Krooninen sairaus

tiivistelmä

resveratrolin (RV) on luonnollinen osa punaviiniä ja viinirypäleitä, jonka on osoitettu olevan potentiaalinen chemopreventive ja syöpälääke. Kuitenkin molekyylitason mekanismit RV: n syöpälääkkeiden ja chemopreventive vaikutukset puutteellisesti. Tässä osoitamme, että RV hoito estää klonogeenisten kasvua ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin annoksesta riippuvaisella tavalla. Mielenkiintoista, kasvain-estävä vaikutus pieniannoksisen RV ei liittynyt mitään merkittäviä muutoksia ilmaus pilkotun PARP ja aktivoitu kaspaasi-3, mikä viittaa siihen, että matalan annoksen RV hoito voi estää kasvainsolujen kasvua kautta apoptoosin-riippumaton mekanismi. Myöhemmät tutkimukset osoittavat, että matalan annoksen RV hoito sai aikaan merkittävän kasvun vanhenemista liittyvän β-galaktosidaasi (SA-β-gal) värjäystä ja kohonnut ilmentyminen p53 ja p21 NSCLC-soluja. Lisäksi osoitamme, että RV-indusoidun suppression keuhkosyövän solujen kasvua liittyy lasku ilmentymisen EF1A. Nämä tulokset viittaavat siihen, että RV voi aiheuttaa sen syövän vastaisia ​​ja chemopreventive vaikutukset indusoimalla ennenaikaista vanhenemista. Mekanistisesti RV aiheuttama ennenaikainen vanhenemista korreloi lisääntyneeseen DNA kaksinkertainen katkeamisen (DSB: t) ja reaktiivisten happiradikaalien (ROS) tuotanto keuhkojen syöpäsoluja. Esto ROS tuotanto N-asetyylikysteiini (NAC) vaimentaa RV aiheuttama DNA DSB: t ja ennenaikaista vanhenemista. Lisäksi osoitamme, että RV hoito selvästi indusoi NAPDH oksidaasi-5 (Nox5) ilmentymistä sekä A549 ja H460-soluissa, mikä viittaa siihen, että RV voi kasvaa ROS sukupolvi keuhkosyövän soluihin säätelemällä Nox5 ilme. Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että pieni annos RV hoito estää keuhkosyövän solujen kasvua kautta aiemmin unappreciated mekanismi, eli induktio ennenaikaista vanhenemista kautta ROS-välitteisen DNA-vaurioita.

Citation: Luo H, Yang A, Schulte BA , Wargovich MJ, Wang GY (2013) Resveratrol Aiheuttaa ennenaikainen Vanheneminen Lung Cancer Cells kautta ROS-välitteisen DNA Damage. PLoS ONE 8 (3): e60065. doi: 10,1371 /journal.pone.0060065

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 marraskuu 2012; Hyväksytty: 20 helmikuu 2013; Julkaistu: 22 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Luo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain NIH apurahoja CA138313 ja HL106451 (www.nih.gov). Tätä työtä tuki myös osittain amerikkalainen Cancer Society Institutional Research Grant (# IRG-97-219-08). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia kiinnostusta ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on vastuussa enemmän syöpäkuolemista Yhdysvalloissa kuin yhteenlaskettu kuolleisuus paksusuolen, rinta- ja eturauhassyövän [1]. Vaikka uudempi kehittyneitä hoitomenetelmiä, 5 vuoden eloonjäämisaste on alle 16% ja ei ole muuttunut merkittävästi vuosikymmenten ajan [1], [2]. Tämä huono ennuste korostaa kiireellistä tarvetta kehittää uusia strategioita ehkäisyä ja tehokkaampaa hoitoa tätä tappavaa tautia. Luonnontuotteet (NP) ovat laajalti käytössä amerikkalaiset täydentäviä ja vaihtoehtoisia lääkkeitä (CAM) ehkäisyyn ja hoitoon eri ihmisen sairauksien kuten syöpien [3], [4]. Käyttö NP antituumoriaineina hallintaan ihmisen syövissä on houkutteleva ajatus, koska ne ovat helposti saatavilla ja tapahtuu vähän tai ei lainkaan myrkyllisyyttä [3], [5] – [7]. Resveratrolin (RV) on yksi tällainen NP: itä ja on osoitettu olevan sekä syöpälääkkeiden ja chemopreventive potentiaalit [3], [8] – [10]. Kuitenkin tarkka molekyylitason mekanismit RV: n chemopreventive ja syöpää ehkäisevistä vaikutuksista ei täysin ymmärretä. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli määritellä rooli ennenaikaista vanhenemista in RV aiheuttaman antituumorivaikutukset keuhkojen syöpäsoluja.

Cellular vanhenemista on pysyvä tila solukierron pysähtymisen jotka voivat laukaista erilaisia ​​jännityksiä lukien DNA-vaurioita, telomeerien lyhentäminen ja oksidatiivisen stressin [11] – [13]. Kaksi pääryhmään solun vanhenemisen ovat monistus vanhenemista ja stressin aiheuttama ennenaikainen vanhenemista (SIPS). Monistus vanhenemista kuvasi ensimmäisenä Hayflick ja Moorhead ihmisen fibroblasteissa jälkeen solut tehtiin laaja replikointi seurauksena sarja kulttuurin kohtien [14]. Tämän jälkeen, todettiin, että solut voivat myös läpikäydä SIPS vastauksena DNA: ta vaurioittavien aineiden, kuten ionisoivan säteilyn ja syöpälääkkeiden kemoterapeuttisia [11] – [13], [15]. Läpikäyvien solujen SIPS ovat morfologisesti erottaa replicatively senescent soluja ja niillä on monia ominaisuuksia katsoneet monistus vanhenemista, kuten lisääntynyt vanhenemista liittyy β-galaktosidaasi (SA-β-gal) aktiivisuus ja lisääntynyt p53 ja p21 ilmentymistä [11] – [13] [15] – [17]. Vaikka telomere lyhentäminen ajateltiin olevan suurin syy monistus vanhenemista, ennenaikainen vanhenemista voi tapahtua telomerase- ja telomeerien lyhenemistä-riippumaton mekanismi [18], [19]. Vanheneminen rajoittaa elinikää ja proliferatiivista kapasiteettia soluja, joten induktio vanhenemisen pidetään tärkeä mekanismi syövän ehkäisyä [20] – [22]. Vielä tärkeämpää on, kehittyvien todisteet ovat osoittaneet, että hoito aiheuttama vanhenemista on kriittinen mekanismi, jonka kautta monia syövän vastaisia ​​aineita, inhiboivat kasvainsolujen kasvua [11], [12], [23]. Mielenkiintoista on, että on osoitettu, että hoidon aiheuttama vanhenemista voidaan saavuttaa paljon pienemmillä annoksilla kemoterapian kuin ne, joita indusoi apoptoosia, mikä osoittaa, että korkeat annokset syöpälääke voi aiheuttaa apoptoosia kun taas alhainen hoidot indusoivat pääasiassa vanhenemista syöpäsoluja [12] . Verrattuna perinteisiin apoptoosin indusoiva strategioita, tämä pieni annos lähestymistapa voi merkittävästi vähentää sivuvaikutuksia syövän hoitoon ja siten parantaa elämänlaatua syöpäpotilaiden. Siksi on tärkeää ymmärtää, onko pienen annoksen RV voi estää keuhkosyöpää solujen kasvua vastaan ​​käynnistämällä ennenaikaista vanhenemista.

RV on myrkytöntä luonnollinen polyfenoliyhdistepitoisuus löytyy runsaasti viinirypäleitä, punaviinit, mulperinmarjat ja muut syötävät kasvit. Viimeaikaiset kliiniset kokeet ovat osoittaneet, että RV on hyvin siedetty ja suhteellisen turvallinen käytettäväksi ihmisillä [5] – [7]. RV on osoitettu estävän leviämisen erilaisia ​​syöpäsoluja kautta inaktivaatio eri solujen eloonjäämisreittejä lukien PI3-kinaasi /AKT [24]. RV: n on myös osoitettu olevan mahdollisia kemiallinen estoaktiivisuus useita karsinogeeni aiheuttama kasvain mallit mukaan lukien rinta-, suoli, maksa, ruokatorven ja paksusuolen [3], [25], [26]. Lisäksi on raportoitu, että RV hoito estää haiman syövän kasvua ja parantaa syöpää ehkäisevistä vaikutuksista gemsitabiinin mahdollisesti kautta tukahduttaminen NF-КB aktivointi ja alas-ekspressiota sääteleviä sykliini D1, COX-2, ICAM-1, MMP-9 ja surviviinille tuumorikudoksissa [27]. Vaikka aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että RV, suurina annoksina, voi estää syöpäsolujen lisääntymistä indusoimalla apoptoosin [28] – [31], on suuri haaste käyttää tätä CAM on, että konsentraatio RV vaaditaan apoptoosin indusoimiseksi kasvainsolut

in vitro

on liian suuri saavuttaa

in vivo

kliinisessä ympäristössä [5] – [7], [32]. Koska induktio vanhenemisen vaatii paljon alhaisempi pitoisuus syöpälääkkeiden ja siten tuottaa vähemmän sivuvaikutuksia [12], pyrimme tutkimaan, jos pienen annoksen RV hoito voi estää syöpäsolujen kasvua indusoimalla ennenaikaista vanhenemista. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että matalan annoksen RV käsittely johtaa merkittävään kasvuun vanhenemista liittyvän β-galaktosidaasi (SA-β-gal) värjäystä ja kohonnut p53 ja p21 ilmentymistä NSCLC-soluja, mikä viittaa siihen, että syövän vastainen vaikutus RV on pääosin peräisin induktioon Vanheneminen keuhkojen syöpäsoluja. Mekaaniset tutkimukset paljastavat, että RV aiheuttama vanhenemista liittyy lisääntynyt DNA DSB: t ja ROS tuotanto keuhkojen syöpäsoluja. Lisäksi meidän tiedot osoittavat myös, että inhibitio ROS tuotanto NAC vaimentaa RV aiheuttama DNA DSB: t ja ennenaikaista vanhenemista. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot osoittavat, että pieni annos RV hoito aiheuttaa ennenaikaista vanhenemista keuhkojen syöpäsoluja kautta ROS-välitteisen DNA-vaurioita, jotka korostavat merkittävästi vanhenemisen induktion RV: n syöpää ehkäisevistä vaikutuksista.

Tulokset

RV estää niiden kasvun keuhkosyövän soluja annoksesta riippuvaisella tavalla

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että suuremmat annokset RV hoito voi inhiboida kasvainsolujen apoptoosin indusoimiseksi [28] – [31], mutta suuri haaste tämän apoptoosin aiheuttavia strategia on, että pitoisuus vaaditaan apoptoosin kasvainsoluissa

in vitro

ei ole tavoitettavissa

in vivo

[5] – [7], [32]. Siksi on tärkeää määrittää, jos pienen annoksen RV hoito vaikuttaa syöpäsolujen kasvua. Tämän vuoksi käsittelimme A549 ja H460 keuhkosyövän soluja erilaisilla pienillä annoksilla RV (0-50 uM) tutkia jos RV hoito on vaikutusta siirtomaa muodostumista NSCLC soluja. Klonogeenisten selviytymisen määritykset osoittivat, että jopa niinkin alhainen kuin 10 uM RV hoito voi merkittävästi estää pesäkkeitä muodostavien aktiivisuus A549 ja H460-solujen (kuviot. 1A, 1B ja 1C). Tiedot osoittavat myös, että RV-indusoidun suppression pesäkemuodostuksen korreloi hyvin pitoisuudet RV, viittaa siihen, että RV hoito estää klonogeenisten kasvun NSCLC-solujen annoksesta riippuvalla tavalla.

(A) klonogeeninen selviytymisen määritykset osoittavat, että määrä syöpäsolujen johdettu pesäkkeet vähenee RV annoksen. (B) tulokset klonogeenisten määrityksiä normalisoida klonogeenisten eloonjäämistä ohjaus A549-soluja ja ne ilmaistaan% valvonnan. (C) tulokset klonogeenisten määrityksiä normalisoida klonogeenisten eloonjäämistä ohjaus H460-soluja ja ne ilmaistaan% valvonnan. **,

p

0,01 vs. kontrolli.

Matala annos RV estää keuhkosyövän solujen kasvua kautta apoptoosin-riippumaton mekanismi

Vaikka se on ollut osoittaneet, että suurempia annoksia (100-200 uM) RV hoito voi indusoida apoptoosia kasvainsoluissa [28] – [31], se on tuntematon, jos alhaisen annoksen RV tukahduttaa kasvua keuhkosyövän solujen läpi apoptoosin. Koska aktivoitu kaspaasi-3 ja halkaistut PARP ovat hyvin dokumentoituja mittauksia apoptoosin [33], [34], tutkimme jos pieniannoksisen RV hoito on vaikutusta ilmaisun aktivoitujen kaspaasi-3 ja halkaistut PARP A549 ja H460-soluissa. Kuten kuvassa 2, Western blotting tietojen mukaan pieni annos RV hoito ei aiheuta merkittäviä muutoksia ilmaus pilkotun PARP ja aktivoitu kaspaasi-3 joko A549- tai H460-soluissa. Sitä vastoin kamptotesiini (CPT) käsittely johti voimakas kasvu pilkotun PARP ja aktivoitu kaspaasi-3: n ekspressio sekä A549 ja H460-solujen (kuviot. 2A ja 2B). Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että matalan annoksen RV estää keuhkosyöpä solun kasvun kautta apoptoosia riippumaton mekanismi.

(A) Western blot-määritykset suoritettiin ekspression määrittämiseksi aktivoidun kaspaasin 3 ja pilkottiin PARP A549-soluja. Aktiini käytettiin latauskontrollina. (B) Western blot-määritykset suoritettiin ekspression määrittämiseksi aktivoidun kaspaasin 3 ja pilkottiin PARP H460-soluissa. Aktiini käytettiin latauskontrollina.

RV indusoi ennenaikaisen vanhenemisen keuhkosyövän soluja

On ehdotettu, että induktio ennenaikaisen vanhenemisen on tärkeä mekanismi, jonka avulla ionisoivan säteilyn ja monet kemoterapeuttiset aineet saavat aikaan syöpää ehkäisevistä vaikutuksista [11] – [13], [15], [17], [23]. Niinpä tarkoituksena oli tarkastella, jos pienen annoksen RV hoito indusoi ennenaikaisen vanhenemisen merkkejä in NSCLC soluissa. Koska lisääntynyt SA-β-gal aktiivisuus on vakiintunut biomarkkereiden vanhenemisen [16], tutkimme jos pieniannoksisen RV hoito indusoi ennenaikaisen vanhenemisen merkkejä A549 ja H460-soluissa SA-β-gal värjäys. Kuten on esitetty kuviossa 3A, tulokset osoittavat, että määrä SA-β-gal-positiiviset senescent solujen lisääntyy selvästi RV-käsiteltyjen versus kontrolli A549 ja H460-soluja. Lisäksi prosenttiosuus SA-β-gal-positiivisten solujen kasvaa annoksen RV, viittaa siihen, että RV hoito indusoi ennenaikaisen vanhenemisen keuhkosyövän soluissa annoksesta riippuvalla tavalla (kuviot. 3B ja 3C).

(A) SA-β-gal värjäys kasvoi RV annoksia sekä A549-soluja (ylempi paneeli) ja H460-soluissa (alempi kuva). (B) osuus SA-β-gal-positiiviset senescent solujen RV-käsiteltyjen ja kontrolli A549-soluja on esitetty keskiarvona ± SEM. (C) osuus SA-β-gal positiivisia senescent solujen RV-käsiteltyjen ja kontrolli H460-solujen esitetään keskiarvona ± SEM. (D) Western blot-määritykset suoritettiin määrittämiseksi p53: n, p21 ja EF1A A549-soluissa. Aktiini käytettiin latauskontrollina. (E) Western blot-määritykset suoritettiin määrittämiseksi p53: n, p21 ja EF1A H460-soluissa. Aktiini käytettiin latauskontrollina. *,

p

0,05 vs. kontrolli; **,

p

0,001 vs. kontrolli.

tutki myös ekspressiotasot p53 ja p21, kaksi tärkeää molekyylejä säätelyyn osallistuvan vanhenemisen [12], [15], [17], [35] ja RV-käsiteltyjen NSCLC soluissa. Western blotting tiedot osoittivat, että ekspressiotasot p53 ja p21 lisättiin merkittävästi RV-käsitellyissä soluissa verrattuna ohjaus A549 ja H460-solut (kuviot. 3D ja 3E). Nämä tulokset viittaavat siihen, että p53-p21-reitin osallistuu RV aiheuttaman ennenaikaisen vanhenemisen merkkejä keuhkojen syöpäsoluja. Mielenkiintoista, meidän tiedot osoittavat myös, että RV hoito merkitsevästi alas-säätelee ilmentymistä EF1A A549 ja H460-solut (kuviot. 3D ja 3E), mikä viittaa siihen, että EF1A voi olla tärkeä rooli säätelyssä RV aiheuttaman ennenaikaisen vanhenemisen merkkejä in NSCLC soluissa.

RV hoito aiheuttaa DNA-vaurioita ja lisää ROS tuotanto keuhkosyöpäsoluissa

Monet kemoterapeuttiset aineet ja säteily tappaa kasvainsoluja indusoimalla DNA-vaurioita. Fosforyloitua H2AX (γH2AX) on vankka merkkiaine DNA DSB: t [36]. Sen määrittämiseksi, DNA-vaurioita myötävaikuttaa RV aiheuttamaa syöpää ehkäisevistä vaikutuksista, suoritimme γH2AX pesäkkeitä määrityksiä tutkia jos RV hoito aiheuttaa DNA DSB: t keuhkojen syöpäsoluja. Kuten kuviossa 4 on esitetty, meidän tiedot osoittavat, että RV käsittely johtaa merkittävään kasvuun muodostumista γH2AX pesäkkeitä sekä A549 ja H460-solujen (kuviot. 4A, 4B ja 4C). Koska muodostumista γH2AX pesäkkeitä on tärkeä korvike DNA DSB: t [36], nämä tulokset osoittavat ensimmäistä kertaa, että syövänvastainen vaikutus RV johtuu ainakin osittain RV aiheuttaman DNA-vaurioita NSCLC soluissa.

(A) DNA: n DSB: t määritettiin γH2AX immunofluoresenssimikroskopian avulla kuten aiemmin on kuvattu (16). Edustavia immuunifluoresenssivasta kuvia γH2AX pesäkkeitä in RV-käsiteltyjen A549 ja H460-soluissa on esitetty. (B) osuus γH2AX pesäkkeitä positiivisten solujen RV-käsiteltyjen A549-solut on esitetty keskiarvona ± SEM. (C) osuus γH2AX pesäkkeitä positiivisten solujen RV-käsiteltyjen H460-soluissa esitetään keskiarvona ± SEM. (D) tasot ROS mitattiin DCF-DA värjäys ja virtaussytometria analysoidaan 24 tunnin kuluttua RV hoidon. Tasot ROS RV-käsiteltyjen A549-soluja esitetään kertainen muutos pitoisuuksiin verrattuna hallinnassa soluissa. (E) tasot ROS RV-käsiteltyjen H460 soluja esitetään kertainen muutos pitoisuuksiin verrattuna hallinnassa soluissa. *,

p

0,05 vs. kontrolli; **,

p

0,01 vs. kontrolli.

ja muut ovat osoittaneet, että ROS on ratkaiseva merkitys välittämisessä genotoksisia stressin aiheuttama DNA-vaurioita [37], [ ,,,0],38]. Siksi me arveltu, että RV voi aiheuttaa DNA DSB: t kautta lisääntynyt ROS tuotantoa NSCLC soluissa. Tämän hypoteesin testaamiseksi, tutkimme jos RV hoito on vaikutusta ROS tuotanto keuhkojen syöpäsoluja. DCF-DA värjäys ja virtaussytometria määritykset osoittivat, että tasot ROS oli selvästi lisääntynyt RV-käsiteltyjen A549 ja H460 soluja verrattiin kontrolli solujen (kuviot. 4D ja 4E). Nämä tulokset viittaavat siihen, että RV voivat aiheuttaa keuhkosyöpäsolua ennenaikaista vanhenemista kautta ROS-välitteisen DNA-vaurioita.

NAC vaimentaa RV aiheuttaman DNA-vaurioita ja ennenaikaisia ​​vanhenemisen keuhko- syöpäsoluja

Vaikka tiedot ovat osoittaneet että RV aiheuttama DNA-vaurio liittyy lisääntynyt ROS tuotantoa NSCLC soluissa (Kuva. 4), on vielä määrittelemättä, jos esto ROS tuotanto käyttäen antioksidantit voivat estää RV aiheuttamaa DNA-vaurioita ja ennenaikaisia ​​vanhenemista. Tätä varten, me esi-inkuboitiin solujen kanssa NAC ennen RV käsittelyä sen määrittämiseksi, NAC voi vaimentaa RV-indusoidun DNA-DSB: t ja ennenaikaista vanhenemista keuhkojen syöpäsoluja. Kuten on esitetty kuviossa 5A, meidän tiedot osoittavat, että esikäsittely NAC inhiboi merkittävästi muodostumista RV-indusoidun γH2AX pesäkkeitä A549 ja H460-soluja. Lisäksi SA-β-gal-värjäyksen tulokset osoittavat, että prosenttiosuus RV aiheuttaman ennenaikaisen senescent vähenee huomattavasti NAC-käsitellyissä soluissa (kuviot. 5D ja 5E). Yhdessä nämä havainnot tukevat vahvasti hypoteesia, että RV indusoi keuhkosyöpäsolua ennenaikaista vanhenemista kautta ROS-välitteisen DNA-vaurioita.

(A) DNA: n DSB: t määritettiin γH2AX immunofluoresenssimikroskopian avulla kuten aiemmin on kuvattu (16). Edustavia immuunifluoresenssivasta kuvia γH2AX pesäkkeitä A549 ja H460-soluissa on esitetty. (B) esto ROS NAC (5 mM) vähentää RV (30 uM) aiheuttaman γH2AX pesäkkeitä A549-soluja. (C) esto ROS NAC (5 mM) vähentää RV (30 uM) aiheuttaman γH2AX pesäkkeitä H460-soluissa. (D) esto ROS NAC vaimentaa RV aiheuttaman ennenaikaisen vanhenemisen merkkejä A549-soluissa. (E) esto ROS NAC vaimentaa RV aiheuttamaa ennenaikaista vanhenemista H460-soluissa. **,

p

0,001 vs. kontrolli.

#

p

0,01 vs. RV.

RV indusoi Nox5 ilmentyminen keuhkosyöpäsoluissa

Seuraavaksi pyrittiin määrittämään mekanismien jolla RV indusoi ROS sukupolvi syöpäsoluissa. Kerrottiin, että lisääntynyt solunsisäinen syklinen AMP (cAMP) voi myötävaikuttaa mitokondrioiden ROS kertymistä [39]. Mielenkiintoista, tuoreessa tutkimuksessa Park et al. on osoittanut, että RV hoito lisää cAMP-tasoja hiiren C2C12-soluissa [40]. Sen määrittämiseksi, RV muuttaa cAMP tasoja ja vuorostaan ​​indusoi ROS sukupolvi keuhkosyöpäsoluissa Havaitsimme cAMP tasot A549 ja H460-solujen jälkeen eri tekee RV hoitoa. YVA Tulokset osoittavat, että RV hoito ei ole merkittävää vaikutusta cAMP tasoja A549-soluja (kuvio S1A). Enemmän kiinnostavaa, tiedot osoittavat, että RV estää cAMP-tasoja H460-soluissa (kuvio S1B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että cAMP ei voi olla avainasemassa välittämisessä RV aiheuttaman ROS sukupolvi keuhkojen syöpäsoluja.

NADPH oksidaasien (Noxs) ovat perheen transmembraanisen entsyymejä, jotka tuottavat superoksidi ja muita ROS [41] . Ymmärtääkseen paremmin, kuinka RV indusoi ROS sukupolvi syöpäsoluissa, tutkimme jos RV hoito on vaikutusta ilmaus Nox1, Nox2, Nox3, Nox4 ja Nox5 in NSCLC soluissa. Reaaliaikainen RT-PCR-tulokset viittaavat siihen, että Nox1, 2 ja 5 on runsaasti ilmaistaan ​​sekä A549 ja H460-soluissa, kun taas NOx: 3 ja 4 ovat tuskin havaittavissa keuhkosyövän soluja (kuvio S2). Yllättäen meidän tietojen mukaan RV käsittely valikoivasti kasvattaa Nox5 ilmentymistä sekä A549 ja H460-solut (kuviot. 6A ja 6C), mikä viittaa siihen, että RV aiheuttama ROS sukupolvi syöpäsoluissa todennäköisesti johtuu lisääntyneestä Nox5 ilme. Koska yhtä tärkeää roolia antioksidantti entsyymejä, kuten mitokondrioiden (SOD) ja tioredoksiini (TXN) moduloinnissa solunsisäisten ROS tasapaino [42], päätimme selvittää, RV hoito vaikuttaa ilmaus SOD ja TXN keuhkojen syöpäsoluja. Reaaliaikaisen PCR tiedot osoittavat, että RV käsittely aiheuttaa vain lievää kasvua (alle 2-kertaisesti) SOD2 ilmentyminen A549-soluja, mutta sillä ei ole vaikutusta ilmaisun SOD1, SOD2 ja TXN mRNA H460-soluissa (kuviot. 6B ja 6D). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että RV voi aiheuttaa ROS syöpäsoluja kautta säätelystä Nox5 ekspressiota.

(A) Soluja käsiteltiin 50 uM RV tai DMSO: ta vehikkelikontrollina. Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun RV käsittelyn ekspressiotasot Nox1, Nox2, ja Nox5 mRNA: t määritettiin käyttäen reaaliaikaista RT-PCR: llä. (B) ekspressio tasot SOD1, SOD2 ja TXN A549-solut määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä. (C) ilmentyminen tasolla Nox1, Nox2, ja Nox5 H460-soluissa esitetään kertainen muutos (keskiarvo ± SEM). (D) ilmentyminen tasolla SOD1, SOD2 ja TXN H460-soluissa esitetään. **,

p

0,001 vs. kontrolli.

Keskustelu

Cellular vanhenemista on pysyvä tila solukierron pysähtymisen joka voi laukaista erilaisia jännityksiä lukien DNA-vaurioita, telomeerien lyhentäminen ja oksidatiivisen stressin. Vanheneminen rajoittaa elinikää ja proliferatiivista kapasiteettia soluja, joten induktio vanhenemisen pidetään tärkeä mekanismi syövän ehkäisyä [20] – [22]. Vielä tärkeämpää on, yhä enemmän näyttöä on osoittanut, että hoito aiheuttama vanhenemista on kriittinen vaikutusmekanismi monien kemoterapeuttisten aineiden ja sädehoitoa [11], [12], [15], [17], [23]. Kuitenkin osuus Vanheneminen induktion RV: n syöpää ehkäisevistä ja chemopreventive vaikutuksia ei ole hyvin selvitetty. Täällä voimme tarjota kokeelliset tulokset osoittavat, että pieni annos RV hoito estää niiden kasvun keuhkosyövän solujen kautta apoptoosin-riippumaton mekanismi. Tulokset paljastavat, että RV voi aiheuttaa sen syövän vastaisia ​​ja chemopreventive toiminnan kautta induktion Vanheneminen syöpäsoluissa. Yhdenmukainen havaintojemme Rusin et al. kertoi myös, että RV hoito indusoi vanhenemista kaltainen fenotyyppi syöpäsoluissa [43]. Tämä on merkittävä havainto, koska induktio vanhenemisen, toisin kuin apoptoosiin, vaatii paljon alhaisempi pitoisuus RV, mikä viittaa siihen, RV voi olla kliinisesti käyttökelpoista. Lisäksi nämä tutkimukset korostettaisiin Vanheneminen induktion välittämisessä RV: n chemopreventive ja syöpää ehkäisevistä vaikutuksista.

On vakiintunut, että induktio DNA-vaurioiden on keskeinen mekanismi, jonka kautta monet syöpälääkkeiden kuten ionisoiva säteily tappaa kasvainsoluja [13], [15], [38], [44]. Erityyppisten DNA-vaurion, DNA DSB: t ovat kaikkein sytotoksisia, koska niiden suuren mahdollisesti aiheuttaa solukuoleman ja /tai solusyklin pysähtymiseen. Siten lisääntynyt kapasiteetti DNA-vaurioiden korjaus kasvainsoluissa ajateltiin olevan tärkeä tekijä terapia-vastavoimana syöpähoitoihin [45]. Mielenkiintoista on, että on osoitettu, että monet DNA: ta vaurioittavien aineiden, kuten ionisoivan säteilyn voi aiheuttaa DNA-vaurion välittämää ennenaikaista vanhenemista syöpäsoluissa, mikä viittaa siihen, että näiden terapeuttisten aineiden niillä voi olla syöpää ehkäisevistä vaikutuksista kautta DNA-vaurioita-välitteisen ennenaikaista vanhenemista [13], [ ,,,0],15]. Vaikka tiedot ovat osoittaneet, että RV indusoi ennenaikaisen vanhenemisen merkkejä keuhkojen syöpäsoluja annosriippuvaisesti, se oli suurelta osin tuntemattomia, jos DNA-vaurio on osallisena RV aiheuttaman vanhenemisen kasvainsoluissa. Tutkimus paljasti, että γH2AX pesäkkeitä, tärkeä korvike DNA DSB: t, olivat selvästi lisääntynyt RV-käsiteltyjen NSCLC soluja verrattuna kontrolli soluihin. Nämä tiedot viittaavat siihen, että DNA-vaurioita aiheuttama ennenaikainen Vanheneminen voi myötävaikuttaa syöpää ehkäisevistä vaikutuksista RV. Yhdenmukainen havaintomme, todettiin, että RV voi aiheuttaa plasmidi-DNA taukoja, kun läsnä on Cu (II) ja Hapettavissa olosuhteissa [46]. Nämä tulokset tukevat hypoteesia, että pieni annos RV hoito estää kasvua keuhkosyövän soluihin DNA-vaurion aiheuttaman ennenaikaisen vanhenemisen merkkejä.

aktivointi p53-p21-reitin DNA-vaurioita on osoitettu olevan kriittinen mekanismi taustalla SIPS [12], [15], [17], [18]. Tässä osoitamme, että RV aiheuttama ennenaikainen Vanheneminen liittyy lisääntynyt p53 ja p21 NSCLC soluissa, mikä viittaa siihen, että aktivointi p53-p21-reitin voi olla tärkeä rooli moduloimaan RV aiheuttaman vanhenemisen merkkejä keuhkojen syöpäsoluja. Vielä tärkeämpää on, se todettiin myös, että RV aiheuttama vanhenemista korreloi hyvin merkittävä lasku EF1A ilmaisun A549 ja H460-soluissa. Nämä uudet havainnot osoittavat, ensimmäistä kertaa, että alas-säätely EF1A on mukana RV aiheuttaman ennenaikaisen vanhenemisen merkkejä keuhkojen syöpäsoluja. Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, tuore tutkimus on ehdottanut, että vähentynyt ilmentyminen EF1A on potentiaalinen biomarkkereiden ennenaikaisen vanhenemisen [47]. Kuitenkin lisätutkimuksia tarvitaan määritellä tarkkaa roolia EF1A moduloinnissa RV aiheuttaman ennenaikaisen vanhenemisen merkkejä syöpäsoluissa.

Monet syöpälääkkeiden ja ionisoivan säteilyn tuhoamaan kasvainsoluja pitkälti sukupolven ROS [48]. Lisäksi lisääntynyt ROS voi laukaista oksidatiivisen DNA-vaurioita ja aiheuttaa DNA DSB: t, mikä johtaa ennenaikaiseen vanhenemiseen [37]. Voit selvittää roolin ROS RV aiheuttaman ennenaikaisen vanhenemisen merkkejä keuhkojen syöpäsoluja, tutkimme tasot ROS RV-käsiteltyjen A549 ja H460-soluissa käyttäen DCF-DA värjäys ja virtaussytometria-analyyseissä. Tiedot osoittavat, että RV-indusoitu vanhenemista liittyy lisääntynyt ROS: n ja DNA DSB: t keuhko- syöpäsoluja, mikä viittaa siihen, että RV voi aiheuttaa ennenaikaista vanhenemista keuhkosyövän soluihin ROS-välitteisen DNA-vaurioita. Tärkeä osuus ROS RV aiheuttaman DNA-vaurioita ja ennenaikaisia ​​vanhenemisen varmistettiin lisäksi havainnot, että esto ROS tuotanto NAC vaimentaa RV aiheuttaman DNA-vaurioita ja vanhenemista in NSCLC soluissa. Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, esihapetinta vaikutus RV havaittiin myös U937 leukemiasolujen ja leimasi ehtyminen GSH ja kasvu ROS tuotanto [49]. Lisäksi aiemman selvityksen Hadi ja työtoverit osoittivat myös, että RV voisi lisätä ROS sukupolvi ja ROS aiheuttaman DNA-vaurioita ihmisen perifeerisillä lymfosyyteillä [50], [51]. Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että pieni annos RV estää niiden kasvun keuhkosyövän soluja vastaan ​​käynnistämällä vanhenemista kautta ROS-välitteisen DNA-vaurioita.

On syytä huomata, että on olemassa todisteita siitä, että RV voi toimia ROS scavenger normaaleissa soluissa suojaamaan ionisoivan säteilyn aiheuttamaa oksidatiivista stressiä ja kudosvaurioiden [52], mikä viittaa siihen, että RV voi olla ero vaikutuksia ROS tuotanto normaaleissa verrattuna syöpäsoluja. Ottaen huomioon, että poikkeava redoksisysteemien havaitaan usein monissa kasvainsoluissa [48], [53], [54], on mahdollista, että RV voi selektiivisesti estää syöpäsolujen kasvua, joilla on vähän tai ei lainkaan toksisuutta normaaleille soluille, koska niiden ero redox status. Suostumuksella tämän hypoteesin, tuloksemme osoittavat, että RV hoito ei ole merkittävää vaikutusta ilmaisun SOD1, SOD2 ja TXN H460 keuhkosyövän soluja, vaikka on raportoitu, että RV voisi aiheuttaa merkittävän (yli 6-kertainen) nousu SOD2 ilmentyminen normaaleissa soluissa [55]. Vielä tärkeämpää on, tutkimuksemme osoittavat ensimmäistä kertaa, että RV valikoivasti kasvattaa Nox5 ilmentymistä NSCLC soluissa, mikä viittaa siihen, että RV voi aiheuttaa ROS sukupolvi syöpäsoluja kautta upregulating Nox5 ilme.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

resveratrolin (Trans-3, 4 ’, 5-trihydroxystilnene) ja kaikki muut kemikaalit hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO). Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM) ja muita elatusaineita saatiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Kanin anti-humaani-p53-vasta-ainetta ja kanin anti-humaani EF1A monoklonaalinen vasta-aine hankittiin Cell Signaling (Danvers, MA). Hiiren anti-ihmis-p21 monoklonaalinen vasta-aine saatiin Santa Cruz Biotechnology. Monoklonaaliset β-aktiini-vasta ostettiin Sigma. Vanhenemista liittyvä β-galaktosidaasi (SA-β-gal) -värjäyspakkausta ostettiin Cell Signaling. Hiiren anti-fosfo-histoni H2AX (γH2AX) monoklonaalinen vasta-aine hankittiin Millipore (Bedford, MA). TRIzol reagenssia ja SuperScript III ensimmäisen stand -synteesijärjestelmässä ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Syklisen AMP (cAMP) EIA kit hankittiin Cayman Chemical (Ann Arbor, MI).

Solulinjat ja kulttuuri

Ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinjat A549 ja H460 hankittiin American Type Culture Collection. A549-soluja viljeltiin DMEM-alustassa, joka sisälsi 10% FBS: ää, 2 mM L-glutamiinia ja 100 mikrogrammaa /ml penisilliini-streptomysiiniä (Invitrogen). H460-soluja kasvatettiin RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää, 2 mM L-glutamiinia ja 100 mikrogrammaa /ml penisilliini-streptomysiiniä (Invitrogen).

klonogeeninen -eloonjäämiskoe

klonogeeninen määrityksissä olivat suoritetaan vaikutusten määrittämiseksi RV hoidon pesäkkeitä muodostavaa kykyä NSCLC-soluja. Lyhyesti, A549 ja H460 keuhkosyövän soluja viljeltiin alhainen tiheys, kun läsnä on eri pitoisuuksia RV tai DMSO: ta vehikkelikontrollina 60 mm astiat 10-12päivä muodostumisen sallimiseksi solujen pesäkkeitä. Pesäkkeet kiinnitettiin ja värjättiin 0,5% kristallivioletilla (Sigma) metanolissa 30 minuutin ajan. Pesäkkeiden lukumäärä (≥50 solua) pisteytettiin käyttäen mikroskopia.

Vanheneminen liittyvä β-galaktosidaasi (SA-β-gal) värjäys

in situ värjäys SA-β-gal- suoritettiin käyttäen vanhenemista β-galaktosidaasi-värjäykseen tarkoitettua reagenssipakkausta (Cell Signaling), kuten aiemmin on kuvattu [56].

Western blotting -analyysi

A549 ja H460-soluja käsiteltiin eri annoksilla RV tai DMSO: ta, kuten ohjaus. Yhteensä solujen proteiinit valmistettiin 24 tunnin käsittelyn jälkeen käyttäen soluhajotuspuskurin (Cell Signaling), johon on cocktail proteinaasi-inhibiittorit (Sigma). Western blotting -analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [56]. Lyhyesti viisikymmentä mikrogrammaa proteiinia näytteet erotettiin 10%: Mini-Protean tgx geelit (Bio-Rad) ja siirrettiin 0,2 jiM PVDF-kalvolle (Millipore). Blotit blokattiin 5% rasvatonta maitoa 1-2 tuntia huoneenlämpötilassa ja sen jälkeen testattiin primaarisilla vasta-aineilla ja inkuboidaan 4 ° C: ssa yön yli. Sen jälkeen kun oli pesty TBS-T, blotteja inkuboitiin asianmukaisten HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Proteiiniviivat tunnistettiin käyttämällä ECL Plus Western Blotting Detection System (GE Healthcare Life Science).

Immunofluoresenssianalyysi mikroskooppinen analyysi γH2AX pesäkkeitä

Soluja viljeltiin 4-kaivokammion liukuu yön yli ja seuraavana päivä hoidettiin RV tai DMSO (ajoneuvon hallinnan). Lopussa halutun hoitoja kertaa, solut kiinnitettiin jääkylmällä 4% paraformaldehydillä 10 minuutin ajan ja pestiin kahdesti PBS: llä. Sitten solut läpäiseviksi 0,2% Triton X-100 /PBS: llä jään päällä 10 minuuttia. Objektilasit blokattiin 5% normaalia vuohen seerumia, 30 min ajan ennen inkubointia hiiren anti-fosfo H2AX (S139) monoklonaalinen vasta-aine 2 tuntia huoneenlämpötilassa tai yön yli 4 ° C: ssa.