Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Signaalin anturin ja aktivaattori transkription 3 (STST3) on transkriptiotekijä, joka säätelee solujen eri prosesseja, kuten solun eloonjäämisessä, angiogeneesissä ja leviämisen. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme, että betuliinihappo (BA), joka on triterpene kuoresta valkoinen koivu, oli inhiboivia vaikutuksia hypoksia-aktivaatio STAT3 androgeenien riippumaton ihmisen eturauhassyöpä PC-3-soluja.

Menetelmät /Principal havainnot

BA esti proteiinin ilmentymisen ja transkription toimintaa hypoksian indusoituva tekijä-1α (HIF-1α) hypoksisissa kunnossa. Johdonmukaisesti, BA esti hypoksian indusoiman fosforylaation, DNA sitoutumisaktiivisuus ja ydinvoiman kertymistä STAT3. Lisäksi, BA vähentää merkittävästi solun ja erittyneet verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF), joka on kriittinen angiogeeninen tekijä ja kohdegeeni STAT3 indusoituu hypoksian. Lisäksi BA estää

in vitro

kapillaariputki muodostumista ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC), jota pidettiin kunnostetussa alustassa hypoksisten PC-3-soluja, mikä anti-angiogeeninen aktiivisuus BA hypoksisissa kunnossa. Huomattavaa on, että kromatiinin immunosaostus (chip) määritys paljasti, että BA inhiboivat HIF-1α ja STAT3 VEGF promoottori. Lisäksi hiljentäminen STST3 käyttämällä siRNA transfek- tehokkaasti parantaa alennetun VEGF tuotantoa aiheuttama BA hoitoa hypoksiaolosuhteissa.

Johtopäätökset /merkitys

Yhteenvetona tuloksemme viittaavat siihen, että BA on anti-angiogeeninen aktiivisuus häiritsevää sitoutumisen HIF-1α ja STAT3 VEGF-promoottorin hypoksinen PC-3-soluja.

Citation: Shin J, Lee HJ, Jung DB, Jung JH, Lee HJ, Lee EO, et ai. (2011) tukahduttaminen STAT3 ja HIF-1 Alpha sovittelee antiangiogeenisen Betuliinihapon in Hypoxic PC-3 syöpäsolujen. PLoS ONE 6 (6): e21492. doi: 10,1371 /journal.pone.0021492

Editor: Karen L. Mossman, McMaster University, Kanada

vastaanotettu: 16 maaliskuu 2011; Hyväksytty: 29 toukokuu 2011; Julkaistu: 24 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Shin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Korean Science and Engineering Foundationin (KOSEF) Grant rahoittama Korean hallitus (MEST) (nro 2011-0063466). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Signaalin anturin ja aktivaattori transkription 3 (STST3) on yksi STAT proteiinien perheen ja konstitutiivisesti aktiivinen monenlaisia ​​ihmisen syöpäsoluja [1]. Aktivoitu STAT3 proteiinien sytokiinien ja kasvutekijöiden muodostavat homo- tai heterodimeerejä, ja sitten siirtävät sytoplasmasta tumaan, jossa ne sitoutuminen promoottori eri geenin tuotteita mukana anti-apoptoosin (BCL-2, Bcl-x

L ja surviviini), proliferaation (sykliini D1), ja angiogeneesi (verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF)) [2]. Mielenkiintoista on, että viimeaikaiset tutkimukset raportoitu, että STAT3 on aktivoitu vasteena hypoksia, yhteinen piirre erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia [3], [4]. Aktivoitu STAT3 välittää säätely ylöspäin hypoksian indusoima tekijä alfa (HIF-1α), tärkeä säätelijä sopeutua hypoksisissa olosuhteissa lisäämällä sen vakaus ja transkriptioaktiviteettia [5]. Niinpä äskettäin STST3 ja HIF-1α ovat houkutteleva kohde molekyylejä luonnollisia yhdisteitä ja kasviuutteet syöpätutkimuksessa.

betuliinihappoa (BA), aluksi raportoitu ihmisen melanooma-spesifinen estäjä, on triterpenoidi pääosin johdettu kuori valkoinen koivu (

hieskoivu

) [6]. Viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, syövän vaikutukset BA [7], [8], anti-inflammatoriset [9] ja anti-virus [10] toiminnan kautta eri signalointireittejä, kuten epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) [11], hedgehog [12], signaalinmuuntajana ja aktivaattori transkription 3 (STST3) [13] ja tumatekijä-kappa B (NF-KB) [14]. Siitä huolimatta ei ole mitään todisteita siitä, että BA välittää syövän vastaista aktiivisuutta estämällä STST3 signalointia kiinteitä kasvaimia.

Näin ollen esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet roolit STAT3 ja HIF-1 α BA aiheuttama anti- angiogeeninen aktiivisuus hypoksinen PC-3 syöpäsolujen MTT: llä, Western blotting, immunosytokemia, ELISA ja EMSA.

tulokset

solumyrkkyvaikutuksessa betuliinihapon (BA) vastaan ​​PC-3-solujen

solumyrkkyvaikutuksessa BA (Fig. 1) arvioitiin MTT: llä. PC-3-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla BA (0, 12,5, 25, 50 tai 100 uM) 24 tuntia. Solujen elinkelpoisuus aleni 78,49 ± 5,67 ja 62,64 ± 1,26% pitoisuuksilla 12,5 ja 25 uM, vastaavasti, ja jatkuva to~60% yli 25 uM (kuvio. 2A).

Molekyylipaino = 456.

(A) PC-3-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla BA (0, 12,5, 25, 50 tai 100 uM) 24 tuntia. Solujen elinkykyisyys analysoitiin MTT-määrityksellä. (B) Soluja altistettiin normoksia tai hypoksia 0,5, 2, 4, 6, 8, 12 tai 24 h. Solulysaatit valmistettiin ja alistettiin Western-blottauksella ekspression määrittämiseksi HIF-1α. (C) Soluja käsiteltiin tai ilman BA (5 tai 10 uM) mukaisesti normoxic tai hypoksisissa ehto 4 tuntia. Solulysaatit valmistettiin ja alistettiin Western-blottauksella ekspression määrittämiseksi HIF-1α. (D) Tumauute valmistettiin soluista käsiteltiin BA (0, 10, 20 tai 40 uM) mukaisesti normoksia tai hypoksia 4 tuntia. HIF-1α transkription aktiivisuus mitattiin käyttäen TransAm HIF-1-transkriptiotekijän määritys kit. Tiedot edustavat keskiarvoja ± S.D.

##, p 0,01

vs

normoksia ohjaus, ja

*, p 0,05 ja

** 0,01

vs

hypoksian ohjaus.

Vaikutus Betuliinihapon (BA) happivajaus aiheuttama HIF-1α aktivaation PC-3-solujen

Hypoksia on tunnusmerkki kiinteitä kasvaimia [15] ja HIF-1α on transkriptiotekijä, joka vastaukset hypoksia [16]. Oliko BA voi vaikuttaa HIF-1α aiheuttama hypoksia, ensin määritellään paras aika pisteen hypoksian aiheuttaman HIF-1α ilmentymistä PC-3-solut. Solut altistettiin normoksia tai hypoksia 0,5, 2, 4, 6, 8, 12 tai 24 h. HIF-1α ilmentyminen dramaattisesti aiheuttama hypoksisissa ehto 4 h (Fig. 2B). Sitten soluja käsiteltiin kanssa tai ilman BA hypoksiaolosuhteissa 4 tuntia. BA laski hypoksian indusoiman HIF-1α ilmentymisen annoksesta riippuvalla tavalla verrattuna hypoksian ohjaus (Fig. 2C). Lisäksi, hypoksia merkittävästi aktivoitu HIF-1α transkription, kun taas BA hoidon esti hypoksia-välitteisen transkription aktivoitumisen HIF-1α annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 2D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että BA on kyky estää ilmentymisen sekä transkription HIF-1α in hypoksinen PC-3-soluja.

Vaikutus Betuliinihapon (BA) on hypoksian indusoiman STAT3 aktivaation PC-3 solut

Viimeaikaiset tutkimukset raportoitu, että transkriptiotekijä STST3 on mukana transkription säätelyyn HIF-1α [17]. Tutkimuksessamme hypoksia parannettu fosfo- STAT3 tason samalla normoksia ei vaikuttanut sitä. BA hoito esti hypoksia-välitteisen STAT3 fosforylaation annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 3A). Lisäksi, EMSA paljasti, että BA esti STAT3 /DNA-sitoutumisaktiivisuutta hypoksiaolosuhteissa annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 3B). Lisäksi imunocytochemical (ICC) värjäys anti-HIF-1α-vasta osoitti merkittävää ydin- ilmaus HIF-1α hypoksisissa kunnossa. Sen sijaan, BA hoito heikennettyjä HIF-1α ilmentymisen tumaan hypoksinen PC-3-solut (Fig. 3C), mikä viittaa siihen, sen inhiboiva vaikutus tumaansiirtymiseen HIF-1α.

PC-3-soluja käsiteltiin tai ilman BA (5 tai 10 uM) alle normoxic tai hypoksinen ehto 4 tuntia. (A) Solulysaatit valmistettiin ja alistettiin Western-blottaus ja fosfo-STAT3 ja STAT3. (B) NMR-uutteet valmistettiin ja levitettiin EMSA analysoida STAT3 DNA: ta sitovan aktiivisuuden. (C) Soluja käsiteltiin tai ilman BA (10 uM) hypoksiassa. Immunosytokemiassa suoritettiin STST3. DAB (ruskea) ja hematoksyliini-eosiinilla käytettiin substraattina ja counterstaining, vastaavasti.

Effects Betuliinihapon (BA) on hypoksian indusoiman angiogeneesin

Hypoksia on yksi angiogeneesin indusoijat kautta HIF-1α aktivointi [18]. Siten estävää vaikutusta BA arvioitiin hypoksia-välitteisen angiogeneesin. VEGF, kriittinen angiogeneesitekijää [19], arvioitiin eritettyä solun ja proteiinin tasot ELISA: lla ja Western-blottauksella, vastaavasti. BA merkittävästi vähentää VEGF-tuotannon annoksesta riippuvaisella tavalla ELISA: lla (Fig. 4A). Johdonmukaisesti, BA heikennettyjä VEGF-proteiinin ilmentymisen annoksesta riippuvalla tavalla Western blottauksella (kuvio. 4B).

(A ja B), PC-3-soluja käsiteltiin 0, 5 tai 10 uM BA 24 tuntia . (A) VEGF tasot viljelmäsupernatanteissa mitattiin käyttämällä Quantikine VEGF ELISA-kitillä. (B) Solulysaatit valmistettiin ja alistettiin Western blotting määrittämiseksi VEGF ilmentymisen. Käyrät edustavat suhteellisia kaistaintensiteettejä VEGF /β-aktiini. Tiedot edustavat keskiarvoja ± S.D.

##, p 0,01

vs

normoksia ohjaus, ja

*, p 0,05 ja

** 0,01

vs

hypoksian ohjaus. (C) HUVEC käsiteltiin VEGF: n (20 ng /ml) positiivisena kontrollina tai viljelmän supernatantista PC-3-solut, joita käsiteltiin tai ei BA (10 uM) mukaisesti normoksia tai hypoksia. -Putken muodostumiseen määritys suoritettiin käyttäen kasvutekijä vähentää Matrigel. Solut kiinnitettiin Diff-Quick ratkaisu, valokuvataan satunnaisesti alle Axiovert S 100 valon mikroskoopilla x 100 suurennus ja laskettiin.

Lisäksi HUVEC-putken muodostumiseen määritys, joka tunnetaan tyypillinen angiogeneesin

in vitro

mallissa suoritettiin vahvistamaan antiangiogeeniset vaikutus BA happivajaus välittämän angiogeneesiä. VEGF käytettiin positiivisena kontrollina angiogeneesin induktio. HUVEC-soluja sekoitetaan supernatantit PC-3-soluja viljeltiin puuttuessa tai läsnä BA hypoksiassa. Kuten on esitetty kuviossa. 4C, hypoksian indusoiman putken muodostumiseen estettiin BA käsittely PC-3-solut, kun taas kirkas putken muodostumiseen oli esillä käsittelemätön kontrolli hypoksiaolosuhteissa, mikä viittaa siihen, että BA estää hypoksia-välitteistä angiogeneesiä.

Effects Betuliinihapon (BA ) on sitoutumisen STAT3 ja HIF1 α VEGF-promoottorin hypoksinen PC-3-solujen

Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että STAT3 aktivointi on yhdistää suoraan transkription säätelyyn VEGF sitoutumalla VEGF-promoottori [20], [ ,,,0],21]. Tämän valossa tapahtuman teimme kromatiinin immunosaostuksella (chip) määritys. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, sitova aktiivisuus STAT3 ja HIF-1α VEGF-promoottorin havaittiin hypoksiassa (kaistat 5-8), verrataan normoksia (kaistat 1-4). Erityisesti, BA hoito tukahdutti sitoutuminen STAT3 ja HIF-1α VEGF-promoottorin hypoksinen kunnossa (kaistat 9-12).

(A) PC-3-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman BA (10 uM) mukaisesti normoksia tai hypoksia 4 tuntia. Immunosaostetut DNA kanin normaali IgG, HIF-1α tai STAT3-vasta-monistettiin PCR-analyysi VEGF-promoottori. (B) Soluja transfektoitiin siRNA: lla ja hajo- tai STAT3 24 tuntia ja käsiteltiin kanssa tai ilman BA (10 uM) 18 tunnin ajan hypoksian. VEGF-tasot viljelmäsupernatanteissa mitattiin käyttämällä Quantikine VEGF ELISA-kitillä. Tiedot edustavat keskiarvoja ± S.D.

#, p 0,05

vs

ohjaus, ja

*, p 0,05

vs

ohjaus siRNA. Solulysaatit altistettiin Western blotting varten fosfo-STAT3, STAT3 ja HIF-1α.

Sen vahvistamiseksi keskeistä asemaa STST3 anti-angiogeeninen sääntely Ba hypoksinen PC-3-solut, STAT3 siRNA transfektio suoritettiin PC-3-solut. Hoito joko BA tai STAT3 siRNA vähensi tuotantoa VEGF 39,6% ja 45,9% vastaavasti, verrattuna käsittelemättömään kontrolliin. Lisäksi BA hoito vähensi merkitsevästi VEGF tuotantoa 63,25% vuonna STST3 siRNA-transfektoiduissa PC-3-solut (Fig. 5B). Western blotting osoitti, että siRNA varten STAT3, mutta ei hallita tehokkaasti estetty STAT3 (Fig. 5B).

Keskustelu

Eturauhassyöpä luokitellaan adenokarsinooma on toiseksi yleisin pahanlaatuisia kasvaimia American men ja arvio 192280 uutta tapausta ja noin 27360 kuolemaa vuonna 2009 [22], [23]. Betuliinihappo (BA), kasviperäinen pentasyklisestä lupane-tyyppinen triterpenoid, voidaan uuttaa eri kasveista, kuten

Sarracenia flava

[24],

Diospyros

spp.,

Inga punctata

[25],

Ziziphus

spp., ja

Vauquelinia corymbosa

[26]. Useat ryhmät raportoitu syövän vastaista aktiivisuutta BA erilaisissa syövissä, mukaan lukien keuhko-, peräsuolen syöpä, rintasyöpä, eturauhassyöpä ja kohdunkaulan syöpä [27], mutta ei normaaleissa soluissa [28]. Myös BA estivät täysin kasvaimen kasvua ilman myrkyllisyyttä kateenkorvattomissa hiirissä, joilla on ihmisen ihosyövän [6]. Lisäksi syövän vastaista aktiivisuutta ja BA aiheuttaman apoptoosin indusoimiseksi syöpäsoluja. Esimerkiksi, BA: n indusoiman apoptoosin oli riippumaton p53 neurorectodermal kasvaimen [29] ja melanoomasoluja [30]. Vuonna neuroblastoomasoluja, BA: n indusoiman apoptoosin menetyksen kautta mitokondrion kalvon potentiaalia, reaktiivisen hapen (ROS) tuotanto ja kaspaasin aktivaatio [31].

Mielenkiintoista, Karna ja kollegat raportoi äskettäin, että BA esti ilmaus HIF- 1α ja endoteelikasvutekijä (VEGF) ihmisen kohdun limakalvon syövän solujen [32]. Kuitenkin sääntelyn mekanismeja, joilla BA estää angiogeneesin ei täysin tunneta. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että BA tukahdutettu hypoksia välittämän proteiinien kertymistä, transkription aktivaatio ja ydinvoiman lokalisointi HIF-1α PC-3-solut. Yhdenmukainen tulokset Karna paperi-, meidän tiedot osoittivat myös, että BA merkitsevästi esti VEGF eritystä ja proteiinin ilmentymistä hypoksinen PC-3-solut. Lisäksi

in vitro

putken muodostumiseen määrityksessä vahvistivat lisäksi anti-angiogenenic vaikutus Ba hypoksinen PC-3-solut.

Äskettäin Niu ja työtovereiden ehdotti, että konstitutiivisesti aktivoitu STST3 sääteli VEGF ja indusoitiin kasvaimen angiogeneesi [20]. Lisäksi, Wei ja kollegat raportoitu, että STAT3 aktivointi säätelee VEGF: n ilmentymistä ja ihmisen haimasyövän angiogeneesin Lisäksi useita asiakirjoja kuvattu rooli STAT3 mahdollisena modulaattori HIF-1α-indusoitu VEGF signaloinnin syöpäsoluissa [4], [33] . Tässä suhteessa vaikutusta BA STAT3 ja HIF-1α aktivaatio tutkittiin hypoksinen PC-3-solujen tutkimuksessamme. Yhdenmukainen todisteita mukaan Pandey ja työtovereiden että BA tukahdutettiin STST3 aktivointi useita myeloomasoluja [13], BA esti hypoksian aiheuttamaa tyrosiinifosforylaation, sitoutuu DNA: han ja ydinvoiman translocalization of STAT3, mikä viittaa estävää vaikutusta muihin BA STAT3 aktivointia.

VEGF promoottori sisältää erilaisia ​​transkriptiotekijän sitoutumiskohdista lukien STST3 [20] sekä HIF-1 [34]. Fyysinen vuorovaikutus STAT3 kanssa HIF-1 ohjaa VEGF transkription aktivointi niiden sitoutuminen VEGF promoottori [4]. Tutkimuksessamme hypoksia edistänyt sitoutumista STAT3 ja HIF-1α VEGF-promoottorin PC-3-soluja. Sen sijaan, BA merkittävästi inhiboi STAT3 ja HIF-1α VEGF-promoottorin sivuston hypoksisissa kunnossa. Lisäksi hiljentäminen STST3 käyttämällä erityistä siRNA merkittävästi parannettu BA välittämää VEGF tuotantoa, mikä osallistuminen STAT3 anti-angiogeeninen sääntely Ba hypoksinen PC-3-solut. Samanlaisia ​​Tutkimuksessamme Gariboldi ja kollegat ilmoitti, että NVP-AEW541, joka on IGFR1 estäjä, häiritsi IGF /STST3 /HIF1 reitin ihmisen glioblastoomasoluissa [35]. Leeman-Neill ja työtovereiden myös raportoitu, että guggulsterone esti STST3 ja HIF-1α ja ehdotti biologinen perustelut edelleen kliinisen tutkimuksen BA ihmisen pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) hoito [36].

Yhdessä meidän tiedot osoittavat, että BA tukahdutti ilmaisun ja transaktivaation hypoksian aiheuttaman HIF-1α, STAT3, VEGF sekä kapillaariputken muodostumista PC-3-solut. On huomionarvoista, että syövän vastaista aktiivisuutta BA kohdistamaa angiogeneesin eston kautta sitoutumisen STAT3 ja HIF-1α VEGF-promoottorin PC-3-soluja. Siten meidän havainnot viittaavat siihen, että BA voi olla voimakas anti-angiogeeninen aine kohdistamalla STST3 /HIF-1α /VEGF signalointi eturauhassyöpähoidolle.

Materiaalit ja menetelmät

yhdisteet

betuliinihappoa (BA) (kuvio 1) ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) ja liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) kuin 10 mM varastoliuosta koekäyttöön.

Soluviljely

Ihmisen eturauhassyöpä-solulinjaa PC-3 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) ja pidettiin RPMI1640 (Welgene, Daegu, Korea), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% antibiootti-antimyotic ratkaisu. Ihmisen napalaskimon endoteelisolut (HUVEC) eristettiin tuoreesta ihmisen napanuoran laskimon ja ylläpidetään EBM-2 (Lonza, Valais, Sveitsi), jota oli täydennetty 2% FBS: ää, 0,04% hydrokortisonia, 0,1% VEGF, 0,1% IGF-1, 0,4 % hFGF-B, 0,1% hEGF, 0,1% askorbiinihappoa, ja 1% hepariinia.

Hypoksia induktio

Soluja inkuboitiin anaerobisissa inkubaattorissa 94% N

2, 5% CO

2 ja 1% O

2 (Thermo tieteellinen, Rockford, IL) kuten aiemmin on kuvattu [37].

Sytotoksisuusmääritvs

arvioimiseksi sytotoksisuuden BA, 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [38]. PC-3-solut maljattiin 96-kuoppaisille mikrolevyille tiheydellä 1 x 10

4 solua per kuoppa ja altistettiin eri pitoisuuksia BA (0, 12,5, 25, 50 tai 100 uM) 24 tuntia. MTT-liuosta (1 mg /ml) (Sigma-Aldrich) lisättiin päälle kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 2 tuntia 37 ° C: ssa. Uuttopuskuria (20% SDS: ää ja 50% dimetyyliformamidia) lisättiin sitten, ja optinen tiheys (OD) mitattiin käyttämällä mikrolevylukijaa (Tecan Austria GmbH, Grödig, Itävalta) aallonpituudella 570 nm. Solujen elinkelpoisuus laskettiin prosenttiosuutena elinkelpoisten solujen BA-hoidetussa ryhmässä verrattuna käsittelemättömään kontrolliin mukaan seuraavan yhtälön.

solujen elinkelpoisuuden (%) = [OD (BA) – OD (Blank)] /[OD (Ohjaus ) – OD (tyhjä)] x 100

Western blot-analyysi

Koko-solu-uutteet valmistettiin käyttäen lyysipuskuria [50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% triton X -100, 0,01% SDS, 1 mM EDTA (pH 8,0) ja proteaasiestäjäseostabletit tabletit (Roche Applied Science, Inndianapolis, IN)]. Nuclear ja sytoplasminen uutteet saatiin fraktioitiin käyttäen NE-PER ydin- ja sytoplasman uuttoreagenssit (Thermo tieteellinen, Rockford, IL). Proteiini näytteet erotettiin 10% SDS-PAGE geelillä ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Kalvo blokattiin 5% rasvatonta kuorittua maitoa, ja koetettiin ensisijaisen vasta-HIF-1α (1:500, Gene Tex, Irvine, CA), STAT3 (1:1000, Cell Signaling, Danvers, MA), fosfori-STAT3 (1:500, Cell Signaling, Danvers, MA), VEGF (1:500, Santa Cruz Biotekniikka, Santa Cruz, CA) ja β-aktiini (Sigma, St. Louis, MO) yön yli 4 ° C: ssa. Kalvot altistettiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineilla 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja proteiinin ilmentymistä havaittiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssi- (ECL) Western blotting detektioreagenssi (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ).

HIF-1α transkription aktiivisuuden määritys

HIF-1α transkriptionaalista aktiivisuutta analysoitiin HIF-1α transkriptiotekijä määritys käyttäen TransAm HIF-1-transkriptiotekijän iinianalyysikitissä (Active Motif, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti tumauutteita lisättiin 96-kuoppaisen mikrolevyn päällystetty oligonukleotideja, jotka sisältävät hypoksia-vaste-elementin (HRE) (5′-TACGTGCT-3 ’) erytropoietiini (EPO) geenin. HIF dimeerejä läsnä tumaekstrakteilla sitoutuvat korkealla spesifisyydellä tämän vaste-elementin ja myöhemmin havaitaan vastaan ​​kohdistettu vasta HIF-1α. Lisäämällä sekundäärinen vasta-aine oli konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (HRP) tarjoaa herkän kolorimetrinen lukeman, joka on helposti määrällisesti spektrofotometrisesti. Arvot ilmaistaan ​​optisen tiheyden (OD) 450 nm: ssä, jossa on viite aallonpituudella 655 nm.

Immunosytokemia

PC-3-solut ympättiin 4-kammion dioja tiheydellä 3 x 10

4 solua per säiliö ja käsitelty tai ilman BA (10 uM) hypoksiaolosuhteissa aikaisemmin kuvatulla [37]. Solut kiinnitettiin 4% formaldehydiä, liuos 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja blokattiin blokkauspuskurissa (10% BSA /Triton X-100 PBS: ssa), joka sisälsi 6% hevosen seerumia, 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Levyjä inkuboitiin anti-STAT3 (1: 100) vasta-aineen yli yön 4 ° C: ssa, ja sitten tutkittiin anti-hiiri- tai kanin biotinyloitua vasta-aineita (Vector Labs, Burlingame, CA) 1,5 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Ilmaisu havaittiin käyttämällä Vector ABC monimutkaisia ​​/HRP Kit (Vector Labs, Burlingame, CA) ja väri-kehitetty 3,3′-diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla pimeässä. Sitten koekappaleet vastavärjättiin hematoksyliini-eosiinilla (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ja analysoitiin mikroskoopilla (Leica Res., Wetzlar, Saksa).

Elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä (EMSA)

STST3-DNA: ta sitova analysoitiin elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä (EMSA) käyttäen Gelshift Kemiluminesenssiin EMSA kit (Active motiivi, Carlsbad, CA), kuten aiemmin on kuvattu [39]. Lyhyesti tumauutteita valmistettiin anetolin käsiteltyjä soluja ja inkuboitiin STAT3 konsensus oligonukleotidien (5′- CTT CAT TTC CCG TAA ATC CCT AAA GCT-3 ’) (Santa Cruz Biotekniikka, Santa Cruz, CA). DNA-proteiini-kompleksi on muodostettu erotettiin vapaasta oligonukleotidien 5% natiivi polyakryyliamidigeeleillä. Kemiluminesenssiosoitusta suoritettiin käyttäen ECL-reagensseilla mukaan myyjän protokollat ​​(GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ).

In vitro-putken muodostumiseen määritys

In vitro-putken muodostumiseen Määritys suoritettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [40]. Matrigel (BD), lisättiin 24-kuoppaisille levyille ja polymeroitiin inkuboimalla 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. HUVEC-solut ympättiin Matrigel päällystetyille levyille ja inkuboitiin EBM-2, johon oli lisätty VEGF: ää (20 ng /ml) tai supernatantti PC-3-soluja käsiteltiin BA (0 tai 10 uM) mukaisesti normoksia tai hypoksia 24 tuntia. Kun 8 tunnin inkuboinnin jälkeen solut kiinnitettiin 4% formaldehydiä ja satunnaisesti valitun kentät valokuvattiin alle Axiovert S 100 valomikroskoopilla (Carl Zeiss, Weimar, Saksa) 100 x suurennus.

Entsyymi-immunologinen määritys ( ELISA) VEGF

PC-3-solut maljattiin 60 mm: n malja, jonka tiheys 1 x 10

6 solua /malja ja inkuboitiin puuttuessa tai läsnä ollessa BA (10 uM) mukaisesti normoksia tai hypoksia 24 tuntia. VEGF taso supernatantissa mitattiin käyttäen ihmisen VEGF ELISA kit mukaan valmistajan protokollan (Biosource International Inc., Camarillo, CA).

Kromatiini immunosaostuksella (chip) määritys

PC-3 maljattiin 100 mm maljoille tiheydessä 1,5 x 10

6 solua /malja, käsiteltiin BA 4 h alle normoxic tai hypoksinen kunnossa ja sen jälkeen 1% formaldehydiä ja 0,125 M glysiiniä. Liukoiset kromatiini eristettiin käyttämällä EZ-Zyme chromatin prep kit (Millipore, Billerica, MA) ja immunosaostettiin vasta normaalin kaniinin IgG (EMD biotieteiden, Gibbstown, NJ), HIF-1α tai STAT3. Histoni /DNA-silloitukset palautettiin lisäämällä 5 M NaCl: a 65 ° C: ssa 4 h, jonka jälkeen uutetaan fenoli /kloroformilla ja saostetaan etanolilla. PCR-reaktio suoritettiin monistamaan VEGF-promoottorin käyttämällä siru alukkeita (sense 5′-AGACTCCACAGTGCATACGTG-3 ’ja antisense 5′-AGTGTGTCCCTCTGACAATG-3’.

siRNA trasnfection

PC-3-soluja väliaikaisesti transfektoitu hajotus- tai STAT3 siRNA (SantaCruz bioteknologia, SantaCruz, CA) 50 nM käyttäen INTERFERin siRNA transfektioreagenssia (Polyplus-transfektio Inc., New York, NY). Kun oli inkuboitu 24 tuntia, soluja käsiteltiin BA ja ylläpidetään 18 tunnin hypoksiaolosuhteissa.

tilastollinen

Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvoina ± SD tilastollinen merkittävyys analysoitiin Studentin t-testiä.