Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että PMS1077, verihiutaleita aktivoivan tekijän (PAF) antagonisti, voisi indusoida Raji-soluja. Kuitenkin vaikutusmekanismia ei ole vielä määritetty. Tumatranskriptiotekijä-kappa B (NF-KB) signalointireitistä on keskeisessä asemassa kasvainsolun eloonjäämistä, lisääntymistä, invaasiota, etäpesäke, ja angiogeneesi, joten määritimme vaikutuksia PMS1077 ja sen rakenteelliset analogit on tuumorinekroositekijä-α ( TNF-α) indusoi NF-KB: n signalointia. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että PMS1077 inhiboi TNF-α indusoima NF-KB-säänneltyjen reportterigeenin annoksesta riippuvaisella tavalla. Western blot-määritys osoitti, että PMS1077 tukahdutti TNF-α aiheuttama estäjä KB-α (IKB-α) fosforylaatio, IKB-α hajoamista, ja p65 fosforylaatio. PMS1077 johdonmukaisesti esti TNF-α aiheuttama p65 tumaansiirtymiseen kuten osoitettu immunofluoresenssimäärityksellä käytetty. Telakka tutkimukset molekyylimallinnuksella ennusti PMS1077 saattaa suorassa vuorovaikutuksessa IKB kinaasi-β (IKK-β) alayksikköä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että PMS1077 voi tukahduttaa NF-KB: n kohdistamalla IKK-β mukana NF-KB: n signalointireitin. Lopuksi osoitti, että PMS1077 herkistyneet solut TNF-α: n indusoiman apoptoosin, jonka ilmentymisen estämiseksi NF-KB: n säänneltyjen anti-apoptoottisia geenejä. Tuloksemme osoittavat uusien funktio PMS1077 on NF-KB-signalointireittiä ja sitä, että PMS1077 voidaan pitää anti-kasvain johtaa yhdisteen.

Citation: Shi J, Chen J, Serradji N, Xu X, Zhou H, Ma Y et ai. (2013) PMS1077 herkistää TNF-α aiheutti apoptoosia ihmisen eturauhassyövän solut estämällä NF-KB Signaling Pathway. PLoS ONE 8 (4): e61132. doi: 10,1371 /journal.pone.0061132

Editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kiina

vastaanotettu 17. lokakuuta 2012 Hyväksytty 5 maaliskuuta 2013 Julkaistu: 09 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Shi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Chun Hui Projects (numero Z2009-1-62001, https://www.moe.edu.cn) Kiinasta opetus- ja osittain Science and Technology Support Projects Gansun maakunnassa (numero 1104FKCA123, https://www.gsstc.gov.cn), Kiina. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

viime vuosina olemme syntetisoida tiettyjä piperatsiini- johdannaisia, jotka osoittivat, voimakas dual anti-PAF ja anti-HIV-1 toimintaa [1], [2], [3], [4]. Vaikka edelleen parantaa näitä ominaisuuksia ja ottaen huomioon joustavuutta näiden yhdisteiden, olimme myös mukana tutkia mahdollisia vaikutuksia näiden yhdisteiden muihin sairauksiin, kuten tulehdus ja kasvaimen synty. Meidän edellinen työ osoitti, että PMS1077 voisi indusoida Raji-soluja, mutta vaikutusmekanismia jää epäselväksi [5].

Koska kriittinen rooli NF-KB säänneltyjä geenituotteiden solujen lisääntymistä, eloonjääntiä, invaasio, etäpesäke, ja angiogeneesi [6], [7], [8], päättelimme, että PMS1077 voisi välittää apoptoosia syöpäsolujen moduloimalla NF-KB signalointiryöpyn. NF-KB-perheen oleellisesti koostuu viidestä proteiineihin, Rel-A (p65), Rel-B, C-Rel, P50, ja p52 [9]. Tyypillinen nisäkkään NF-KB koostuu p50 /p65-heterodimeerin. Stimuloimattomissa soluissa NF-KB sitoutuu estäjä KB: n proteiinien ja on eristäytynyt sytoplasmassa inaktiivisena monimutkainen. Kun stimulaatio esimerkiksi TNF-α, signalointi cascade johtaa aktivoinnin IKB-kinaasin monimutkainen, mikä johtaa fosforylaatioon, ubikitinaation ja hajoaminen lKB, että 26S-proteasomin [9], [10]. Sitten vapautunut NF-KB-heterodimeerin nopeasti translokoituu tumaan, jossa se sitoutuu KB päällä ja indusoi transkriptiota monenlaisia ​​kohdegeenien osallisina syövän kehittymisessä ja etenemisessä [8], [11].

Tässä tutkimuksessa olemme arveltu, että PMS1077 voivat mukauttaa NF-KB-reitin. Tämän hypoteesin testaamiseksi olemme määritettiin vaikutukset PMS1077 ja sen rakenteelliset analogit on TNF-α-indusoidun NF-KB: n aktivaation. Meidän havainnot osoittivat, että PMS1077 voi estää TNF-α aiheuttama IKB-α hajoamista, IKB-α fosforylaatio, p65 fosforylaatio, ja p65 tumaansiirtymiseen. Telakka tutkimukset molekyylimallinnuksella ennusti PMS1077 saattaisi tukahduttaa NF-KB aktivoitumisen suoraan vuorovaikutuksessa IKK-β. Lisäksi, PMS1077 havaittiin myös tukahduttaa TNF-α indusoima NF-KB: n säädellään anti-apoptoottisia geenejä, mikä johtaa herkistymistä TNF-α: n indusoiman apoptoosin kasvainsoluissa. Tällä tavoin Tutkimuksen tuloksien kehittynyt ymmärrystämme molekyylitason mekanismeja syövän vastaisen aktiivisuuden PMS1077, ja se voi auttaa meitä edelleen optimoida niiden ominaisuuksien mahdollisia lääkekehityksen.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

HEK293T (ihmisen alkion munuainen), DU145 (ihmisen eturauhassyöpä) ja PC3 (ihmisen eturauhassyöpä) solut saatiin American Type Culture Collection. Soluja viljeltiin DMEM: ssä (Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine), jota oli täydennetty 10% FBS: ää (naudan sikiön seerumia), 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 mg /ml streptomysiiniä, ja niitä inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa . PMS1077 ja sen rakenteelliset analogit syntetisoitiin, kuten aiemmin on raportoitu [4]. Nämä analogit liuotettiin DMSO: hon tuottamaan 50 mmol /L kantaliuos in vitro kokeissa. TPCA-1 (spesifinen inhibiittori NF-KB) ostettiin Sigma Aldrich (St. Louis, MO, U.S.). Vasta-aineita P-p65, p65, P-IKB-α, IKB-α, Bcl-x L, Bcl-2, surviviini ja PARP ostettiin Cell Signaling Technology. TNF-α ostettiin Pepro Tech. GenEscort ™ transfektioreagenssi ostettiin Wisegen Biotechnology Corporation (Nanjing, Kiina).

Transfektio ja lusiferaasireportterista määritys

DU145 ja PC3-solut ympättiin 60 mm kudosviljelymaljoille, vastaavasti. NF-KB-riippuvan tulikärpäsen lusiferaasireportteriplasmidi (4 x KB-pGL4.20) transfektoitiin ympättyä solua käyttäen GenEscort ™ transfektioreagenssia mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. 48 tunnin kuluttua solut valittiin ja lisääntyivät väliaineessa, jota oli täydennetty 5 ug /ml puromysiiniä, kunnes resistenttien kloonien ilmestyi. Kaksi validoitu kloonit nimettiin DU145-NF-KB-Luc ja PC3-NF-KB-Luc. Suuren suoritustehon seulonnan ilmoitettu yhdisteiden suoritettiin näissä solulinjoissa käyttäen ONE-Glo Luciferase Assay System (Promega).

tutkia NF-KB-aktivaation HEK293-soluissa TNF-α, NF-KB-riippuvaisia tulikärpäsen lusiferaasi toimittaja (4 × KB-pGL4.20) oli ohimenevästi kotransfektoitu yhdessä Renilla lusiferaasiplasmidin (pGL4.74) HEK-293T-soluissa siima leikkaamalla GenEscort ™ transfektioreagenssi mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Käsittelyn jälkeen solut lyysattiin passiivista hajotuspuskuria (Promega), ja lusiferaasiaktiivisuus määritettiin käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega), jossa on Wallac1420 VICTOR (Perkin-Elmer, Wellesely, MA, US-). Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuudeksi ilmaistiin suhteena tulikärpäsen lusiferaasin aktiivisuuden Renilla lusiferaasiaktiivisuus. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena.

3- (4, 5-cimethylthiazol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT)

Solujen elinkyky määritettiin käyttäen MTT-määritystä. Lyhyesti, solut maljattiin 96-kuoppalevyille (1 x 10

4 solua /kuoppa), käsiteltiin erilaisilla yhdisteillä eri pitoisuuksina, ja sen jälkeen pidettiin viljelmässä vielä 12 tai 24 h. Lopussa tämän ajan, 20 ui MTT: tä (5 mg /ml) lisättiin elatusaineeseen ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 2 tuntia. Sitten väliaine poistettiin. Veteen liukenemattomia formatsaanikiteet liuotettiin sitten DMSO: hon (100 ul /kuoppa). Optinen tiheys kussakin kuopassa mitattiin Wallac1420 VICTOR (Perkin-Elmer, Wellesley, MA, US-) aallonpituudella 570 nm, jossa viitataan aallonpituudella 630 nm. Kunkin testattu konsentraatio, kuoppiin, jotka sisältävät kaikki reagenssit lukuun ottamatta solujen toimivat vertailuryhmänä. Solujen eloonjääminen on tässä kuvattu suhteellinen absorbanssi (A) prosenttiosuus määrittelemää (A

huume /A

ohjaus x 100) (Ye et al., 2004).

Western blotting-analyysi

Western blottaus proteiinien suoritettiin, kuten on kuvattu yksi aiempien tutkimusten [12]. Lyhyesti, käsiteltyjen solut kerättiin RIPA-lyysipuskuria, joka sisälsi 50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% DOC, 0,1% SDS: ää, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA: a, 20 mM NaF , 2 mM natriumortovanadaattia ja proteaasiestäjäseostabletit (Roche). Hajotuksen jälkeen lysaatit sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 13000 g: llä 4 ° C: ssa. Kokonaisproteiinin näytteet (30-60 ug) siirrettiin PVDF-kalvolle elektroforeesierottelun jälkeen 12% SDS-polyakryyliamidigeelillä. Kun oli salvattu 5% rasvatonta maitoa TBST (0,1%) 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, membraaneja inkuboitiin yön yli primaarisen vasta-aineen kanssa 4 ° C: ssa ja pestiin viisi kertaa TBST: ssä, sitten inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi konjugoitu sekundäärisen vasta-aineita huoneen lämpötilassa 2 tuntia. Membraanit pestiin viisi kertaa TBST: ssä, ja inkuboitiin sitten parannetun kemiluminesenssi Länsi tunnistusjärjestelmä (Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, US) ja valotettiin röntgenfilmille.

NF-KB /p65 tumaansiirtymiseen määrityksessä

immunosytokemi- analyysi NF-KB: n /p65: n tumaan- PC-3-soluissa suoritettiin käyttäen Cellular NF-KB: n translokaatio Kit (Beyotime Biotech) mukaisesti valmistajan ohjeiden, kuten aiemmin on kuvattu [13 ], [14]. Lyhyesti, solut ympättiin 96-kuoppalevyille 4000 solua /kuoppa. 24 tuntia myöhemmin solut esikäsiteltiin PMS1077 (50 uM) 2 tunnin ajan, minkä jälkeen seuraa käsittely 20 ng /ml TNF-α: ssa 30 minuuttia. Solut esikäsitelty 0,2% DMSO ja 2 uM TPCA-1 käytettiin negatiivisina ja positiivisina kontrolleina vastaavasti. Käsittelyn jälkeen solut kiinnitettiin ja inkuboitiin estopuskurilla huoneenlämpötilassa 1 h tukahduttaa ei-spesifinen sitoutuminen. Seuraavaksi soluja inkuboitiin yön yli primaarisen NF-KB: n p65-vasta-ainetta 4 ° C: ssa, jota seurasi inkubointi Cy3-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa huoneenlämmössä 1 h, sitten DAPI 5 min ennen havainnointia. P65-proteiini näytti punaista alle fluoresenssimikroskopiaa ja ytimien ilmestyi sininen. Punainen ja sininen kuvat yhdistettiin Image J ohjelmisto tuottaa purppura fluoresenssia alueilla yhteistyössä lokalisointi.

Nuclear translokaatio NF-KB /p65 havaittiin myös DU145 soluissa Western blotting-analyysi läsnäolon p65 sytoplasmassa ja tumassa. Käsittelyn jälkeen solut sytoplasmista ja ydin- fraktiot valmistettiin käyttäen menetelmää, kuten on kuvattu yksi aiemmin tutkimuksia [12]. Sitten proteiini näytteet analysoitiin Western-blottauksella.

RT-PCR-määritys

Kokonais-RNA käsiteltyjen solujen valmistettiin käyttäen RNAprep puhdasta solun Kit (TIANGEN, Bei Jing, Kiina) mukaisesti valmistajan ohjeita. 5 ug kokonais-RNA: ta kustakin näytteestä tehtiin käänteistranskriptio käyttämällä M-MLV käänteistranskriptaasia (Promega). Seuraavia alukkeita käytettiin: GAPDH-eteenpäin, GTCAACGGATTTGGTCGTATT ja GAPDH- kääntää, AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT; Bcl-x L-eteenpäin, CTGAATCGGAGATGG AGACC ja Bcl-x L-käänteinen, TGGGATGTCAGGTCACTGAA; Bcl-2-eteenpäin, TGCACCTGACGCCCT TCAC ja AGACAGCCAGGAGAAATCAAACAG ja Bcl-2-käänteinen, AGACAGCCAGGAGA AATCAAACAG; surviviiniperäistä eteenpäin, CCTTTCCTAAGACATTGCTAAG ja surviviiniperäiset käänteinen, GTG AATTTTTGAAACTGGACAG. PCR suoritettiin 94 ° C: ssa 30 s, 56 ° C: ssa 30 s ja 1 min 70 ° C: ssa 30 sykliä. PCR-tuotteet analysoitiin 2% agaroosigeelissä ja visualisoitiin etidiumbromidivärjäyksellä.

apoptoosimäärityksessä

havaitseminen apoptoottisten solujen suoritettiin käyttäen FITC-konjugoitua anneksiini V: n ja propidiumjodidia (PI) . DU145-soluja käsiteltiin 0, 40 ja 80 uM PMS-1077: ssa 24 tuntia ja sitten pelletoitiin sitten alas sentrifugoimalla, pestiin kaksi kertaa kylmällä PBS: llä, ja sentrifugoitiin 1000 rpm: solujen keräämiseksi. Solut suspendoitiin uudelleen 200 ul: aan sitovaa puskuria, ja sitten 10 ui anneksiini-V-FITC: tä, 5 ui PI lisättiin. Soluja inkuboitiin pimeässä 30 minuutin ajan ja analysoitiin virtaussytometrialla. FACS suoritettiin käyttäen 488 nm: n eksitaatioaallonpituudella ja kaistanpäästösuodattimia on 515-545 nm (anneksiini-V-FITC tunnistus) ja 563-607 nm (PI tunnistus). Tietojen analysointi suoritettiin käyttäen Cell Quest ohjelmaa.

Molecular telakointi tutkimuksen

IKK-β kinaasidomeeni (tähteet 16-310) eristettiin kiderakenne IKK-β monimutkaisissa kanssa estäjä (ATE ID: 3RZF) [15]. Yhdisteet PMS1077 ja PMS601 rakennettiin käyttäen Avogadro, jossa MMFF94 voimakenttä energia minimointi lukien 5000 vaiheet jyrkimmän laskeutumisen ja 2000 vaiheet konjugaatin kaltevuudet [16]. Kaikki rakenteet telakointi valmistettiin käyttämällä AutoDockTools [17]. Gasteiger lataus ja fuusioimalla ei-polaarinen vetyä lisättiin.

Molecular telakointi suoritettiin AUTODOCK Vina [18]. Yhdisteet asetettiin joustavia rakenteita, ja sitovat konformeerit etsittiin käyttäen iterated Local Search globaalin optimismi. Lopullinen sitova konformeerit valittiin mukaan paras AUTODOCK Vina pisteet, yhdistäminen tietoon perustuvan ja empiirinen lähestymistapa Eq. 1. (1) B

Täällä

AG-

on yhteensä sitova energiaa;

AG-

Gauss

on kaksi Gaussin funktio, joka sisältää houkuttelevia termi hajonta;

AG-

vastenmielisyys

on neliö

d

(pinta etäisyys), kun

d 0

;

AG-

hydrofobisia

ja

AG-

hbond

ovat hydrofobisia vuorovaikutuksia ja vetysidokset, vastaavasti; ja

AG-

tuksen

on yhdiste käännettävissä joukkovelkakirjojen.

sitoutumisaffiniteetti arvioitiin myös käyttämällä AUTODOCK kipeä 4.1 (Eq. 2) ja NNScore 2,0 [19]. (2)

Täällä

W

vdw

,

W

hbond

,

W

sähkö

, ja

W

sol

ovat painotusta vakioita Van der Waalsin vuorovaikutukset, vetysidokset, sähköstaattiset vuorovaikutukset, ja desolvation energia, tässä järjestyksessä;

W

tor

on paino yhdisteiden vääntö.

NNScore 2.2 vie paljon enemmän reseptori-ligandi ominaisuudet osallistumaan sitoutumisaffiniteetti, kuten AUTODOCK Vina termein ja 12 erillistä sitovaa ominaisuuksiltaan BINANA [20]. Esillä olevassa tutkimuksessa, BINANA ja Ligplot + [21] otettiin analysoimaan vuorovaikutusta PMS1077 ja IKK-β.

Tilastot ja data-analyysin

Kaikki kokeet suoritettiin riippumattomasti ainakin kolme kertaa ja tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta, ellei toisin mainita. Tilastollinen merkitsevyys välillä käsittelemättömien ryhmien ja käsiteltyjen ryhmien määritettiin käyttäen yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA) ja t-testiä. P 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

PMS1077 tukahdutettu TNF-α indusoima NF-KB-säännellyn reportterigeenin

Tässä tutkimuksessa valaista mekanismista anti-kasvain toimintaa PMS1077 (Fig. 1), loimme DU145-NF-KB-Luc ja PC3-NF-KB-Luc solulinjoja, jotka ekspressoivat stabiilisti 4 × KB: n promoottorin, joka ohjaa lusiferaasireportteri- ja määritettiin vaikutukset PMS1077 on TNF-α indusoimaa NF-KB: n näissä solulinjoissa. Tässä reportterigeenimäärityksessä, PMS1077 havaittiin estävän TNF-α indusoimaa NF-KB: n aktiivisuutta yli 50% DU145-soluissa ja PC3-soluja. Ainoastaan ​​tiedot DU145-soluissa on esitetty kuviossa. 2A.

(A) DU145-NF-KB-Luciferase soluja käsiteltiin PMS1077 ja sen rakenteelliset analogit on lopullinen konsentraatio 50 uM. TPCA-1 (2 uM) on spesifinen inhibiittori NF-KB: n ja positiivisen kontrollin ja DMSO: ta ajoneuvoon. Sitten solut jätettiin käsittelemättä tai altistunut TNF-α (20 ng /ml) 12 tuntia. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttäen ONE-Glo® Luciferase Assay System (Promega). (B) DU145-soluja käsiteltiin PMS601, PMS1077, PMS1120 ja PMS1144 ilmoitettuina pitoisuuksina 12 tuntia. Solujen elinkyky määritettiin käyttämällä MTT-määritystä. Arvot ovat keskiarvo ± S.D. kolme riippumatonta rinnakkaista. *

P

0,05 versus TNF-α kannustanut ryhmä.

Jotta voitaisiin löytää tehokkaampia yhdisteitä, sarja analogeja (Fig. 1), rakenteellisesti hyvin lähellä PMS1077 , toimitettiin samassa määrityksessä. PMS1120, kanta isomeeri PMS1077 osoitti vertailevan toimintaa PMS1077 molemmissa solulinjoissa, kun taas PMS1141 oli yhtä aktiivinen kuin PMS1077 vain PC3-solulinjassa. Muut analogit olivat vähemmän aktiivisia kuin PMS1077 sekä solulinjoissa ja PMS601 oli yksi aktiivinen yhdisteitä tässä sarjassa. Kuten PMS1077, vain dataa DU145-soluissa on esitetty kuviossa. 2A.

Jos haluat jättää vaikutusten sytotoksisuuden määrittelimme, vaikutuksia näiden yhdisteiden solun elinkelpoisuuden. MTT-analyysi osoitti, että PMS601, PMS1077, PMS1120 ja PMS1141 oli vain kohtalainen sytotoksisuus ( 30%), on DU145-soluissa pitoisuuksina yhtä suuri kuin 80 uM (Fig. 2B). Lopuksi valitaan PMS1077 paras yhdistettä ja PMS601 kontrollina myöhemmissä kokeissa.

edelleen vahvistaa nämä tulokset tarkempi kahden lusiferaasimäärityssysteamiä, HEK293T-soluja väliaikaisesti ko-transfektoitiin NF-KB- -regulated lusiferaasireportteriplasmidin (4 × KB-minip /PGL4.20) ja sisäinen valvonta plasmidi (PGL4.74). Kuten on esitetty kuviossa. 3A, NF-KB: n suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus indusoiman TNF-α annoksesta riippuvalla tavalla, ja tämä toiminta tukahdutettiin tunnettu IKK-β-inhibiittori TPCA-1 (Fig. 3B). Kun soluja käsiteltiin PMS1077, olemme huomanneet, että TNF-α indusoimaa NF-KB: n suhteellinen lusiferaasireportterigeenillä aktiivisuus estyi annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 3C). Kuitenkin PMS601, negatiivinen kontrolli, ei ollut merkittävää vaikutusta tähän toimintaan (Fig. 3d).

HEK293T soluja ohimenevästi kotransfektoitiin NF-KB-Firefly lusiferaasi ja TK-Renilla lusiferaasireporttiterilla vektoreista NF -κB aktiivisuuden määrityksessä. (A) NF-KB-riippuvaisia ​​reportteri geeni-ilmentymisen indusoima TNF-α. Transfektoidut solut käsiteltiin ajoneuvon tai TNF-α (1, 5, 10, 20 ja 50 ng /ml) 12 h; (B) TPCA-1 inhiboi ilmentymisen TNF-α indusoimaa NF-KB-riippuvaisia ​​reportteri geeni. Transfektoidut solut käsiteltiin ajoneuvon tai TPCA-1 (1, 2, 3, ja 4 uM), sitten inkuboitiin TNFa: n kanssa (20 ng /ml) 12 h; (C) PMS1077 inhiboi TNF-α indusoimaa NF-KB-riippuvaisia ​​reportteri geeni-ilmentymisen. Transfektoidut solut käsiteltiin ajoneuvon tai PMS1077 (20, 40, 60 ja 80 uM), sitten inkuboitiin TNF-α (20 ng /ml) 12 h; (D) PMS601 ei ollut vaikutusta TNF-α indusoimaa NF-KB-riippuvaisia ​​reportteri geeni-ilmentymisen. Transfektoidut solut käsiteltiin ajoneuvon tai PMS601 (20, 40, 60 ja 80 uM), sitten inkuboitiin TNF-α (20 ng /ml) 12 tuntia. Käsittelyn jälkeen lusiferaasiaktiivisuuden (A), (B), (C), ja (D) mitattiin käyttämällä Dual Luciferase Assay (Promega). Esitetyt tulokset edustavat suhteellista lusiferaasiaktiivisuutta normalisoitu vastaan ​​Renilla lusiferaasiaktiivisuus. Arvot ovat keskiarvo ± S.D. kolme riippumatonta rinnakkaista. *

P

0,05 versus TNF-α stimuloidaan ryhmä; NS, ei merkittävää.

PMS1077 estivät TNF-α riippuva IKB-α fosforylaation ja hajoaminen

fosforylaatio ja ubikitiinipromoottori proteasomin välittämä hajoaminen IKB-α proteiini on keskeisessä asemassa NF-KB: n signalointireitin. Vaikka havaitaan fosforylaation ja hajoamista lKB-α in HEK293T-, olemme huomanneet, että TNF-α indusoimaa IKB-α hajoamista saavutti maksimin 0,5 h 1 h, ja että uudelleensyntetisoimisen lKB-α tapahtui 2 h 4 h kuluttua TNF-α hoidon (Fig. 4A). Sen määrittämiseksi, onko inhibitio TNF-α indusoimaa NF-KB: n aktivaation aiheuttaa tukahduttaminen lKB-α hajoamista, esikäsittelimme HEK293T-solujen PMS1077 ja altistettiin sitten ne TNF-α: ssa 0,5 tuntia. Erityisesti, PMS1077 havaittiin estävän hajoamista lKB-α annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 4B). Sen sijaan havaitsimme mitään selvää vaikutusta hajoamiseen IKB-α in PMS601 (80 uM) esikäsitellyt solut (Fig. 4B). Nämä tiedot osoittivat, että PMS1077 voidaan estää TNF-α indusoimaa IKB-α hajoamista, mikä johtaa suppression NF-KB: n aktivaation.

(A) TNF-α indusoimaa IKB-α hajoamista, IKB-α fosforylaation. HEK293T-soluja käsiteltiin TNF-α (20 ng /ml) ja osoitettujen ajanjaksojen ajan; (B) PMS1077 inhiboi TNF-α indusoimaa IKB-α hajoamista. HEK293T-soluja käsiteltiin ajoneuvon tai PMS1077 (20, 40, 60 ja 80 uM) tai PMS601 (80 uM) ja TPCA-1 (1 uM), sitten inkuboitiin TNF-α (20 ng /ml), 0,5 tuntia; (C) PMS1077 inhiboi TNF-α indusoimaa IKB-α fosforylaation. HEK293T-soluja käsiteltiin ajoneuvon tai PMS1077 tai PMS601 tai TPCA-1, kuten (B), inkuboitiin sitten TNF-α (20 ng /ml) 2 tuntia; (D) DU145-soluja käsiteltiin ajoneuvon tai PMS1077 (40 ja 80 uM) ja TPCA-1 (1 uM), sitten solut joko jätettiin käsittelemättä tai altistunut TNF-α (20 ng /ml) 12 tuntia. Käsittelyn jälkeen, koko solulysaatit (A), (B), (C), ja (D) valmistettiin ja analysoitiin Western-blottauksella vasta-IKB-α, fosforylaatio-IKB-α (Ser-32), fosforylaatio -p65 (Ser-536) ja GAPDH. Kaikki tiedot esitetään edustavat kolmen erillisen kokeen.

Sen määrittämiseksi, onko inhibitio TNF-α indusoimaa hajoamista lKB-α aiheutti eston fosforylaation lKB-α, tutkittiin vaikutuksia PMS1077 TNF-α aiheuttama fosforylaation IKB-α in HEK293T soluissa. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, uudelleensyntetisoimisen IKB-α tasolle samanlainen kuin valvonnan 2-4 h käsittelyn jälkeen ja IKB-α fosforylaation saavutti kohtuullisella tasolla 1-2 tunnin kuluttua TNF-α käsittely siten suoritimme western blot-analyysi IKB -α fosforylaatio 2 h kuluttua TNF-α stimulaatiota. Tulosten perusteella analyysi osoitti, että esikäsittely PMS1077 inhiboivat voimakkaasti TNF-α indusoimaa IKB-α fosforylaatiota annoksesta riippuvaisella tavalla, mutta PMS601 ei ollut vaikutusta tämän fosforylaation (kuvio. 4C).

Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että PMS1077 inhiboi TNF-α indusoimaa NF-KB: n kautta, vaimentamalla fosforylaation ja hajoamista lKB-α. Kuitenkin rakenteellinen analogi PMS601 ei ollut merkittävää vaikutusta fosforylaatioon ja hajoaminen lKB-α.

PMS1077 esti konstitutiiviset ja TNF-α aiheuttama fosforylaation p65

On hyvin osoitettu, että fosforylaatio seriinin 536 p65 on tärkeä rooli säätelyssä NF-KB: n aktiivisuuden, ja voidaan saada aikaan erilaisia ​​tulehdusta edistävät, mukaan lukien TNF-α [22], [23], [24], [25]. Tästä syystä tutkimme myös vaikutuksia PMS1077 TNF-α indusoimaa fosforylaatiota p65. Western blot-analyysi osoitti, että fosforylaatio p65 tapahtui TNF-α käsiteltyjen DU145-solut, ja tämä fosforylaatio p65 estyi annoksesta riippuvalla tavalla esikäsitelty solujen PMS1077 (40 ja 80 uM) (Fig. 4D, oikealla).

DU145 ja PC3-solujen tiedetään olevan konstitutiivisesti aktiivinen NF-KB: n [26], [27]. Sen määrittämiseksi, onko PMS1077 vaikuttaa myös konstitutiivisia NF-KB: n ilmentymisen näissä soluissa, käsittelimme DU145cells kanssa PMS1077 (40 ja 80 uM) ilman TNF-α. Kuten on esitetty kuviossa. 4D (vasemmalla), PMS1077 tukahdutti täydellisesti konstitutiivinen fosforylaatio p65 in DU145-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla. Lisäksi, PMS601 havaittiin ei ole merkittävää vaikutusta sekä indusoituva ja konstitutiivinen fosforylaatio p65 (Fig. S1). Näin ollen, nämä tulokset osoittivat, että PMS1077 voi estää sekä indusoituva ja konstitutiivinen NF-KB: n aktivaation.

PMS1077 estetty TNF-α indusoimaa NF-KB /p65 tumaansiirtymiseen

Koska IKB-α hajoaminen on vaaditaan tumaansiirtymiseen p65, etsimme onko PMS1077 voisi myös tukahduttaa TNF-α aiheuttama tumaansiirtymiseen p65. Western blot-analyysi osoitti, että tumaansiirtymiseen p65 esiintynyt DU145 jälkeen TNF-α hoitoa. Kuitenkin, kun solut esikäsiteltiin PMS1077 (50 uM) tai TPCA-1, TNF-α onnistunut indusoimaan tumaansiirtymiseen p65 (Fig. 5A). Näiden tulosten vahvistamiseksi, suoritimme immunosytokemian tarkkailla p65 PC3 ja DU145 soluja. Tulokset osoittivat, että käsittelemätön, sekä PMS1077 (50 uM) tai TPCA-1 esikäsitellyt solut, p65 paikannettiin sytoplasmassa, kun taas solut, joita käsiteltiin TNF-α yksin, p65 oli translokaatio tumaan (kuvio. 5B ja Fig.S2). Kuitenkin, PMS601 ei ollut vaikutusta tämä kulkeutuminen p65 (Fig. S2). Nämä tiedot vahvistivat, että PMS1077 esti TNF-α aiheuttama tumaansiirtymiseen p65.

(A) DU145 soluja esikäsiteltiin PMS1077 (50 uM) tai TPCA-1 (2 uM) 6 tunnin ajan ja sen jälkeen TNF -α (20 ng /ml) stimulaatio 0,5 tuntia. Soluliman ja tumauutteet, jotka edustavat yhtä monta solut analysoitiin Western-blottauksella käyttämällä mainituilla vasta-aineilla. (B) PC-3-soluja esikäsiteltiin PMS1077 (50 uM) ja 6 h ja tämän jälkeen TNF-α (20 ng /ml) stimulaatio 0,5 tuntia. TPCA-1 (2 uM) ja DMSO: käytettiin positiivisina NF-KB: n estäjä, ja negatiivinen kontrolli, vastaavasti. Käsittelyn jälkeen solut värjättiin ensisijaisesti anti-p65-vasta-aineen ja Cy3 fluoreseiini-konjugoitu sekundaarinen vasta-aine (punainen), ja sen jälkeen tuma vastavärjättiin DAPI (sininen) ja tutkittiin käyttäen Fluoresenssimikroskopia. Kuvat otettiin kullekin fluoresenssikanava, käyttämällä sopivia suodattimia 40 × tavoite. Punainen ja sininen kuvat yhdistettiin Image J ohjelmisto. Kaikki tiedot esitetään edustavat kolmen erillisen kokeen.

Telakka tutkimuksen molekyylimallinnuksella vuorovaikutus PMS1077 tai PMS601 ja IKK-β

erilaisia ​​aineita, mukaan lukien TNF-α, interleukiini-1-beeta (beta), forbolimyristaattiasetaattia (PMA), ja okadahapon (OA) on raportoitu aktivoida NF-KB: n ja PMA: n voivat indusoida NF-KB: n kautta IKK monimutkainen [28], [29] . Esillä olevassa tutkimuksessa, PMS1077 molemmat voivat inhiboida TNF-α ja PMA indusoi NF-KB: n aktiivisuuden (kuvio. 2A ja Fig. S3). TNF-α indusoiman fosforylaation lKB-α katalysoivat IKK. Joka perustuu siihen, että PMS1077 voi estää IKB-α-fosforylaation, mutta PMS601 ei havaittu vaikutusta tämän fosforylaation (kuvio. 4C), me arvioimme sitä, olisiko PMS1077 voitaisiin kohdistaa IKK. Jotta voitaisiin tutkia tätä mahdollisuutta, vertasimme sitoutumisaffiniteetti näiden kahden yhdisteen ja IKK-β käyttämällä laskennallisia menetelmiä. PMS1077 ja PMS601 oli telakoituna IKK-β kinaasidomeenin ja sitoutumisaffiniteetti arvioitiin kolmella eri pisteet toimintoja, jotka olivat AUTODOCK vina pisteet, AUTODOCK pisteet 4,1 ja NNScore 2,0 (katso materiaalit ja menetelmät). Vuodesta AUTODOCK vina pisteet, pisteet PMS1077 on pienempi kuin PMS601, ja lasketun K

d PMS1077 oli n noin 15 kertaa pienempi kuin PMS601. Tämä vahvistettiin kaksi muuta pisteytystä (taulukko 1). Molemmat AUTODOCK pisteet 4,1 ja NNScore 2,0 osoitti, että lasketut K

d PMS1077 oli enemmän kuin kaksi satoja pienempi kuin PMS601. Tämä laskelma on yhtä mieltä esitettyihin tuloksiin (Fig. 4B), joka osoitti mitään selvää muutosta fosforylaation IKB-α at PMS601 pitoisuuksia jopa 80 uM. Yksityiskohdat välistä vuorovaikutusta PMS1077 ja IKK-β oli kuvassa. 6. Hydrofobiset vuorovaikutukset havaittiin myötävaikuttaa eniten sitoutumisaffiniteetti, kuten tähteet LUE21, VAL29, TYR98, ja ILE165. Kaksi vetysidoksia muodostuu THR23 ja PMS1077.

(EN) 3D-malli PMS1077 (pallo ja tikku tyyli) vuorovaikutus IKK-β kinaasidomeeni (tähteet esitetty tikku malli), vetysidoksia esitetään romuttuneet linja. (B) 2D kaavio vuorovaikutukset PMS1077 ja IKK-β.

Tällä tavoin, nämä laskelmat osoittivat, että PMS1077 voi inhiboida NF-KB: n aktivaatio suoraan sitovia IKK-β ja eri sitoutumisaffiniteetti IKK-β johtaa eri toiminta PMS1077 ja PMS601.

PMS1077 herkistyneet syöpäsolujen TNF-α: n indusoiman apoptoosin kautta tukahduttaa TNF-α indusoimaa transkription anti-apoptoottisten geenien

Meidän edellinen työ on osoittanut, että PMS1077 voivat aiheuttaa apoptoosin Raji-soluja [5]. Tässä työssä olemme havainneet, että PMS1077 myös indusoi apoptoosia DU145 ja merkittävästi herkistyneet TNF-α: n indusoiman apoptoosin, mistä on osoituksena MTT-määrityksellä (Fig. 7A), ja ero häiriöitä sijaan mikroskopia (Fig. 7B). Tämä vahvistettiin virtaussytometrialla läpi anneksiini-V-FITC: llä ja propidiumjodidilla (PI) värjäys PMS1077 käsiteltyjen DU145-soluissa, kuten on esitetty kuviossa. 7C.

(A) DU145-soluja käsiteltiin ajoneuvon PMS1077 tai PMS601 kuin Pitoisuus (0-80 uM), ja sitten inkuboitiin kanssa tai ilman TNF-α (20 ng /ml) 24 tuntia. Solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksellä. (B) DU145-soluja käsiteltiin ajoneuvon tai PMS1077 (40 ja 80 uM), ja sitten inkuboitiin TNF-α (20 ng /ml) 24 tuntia. Käsitellyt solut havaittiin differentiaalisella häiriöitä kontrasti mikroskoopilla. (C) DU145-solut käsiteltiin kuten (B) ja apoptoosin analyysi suoritettiin virtaussytometrialla läpi anneksiini-V-FITC: llä ja propidiumjodidilla (PI) värjäämällä käsiteltyjen solujen. (D) DU145-soluja käsiteltiin ajoneuvon tai PMS1077 (40 ja 80 uM), sitten inkuboitiin TNF-α (20 ng /ml) 12 tuntia. Käsittelyn jälkeen, koko solulysaatit valmistettiin ja analysoitiin Western-blottauksella vasta-aineilla, kuten on ilmoitettu. (E) DU145-soluja inkuboitiin TNF-α (20 ng /ml) 1 h, ajoneuvon tai PMS1077 esikäsittely 6 tuntia. MRNA taso NF KB: kohdegeenien tutkittiin käyttäen RT-PCR. (F) DU145-solut käsiteltiin kuten (D) ja kokosolulysaateille valmistettiin ja analysoitiin Western-blottauksella vasta-aineiden kanssa PARP ja GAPDH. Kaikki tiedot esitetään edustavat kolmen erillisen kokeen.

On hyvin tunnettua, että NF-KB: n signalointireitin herkistää TNF-α solukuolema ja TNF-α käytetään usein aiheuttaa solujen apoptoosin [30], [31], [32]. NF-KB-signaloinnin antagonisoi TNF-α ja kemoterapeuttisten aineiden indusoiman apoptoosin edistämällä transkription anti-apoptoottiset geenit, kuten c-FLIP, CIAP-1, CIAP-2, XIAP, surviviini, Bcl-x L ja Bcl-2. Tällä tavoin esto NF-KB: n signalointi voi voimistaa TNF-α: n indusoiman apoptoosin [31], [32], [33], [34]. Sitten määritetään, onko PMS1077 voivat moduloida TNF-α indusoima anti-apoptoosi-geenien Bcl-x L, Bcl-2 ja surviviinille DU145-soluissa. Erityisesti, kun TNF-α hoitoa, näiden geenien ilmentymistä on parantunut, mutta esikäsittely solujen PMS1077 alassäädetty ilmentymistä näiden geenien annoksesta riippuvaisella tavalla sekä proteiini- ja mRNA-tasolla (kuvio. 7D ja 7E). Olemme myös havainneet, että TNF-α aiheuttama lohkaisu PARP lisäsi merkitsevästi PMS1077 (Fig. 7F).