Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia antituumorivaikutuksen of RY10-4, pieni molekyyli, joka on suunniteltu ja syntetisoitiin perustuen rakenteeseen protoapigenone. Aikaisempi seulonta tutkimus osoitti, että RY10-4 hallussaan antiproliferatiivisia vaikutuksia vastaan ​​HepG2 ihmisen maksasyövän soluja. Kuitenkin täyden valikoiman RY10-4 syöpälääkkeen vaikutuksia maksakasvaimia ja taustalla mekanismeja ei ole tunnistettu. Tässä työllistää virtaussytometria, ja Western blot-analyysi, osoitamme, että RY10-4 voi aiheuttaa solusyklin pysähtymiseen, solunsisäinen reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tuotanto ja apoptoosin HepG2-soluissa. HepG2-solujen ksenografti tuumorin malli, RY10-4 estivät merkittävästi kasvainten kasvua ja indusoi apoptoosia kasvainsoluissa, joilla on vähän sivuvaikutuksia. Lisäksi RY10-4 aiheutti tukahduttaminen STAT3 aktivointi, joka voi olla mukana apoptoosin. Lisäksi, RY10-4 inhiboivat Hep3B ja Huh-7 ihmisen maksasyövän soluja konsentraatiosta riippuvalla tavalla. Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että RY10-4 on suuret mahdollisuudet kehittyä kemoterapeuttinen aine maksasyövän.

Citation: Zhang X, Wang Y, Han S, Xiang H, Peng Y, Wu Y, et al. (2016) RY10-4 estää proliferaatiota of Human Hepatosellulaarinen Cancer HepG2-solujen apoptoosin aiheuttamiseksi

In vitro

ja

In Vivo

. PLoS ONE 11 (3): e0151679. doi: 10,1371 /journal.pone.0151679

Editor: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 20 lokakuu 2015; Hyväksytty: 02 maaliskuu 2016; Julkaistu: 14 maaliskuu 2016

Copyright: © 2016 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tuki National Natural Science Foundation of China (nro 31270390, jotta YYW) ja Natural Science Foundation of Hubei (No. 2015CFC852, että XZ). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

mukaan viimeisimmän maailmanlaajuisen syöpä tilastotieto, maksasyövän on kolmanneksi korkein syy syövän liittyvän kuoleman maailmanlaajuisesti [1]. Yhtenä tärkeimmistä syövän hoitomuodot, kemoterapia on tehokkuus pitkittää ja parantaa elämänlaatua potilailla [2]. Tutkimus pienten molekyyli yhdisteitä antituumorivaikutuksen on suurta hyötyä uusien solunsalpaajiin. Joitakin pieniä molekyyliyhdisteitä, kuten piperlongumine [3] ja obtusaquinone [4], kohdistaminen ja valikoivasti tappaa syöpäsoluja, voisi olla lupaava syövän terapeuttisia aineita.

Hyödyntämällä luonnollisia tuotteita kuten lyijyn yhdiste on hyödyllinen ja käytännöllinen menetelmä lääkekehityksessä. Perustuen rakenteen luonnontuote protoapigenone, RY10-4 suunniteltiin ja syntetisoitiin Yuan

et al

. laboratoriossamme, ja se osoitti voimakas anti-kasvain toimintaa vastaan ​​useita ihmisen syövän solulinjoissa [5]. Sen kemiallinen rakenne on lähellä protoapigenone, kun taas sen antituumorivaikutuksen parannettiin ja sivuvaikutukset vähenivät. Mekanismien välittävä anti-kasvain aktiivisuus RY10-4 mukana induktio autophagy tai apoptoosin ihmisen rinta- tai keuhkosyöpä solulinjoissa, vastaavasti [6,7]. Aiemmassa seulonta tutkimuksessa, RY10-4 osoitti huomattavaa lisääntymistä torjuvia vaikutuksia HepG2 ihmisen hepatosellulaarisen syöpäsoluja

in vitro

, ja esti kasvua hiiren hepatosellulaaristen H22 kasvain

in vivo

[5] . Kuitenkin lisätutkimuksia tarvitaan täysin ymmärtää anti-kasvain vaikutuksia RY10-4 vuonna maksasyövän ja sen mahdollinen toimintatapa. Tässä osoitamme, että RY10-4induces apoptoosin HepG2 maksasyövän solut sekä

in vitro

ja

in vivo

, ja siten on kyky tukahduttaa maksakasvaimia.

Materiaalit ja menetelmät

Regents ja vasta-aineet

RY10-4 ( 95%) valmistettiin aikaisemmin laboratoriossamme, kuten ovat kuvanneet Yuan et al. [5]. Sulforodamiini B (SRB) ostettiin J K Scientific (Peking, Kiina). Dimetyylisulfoksidi (DMSO) ja N-asetyylikysteiini (NAC) ostettiin Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Hoechst 33342, propidiumjodidi (PI), reaktiivisen hapen iinianalyysikitissä (DCFH-DA), RIPA lyysipuskuria, BCA proteiinimäärityksellä kit, ja BeyoECL plus kemiluminesenssin kit saatiin Beyotime Inc. (Shanghai, Kiina). Anneksiini V-FITC /PI apoptoosin detektiovälinepakkaukset ostettiin Keygen Biotech (Nanjing, Kiina). Spesifisiä vasta-aineita vastaan, Bcl-2, Bax, p53, sykliini E CDK2, pilkottiin caspase3, aktiini, STAT3, p-STAT3, p21, GAPDH ja vastaavat sekundaariset vasta-aineet saatiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA).

solun viiva ja soluviljelmissä

Ihmisen hepatosellulaarinen syöpä HepG2, Hep3B ja Huh-7 solulinjat ostettiin Kiinasta Center for Type Culture Collection, CCTCC). Soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM, Hyclone), jota oli täydennetty 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS, Hyclone) ja antibiootteja (100 ug /ml streptomysiiniä ja 100 IU /ml penisilliiniä), kostutetussa ilmakehässä 5% CO

2 37 ° C: ssa.

SRB-määritys

solujen elinkelpoisuus mitattiin SRB-määritys, kuten on kuvattu aiemmin [6]. Lyhyesti, HepG2-soluja siirrostettiin 96-kuoppaisille viljelylevyille (5000 solua per kuoppa), ja sitä käsiteltiin sarja pitoisuuksia RY10-4. Käsittelyn jälkeen solut kiinnitettiin 10% trikloorietikkahapolla 1 h ajan 4 ° C: ssa, ja pestiin 1% etikkahapolla. Kiinnitetyt solut värjättiin 0,4% SRB: ssa 15 minuuttia, pestään neljä kertaa ja jätettiin kuivumaan huoneen lämpötilassa. Sitoutunut väri liuotettiin Tris-Base ratkaisu, ja absorbanssi 540 nm: ssä rekisteröitiin käyttämällä mikrolevyn lukijaa (BioTek Instruments, Inc. USA). Tutkia roolia ROS RY10-4 solukuolema, HepG2-soluja esikäsiteltiin ROS puhdistusainetta NAC (5 mM) 2 h, mitä seurasi käsittely RY10-4 ja solujen elinkyky mitattiin.

klonogeeninen määritys

HepG2 solut eksponentiaalisen vaiheen kasvun ympättiin 6-kuoppaisille levyille (1000 solua per kuoppa), ja annettiin kiinnittyä. Hoidon jälkeen sarja-pitoisuudet RY10-4 24 tuntia, soluja viljeltiin tuoreeseen elatusaineeseen ilman lääkkeitä, kunnes näkyvissä muodostuneiden pesäkkeiden. Solun pesäkkeet kiinnitettiin sitten 4% paraformaldehydillä ja värjättiin 0,5% kristallivioletilla värjäysliuosta.

Solusyklianalyysiä

solusyklin analyysi, vaihe jakelu DNA-pitoisuus määritettiin käyttäen PI värjäystä. Hoidon jälkeen 0, 0,9, 1,8, ja 2.7μM on RY10-4 24 tuntia, HepG2 solut kerättiin ja kiinnitettiin 70% etanolilla yön yli -20 ° C: ssa. Sitten solut pestiin ja värjättiin PI-värjäyksellä (50 ug /ml PI: n ja 10 ug /ml RNaasi) 30 minuutin ajan pimeässä. Solusyklin jakautumisen analysoitiin virtaussytometrialla käyttämällä Cell-Quest -ohjelmistoa (Becton Dickinson, USA).

Measurement solunsisäisten ROS

DCFH-DA: ta käytettiin fluoresoiva koetin mitata solunsisäisen ROS virtaussytometrialla. Lyhyesti, HepG2-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille. Tarttumisen jälkeen, soluja käsiteltiin vaihtelevilla RY10-4. Sitten väliaine poistettiin ja soluja inkuboitiin 10 uM DCFH-DA 20 min pimeässä. Värjätyt solut kerättiin ja analysoitiin virtaussytometrillä (Becton Dickinson, USA). Joissakin kokeissa solut esikäsiteltiin ROS scavenger NAC.

Apoptosis havaitseminen

HepG2-soluja käsiteltiin vaihtelevilla RY10-4 ja analysoitiin apoptoosin joko Hoechst 33342 värjäystä tai anneksiini V-FITC /PI. Lyhyesti, käsittelyn jälkeen solut värjättiin Hoechst 33342: ssa 10 minuuttia huoneen lämpötilassa, sitten pestiin ja niitä tarkkailtiin fluoresoiva käännettyä mikroskooppia (Nikon Eclipse, Japani). Vaihtoehtoisesti, solut kerättiin ja värjättiin anneksiini V-FITC /PI apoptoosin havaitsemiseen mukainen pakkaus valmistajan protokollan; apoptoottisten solujen havaittiin virtauksen cytomety (Becton Dickinson, USA).

Western blot -määritys

Proteiinin ilmentyminen määritettiin Western blot. Lyhyesti, kokonais-proteiinit uutettiin RIPA-lyysipuskuria, joka sisälsi 1% phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) ja 1% cocktail. Proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvolle (Bio-Rad). Membraani blokattiin 5% rasvaton maito 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja inkuboitiin tietyn primaarisen vasta-aineen yli yön 4 ° C: ssa. Membraani pestiin sitten ja inkuboitiin vastaavan sekundaarisen vasta-aineen kanssa 2 tuntia huoneenlämpötilassa. Spesifinen proteiini-vasta-aine kompleksin tehtiin näkyväksi ECL plus kemiluminesenssin kit.

Nude hiiret ksenograftimallia

Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin institutionaalisten eläinten eettisen komitean Huazhong tiede ja teknologia, Kiina . Kaikki koe-eläimet saivat hoitoa ohjeiden mukaisesti ehdottamien Institutional Animal Care ja käyttö komitea, ja yritettiin minimoida kärsimyksen. On neljästä viiteen viikon ikäisten BALB /c-nude-hiiriin (nro 4304701485) ostettiin Hunan SJA Laboratory Animal Co Ltd (Hunan, Kiina). Hiiret majoitettiin erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa on vapaa pääsy jyrsijämuonaa ja vettä 20-22 ° C: ssa 12 tunnin valo-pimeä sykli, ja totutetaan viikon ajan ennen koetta. Sitten HepG2-soluja (2 x 10

6) injektoitiin subkutaanisesti jokaisen hiiren. Kun määrät olevien kasvainten saavuttanut 100-200 mm

3, hiiret satunnaistettiin seuraaviin ryhmiin: suolaliuos-ohjaus, pieni annos RY10-4 (5 mg /kg) käsitellyssä ryhmässä, ja suuren annoksen RY10-4 (50 mg /kg) käsitellyssä ryhmässä. Kehon paino ja kasvaimen tilavuus eläinten mitattiin kerran viikossa. Hiiriä tarkkailtiin päivittäin haavaumat, vatsan turvotus, kuihtuminen ja /tai muita merkkejä hätä. Kun hiiri esitti edellä mainitun oire (t) ja uskottiin, että hiiri ei kestäisi, se uhrattiin ja kuolinhetkellä tallennettiin. Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa: V =

ab

2/2 (

,

b

ovat kasvaimen pituus ja leveys, vastaavasti). Suhteellinen kasvaimen tilavuus (RTV) = V

t /V

0, jossa V

0 on kasvaimen tilavuus mitattiin ajankohtana ensimmäisen lääkkeen annon ja V

t on kunkin kasvaimen mittauksen jälkeen hoidon. Tällä kokeellinen päätepisteen, kaikki hiiret tapettiin katkaisemalla kaula eetterinukutuksessa.

histopatologia ja immunohistokemia analyysi

Yksi osa kasvainkudoksen näyte kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja upotettiin parafiiniin. Kudosleikkeet (4 mm) valmistettiin ja värjättiin hematoksyliinillä /eosiinilla (H solujen kasvun esto-suhde määritettiin SRB-määrityksessä ja IC

50-arvo oli 1,88 uM. (B) HepG2-solut ympättiin hyvin alhainen tiheys, ja käsiteltiin RY10-4 24 tuntia. Sitten soluja kasvatettiin tuoretta väliainetta ilman lääkkeitä muodostamaan pesäkkeitä. Siirtomaa muodostuminen suhde (% kontrollista) laskettiin.

RY10-4 aiheuttama solusyklin pysähtymisen HepG2-soluissa

solusyklin jakautumista HepG2-soluissa jälkeen RY10-4 hoito oli arvioitiin analyysi DNA sisältöä käyttämällä PI värjäystä. Kuten on esitetty kuviossa 2A ja 2B, RY10-4 pitoisuuksina 0,9, 1,8 ja 2,7 uM indusoi merkittävää kasvua solujen prosenttiosuus S-vaiheessa. Myös 2,7 uM RY10-4 indusoi huomattava nousu G2 /M vaiheessa (

P

= 0,0127). Western blot-analyysi osoitti, että ekspressio solusyklin liittyvien proteiinien sykliini E ja CDK2 HepG2-soluissa väheni RY10-4 jälkeen (kuvio 2C).

(A) Soluja käsiteltiin 0, 0,9, 1,8 ja 2.7μM RY10-4 24 tuntia, ja DNA-pitoisuus analysoitiin käyttämällä propidiumjodidivärjäys ja virtaussytometrialla. (B) Cell cycle jakaumat, esitetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (C) käsittelyn jälkeen RY10-4, ilmaus solusyklin liittyvien proteiinien sykliini E ja CDK2 analysoitiin Western blot.

RY10-4 aiheuttama solunsisäisen ROS tuotantoa HepG2-soluissa

solunsisäinen ROS tuotanto havaittiin käyttäen hapetus herkkä fluoresoiva koetin DCFH-DA. Kuten on esitetty kuviossa 3A, sen jälkeen kun hoito osoitetun pitoisuudet RY10-4, solunsisäisen ROS tuotanto dramaattisesti lisääntynyt HepG2-soluissa. Keskittymä riippuvaisella tavalla havaittiin, ja esikäsittelyä NAC (5 mmol) 2 tunnin lähes täysin päinvastainen RY10-4 aiheuttamaa ROS tuotantoa HepG2-soluissa (kuvio 3B). Johdonmukaisesti, esikäsittely NAC esti myös solujen elinkyvyn lasku indusoi RY10-4 (kuvio 3C).

(A) HepG2-soluja käsiteltiin osoitetulla pitoisuudet RY10-4, ja solunsisäinen ROS tuotanto oli havaittu menetelmät kuvatulla tavalla. (B) solunsisäinen ROS tasot (% kontrollista), esitetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (C) HepG2-soluja käsiteltiin RY10-4 puuttuessa tai läsnä NAC esikäsittelyn; solujen elinkelpoisuus määritettiin SRB-määritystä.

RY10-4 indusoi apoptoosin HepG2-soluissa

fluoresenssivärjäyksellä tumien ja anneksiini V-FITC /PI-värjäys suoritettiin apoptoosin havaitsemiseen HepG2-soluissa. Kuvio 4A osoittaa, että hoidon jälkeen osoitetun pitoisuudet RY10-4, kondensoidaan ytimet ja apoptoottisten kappaleiden havaittiin HepG2-soluissa värjäämällä Hoechst 33342. anneksiini V-FITC /PI-värjäys osoitti myös, että RY10-4 indusoi apoptoosia konsentraatiosta riippuvalla tavalla (kuvio 4B). Verrataan kontrolliryhmään, prosenttiosuus apoptoottisten solujen määrä oli lisääntynyt RY10-4-hoidetuissa ryhmissä (kuvio 4C). Lisäksi, apoptoosin liittyvät proteiinit p53, Bcl-2, Bax, ja pilkottiin kaspaasi-3 analysoitiin Western blot. Kuten kuviossa 4D, ekspressiota anti-apoptoottisen proteiinin Bcl-2 väheni käsittelyn jälkeen RY10-4, kun taas p53: n, Bax ja pilkottiin kaspaasi-3 kasvoi konsentraatiosta riippuvalla tavalla. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että RY10-4 voi indusoida apoptoosia HepG2-soluissa.

(A) Soluja käsiteltiin osoitetulla pitoisuuksilla RY10-4 24 tuntia, ja tumat värjättiin Hoechst 33342. Nuolet osoittavat kondensoidaan ja hajanainen ytimeksi. (B) Virtaussytometria määrityksessä havaitsemaan apoptoosia HepG2-soluissa käyttämällä anneksiini V /PI värjäystä. Edustavia virtaussytometrillä profiilit näkyvät. (C) osuus apoptoottisten solujen, esitetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (D) Expression of apoptosis-related proteins analysoitiin Western blot HepG2-soluissa käsittelemättömän tai käsitelty RY10-4.

Anti-kasvain aktiivisuus RY10-4 HepG2 solujen ksenograftimallissa

anti-kasvain vaikutus RY10-4

in vivo

arvioitiin käyttäen paljaan hiiren ksenograftimallissa. Kaikki hiiret selvisivät koko kokeen ajan, ja ne tapettiin eetterianestesiassa kokeiluasteella päätepisteen. Kuten on esitetty kuviossa 5A, hoito RY10-4 johti huomattavan kasvun inhibition HepG2 solujen ksenograftikasvaimissa verrattuna suolaliuoksella hoidetusta kontrolliryhmästä. Lopussa kokeen, kasvaimen tilavuus oli 1326 ± 407 mm

3, 530 ± 201 mm

3 ja 411 ± 108 mm

3 kontrolliryhmässä pieniannoksinen RY10-4 hoitoryhmässä ja suuren annoksen RY10-4 hoitoryhmässä, vastaavasti. Keskimääräinen kasvaimen tilavuus kontrolliryhmässä oli lähes seitsenkertainen alkuperäisestä tilavuudesta, kun taas kasvainten hoidossa ryhmissä nostettiin vain noin kaksinkertaiseksi verrattuna alkuperäiseen määrään (kuvio 5B). Olemme myös analysoineet ilmentyminen apoptoosin liittyvien proteiinien Bcl-2: n ja Bax kasvainkudoksessa näytteet jokaisesta ryhmästä immunohistokemiallisesti ja Western blot. Kuten kuviossa 5C ja 5D, verrattuna kontrolliryhmään, ekspressiota anti-apoptoottisen proteiinin Bcl-2 vähentynyt, kun taas pro-apoptoottisen proteiinin Bax kasvoi sekä alhaisissa ja korkeissa annoksia RY10-4. HE-värjäys osoitti myös suuria alueita kasvainsolun kuoleman hoitoryhmässä (kuvio 5E). Nämä tulokset viittaavat siihen, RY10-4 voivat aiheuttaa hepatosellulaaristen kasvainten apoptoosin

in vivo

. Kehon paino kussakin ryhmässä ei muuttunut merkittävästi koko kokeen ajan (kuvio 5F), ja RY10-4 hoito ei vaikuta veren biokemialliset indeksit kasvain nude-hiiriin (S1 taulukko), viittaa siihen, että RY10-4 on todennäköisesti hieman puolella vaikutukset

in vivo

.

(A) edustaja ksenograftikasvaimissa saatu ohjaus hiirillä ja hiiriä hoidettiin RY10-4. (B) suhteellisen kasvaimen tilavuus (RTV) laskettiin kaavan mukaan Methods. (C ja D) Expression of Bcl-2: n ja Bax kasvainkudoksessa analysoitiin immunofluoresenssin ja Western blot. (E) HE-värjäys suoritettiin patologinen tutkimus kasvainkudoksen eri ryhmissä. (F) keskimääräinen kehon painot hiirtä kussakin ryhmässä arvioitiin.

molekyyli- mekanismeja apoptoosin induktion RY10-4 HepG2-soluissa

Koska STAT3 säätelee ilmentymistä eri kasvaimen kasvuun liittyvät onkogeeninen geenejä ja sillä on keskeinen rooli solujen lisääntymisen [9], me tutkimme, RY10-4 voi säädellä konstitutiivista STST3 aktivaation HepG2-soluissa. Kuten kuviossa 6A, RY10-4 esti konstitutiivinen fosforylaatio STAT3 (tyrosiini 705) HepG2-soluissa. RY10-4 sääteli ilmentymistä p21, joka voi olla mukana RY10-4 aiheuttaman solusyklin pysähtymisen. Lisäksi, IL-6 (10 ng /ml) käänteinen RY10-4 aiheuttama STAT3 inaktivointi, jota seuraa lisäys sykliini E ilmentymisen RY10-4 käsiteltyjen HepG2-soluissa (kuvio 6B). Lisäksi esikäsittely NAC esti STAT3 kumoamisen ja p53 aiheuttama nousu RY10-4 HepG2-soluissa (kuvio 6C).

(A) HepG2-soluja käsiteltiin osoitetulla pitoisuudet RY10-4, ja ilmaisu p-STAT3 ja p21 analysoitiin Western blot. (B) HepG2-soluja käsiteltiin RY10-4 kanssa tai ilman IL-6 stimulaatio; ilmentyminen p-STAT3 ja sykliini E analysoitiin Western blot. (C) HepG2-soluja käsiteltiin RY10-4 puuttuessa tai läsnä NAC esikäsittelyä. Ekspression p-STAT3 ja p53 analysoitiin Western blot.

anti-proliferatiiviset vaikutukset RY10-4 muihin maksasyövän solulinjoja

tarkkailla anti-proliferatiivinen vaikutukset RY10-4 muita ihmisen maksasyövän solulinjoja, me valitsemme Hep3B ja Huh-7 maksasyövän solulinjoja. Kuten on esitetty kuviossa 7A, RY10-4 inhiboivat Hep3B ja Huh-7-solujen pitoisuudesta riippuvalla tavalla, ja Hep3B-solut olivat herkempiä. Seuraavaksi havaitaan ilmaisuja apoptoosin liittyvien proteiinien RY10-4 saaneilla Hep3B soluissa. Kuten on esitetty kuviossa 7B, kun hoidon RY10-4, ilmaus p53: n ja Bax kasvoi, kun taas Bcl-2 väheni.

(A) Hep3B tai HuH-7-soluja käsiteltiin sarjassa pitoisuuksia ja RY10-4, ja solujen kasvun inhibition suhteen määritettiin SRB-määrityksellä. (B) Hep3B-soluja käsiteltiin RY10-4, ja ilmaisuja apoptoosiin liittyvien proteiinien p53, Bcl-2: n ja Bax analysoitiin Western blot.

Keskustelu

luonnontuote protoapigenone ja useat sen johdannaiset ovat osoittaneet voimakas anti-kasvain vaikutuksia tiettyjä ihmisen syövän solulinjoista [10,11]. Protoapigenone voidaan pitää hyödyllisenä johtaa yhdisteen löytää uusia kemoterapeuttisten aineiden. Laboratoriossamme, RY10-4 suunniteltiin ja syntetisoitiin protoapigenone analoginen, yrityksenä kehittää uusi anti-kasvain yhdistettä. Joidenkin aiemmin tutkimuksia ja selvityksiä [12,13], RY10-4 oli voimakas kasvaimen vastaisia ​​aktiivisuuksia ihmisen rintasyövän soluissa. Toisessa raportissa, RY10-4 voivat aiheuttaa autophagic solukuoleman MCF-7-soluissa, kun taas protoapigenone voinut [6]. Lisäksi Xue

et al

. kertoi, että RY10-4 indusoi apoptoosia ja estää hyökkäys ihmisen keuhkosyövän A549-soluja estämällä STST3 signalointi [7]. Nämä tutkimukset osoittavat, että RY10-4 on suuri potentiaali uusien kasvainten vastaisen aineen.

Esillä olevassa tutkimuksessa olemme arvioitiin kasvaimen vastainen aktiivisuus RY10-4 maksasyöpää. Tulokset osoittivat, että RY10-4 tehokkaasti esti leviämisen HepG2 maksasyövän solut

in vitro

IC

50 arvoon 1,88 pM. Lisäksi klonogeenisten määritys suoritettiin määrittää pitkän aikavälin vaikutukset RY10-4 HepG2-soluissa. Klonogeeniset määritys korreloi hyvin määrityksen kasvaimien

in vivo

, ja se on osoittautunut ennustearvo kemosensitiivisyys testissä antituumoriaineista [14]. Tuloksemme osoittivat konsentraatiosta riippuvaisen eston in kyky muodostaa klooneja in RY10-4 käsiteltyjen HepG2-soluissa (kuvio 1 B), mikä viittaa siihen, että RY10-4 on parantava potentiaalia vastaan ​​hepatosellulaarista syöpää.

solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin ovat keskeisiä toimintamekanismit monia syöpälääkkeitä. On raportoitu, että protoapigenone ja sen analogit sekä RY10-4 voi aiheuttaa solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin joissakin ihmisen syöpäsolulinjoissa [13,15-17]. Täällä analysoimme solusyklin jakelua ja apoptoosin HepG2 soluista hoidon jälkeen RY10-4. Huomasimme, että RY10-4 voi aiheuttaa solusyklin pysähtymisen S ja G2 /M vaiheessa, mikä saattaa johtua alas-säätely solusyklin liittyviä proteiineja sykliini E ja CDK2 (kuvio 2). Lisäksi, Hoechst 33342 värjäys ja anneksiini V-FITC /PI-värjäys osoitti, että RY10-4 indusoi myös pitoisuus-riippuvaista apoptoosia in HepG2-soluissa (kuvio 3). P53 on yksi tärkeimmistä tuumorisuppressorien ja kohdentamalla p53 proteiinit voivat osoittautua terapeuttisesti käyttökelpoisten [18,19]. P53 voidaan stimuloida hypoksia, karsinogeenien, oksidatiivista stressiä ja muita stressitekijöitä, asiakkuutta solukierron pysähtymisen tai apoptoosin

kautta

useita reittejä [20]. Bcl-2-perheen proteiineja, mukaan lukien pro- ja anti-apoptoottiset sääntelyviranomaisten, myös tärkeä rooli apoptoosin induktioon ja solun selviytymisen [21,22]. Lisäksi, kaspaasi-perheen proteiinien, kuten kaspaasi-3 ovat toimeenpanijoina apoptoosin ja kaspaasien aktivaatio käynnistää apoptoosin [23]. Hoidon jälkeen RY10-4 ekspressio p53, Bax ja pilkottiin kaspaasi-3 kasvoi, kun taas Bcl-2 laski HepG2-soluissa (kuvio 3D). Nämä tulokset osoittavat, että apoptoosin induktio voi olla taustalla oleva mekanismi kasvainten vastaisen toiminnan RY10-4 ihmisen hepatosellulaarisen syövän HepG2-soluissa.

pakottavia todisteita viittaa siihen, että ROS ovat osallisina erilaisissa solun ohjelmia ja toistaa keskeinen merkitys ihmisen fysiologisten ja patologisten prosessien [24]. Syöpäsolut yleensä esiintyy enemmän pohjapinta tasoilla ROS, joilla on erilainen redox asema vertaamalla normaalien solujen, ja korkeat ROS tasot voivat usein vahingoittaa soluja [25,26]. Siksi asiakkuutta ROS tuotanto syöpäsoluissa voi olla myönteinen terapeuttinen vaikutus. Yhdisteet kuten piperlongumine, obtusaquinone ja psoralidin aiheuttaa ROS tuotanto siten proliferaation ihmisen syöpäsoluja [3,4,27]. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että RY10-4 indusoi solunsisäistä ROS tuotanto, joka voitaisiin kääntää esikäsittelemällä NAC HepG2-soluissa. Myös RY10-4 solukuolema osittain estää esikäsittelyn NAC (kuvio 4). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ROS tuotanto voi olla tärkeä rooli RY10-4 aiheuttama HepG2 solukuolemaa. Suhde RY10-4 aiheuttaman apoptoosin ja ROS tuotanto tullaan edelleen tutkittiin seurantatutkimuksessa. Lukuisat todisteet osoittavat, että STST3 on keskeinen rooli kehityksen ja etenemisen monien ihmisen kasvaimista, ja tukahduttaminen STAT3 aktivointi johtaa kasvun estäminen ja apoptoosin kasvainsolulinjoissa sekä hiiren ksenograftimalleja [9,28]. Tutkimuksessamme havaitsimme, että RY10-4 tukahdutettiin STAT3 aktivaation HepG2-soluissa, ja vaikutus oli riippuvainen ROS sukupolven (kuvio 6). Yhdessä ROS riippuvainen inaktivaatio STAT3 voi olla molekyylimekanismi RY10-4 sen anti-maksakasvain aktiivisuutta.

Yleisesti ottaen vain kliinisissä kokeissa voidaan viime kädessä määrittää, onko uusi aine on tehokas syövän hoidon potilailla. Kuitenkin on olemassa monia eettisiä, lääketieteelliset ja taloudelliset rajoitukset ja rajoitukset kliinisiä tutkimuksia, joten kätevä kokeellinen järjestelmä on suuri merkitys syövän huumeiden seulontaan [29]. Nude-hiirissä ksenograftimallissa käytetään tavallisesti biologisen aktiivisuuden arvioimiseksi, syöpälääkkeiden

in vivo

[30,31]. Ihmisen syöpäsolut voivat kasvaa vierassiirrännäiset immuunipuutteiselle hiiren. Jossain määrin tämä malli on hyödyllinen ennustaa kliininen vaste lääkehoitoon. Täällä, loimme HepG2 solun ksenograftimallia arvioimiseksi antituumorivaikutuksen RY10-4. Huomasimme, että RY10-4 aiheuttaman apoptoosin kasvaimen ja estivät merkitsevästi sen kasvu

in vivo

(kuvio 5). Lisäksi RY10-4 on luultavasti vain vähäisiä sivuvaikutuksia

in vivo

, koska se ei vaikuttanut eläimen kehon painoa ja veren biokemialliset indeksit.

Käsillä oleva paperi osoittaa, että RY10-4 voi merkittävästi estää leviämisen ihmisen maksasolusyövän HepG2-soluissa sekä

in vitro

ja

in vivo

. Apoptoosin induktio voi olla taustalla oleva mekanismi sen anti-kasvain aktiivisuutta. RY10-4 tukahdutti maksa kasvaimen kasvua

in vivo

ilman merkittävää hematologisen myrkyllisyyden, maksatoksisuus tai nefrotoksisuutta. Lisäksi, RY10-4 inhiboivat Hep3B ja Huh-7 ihmisen maksasyövän soluja konsentraatiosta riippuvalla tavalla. Nämä tulokset viittaavat siihen, että RY10-4 on suuria mahdollisuuksia uutena kemoterapeuttinen aine maksasyövän.

tukeminen Information

S1 Taulukko. Täydellinen verenkuva ja biokemiallisia profiilin nude-hiirissä sen jälkeen, kun hoidon RY10-4 ja 4 viikkoa (keskiarvo ± SD, n = 8).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0151679.s001

(DOCX)