Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Cub ja Sushi Useiden verkkotunnusten 1 (CSMD1) geeni, joka sijaitsee lyhyen varren kromosomin 8, koodaa tyypin I transmembraaniproteiinia, jonka tehtävänä on tällä hetkellä tiedetä. CSMD1 ilme usein menetetään paljon epiteelisyövissä. Tavoitteena oli luonnehtia välisiä suhteita CSMD1 somaattisten mutaatioiden alleeli epätasapaino, DNA: n metylaatio, ja kliinisiä piirteitä peräsuolen syöpäpotilailla.

Methods

Sekvensoimme CSMD1 koodaavat alueet 54 Kolorektaalituumorien käyttämällä 454FLX pyrosekvensointi alustan kysellä 72 amplikoneja, jotka kattavat koko koodaavan sekvenssin. Käytimme heterotsygoottinen SNP-alleelin suhteet useilla CSMD1 loci määrittää alleeliset tasapaino ja päättelevät Heterotsygotian menetys. Lopuksi suoritetaan metylaatiospesifistä PCR 76 Kolorektaalituumorien määrittämiseksi DNA metylaatio tilan CSMD1 ja tunnettujen metylaation tavoitteet ALX4, RUNX3, NEUROG1, ja CDKN2A.

Tulokset

Käyttämällä 454FLX sekvensointi ja vahvistaa jossa Sanger sekvensointi, 16 CSMD1 somaattiset mutaatiot tunnistettiin 6 54 Kolorektaalituumorien (11%). Nonsynonymous on synonyymi mutaation suhde 16 somaattisista mutaatioista oli 15:1, suhde huomattavasti korkeampi kuin odotettu 2:01 suhde (p = 0,014). Tämä suhde osoittaa läsnäolon positiivinen valinta mutaatioita CSMD1 proteiinisekvenssin. CSMD1 alleelinen epätasapaino oli läsnä 19 37 informatiivinen tapauksista (56%). Potilaat, joilla on alleelinen epätasapaino ja CSMD1 mutaatiot olivat huomattavasti nuorempia (keski-ikä, 41 v) kuin ilman somaattisia mutaatioita (keski-ikä 68 vuotta). Suurin kasvaimia metyloitiin yhden tai useamman CpG-lokuksen sisällä CSMD1 koodaavan sekvenssin, ja CSMD1 metylaatio korreloi merkitsevästi kahden tunnetun metylaation tavoitteet ALX4 ja RUNX3. C: G T A vaihdot olivat merkittävästi yliedustettuna (47%), mikä viittaa laajaan sytosiini metylaatio altistavia somaattisten mutaatioiden.

Johtopäätökset

Deep amplikonin sekvensointia ja metylaatiospesifistä PCR paljastavat, että CSMD1 muutokset korreloi aikaisempien kliinisten esityksen peräsuolen kasvaimissa, mikä edelleen syytetään CSMD1 kuin kasvainsuppressorigeenin.

Citation: Shull AY, Clendenning ML, Ghoshal-Gupta S, Farrell CL, Vangapandu HV, Dudas L, et ai . (2013) somaattisista mutaatioista, alleelityypitys Loss, ja DNA metylointi Cub ja Sushi Useiden verkkotunnusten 1 (CSMD1) Gene paljastaa Assosiaatio nuorena Diagnoosi peräsuolen syövän Potilaat. PLoS ONE 8 (3): e58731. doi: 10,1371 /journal.pone.0058731

Editor: Nathan A. Ellis, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 29 marraskuu 2012; Hyväksytty: 05 helmikuu 2013; Julkaistu: 07 maaliskuu 2013

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: tuki tämän hankkeen tarjosi National Institutes of Health myöntää 7R21CA127683. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on kolmanneksi yleisin syöpä noin 1 miljoonaa vuotuista tapauksissa maailmanlaajuisesti [1]. Tämä monimutkainen häiriö on yleensä ominaista runsaasti somaattisten mutaatioiden [2]. Kuitenkin jokainen kasvain on oma ainutlaatuinen mutaatiostatuksesta maisema [3], ja taustalla olevien mekanismien, jotka aiheuttavat tätä monimuotoista tunnetaan huonosti. Aktivoivat mutaatiot adenomatoottisen polypoosin coli (APC), Kirsten ras (KRAS) ja fosfatidyyli 3-kinaasi (PIK3CA) geenit ovat hyvin yleisiä kolorektaalisyövissä [4]. On todennäköistä, että oikea yhdistelmä mutaatiot voivat antaa tietyn solukloonin proliferatiivisen edun. Mutaatiot, jotka aiheuttavat tai edistävät kasvaimen etenemistä kutsutaan yleisesti kuljettajina, kun taas mutaatiot, jotka eivät tarjoa valikoivaa etua yleisesti nimitystä matkustajien [5], [6], [7]. Suurin osa somaattisia mutaatioita, jotka kertyvät kasvaimet ovat hiljaisia ​​matkustajia [8], [9], kun taas pieni osajoukot mutaatiot ovat todellisia kuljettajat [10], [11]. Olettaen, että kaikki hiljainen (synonyymi) mutaatiot ovat matkustajat, tausta korko somaattisten mutaatioiden kolorektaalisyövissä on arviolta olevan 1 mutaatio kohti miljoonan emäksen [12]. Geenit, jotka ovat useammin muuntunut kuin ennustettu taustan määrä voi olla kuljettajia neoplastisten kehitystä. Olettaen, että kaikki hiljaiset mutaatiot ovat matkustajat ja että ei-äänetön (nonsynonymous) mutaatiot voivat joko olla tai matkustajia, yleinen suhde nonsynonymous on synonyymi (NS /S) mutaatioita tietyssä geenissä voi tarjota lisää todisteita siitä, että geeni on alle positiivinen tai negatiivinen valinta muutokset aminohapposekvenssin. Geenit, jotka kertyvät mutaatiot, mutta ei ole mitään selektiivisiä paineita, on odotettavissa nonsynonymous on synonyymi (NS /S) noin suhteessa 02:01. Tämä odotettu suhde perustuu kahden ensimmäisen nukleotidiasemia kodoni sanelee sen koodaama aminohappojakso ja kolmas ”wobble” asennossa, joka sallii kodoni redundanssia. Tämä mekanistinen setup geneettisen koodin luo kaksi kertaa niin paljon mahdollisuuksia tietyn yhden nukleotidin substituutio muuttaa aminohapposekvenssiä on mahdollisuuksia korvata nukleotidi- säilyttää silti aminohapposekvenssin. Geenit, joiden yliedustettuina kuin synonyymi mutaatiot ovat NS /S-suhde, joka on tilastollisesti merkitsevästi korkeampi kuin odotettu 02:01 ja voi varmuudella olettaa olevan positiivisessa selektiivinen paine muuttaa aminohapposekvenssiä prosessin aikana kasvaimen kehittymistä [ ,,,0],13]. Siksi korkean NS /S-suhde somaattisista mutaatioista voivat antaa tilastollista näyttöä siitä mutatoidun geenin on kuljettaja syövän etenemisen [3], [5].

Cub ja Sushi Useiden verkkotunnusten 1 (CSMD1) geeni on uusi ehdokas tuumorisuppressorigeeniä sijaitsevat p käsivarteen kromosomin 8 (2792875 … 4852328). CSMD1 usein osoitettu poistettava [14], [15], [16], mutatoitunut [2], [10], [17], tai denaturoitua [14], [18] monissa syövissä. Itse CSMD1 ilme on usein menetetään rintasyövän [19], kun taas CSMD1 menettää alleeliset tasapainoa pään ja kaulan okasolusyöpää (HNSCC) ja keuhkosyövässä [20]. CSMD1 on myös osoitettu metyloitavaa HNSCC solulinjoissa [21].

Ensimmäinen eksoni CSMD1 satamat metyloitu CpG-saarekkeen (kromosomissa 8: 4848969-4852635) [21], sekvenssi runsaasti C: G emäsparin sisällä CpG tai CpHpG yhteyksissä [22]. CpG Island Methylator Fenotyyppikuvaus (CIMP) [23] kuvaillaan osajoukko Kolorektaalituumorien jotka osoittavat korkeita metylaatio taajuuden erityisiä CpG saaria. Nämä CIMP kasvaimet ovat erillisiä kliinisiä, patologisen ja molekyylien allekirjoitukset kuten proksimaalinen kasvaimen sijainti, huono erilaistumista ja mikrosatelliittien epävakautta. Tärkeä kliininen korrelaatiot CIMP on havaittu myös rinta- ja aivokasvainten [24] osoittaa, että ilmiö ei ole vain kudosspesifisiä. Vielä ei ole selvää, onko CIMP tila aiheuttaa tai on vain liittyvät näihin fenotyyppejä. Metylointi erityisiä CIMP geenien vain löyhästi korreloi tukahduttaminen geeniekspression; Siksi muut mekanismit vaikuttavat kliiniset käyttäytymiseen CIMP kasvaimet voivat olla tärkeitä. Ituradan nukleotidisubstituutioita, joihin C: G T A siirtymät arvellaan katalysoida sytosiinin metylaatio [25]. Nämä substituutiot johtavat genominlaajuisten aliedustus CpG dinukleotidejä verrattuna siihen, mitä on odotettavissa sattumalta yksin. Genome metylaatio on siis vaikuttanut genomin evoluutio ja polymorfismi maiseman useimpien selkärankaisten. Samankaltaiset päättely, on mahdollista, että CIMP tila tuumorisolujen tai niiden syöpää edeltävän esiasteita (kantasoluja) voi altistaa metyloitu geenejä kerääntyä C: G T A somaattisista mutaatioista.

Somaattiset mutaatiot kasvaimissa voi tarjoavat historiallisia todisteita CSMD1 hiljentäminen metylointi syövän esisolut. Colon kantasoluja sijaitsee juuressa kryptissa voi olla ensisijainen tavoitteet pahanlaatuisiin [26], [27]. Mutaatiot, jotka ovat peräisin kantasoluista [28], [29], [30], [31] on mahdollisuus säilyä riittävän pitkään kertymisestä yhteistyössä onkogeenisten mutaatioita. Vaikka epigeneettisellä hiljentäminen CSMD1 voi myötävaikuttaa pahanlaatuiseen transformoidun fenotyypin, [32], [33], [34], [35], [36], [37], somaattisia mutaatioita, jotka kertyvät seurauksena metylaatio voidaan myös osaltaan maligniteetin tuntematon mekanismeja. Tutkimalla useita menetelmiä CSMD1 muutoksia (mutaatio, metylaatio, ja alleeli tappio), havaitsimme merkittävää korrelaatiot CSMD1 toimintakyvyn menetystä kanssa varhaisessa iässä diagnoosi peräsuolen syöpäpotilailla. Korrelaatio CSMD1 toimintakyvyn menetystä ja Kliininen kuva saattaa auttaa tarjoamaan käsityksen neoplastisten kehittäminen paksusuolen syövän.

Materiaalit ja menetelmät

Kasvain valinta ja DNA Isolation

De- tunnistettu kirurgisista näytteistä saatiin South Carolina Biorepository System (Palmetto Health, Richland, Palmetto Health, Baptist, ja Lexington Regional Medical Center, Lexington, South Carolina). Tutkimus suoritettiin hyväksyntää Institutional Review Board of Palmetto Health, Lexington Medical Center, University of South Carolina ja Georgia Health Sciences University, ja kaikki kirjalliset potilaan suostumukset on saatu ennen tutkimukseen. De-tunnistettiin kliiniset tiedot saatiin kasvain-rekisterin, ja manuaalinen curation patologian kirjaa suoritettiin kudospankille henkilöstö.

Valitsimme 54 mikrosatelliittimerkkien-vakaa Kolorektaalituumorien tätä tutkimusta varten. Kaikki kirurgiset näytteet olivat tuore pakastettu, upotettu Optimal Cutting Lämpötila yhdisteen (Sakura Finetek, Torrence, CA), ja leikattiin. Näytteet leikattiin 10 pm paksuisiksi viipaleiksi ja kiinnitetty Sigma silaani-prep ä dioja. Leikkeitä kiinnitettiin käyttämällä 75%, 95% ja 100% etanolia ja ksyleeni. Viipaleet alusta ja lopussa kunkin kudosnäytteen värjättiin Mayerin hematoksyliinillä (Sigma, St. Louis, MO) ja eosiini (Harleco, Lawrence, KS) ratkaisuja erityisesti saada rajat tuumorikudoksissa. Kaikki potilaan näytteen tiedot esitetään taulukossa 1.

Uuttoja kasvain ja normaali epiteelisolujen kudoksesta viipaleet tehtiin käyttäen mikro- leikkely kehittämä meidän lab. Kasvain ja normaalit solut tunnistettiin mikro-leikkely jossa käytetään kahta valmis H 60 sykliä 94 ° C: ssa 10 sekuntia, 62 ° C 45 sekuntia, ja 62 ° C: ssa 5 min. Lopullinen mallin pitoisuudet kasvain ja normaali DNA olivat 3 ng /ul.

Seulonta mikrosatelliittimerkkien epävakaus Kasvaimet

havaitseminen yhteensopimattomuuden korjauksen puutteellinen kasvaimia suoritettiin läpi monistamisen Mikrosatelliittimarkkerien lokuksen, jotta kasvaimet näytetään hypermutator fenotyyppi voitaisiin sulkea. Kaikki kasvaimet alun perin ennalta seulotaan mikrosatelliitti epävakaus (MSI) käyttäen BAT26 alukkeita, ja ne, joilla epävakauden suljettiin pois. Myöhemmin kasvaimista somaattisia mutaatioita CSMD1 analysoitiin kolme ylimääräistä NCI MSI loci: BAT25, D2S123 ja D17S250 alukkeita. Käytetyt alukkeet on lueteltu taulukossa S1 File S1 (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Mikään kasvaimia osoitti epävakauden BAT26 lokuksen, ja vain yksi näyte (Tumor ID 587) osoitti kohtalaista microsatellite epävakautta BAT25 lokukseen. PCR amplikonit muodostettiin seuraavat protokollan: PCR master mix valmistettiin käyttämällä 5 ui KAPA 5x HiFi-puskuria (KAPA Biosystems Woburn, MA), 0,75 ui 10 mM dNTP: itä, 3,00 ui alukkeet (lopullinen pitoisuus 2,5 uM), 0,50 ui KAPA HiFi HotStart polymeraasia (KAPA Biosystems Woburn, MA), 1,00 ui 10X SYBR Green (Invitrogen, Carlsbad, CA), 8,75 gl PCR vettä (Invitrogen, Carlsbad, CA), ja 1 ui DNA-templaatin 3 ng /ul. Lämpökäsittelyyn suoritettiin MyIQ Thermal iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA) käyttäen seuraavaa menettelyä: 1 sykli 95 ° C: ssa 2 min; 3 sykliä, joissa 63 ° C 15 sekuntia ja 72 ° C 15 s; 3 sykliä 98 ° C: ssa 20 sekuntia, 60 ° C 15 sekuntia, 72 ° C 15 s; 3 sykliä, joissa 98 ° C 20 sekuntia, 57 ° C 15 sekuntia, 72 ° C 15 s; 49 sykliä 98 ° C 20 sekuntia, 56 ° C 15 sekuntia, 72 ° C 15 s; 1 sykli 55 ° C 30 sekuntia; 80 sykliä 55 ° C 30 sekuntia. PCR-tuotteet ajettiin 10% TBE-Urea geelit (BIO-RAD, Kalifornia, USA) valmistajan ohjeiden ja valokuvattiin käyttäen Alpha Imager ja Määrä One ™ ohjelmistoa (Alpha Innotech, San Leandro, CA).

valmistaminen Amplikonit varten Sequencing

eksonit CSMD1 ja KRAS geenit tunnistettiin kanssa Sequence Viewer NCBI sivuston (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/sviewer) . PCR-alukkeet suunniteltiin 71 eksonia CSMD1 ja 2 yhteiset hotspot mutaatiot KRAS (eksoni 2, kodonissa 12 ja 13) käyttäen Primer3 avoimen lähdekoodin ohjelmistoja (https://frodo.wi.mit.edu/primer3/input .htm; (taulukko S1 File S1). KRAS sekvensoitiin vasta mutaatio kuormittajat vuoksi näyte rajoitukset. Suunnanvaihdon tag sekvenssit, 454 a ja 454B, vastaavasti lisättiin alukkeiden kuvatulla tavalla Guide to Amplicon Sequencing (454 Life Sciences, Branford CT). PCR-amplikonit 454 sekvensointi luotiin käyttäen 7,5 ui KAPA 5x HiFi-puskuria (KAPA Biosystems Woburn, MA), 1,125 ui 10 mM dNTP: itä, 2,25 ui alukkeet (lopullinen pitoisuus 2,5 uM), 0,75 ui KAPA HiFi HotStart polymeraasia (KAPA Biosystems Woburn, MA), ja 1 ui DNA-templaattia on 5 ng /ul. lämpökierrätys suoritettiin käyttäen MyIQ Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules CA), ja seuraavat kosketuskohta protokolla: Yksi sykli, 95 ° C: ssa 2 min, 3 sykliä, joissa 94 ° C 10 sek, 64 ° C 10 sekuntia, 70 ° C 30 sekuntia, 3 sykliä, joissa 94 ° C 10 sek, 61 ° C 10 sekuntia, 70 ° C 30 sekuntia; 3 sykliä, joissa 94 ° C 10 sek, 58 ° C 10 sekuntia, 70 ° C 30 sekuntia; 50 sykliä, joissa 94 ° C 10 sek, 57 ° C 10 sekuntia, 70 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. PCR-tuotteet analysoitiin elektroforeesilla 3% agaroosigeelissä ja valokuvattiin käyttäen Alpha Imager ja Määrä One ™ ohjelmistoa (Alpha Innotech, San Leandro, CA). Amplikonit puhdistettiin käyttämällä SPRI Ampure helmiä (Agencourt, Beverly, MA) seuraten valmistajan protokollaa.

Sekvensointi 454FLX Platform

SPRI-Ampure helmi puhdistettu PCR-tuotteiden (CSMD1 ja KRAS) kvantitoitiin käyttäen Quanti-iT PicoGreen dsDNA Pitoisuus (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja Fluoroskan Ascent FL

(

Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). Amplikoneista monistettiin emulsio PCR: llä käyttäen emPCR Kite II ja III (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) ja kaksisuuntaisesti sekvensoitiin 454 GS FLX genomin sekvensseri (University of South Carolina Environmental Genomics Core Facility, Columbia, SC). Amplikoneja kustakin 54 kasvainten sekä 2 pariksi normaali näytteet sekvensoitiin keskisyvyys on 1800-kertaisesti yli 90% amplikoneista edustaa yli 300 sekvenssin lukee näytettä kohti. Yli 500000 yksittäisiä sekvensointi lukee saatiin amplikoneista.

Variant Detection Analysis

454FLX sekvensointi lukee linjattu referenssisekvenssiin NCBI (hg19 Build 37) ja analysoitiin käyttämällä ohjelmistoa CLC Genomics Workbench 4 (CLC Bio, Aarhus, Tanska). Analysoimme sekvensointialustamme saatujen tietojen Kolorektaalituumorien ja vastaaviin normaaleihin näytteitä käyttämällä todennäköisyyspohjaisen Variant Detection Tool antamat Genomics Workbench. Mutaatiot nähdään täydentävän normaalissa Kudoksen dbSNP tietokanta, tai 1000 Genomes Project pidettiin ituradan mutaatioita. Loput mutaatiot katsottiin todennäköisesti somaattisia mutaatioita. Meidän mutaatio soitettiin alla vankka ja tiukat sekvensointi asettamat kriteerit CLC Genomics Workbench todennäköisyydellä puhelu 100 voidakseen poistaa vääriä mutaatio havaintoja. Jokainen homopolymeerijuosteita jätettiin pois meidän tietojen analysointi. Olemme myös jätetty havainneet lisäys /poisto (INDEL) varianttien Tutkimuksessamme koska 454FLX sekvensointi ei ole herkkä havaitsemaan INDEL n.

somaattinen mutaatio Validation kautta Sanger Sequencing

Sangerin sekvensoinnilla suuripitoisuuksista variantit tehtiin, jotta voidaan vahvistaa somaattisten mutaatioiden tunnistetaan variantti havaitseminen analyysi. Beckman Coulter /Agencourt Genomic Services (Beverly, MA) ja ydin genomiikan laitokseen Georgia Health Sciences University suoritetaan Sangerin sekvensoinnin, käyttäen samoja 454 a ja B tunnisteet aiemmin kuvattu kanssa 454FLX sekvensointi. PCR amplikonit muodostettiin kanssa seuraavalla tavalla: PCR master mix valmistettiin käyttämällä 7 ui PCR vettä (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10 ui 2X KAPA SYBR (KAPA Biosystems Woburn, MA), 2 ui aluketta mix ( lopullinen pitoisuus 2,5 uM), ja 1 ui DNA-templaattia on 3 ng /ul. Lämpökäsittelyyn suoritettiin seuraavalla tavalla: 1 sykli 98 ° C: ssa 2 min; 3 sykliä, joissa 98 ° C 10 sekuntia, 63 ° C 10 sekuntia, 70 ° C 30 sekuntia; 3 sykliä, joissa 98 ° C 10 sekuntia, 60 ° C 10 sekuntia, 70 ° C 30 sekuntia; 3 sykliä, joissa 98 ° C 10 sekuntia, 57 ° C 10 sekuntia, 70 ° C 30 sekuntia; 49 sykliä 98 ° C 10 sekuntia, 56 ° C 10 sekuntia, 70 ° C 30 sekuntia; 1 sykli 55 ° C 30 sekuntia; 80 sykliä 55 ° C: ssa 80 sykliä. Sanger kromatogrammit analysoitiin CLC Genomics Workbench 4. Oltuaan vahvistanut Sangerin sekvensoinnilla, The CSMD1 somaattiset mutaatiot kirjattiin ja talletetaan Leiden Open vaihtelu Database (LOVD) (Leiden University Medical Center, Alankomaat).

Alleelisia tasapaino-testausta 454FLX CSMD1 sekvenssit

Käytimme Sequential Probability Ratio Test (SPRT), jolloin havaittu tilastollisesti merkitseviä alleeliset epätasapainot kasvainnäytteissä [39], [40]. SPRT suunniteltiin testaamaan kaksi kilpailevaa hypoteesia käyttäen peräkkäin kertyneet havainnot ajan vastaan ​​ennalta määritetyn ylä- ja alarajojen tietojen [59]. Hypoteesi 1 on, että alleelit ovat tasapainossa, niin odotettu alleelinen mittasuhteet informatiivinen loci pitäisi olla 50%. Hypoteesi 2 on, että yksi kahdesta alleelista esiintyy normaalissa näytteessä on täysin poissa kasvain, joten odotettavissa määräävän alleelinen osuus on informatiivinen loci on 100% tuumorin näytteissä saastumattomalle normaalin DNA. Tapauksissa käynnissä Loh joissa kasvain DNA saastunut jopa 50% normaalia DNA, odotettu hallitseva alleelinen osuus on 66,7%. Luottamusväli konstruoitiin tunnistaa oikein symmetrinen ja epäsymmetrinen alleelit poikki välillä koko alleelin laskee havaittu 454FLX data, joka mahdollistaa jopa 50% saastuminen kasvaimen normaalin DNA. Ylempi käyrä vahvistetaan kynnystä alleelinen epätasapainoa, kun taas alempi käyrä muodostaa kynnyksen alleelinen tasapainoa. Jos kasvain n alleeli osuus ylittää yläraja kasvain luokiteltiin epätasapainoinen. Sitä vastoin, jos alleeli osuus on pienempi kuin alaraja käyrä, kasvain oli luokiteltu tasapainoinen. Jos havaitun alleelin osuutta tapahtui kahden käyrän välinen näytteet luokiteltiin epämääräinen. Kaikissa tapauksissa kaksi tai useampi informatiivinen alleelien piti olla pois tasapainosta soittaa kasvain epätasapainoista.

CSMD1 mRNA Expression Analysis HCT116 WT ja HCT116 DNMT1 /DNMT3B DKO

Expression of CSMD1 mRNA määritettiin suorittamalla kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR HCT116 WT ja HCT116 DNMT1 /3B DKO cDNA. HCT116 WT ja DNMT1 /3B DKO cDNA muodostettiin eristämällä ensin mRNA kunkin käyttäen Dynabeads mRNA eristäminen (Invitrogen, Carlsbad, CA), ja sitten muutettiin cDNA käyttäen Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA). PCR amplikonit muodostettiin kanssa seuraavalla tavalla: PCR master mix valmistettiin käyttämällä 3 ui PCR vettä (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10 ui 2X KAPA SYBR (KAPA Biosystems Woburn, MA), 2 ui aluketta seosta (lopullinen pitoisuus 2,5 uM), ja 5 ui cDNA-templaattia. Lämpökäsittelyyn suoritettiin seuraavalla tavalla: 1 sykli 98 ° C: ssa 2 min; 3 sykliä, joissa 98 ° C 10 sekuntia, 64 ° C 10 sekuntia, 70 ° C 30 sekuntia; 3 sykliä, joissa 98 ° C 10 sekuntia, 61 ° C 10 sekuntia, 70 ° C 30 sekuntia; 3 sykliä, joissa 98 ° C 10 sekuntia, 58 ° C 10 sekuntia, 70 ° C 30 sekuntia; 40 sykliä 98 ° C 10 sekuntia, 57 ° C 10 sekuntia, 70 ° C 30 sekuntia; 1 sykli, jossa 95 ° C 30 sekuntia; 80 sykliä touchdown gradientilla aloittaen 95 ° C: ssa ja väheni -5 ° C jokaisessa syklissä.

metylointianalyysi käyttäen metylaatiospesifisen PCR /High Resolution Melt Curve Analysis

puhdistettu DNA kasvaimia ja ohjaus solulinjat, jotka Agencourt DNAdvance Kit (Beckman Coulter Genomics, Beverly, MA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaksisataa nanogrammaa genomista DNA: ta bisulfiitti modifioitu EZ DNA Metylointi – Gold Kit (Zymo Research), seuraten valmistajan protokollaa. HCT116 ja HCT116-DNMT1 /3B kaksoispoistuma (DKO) DNA [43] käytettiin positiivisina ja negatiivisten kontrollien metylaatiostatuksen kaikkien geenien tutkittu. CSMD1 metyloituu eikä ilmaistu villityypin HCT-116-soluissa. Sen sijaan CSMD1 on metyloitumaton ja ilmaistaan ​​DKO soluissa [60]. CSMD1 geeni metylaatio tiedustellessa klo 3 asentoa ja nimettiin CSMD1-1 (CHR 8: 4852196-4852032), CSMD1-3 (4851450-4851301) ja CSMD1-5 (4851422-4851291). Metylointi PCR alukkeita käytetään on esitetty taulukossa S2 File S1. Jokainen kasvain syntyy aito tuote joko denaturoidulla alukkeilla tai metyloitumattomilla alukkeilla, mutta ei koskaan molempia. Tapauksissa, joissa ei löydy havaittiin joko alukeparia katsottiin epäinformatiivisia. Metylointi tulokset kasvaimia on esitetty taulukossa S3 File S1.

metylaatiospesifisen PCR /korkearesoluutioisia sulaa Curve Analysis pantiin täytäntöön aiemmin kuvattu protokollien [61]. PCR-reaktio suoritettiin käyttämällä 3-6 ng bisulfiitti muunnettua DNA: ta kokonaistilavuudessa 20 ui, joka sisälsi 12,5 ui 2X KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (KAPA Biosystems Woburn, MA), (analysoimiseksi perimän asemaa 3265577 KAPA HRM nopeasti PCR kit käytettiin); ja 2.5pmol alukkeita [62]. Reaktio sykliolosuhteet olivat 94 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 45 sykliä 30 s 94 ° C: ssa, Geenispesifiset Hehkutus Lämpötila 30 s, pidennys 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, ja tiedonkeruu ikkunasta 76- 77 ° C 30 sekuntia. Association dikäyrät kaikkien tuotteiden, ja läsnäolo tai puuttuminen aitoja tuotteita määritettiin verrattuna positiivisten ja negatiivisten kontrollien. Kaikki reaktiot suoritettiin käyttäen MyIQ Yhden väri Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad).

Tilastollinen analyysi

Binomial todennäköisyys käytettiin vertaamaan merkityksen välillä nonsynonymous on synonyymi somaattisten mutaatioiden CSMD1 kolorektaalisyövän potilaalla. Vertailu keskimääräinen ikä diagnoosin tai kliinisen tilan geneettisesti symmetrinen ja epäsymmetrinen potilaalla on somaattisia mutaatioita tehtiin jonka U-testi. Spearmanin käytettiin vertaamaan välisten suhteiden metyloitu loci.

Tulokset

Taajuudet ja Character somaattisista mutaatioista

CSMD1 geeni ulottuu 2,05 Mt genomista DNA on p varren kromosomin 8. koodaava sekvenssi geenin osan on 11740 nukleotidin (0,0234 Mb per diploidi genomi). Sekvensoimme yhteensä 54 Kolorektaalituumorien vastaten 1,26 Mt CSMD1 CDS DNA. Havaitsimme ja Sanger-todennettu 16 somaattisia mutaatioita 6 54 Kolorektaalituumorien (11%) (taulukko 2). Sitten lasketaan somaattisen mutaation nopeudella 11,90 mutaatioiden /MB kurssia, joka on huomattavasti korkeampi kuin genominlaajuisia tausta mutaationopeudet Mikrosatelliittimarkkerien-vakaa kolorektaalisyövissä [3], [38].

somaattiset mutaatiot olivat merkittävästi rikastettiin nonsynonymous muutokset verrattuna synonyymi muutoksiin. Sillä Sanger vahvisti variantteja, tunnistimme 15 nonsynonymous (NS) mutaatioita ja 1 synonyymi (S) mutaatio, varten NS /S suhde 15:1. Todennäköisyys tämän monta (tai enemmän) nonsynonymous mutaatioita esiintyy sattuman on 0,014, vastaan ​​puhuu hypoteesia, että CSMD1 on matkustajan geeni vaikuttaa mutaattori- fenotyypin. Sitä todennäköisempää selitys on, että nonsynonymous mutaatiot valitaan aikana peräsuolen syövän kehitystä. On tärkeää huomata, että kasvaimen 517 oli 10 somaattisia mutaatioita CSMD1, joista yhdeksän oli nonsynonymous. Todennäköisyys tämän monta nonsynonymous mutaatiot esiintyvät sattumalta yksin 0,1. Vaihtoehtoinen hypoteesi on, että selektiivinen paine ajoi kertyminen useiden CSMD1 nonsynonymous muunnoksia samassa kasvain, mahdollisesti asuvat erillisessä alakloonit. Erilaiset osajoukot mutaation taajuuksien CSMD1 viittaavat tähän uskoa siihen, että useita CSMD1 mutaatiot syntyivät erilliset subkloonit samassa kasvaimen väestöstä (kuvio 1).

Ten CSMD1 somaattinen mutaatio havaittiin Kasvain 517. Kuitenkin nämä erityisesti mutaatiot vaihtelevia osajoukot pitoisuuksia, mikä osoittaa, että kukin osajoukko on voinut syntyä riippumattoman kloonin tuumorin sisällä väestöstä.

Koska eteneminen adenokarsinooma voidaan ohjata mutaatioita KRAS onkogeenin, olemme analysoineet mutaatio kuormittajat kodoneissa 12 ja 13: n eksonin 2 käyttämällä Sangerin sekvensoinnilla PCR-tuotteiden. KRAS hotspot somaattiset mutaatiot havaittiin 21 54 Kolorektaalituumorien (~39%). Kolme kasvainten sisältämien somaattisten mutaatioiden sekä CSMD1 ja KRAS, jossa kaksi kolmesta kasvainten osoittaa korkeampi CSMD1 mutanttialleelin taajuudella kuin KRAS mutantti alleeli (taulukko 1). Tämä tulos voi osoittaa, että CSMD1 somaattiset mutaatiot olivat olemassa ennen KRAS somaattiset mutaatiot, joiden uskotaan tapahtuvan aikaisessa peräsuolen syövän etenemiseen. Yksi kasvain ei ole CSMD1 mutaatio alleeli pitoisuudet, jotka olivat vähemmän kuin KRAS mutantti alleeli pitoisuus, mikä osoittaa ehkä että CSMD1 mutaatiot tässä kasvain tapahtui jälkeen KRAS mutaatioita. Silti klooni kätkeminen CSMD1 mutantti alleeli laajennettu riittävästi, jotta CSMD1 mutantti alleeli voidaan havaita, mikä osoittaa, että tämä laajennus ei vetämänä KRAS alleeli. Voidaksemme määrittää aikarajat CSMD1 ja KRAS mutaatiot, carful sekvenssianalyysillä varhaisen vaurioita kuten adenoomia vaaditaan. Kuitenkin havaintojemme mukaan CSMD1 nonsynonymous mutaatioita antaa kasvainsolujen valikoiva etu, joka toimii riippumatta etu, jonka KRAS mutaatioita.

Kolorektaalituumorien kanssa CSMD1 Loh ja somaattisista mutaatioista Näytä Early Clinical Presentation

Out of 54 kasvainten sekvensoitiin, Kolmekymmentäseitsemän oli kaksi tai useampia lokusta, jotka olivat heterotsygoottinen ituradan variantteja ja voisi näin ollen arvioitava CSMD1 alleelinen epätasapainoa Sequential Probability Ratio Test [39], [40]. Viidenkymmenen prosentin (19/37) ja peräsuolen kasvaimia epätasapainoinen kaksi tai useampia peräkkäisiä CSMD1 lokuksen (kuvio 2, taulukko 1), mikä osoittaa, että CSMD1 heterotsygoottisuuden menetys olisi tapahtunut näiden kasvainten. Vaikka ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä, keskimääräinen ikä diagnoosin potilaille, joilla CSMD1 alleelinen epätasapaino oli nuorempi kuin ne, joilla on tasapainossa alleelien (60 vuotta vs. 69 vuotta, Mann-Whitney p = 0,052). Keskimääräinen ikä diagnoosin potilaille, joilla on CSMD1 somaattisista mutaatioista oli myös alle niille, joilla ei somaattisista mutaatioista (58 vuotta vs. 66 vuotta), vaikka tämä ero oli myös tilastollisesti merkitsevä. Heterotsygoottisuuden menetys on mekanismi, joka toimii yhdessä somaattinen mutaatio inaktivoimiseksi tuumorisuppressorigeeneille. Havaitsimme, että potilailla, joilla on sekä epätasapainoisen ja mutatoituja CSMD1 alleelit olivat huomattavasti nuorempia iässä diagnoosi (41 vuotta) kuin potilailla, joilla on tasapainoinen ja villityypin CSMD1 (68 vuotta, Mann-Whitney p = 0,0077). Toisin kuin aikaisemmissa tutkimuksissa [17], emme havaita merkittävää suhdetta CSMD1 somaattisen mutaation asemaa ja kasvaimen vaihe tässä sarjassa näytteitä. Kuitenkin tilastollinen todisteita kliinisen tilan osuu viimeaikaiset tutkimukset The Cancer Genome Atlas (TCGA). Perustuu Kaplan-Meier Survival Analysis, TCGA sekvensointi paljastivat, että peräsuolen syöpäpotilaat CSMD1 muutoksiin on huomattavasti pienempi todennäköisyys selviytymisen kuin potilailla, joilla ei CSMD1 muutoksia (log-rank-testi p = 0,000565) [41]. Tällaisen näytön tunnistaminen CSMD1 muutoksia on mahdollista käyttää merkkeinä kolorektaalisyövässä ennusteeseen.

Yläraja käyrä on esitetty kaaviossa osoittaa 95%: n luottamusväli kynnysarvoa CSMD1 loci luokitellaan epätasapainoinen, kun taas alaraja käyrä osoittaa 95%: n luottamusväli kynnysarvoa CSMD1 loci luokiteltaisiin tasapainoinen. Kasvaimet, jossa on kaksi tai useampia peräkkäisiä lokuksen, jotka oli epätasapainossa oli luokiteltu, joille on tehty heterotsygoottisuuden menetys. Loci joka putosi kahden kynnyksen väliin pidettiin määrittelemätön varten alleeliset kuvaamista. Tietyt loci in CSMD1 osoitti alleeliset tasapaino, vaikka he asuisivat kasvaimia, jotka olivat epätasapainoinen varten CSMD1. Tämä tulos viittaa kromosomaaliseen taukoja, jotka tapahtuvat sisällä CSMD1 geenisekvenssi, alavirtaan tutki loci.

Ylimääräinen CG TA mutaatiot ja CSMD1 Metylointi

Exome sekvensointi kolorektaalisyövissä on kävi ilmi, että useat kasvaimet ovat maailmanlaajuisia yli CG TA somaattiset mutaatiot [2], [3]. Havaitsimme 7 ulos 15 (46,7%) CSMD1 somaattiset mutaatiot olivat CG TA siirtymät (taulukko 2). Tämän luokan mutaatio syntyy ei-entsymaattinen Deaminoimalla 5′-metyylisytosiinin tuottaa tymidiiniä.