jotka erittävät sytokiinejä ja kasvutekijöitä [13,16,17]. On osoitettu, että useat välittäjäaineiden on kriittinen rooli tulehduksen, syövän ja tromboosi, kuten C-reaktiivinen proteiini, interleukiini-6 (IL-6) ja tuumorinekroositekijä-α (TNF-α), interleukiini-1β (IL-1β ) (tulehduksen), matriksimetalloproteaaseja-9 (MMP-9), verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF) (mikä angiogeneesi), kudostekijän (TF) ja fibrinogeeni (hyytymisaikojen) ja liukoisen P-selektiinin (merkintä verihiutaleiden aktivaation) . Inflammatoristen sytokiinien ylös-säädellä eri angiogeenisten tekijöiden, kuten VEGF: n ja MMP-9, verisuonten endoteelisoluissa, syöpäsolut, ja monosyyttien /makrofagien [18-35]. Monosyytit osallistua patologisia tulehdus- ja tromboosin kautta kyky syntetisoida TF ja ilmentävät P-selektiinin stimuloitaessa [36-38]. Kudostekijän (TF), joka on pääasiallinen solun aloitteentekijä veren hyytymisen, vaikuttaa kasvaimeen liittyvien patologisten prosessien, kuten liikahyytymiskykyyn, kasvaimen kasvun, angiogeneesin ja metastaasin [39-40]. Kiehtovan, kaikki nämä molekyylit säätelevät NF-kB [41,42]. Tämä on indusoituva transkriptiotekijä ohjataan signaalilla aktivoinnin porrastetusti. NF-kB säätelee useiden osallistuvien geenien tulehdusreaktioita, solusyklin etenemistä, apoptoosin estämisestä ja soluadheesion, mikä edistää kasvaimen angiogeneesiä, syövän synnyn ja syövän etenemistä. Ehkäisy ja hoito DVT syöpäpotilailla voivat vaikuttaa merkittävästi potilaan hoidon ennustetta ja elämänlaatua. Näin ollen, on olemassa tarve tunnistaa uusia bio-molekyylimarkkereita, jotka voivat tunnistaa syövän potilaille, joilla on suuri riski DVT. Vaikka useat tutkimukset tutkittu roolista eri biologiset merkkiaineet ja /tai sytokiinien syövän ja /tai verisuonitukos, ei aikaisemmissa tutkimuksissa on analysoitu kokonaan nämä NF-kB-säännelty markkereita, jotka puolestaan ​​säätelevät NF-kB itse syöpäpotilailla ja ilman tromboosi. Tunnistaminen Näiden merkkiaineiden voivat hyväksyä NF-kB houkuttelevana kohteena terapeuttiseen interventioon.

Tässä tutkimuksessa murto NF-kB-säännelty merkkiaineita on mitattu ääreisveren syöpäpotilaista ja ilman DVT . Lisäksi vaikutukset dehydroxymethylepoxyquinomicin (DHMEQ), NF-kB estäjä [43,44], arvioitiin osoittamaan suoraa roolia NF-kB-säännelty merkkiaineiden verisuonitukosten kehittämiseen keskuudessa syöpäpotilaita. Lisäksi tunnistaminen biomolekyylitason merkkiaineiden DVT syöpäpotilailla voi tukea merkitystä farmakologisen tromboosiprofylaksina.

Methods

Tutkimuskanta

Oheislaitteet verinäytteet kolmesta aiheista oli kerätty viimeisten 10 vuoden laitoksella Bio-Medical Sciences, University of Catania, Catania, Italia. Nämä ryhmät olivat: 64 syöpäpotilaat samanaikainen DVT (DVT +) (keski-ikä 64 ± 10 vuotta); 321 syöpäpotilasta joilla ei ole ollut DVT (DVT-) (keski-ikä 62 ± 9 vuotta); 100 tervettä verrokkia (keski-ikä 61 ± 12 vuotta), sovitettu sukupuolen ja iän mukaan (taulukko 1). Potilaat diagnosoitu vaikutti DVT perusteella ei pakkausta syvä laskimotukos alaraajojen mukaan doppler koetin ja /tai jonka läsnäolo heijastavaa mallia syvään suonet alaraajojen. DVT potilasta rekrytoitiin aikaan DVT esiintyminen. Ääreisveren näytteitä näistä potilaista saatiin ennen oletus mitään erityisiä antitromboottinen lääke. Lisätietoa tutkimuksesta annettiin potilaille. Kaikki potilaat antoivat kirjallisen suostumuksen ennen tutkimusta. Tutkimuksemme hyväksyi Catanian yliopiston eettisen komitean. Kaikki toimenpiteet tehtiin noudattaen esitettyjä periaatteita Helsingin julistuksen mukaisesti. Kaikki yksilöt tämän käsikirjoitus on antanut kirjallisen tietoon perustuva suostumus (kuten hahmoteltu PLoS suostumuslomakkeessa) osallistumaan tähän tutkimukseen. Potilaita hoidettiin tulehduskipulääkkeitä, statiinit ja syövän vastaisia ​​yhdisteitä, kuten, bevacizubam, talidomidi, lenalidomidi ja /tai sädehoitoa suljettiin pois. Muita poissulkukriteereitä sisältyvät: BMI 35 kg /m

2, vaikeita systeemisiä masennus, diabetes, dyslipidemioiden, verenpainetauti, kroonisiin tulehdussairauksiin, sydämen vajaatoiminta eri vaiheessa, lievä tai vaikea munuaisten vajaatoiminta (kreatiniini ≥ 2,0 mg /dl), pansytopenia ja uudempia kirurgisen toimenpiteen ( ≤ 3 kk). Laskimoverta kerättiin vähintään 3 kuukauden kuluttua viimeisestä syöpähoidon sekä syöpäpotilaiden DVT + ja DVT-.

Lyhenteet: DVT, syvä laskimotukos; BMI, painoindeksi.

Verenkeruu ja laboratoriomenetelmät

Verta kerättiin jokaisen potilaan ja terveisiin kontrolleihin piirretään pyrogeenittömään veriputkea kanssa ja ilman lisäaineita. Sitraatilla verihiutaleita plasma tehtiin käyttämällä kahta sentrifugia vaihetta: 5 min 4000 rpm ja 10 minuutin ajan 11000 rpm Useita eriä seerumia ja plasmaa säilytettiin -80 ° C: ssa. Verinäytteet käytettiin seuraavia analyysejä: 1) CRP, fibrinogeeni, IL-6, TNF-α, IL-1β: n, MMP-9, VEGF, TF antigeenin ja SP-selektiinin plasmassa; 2) monosvvteissä eristäminen. Plasman fibrinogeenipitoisuutta ja herkkä C-reaktiivinen proteiini mitattiin standardin tekniikoita käytetään Keskuslaboratorion Catania yliopistollisen sairaalan. IL-6, TNF-α, IL-1β: n, MMP-9, VEGF: n ja SP-selektiinin mitattiin entsyymi-immunologiset määritykset (ELISA-testit; R tiatsolyylisininen) ja Dimetyylisulfoksidi (DMSO) ostettiin Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA). Iscoven väliaineessa ja Polymixin B Gibco, Life Technologies Inc (Milano, Italia).

DHMEQ (dehydroxymethylepoxyquinomicin), syntetisoitiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [43], liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) pitoisuutena 10 ug /ml ja varastoitiin 20 ° C: ssa. Tämä kantaliuos laimennettiin kasvatusväliaineeseen lopulliseen konsentraatioon 0,1%. Agents. DHMEQ ystävällisesti toimitti Dr. Kazuo Umezawa, Soveltavan kemian, Faculty of Science and Technology, Keio University, Yokohama, Japani.

eristäminen ihmisen monosyyteistä

Perifeerisen veren mononukleaarisia soluja (PBMC) eristettiin sitrattua verestä syöpäpotilaiden DVT + ja DVT- ja terveillä verrokeilla Ficoll-Paque. Eristämiseksi monosyytit, PBMC sijoitettiin 2 tuntia viljelmässä levy, ja tarttumattomat solut poistettiin kolme muutosta lämmintä PBS: ää. Pure monosyyttejä sitten valita positiivisesti anti-CD14-päällystetyt magneettiset mikrohelmien (Mini MACS erotuspylväästä; Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Monosyytti puhtaus oli 98%, kuten arvioitiin virtaussytometrialla (tietoja ei esitetty). Solut yhdistettiin ja suspendoitiin uudelleen loppukonsentraatioon 1×10

6 solua /ml jäädyttää väliaineeseen, joka koostui 30% autologista sitraattiplasmassa, 60% Iscoven ja 10% DMSO: ta. Seuraavaksi solut jäädytettiin erinä 1 ml steriilissä kylmäpulloon (Greiner, Saksa) käyttäen standardia hallinnassa jäädyttämistä menettelyä ja sitten säilyttää nestetypessä.

hoito ja viljely Ihmisen monosyyttien

jälkeen sulatettu huoneenlämpötilassa, kylmäsäilytetyt monosyytit oli elinkelpoisuus 85%, kuten on esitetty trypaanisiniekskluusiolla. Ihmisen monosyyttejä analysoitiin NF-kB aktivaation, sytokiinien tuotantoa ja TF aktiivisuuden määritys (ks onnistua teksti). Lyhyesti, monosyyttejä (5 x 10

5 /ml) otettiin talteen, pestiin ja siirrostettiin kuoppiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää, L-glutamiinia (2 mM), penisilliiniä (100 IU /ml), streptomysiiniä (100 ug /ml), ja esikäsiteltiin DHMEQ (10 ug /ml) 2 tunnin ajan ja sen jälkeen inkuboitiin 24 tuntia. Seuraavaksi soluviljelmän supernatantit kerättiin kvantifiointiin sytokiinin proteiinin tasolla entsyymi-immunologinen määritys (ELISA). Endotoksiinikontaminaatio Soluviljelmien rutiininomaisesti ulkopuolelle kromogeenisen limulus Amebocyte lysaattimäärityksessä (Sigma). Lisäksi kaikki soluviljelmissä 10 ug /ml polymyksiini B: tä lisättiin neutraloimaan kaikki mahdolliset LPS saastumista.

ELISA aktiivisen NF-kB: n p65-alayksikön

mittauksessa NF-kB p65-alayksikön aktivoituminen tumauutteita valmistettiin 5×10

5 monosyytit, esikäsitelty eikä DHMEQ (10 ug /ml) 2 h ja sen jälkeen stimuloitiin 100 ng /ml LPS: ää halutun ajan, käyttäen Nuclear Extract Kit ( aktiivinen Motif, Rixensart, Belgia) mukaan valmistajan protokollaa. Tasot ydin- p65 pitoisuudet määritettiin herkällä ELISA-määritystä (TRANS-AM, Active Motif, Rixensart, Belgia).

Detection of TF aktiivisuuden monosyyteistä kromogeenisesti

solulysaateista aktiivisuus TF mitattiin actichrome1 TF aktiivisuus kit (American diagnostiset, Pfungstadt, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti. näytteitä inkuboitiin rinnakkain tekijä VII ja Spectrozyme FVIIa. TF-FVIIa: n kompleksin pilkkoo Spectrozyme FVIIa, kuten erittäin spesifinen kromogeenisen substraatin vapauttamiseksi paranitroanilin-kromoforin tietyn muutoksen absorption 405 nm: ssä. Tulokset ilmoitetaan pikomoolia litraa kohden (pM) peptidyyli aktiivisuus lipidoitunut TF pilkkomaan Spectrozyme FVIIa monimutkainen.

Serum-riippuvainen aktivaatio sytokiinien ja NF-kB monosyyteissä

Monosyytit (5×10

5) 25 terveiltä luovuttajilta viljeltiin 20 tunnin ajan väliaineessa (RPMI 1640), johon on joko 40% seerumia 64 syöpäpotilaiden DVT + ja 257 DVT- korkein sytokiinien plasmassa (≥ 75

persentiili) tai 40% seerumia 100 terveistä luovuttajista alhaisimman sytokiinien arvot (≤ 25

persentiili). Käsittelyä seerumin, 80μl seerumin kunkin syöpäpotilaan DVT + ja DVT- ja kustakin terveestä luovuttajasta lisättiin monosyyttien viljelyalustaan ​​välittömästi sulatuksen jälkeen. Solut käsiteltiin DHMEQ (10 ug /ml) 2 h, ja sen jälkeen niitä stimuloitiin 100 ng /ml LPS: ää halutun ajan. Hoito monosyyttien LPS käytettiin positiivisena kontrollina. LPS kokeita ei polymyksiini B lisättiin. Inkuboinnin jälkeen soluviljelysupernatantit kerättiin myös kvantifiointiin Sytokiiniproteiinin tason ja NF-kB aktivaation ELISA.

MTT-määritys

Effects of DHMEQ solujen elinkelpoisuus määritettiin 3- ( 4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyyli tetranatrium-bromidia (MTT) menetelmällä [45]. Monosyyttien (3×10

5) ympättiin 96-kuoppaisille levyille 48 tuntia sytostaattinen DHMEQ. Sarjalaimennoksia DHMEQ (2 ug /ml, 5 ug /ml, 10 ug /ml), muodostettiin ja lisättiin soluihin. Inkubaation jälkeen DHMEQ tai DMSO: ilmoitettuina pitoisuuksina ja ajankohtina. Solut käsiteltiin MTT-liuosta (1 mg /ml) 4 tunnin ajan mitattiin mikrolevylukijalla (Bio-Rad, Richmond, CA), jonka viite aallonpituudella 630 nm ja testi aallonpituudella 570 nm. Solujen elävyys ilmaistiin prosentteina DMSO-käsiteltyjen kontrollinäytteistä.

Tilastollinen analyysi

jatkuvia muuttujia, Ero keskimääräisessä välillä tutkimuksen ryhmien arvioitiin analysoimalla varianssianalyysillä (ANOVA, kun kyseessä on kolmen ryhmän) tai t-testi (kaksi ryhmää). Saat erillisen muuttujan ero jakautuminen opintoryhmiin arvioitiin läpi testin χ

2 testiä. Korrelaatio jatkuvia muuttujia arvioitiin läpi Spearmanin korrelaatiokertoimen

r

.

Tulokset

lähtötilanteessa ominaisuuksia tervettä verrokkia ja syöpäpotilaiden ja ilman DVT on esitetty taulukossa 1. merkittäviä eroja ei havaittu ryhmissä suhteen ikä, sukupuoli, tupakointi ja painoindeksi. Taajuus paikallisten syöpien oli samankaltainen syöpäpotilaiden ja ilman DVT sekä jakelu syövän tyyppi /site (taulukko 1).

biomarkkereiden pitoisuuksia plasmassa tulehduksen, angiogeneesi ja hyytyminen syöpäpotilailla DVT + ja DVT-

Mean pitoisuuksina plasmassa erilaisten biomarkkereiden, mukaan lukien tulehdus, angiogeneesi ja hyytymistä, analysoidaan kontrolliryhmässä ja syöpäpotilailla ja ilman DVT on esitetty taulukossa 2. verrattuna hallita ryhmään, suuremmat plasman CRP, fibrinogeenin, IL-6, TNF-α, IL-1β: n, MMP-9, VEGF, TF-antigeeni, ja SP-selektiinin havaittu syöpäpotilailla ja ilman DVT (P 0,01). Kuten odotettua, pitoisuus kaikkien merkkiaineiden laskimotukoksen + ryhmässä oli merkittävästi suurempi kuin vuonna DVT- (p 0,01) lukuun ottamatta, fibrinogeenin (p = 0,35). Korrelaatio kaikki merkit keskenään raportoidaan (S1 taulukko). Positiiviset korrelaatiot (