Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

arvioitiin hyödyllisyys dual PI3K /mTOR-estäjä NVP-BEZ235 (BEZ235) monoterapiana hoitoa ja yhdistelmänä tavanomaisten kemoterapiaa kilpirauhassyöpä.

Menetelmät /Principal havainnot

Kahdeksan solulinjoja neljänlaisia ​​kilpirauhassyöpä (papillaarinen, follikulaarinen anaplastinen, medullaarinen) tutkittiin. Sytotoksisuuden BEZ235 ja viisi tavanomaisten kemoterapeuttisten aineiden yksinään ja yhdistelmänä mitattiin LDH-määritystä. Kvantitatiivinen western blot arvioida proteiinien ilmentymiseen, joka liittyy solusyklin, apoptoosin ja signalointireittejä. Solusyklin jakautuminen ja apoptoosin mitattiin virtaussytometrialla. Hiiren kylki anaplastinen kilpirauhassyöpä (ATC) hoidettiin suun kautta BEZ235 päivittäin. Huomasimme, että BEZ235 esti soluproliferaatiota kaikista syövän linjat, ATC näytteille suurin herkkyys. BEZ235 johdonmukaisesti inaktivoitu signalointi alavirtaan mTORC1. BEZ235 yleensä aiheuttama solusyklin pysähtymisen G0 /G1 vaiheeseen, ja aiheutti myös apoptoosin herkin solulinjat. Lähtötasot p-S6 ribosomaalisen proteiinin (Ser235 /236) ja p27 korreloi BEZ235 herkkyys. Kasvu 8505C ATC ksenograftikasvaimissa inhiboitui BEZ235 ilman havaittu toksisuus. Yhdistelmähoito on BEZ235 ja paklitakselin johdonmukaisesti osoittaneet synergistisiä vaikutuksia vastaan ​​ATC

in vitro

.

Johtopäätökset

BEZ235 yksittäisenä terapeuttisena aineena estää kilpirauhassyöpä lisääntymistä ja on synergistisiä vaikutuksia yhdistelmänä paklitakselin hoidossa ATC. Nämä havainnot kannustavat tulevaisuudessa kliinisissä tutkimuksissa BEZ235 potilaille tämän kuolemaan johtava sairaus.

Citation: Lin SF, Huang YY, Lin JD, Chou TC, Hsueh C, Wong RJ (2012) Utility of PI3K /mTOR Inhibitor (NVP-BEZ235) varten Kilpirauhasen Cancer Therapy. PLoS ONE 7 (10): e46726. doi: 10,1371 /journal.pone.0046726

Editor: Guillermo Velasco, Complutense University, Espanja

vastaanotettu: 21 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 06 syyskuu 2012; Julkaistu: 15 lokakuu 2012

Copyright: © Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Science neuvoston Taiwan, Kiinan tasavalta (NSC 98-2314-B-182A-012 -MY3) (https://web1.nsc.gov.tw/) ja osittain avustuksia Chang Gung Memorial Hospital ja Chang Gung University (CMRPG370581, CMRPG370582, CMRPG370583, CMRPG3A0161) (https://www.cgmh.org.tw/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kilpirauhassyöpä on yleisin hormonitoimintaa maligniteetti, joka on peräisin kilpirauhasen follikulaarinen soluista (papillaarinen, follikulaarinen huonosti eriytetty ja anaplastinen syöpä) tai parafollicular C soluja (medullaarista syöpä). Ilmaantuvuus kilpirauhasen syöpä on kasvanut viime 3 vuosikymmeninä lähinnä kasvusta havaitsemiseksi papillaarisen syövän. Sen sijaan, ilmaantuvuus follikkelien ja huonosti eriytetty kilpirauhassyöpä pysyy muuttumattomana [1], [2]. Useimmat potilaat, joilla on hyvin erilaistunut syöpä, mukaan lukien papillaarinen (PTC) ja follikulaarinen (FTC) kilpirauhassyöpä on suotuisa ennuste. Kuitenkin noin 5%: lle potilaista kehittyy radioaktiivisen jodin tulenkestävä kasvaimia ja yleensä aiheuttaa kuoleman 5 vuoden kuluessa [3]. Anaplastic kilpirauhassyöpä (ATC) on harvinainen, erittäin aggressiivinen, ja usein kuolemaan johtava sairaus, jossa on mediaanielossaolosta vain 6 kuukautta. Medullary kilpirauhassyöpä (MTC) osuus 3-5% kilpirauhasen maligniteetti. Taajuus alue- ja kaukaisten etäpesäkkeitä MTC vähentää selviytymisasteet [4], [5]. Uusien hoitomuotojen tulenkestäviä ja aggressiivinen kilpirauhassyöpä parantamiseksi tarvitaan nykyään huono tuloksia näille potilaille.

PI3K /mTOR-reitti on tärkeä solujen aineenvaihduntaa, selviytymistä ja proliferaatiota. Luokka I

PI3K ovat heterodimeerejä sisältävät p85 sääntely- ja p110 katalyyttinen alayksiköistä, jotka fosforyloivat fosfatidyyli-4,5 faatti (PIP

2), jolloin saatiin fosfatidyyli-3,4,5-trifosfaatin (PIP

3). PIP

3 yhdistyy fosfoinositidi-riippuvaisen proteiinikinaasi 1 (PDK1) fosfory- AKT klo Thr308. Lisäksi, fosforylaatio AKT Ser 473, jonka mTORC2 tarvitaan täyden aktiivisuuden AKT. Aktivointi AKT fosforyloi mTORC1, joka sittemmin fosforyloi S6 kinase1 ja 4E-BP1, mikä johtaa G1 /S solusyklin etenemisen ja apoptoosin. PTEN on tuumorisuppressorina joka defosforyloi PIP

3 ja inaktivoi tämän reitin [6], [7]. Muutokset Tämän signalointireitin esiintyy usein maligniteettien ja ovat potentiaalisia kohteita syövän hoidossa [6] – [8].

kilpirauhassyöpä, geneettiset muutokset vaikuttavat PI3K /mTOR-reitin on tunnistettu.

PIK3CA

(koodaus p110α luokan I

PI3K) kopiomäärä voitto korreloi lisääntynyt

PIK3CA

proteiinin ilmentymisen.

PIK3CA

kopioi vahvistuksenkertojan esiintyy useammin kuin geneettisiä mutaatioita

PIK3CA

tai

PTEN

kilpirauhassyövän hoitoon [9] – [14]. Enemmän

PIK3CA /AKT1

mutaatioita ja

PIK3CA

kopioi voitto tunnistetaan ATC verrattuna hyvin eriytetty syöpää, mikä viittaa siihen, että PI3K /mTOR-reitin aktiivisuus on mukana prosessissa syövän dedifferentiaation [ ,,,0],3], [11], [12]. MTC,

RET

esikasvaintekijän mutaatioita esiintyy lähes kaikissa tuttuja tapauksia (25% MTC) ja noin puolet satunnaista MTC. Tämä voitto-of-function uudelleenjärjestely parantaa PI3K /mTOR signaalitransduktioreittiin [15], [16]. Satunnaista MTC ilman

RET

mutaatioita, yli 50% tuumorin näytteissä aktivointi AKT tai mTOR immunohistokemiallisesti [16].

BEZ235 on kaksi PI3K /mTOR-estäjä, joka vähentää PI3K ja mTOR kinaasitoiminta sitoutumalla kompetitiivisesti ATP-sitoutuminen halkeama näiden entsyymien [17]. BEZ235 voi hoitaa syöpiä kautta induktion G0 /G1 solusyklin pysähtymiseen ja apoptoosiin, ja on viime aikoina tullut vaiheen II kliinisissä kokeissa [17] – [22]. Tämä tutkimus suoritettiin arvioimaan tehoa BEZ235 hoidettaessa kilpirauhassyöpä neljä merkittävää patologinen tyypit, mukaan lukien PTC, FTC, ATC ja MTC. Olemme myös tutkittu yhdistelmä vaikutukset BEZ235 ja työskentelee tällä hetkellä kemoterapeuttisia vastaan ​​neljä ATC solulinjoja.

Tulokset

sytotoksisuus BEZ235

BEZ235 esti solujen lisääntymistä kaikissa kilpirauhassyöpä rivejä annoksesta ja riippuvaisella tavalla (kuvio 1A). Matala annos BEZ235 6,25 nmol /l haitannut vähintään 30% solujen kasvua 6 8 solulinjojen päivänä 4. BEZ235 100 nmol /l pidättänyt yli 80% solukasvua ATC linjat, 78% vuonna medullary ( TT) ja yli 74% hyvin kilpirauhassyöpäpotilailla linjat. DM on BEZ235 päivänä 4 laskettiin kullekin solulinja (kuvio 1 B). 4 ATC linjat olivat herkkiä BEZ235 (Dm, KAT4C = 3,9, KAT18 = 6,6, 8305C = 6,7, 8505C = 9,3 nmol /l), jonka jälkeen follikulaarinen erilaistumaton syöpä FRO81-2 (Dm, 10,6 nmol /L) . Medullaarinen kilpirauhassyöpä (TT), hyvin erilaistunut papillaarinen (BHP7-13), ja follikulaarinen (WRO82-1) syöpä olivat vähemmän herkkiä (Dm 17,1, 17,2, ja 43,1 nmol /l, tässä järjestyksessä).

A, annos-vaste-käyrät saatiin päivittäin käsiteltyjä soluja, joilla on erilaisia ​​kuusi 01:01 laimennosten BEZ235. B Dm BEZ235 päivänä 4 laskettiin CompuSyn ohjelmisto kustakin solulinjasta. ATC solulinjoja (KAT4C, KAT18, 8305C ja 8505C) oli alhaisin Dm ja näin herkimpiä, seuraa by follikulaarinen erilaistumaton kilpirauhassyöpä (FRO81-2), medullaarinen (TT) ja hyvin erilaistunut papillaarinen (BHP7-13) ja follikulaarinen ( WRO82-1) syöpä.

modulaatio signalointipolkujen tekijänä BEZ235

vaikutukset BEZ235 on signalointipolkujen tutkittiin 8505C, TT ja BHP7-13 solulinjoissa (kuvio 2, Kuva S1). p-4E-BP1 (Thr70), p-4E-BP1 (Thr37 /46) ja p-S6 ribosomaalinen proteiini (Ser235 /236) olivat kaikki jatkuvasti tukahdutettu BEZ235 2 tunnin kuluessa, ja eston vaikutus oli merkittävä ja kestävä, vähemmän yli 12% proteiinia havaittiin 24 tunnin kuluttua. p-ERK1 /2 (Thr 202 /Tyr204) aktivoitiin BEZ235 kanssa 2,6-8,6-kertainen nousu 2-8 tuntia kolmessa solulinjoissa. Kuitenkin BEZ235 oli heterogeeninen vaikutuksia p-AKT (Thr308) ja p-AKT (Ser473), joka voitiin estää ajaksi TT ja BHP7-13, mutta olivat pysyvästi lisääntynyt 8505C. Kuten 8505C soluissa, in KAT4C soluissa BEZ235 samoin inhiboi p-S6 ribosomaalinen proteiini (Ser235 /236), mutta aktivoitu p-AKT (Thr308), p-AKT (Ser473) ja p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), ( Kuva S1 ja S2A). Immunoblottaustietojen kvantifioitiin ja tilastollinen analyysi suoritettiin p-4E-BP1 (Thr37 /46) sisään BHP7-13 ja p-S6 ribosomaalisen proteiinin (Ser235 /236) on 8505C ja BHP7-13. BEZ235 syvästi inhiboi näiden proteiinien 2-4 tuntia, ja tämä vaikutus oli kestää 24 tuntia (kuvio S1). p-4E-BP1 (Thr37 /46) tukahdutettiin alle 12% 2-24 tuntia ja tilastollisesti merkitsevästi verrattuna perustason in BHP7-13 (P 0,02, t-testi). Samoin p-S6 ribosomaalinen proteiini (Ser235 /236) oli merkittävästi laskenut alle 7% ja 13% 4-24 tuntia 8505C (P 0,01, t-testi) ja BHP7-13 (P 0,02, t- testi), tässä järjestyksessä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että BEZ235 on vahva kyky estää mTORC1 (mikä laskee p-4E-BP1 ja p-S6 ribosomaalinen proteiini) ja heikompia vaikutuksia mTORC2 (joka johtaa vaihtelevia vaikutuksia p-AKT at Ser473).

p-AKT (Thr308) ja p-AKT (Ser473) nostettiin 8505C yli 24 tuntia. p-AKT (Thr308) ja p-AKT (Ser473) väheni lyhytaikaisesti TT ja BHP7-13. p-4E-BP1 (Thr70), p-4E-BP1 (Thr37 /46) ja p-S6 ribosomaalisen proteiinin (Ser235 /236) on jatkuvasti vähennetty 2 tuntia kautta yli 24 tuntia kolmessa solulinjoissa. BEZ235 aiheutti nopean kasvun p- ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) 2 4 tuntia kolmessa solulinjoissa.

Effects of BEZ235 solusyklin ja apoptoosin

KAT4C , 8505C, TT, BHP7-13 ja WRO82-1 altistettiin BEZ235 24 tai 72 tuntia (kuvio 3A). Verrattuna käsittelemätön kontrolli soluja, BEZ235 6,25, 25 ja 100 nmol /l aiheuttama kasvava solufraktiois- at G0 /G1phase kaikissa solulinjoissa. Edustava solulinja BHP7-13 osoittanut vaikutusta BEZ235 solusyklin jakautuminen (kuvio 3B).

, analyysi solusyklin mittaamalla DNA-pitoisuus paljasti kasvavia annoksia BEZ235 kertyy solujen G0 /G1 24 tuntia (KAT4C, 8505C, BHP7-13 ja WRO82-1) ja 72 tuntia (TT). B, edustava solulinja, BHP7-13 osoitti solusyklin pysähtymisen G0 /G1 vaiheeseen. C, solusyklin säätämiseen proteiinit arvioitiin käyttämällä immunoblot-käsitellyissä soluissa BEZ235 100 nmol /l. p53 väheni 2-4 tuntia 8505C ja TT. BEZ235 alennetaan asteittain p21 TT ja BHP7-13. p27 lisääntyi kaikissa solulinjoissa. Sykliini D1 vähitellen laski 8505C ja BHP7-13. D, apoptoosi mitattuna virtaussytometrialla mittaamiseksi ala-G1-solut paljastivat, että BEZ235 lisää osuudet sub-G1-solujen KAT4C ja KAT18 96 tuntia. E, immunoblot osoitti BEZ235 indusoimaa hajoamista executioner kaspaasi-3 KAT4C ja KAT18.

vaikutuksia BEZ235 (100 nmol /L) on ilmaus G0 /G1 liittyvät solukierron proteiinit tutkittiin ( Kuva 3C, kuvio S2B ja S3). Siirtyminen G0 /G1-vaiheesta S-vaiheeseen on monimutkainen prosessi, johon sykliinejä, sykliiniriippuvaisten kinaasien (CDK: t) ja niihin liittyviä proteiineja, mukaan lukien p53, p21, p27 ja sykliini D1 [31]. p53 on kasvaimia estävä, joka voi aktivoida p21, ja sekä p21 ja p27 ovat estäjiä G1 sykliiniriippuvaisten kinaasien.

BEZ235 lisääntynyt p27 by 4-24 tuntia kaikissa solulinjoissa, jossa maksimaalinen nousu on 3,5-723,2 – kertaiseksi KAT4C, TT ja BHP7-13. Tällainen suhde kasvu ei ollut mitattavissa 8505C vuoksi huomaamaton signaali käsittelemättömissä soluissa. Tilastollinen analyysi suoritettiin p27 ilmentymistä TT, ja saavutti merkitys 8 tuntia verrattuna perusekspression (P = 0,019, t-testi) (kuvio S3C). Tämä data on johdonmukainen havainto G0 /G1 solusyklin pysähtymiseen. BEZ235 oli vaihtelevia vaikutuksia p53, p21 ja sykliini D1 4 solulinjoissa, jotka osoittavat, että voi olla vaihteleva osuus näiden proteiinien vaikuttavista solusyklin etenemisen. Johdonmukainen lisäys p27 in BEZ235 käsitellyissä soluissa todennäköisesti kohdistuu estovaikutusta solusyklin etenemisen at G0 /G1. On mahdollista, että G0 /G1 solusyklin pysähtymisen on seurausta yhdistetty vaikutus enemmän kuin yksi G0 /G1 liittyvä proteiini vaikuttaa BEZ235. Vaihtoehtoisesti induktio p27 yksinään voi riittää pidättämään solusyklin etenemisen. P53 negatiivinen PC3M solulinjassa, BEZ235 aiheuttama P27 ilme ja täydellinen solukierron pysähtymisen G1 vaiheessa aiheuttamatta p21 [17]. Tämä tutkimus osoitti G1 solukierron esto indusoi BEZ235 ei välttämätön vaadi yhdessä p53 ja p21.

estyminen PI3K /mTOR reitti voi myös johtaa apoptoosin [6], [8]. Kyky BEZ235 aiheuttaa apoptoottista solukuolemaa kilpirauhasen syöpäsoluja tutkittiin (kuvio 3D). Verrattuna kontrolli, BEZ235 25 ja 100 nmol /l merkittävästi indusoi apoptoosin mitattuna osuus osa-G1 soluja 96 tuntia KAT4C. Samanlaisia ​​havaintoja havaittiin KAT18, jossa BEZ235 6,25, 25 ja 100 nmol /l ajo kasvava osuus apoptoottisten solujen. Kuitenkin BEZ235 ole osoittanut mitään kasvua sub-G1 solujen 8505C, TT, BHP7-13, ja WRO82-1.

validoimiseksi apoptoosin induktion KAT4C ja KAT18 jonka BEZ235, kaspaasi-3-oli arvioitiin immunoblot 72 tunnin käsittelyn (kuvio 3E, kuvio S4). Yleensä suuremmat annokset BEZ235 indusoi enemmän hajoaminen apoptoottisten executioner kaspaasi-3, on alle 12% kaspaasi-3 havaittiin 100 nmol /l molemmissa solulinjoissa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että apoptoottisten mekanismien osuus sytotoksisuuden BEZ235 vuonna KAT4C ja KAT18. Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien BEZ235 aiheuttaa apoptoosin joissakin, mutta ei kaikissa, solulinjoissa [17] – [22] kantavassa taustalla olevien mekanismien vaihteli kyvyt BEZ235 apoptoosin eri annoksina ja eri solulinjoissa jää epäselväksi [6] – [8].

BEZ235 herkkyys korreloi perustason ilmentymistä p-S6 ribosomaalisen proteiinin (Ser235 /236) ja p27

Dm BEZ235 kattaa laajan kirjon yli 8 eri solulinjoja, jossa on 11-kertainen ero KAT4C ja WRO82-1.To tutkia mahdollisia biomarkkereita, jotka korreloivat herkkyys BEZ235, perustason proteiinien ilmentymisen mukana PI3K /mTOR ja RAS /RAF /ERK reittejä, ja solujen cycle- assosioituneet proteiinit arvioitiin 6 solulinjoissa (kuvio 4A). Herkkyys kuudesta solulinjojen BEZ235 käskettiin mukaan Dm arvoon.

A lähtötasolle proteiinien liittyy signaalitransduktioreittiin ja solukierron arvioitiin immunoblot. Sekvenssi proteiinien ladattu oli mukaan Dm. Ilmaisu p-S6 ribosomaalisen proteiinin (Ser235 /236) laski asteittain KAT4C ja BHP7-13, kun taas p-27 osoitti vastakkaisessa järjestyksessä. Ilmaus muiden proteiinien osoitti satunnainen jakauma. B, Band tiheydet olivat kuvaamisen ja määrällisesti. Väliset suhteet Dm ja proteiinin ilmentyminen analysoitiin käyttämällä Pearsonin korrelaatiokertoimet, ja kuvaajat piirrettiin käyttämällä KAT4C. Ilmaisu p-S6 ribosomaalisen proteiinin (Ser235 /236) oli positiivinen korrelaatio, ja p27 käänteinen korrelaatio, jossa herkkyys BEZ235.

ilmentyminen p-S6 ribosomaalisen proteiinin (Ser235 /236 ) laskee asteittain poikki kasvaa Dm, kun taas taso p-27 kasvaa vähitellen poikki kasvaa Dm. Tilastollisia yhteyksiä analysoitiin käyttämällä Pearsonin korrelaatiokerrointa (kuvio 4B). Ilmaisu p-S6 ribosomaalisen proteiinin (Ser235 /236) oli merkittävä korrelaatio (R

2 = 0,8475, P = 0,009), jossa BEZ235 herkkyys, samalla kun p27 oli merkittävä käänteinen korrelaatio (R

2 = 0,8117, P = 0,014). Toistuva immunoblottia p27 olivat pysyvästi tulokset (liite S1). Ilmentymisen perustason p-AKT (Thr308), p-AKT (Ser473), p-4E-BP1 (Thr70), p-4E-BP1 (Thr37 /46), p-S6 ribosomaalinen proteiini (Ser240 /244), s -ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), p53, p21 ja sykliini D1 Tuloksissa ei havaittu korrelaatiota BEZ235 herkkyys (tuloksia ei ole esitetty).

BEZ235 hoito hiiren kylkeen kasvaimia

Kateenkorvattomiin nude hiiriä kylki vierassiirrännäisiä 8505C käytettiin tutkimaan terapeuttisia vaikutuksia ja turvallisuutta BEZ235

in vivo

. Eläimet vakiintuneiden kylki kasvaimia vastaavia lähtö- määriä hoidettiin suun kautta BEZ235 (50 mg /kg) tai ajoneuvoa päivittäin 25 päivän ajan ja noudatettava kunnes päivä 31 (kuvio 5A). BEZ235 hidastaa kasvaimen kasvua ja ero kasvaintilavuudet välillä BEZ235 ja kontrollihiiristä oli tilastollisesti merkittävä päivänä 21 (94,1 ± 26,4 mm

3 ja 335,1 ± 78,5 mm

3, P = 0,009, t-testi), ja päivä 24 (109,9 ± 29,6 mm

3 ja 403,1 ± 112,8 mm

3, P = 0,019, t-testi). Ero kasvainten menetetty merkitys päivänä 28 4 päivää sen jälkeen se oli keskeytetty (402,7 ± 123,6 mm

3 ja 750,3 ± 198,3 mm

3, P = 0,15, t-testi). Edustavan hiiren valokuvattiin viimeisenä hoitopäivänä (kuvio 5B).

, päivittäinen letkulla suun kautta of BEZ235 (50 mg /kg) tukahduttaa 8505C kasvaimen kasvua. Erot Kasvaimen tilavuuden välillä BEZ235 ja kontrolliryhmän saavutettu tilastollisesti merkitseviä eroja päivinä 21 ja 24. merkitys katosi päivänä 28, 4 päivää sen jälkeen kun se oli keskeytetty. B, edustaja hiiriä 8505C ksenograftikasvaimissa (nuolet) valokuvattiin viime hoitopäivänä (päivä 24). C, BEZ235 ei aiheuttanut mitään laihtuminen, käsitellyissä ja valvonta hiiret (P 0,05 molemmille vertailun). D, BEZ235 tukahduttaa p-AKT (Thr308) ja p-S6 ribosomaalinen proteiini (Ser235 /236) 2 tuntia ja kaspaasi-3: 4 tuntia in vivo. PCNA alennettiin hieman varhain ajan. E, ilmentyminen p-S6 ribosomaalisen proteiinin kasvainsoluissa havaitaan immunovärjäämällä ilmoitettuina ajanjaksoina (suurennos, × 200). Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​Western blot tuloksia.

BEZ235 ei merkittävästi vähentää kehon painoa kahden ryhmän välillä tutkimusjakson aikana (kuvio 5C). Suun kautta BEZ235 vähentää fosforylaation AKT ja S6 ribosomaalinen proteiini 2 tuntia ja saavutti suurimman estäviä vaikutuksia 4 tuntia vain 2% ja 10% Pakt ja PS6 jäljellä, vastaavasti. Tämä inhibitorinen vaikutus kesti 24 tuntia ksenograftikasvaimissa (kuvio 5D, kuva S5). PCNA oli hieman ja ohimenevästi tukahdutettu 2-4 tuntia. Kuitenkin merkittävää hajoamista kaspaasi-3 tapahtunut 4 tuntia, vain 4% kaspaasi-3 jäljellä 24 tuntia. Immunohistokemia p-S6 ribosomaalisen proteiinin (Ser235 /236) in käsitellyt kasvaimet BEZ235 esittänyt samalla tavoin väheneminen värjäys, selvimmin 2-6 tuntia (kuvio 5E).

vuorovaikutus BEZ235 ja kemoterapian ATC-soluissa

Tutkimme yhdistelmä kemoterapia-aineiden ja BEZ235 vastaan ​​ATC. Viisi kemoterapeuttiset aineet (paklitakseli, irinotekaani, etoposidi, 5-FU: n ja doksorubisiinin) osoittivat sytotoksisia vaikutuksia annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla neljässä ATC solulinjoissa (kuvio S6). Tiedot käytettiin laskettaessa mediaani vaikutus annos (Dm) päivänä 4 käyttäen CompuSyn ohjelmistoa (kuvio 6A).

A, Dm laskettiin käyttäen sytotoksisuuden dataa CompuSyn ohjelmisto kunkin lääkkeen kustakin solulinjasta päivänä 4. B, sytotoksisia vaikutuksia BEZ235 ja kemoterapeuttisten aineiden (paklitakseli, irinotekaani ja etoposidi) yksinään tai yhdistelmänä jälkeen 4 päivän hoidon ATC arvioitiin käyttäen LDH määrityksiä. Yhdistelmä BEZ235 ja paklitakselin osoitti synergiavaikutuksia kaikissa solulinjoissa. Yhdistelmä BEZ235 ja irinotekaanin oli sytotoksisten vaikutusten voimistumista suuremmilla annoksilla, mutta paljasti vähän tai ei lainkaan hyödyllisiä terapeuttisia vaikutuksia pienemmillä annoksilla. Yhdistelmä BEZ235 plus etoposidin näkyy vähän ylimääräistä sytotoksisuutta. C CI BEZ235 ja jokainen kemoterapeuttisen aineen laskettiin käyttäen CompuSyn ohjelmistoa. BEZ235 ja paklitakseli näytteillä synergiavaikutuksia kaikissa solulinjoissa, jossa CI 0,8 korkeintaan olosuhteissa. BEZ235 plus irinotekaani oli synergistinen ja antagonistiset vaikutukset 8305C, 8505C ja KAT18 ja antagonistisia vaikutuksia in KAT4C. BEZ235 plus etoposidia osoittivat enimmäkseen antagonistiset vaikutukset kaikissa solulinjoissa. Vaakasuorat katkoviivat at CI = 1 piirrettiin syrjintään synergiasta (CI 1) ja antagonismi (CI 1). D, tyypillinen alueet DRI arvojen kemoterapia-yhdistettynä BEZ235. Läsnäolo BEZ235 paklitakselia enimmäkseen oli suurin Dris vuonna 8505C, KAT4C ja KAT18, sekä myös osoittanut suotuisia Dris vuonna 8305C.

Nämä Dm paklitakselin, irinotekaanin ja etoposidi ovat saavutettavissa potilaiden seerumin , ja ovat kliinisesti merkityksellisiä [32] – [34]. Vaikka doksorubisiinia käytetään kliinisesti anaplastic kilpirauhassyöpä, suhteellisen korkea Dm näissä solulinjoissa hiljaista, että kliinisesti merkittävää annostelu ei ole saavutettavissa potilaiden seerumista ja siksi jätettiin pois näistä tutkimuksista. Vuorovaikutukset BEZ235 ja paklitakseli, irinotekaani, ja etoposidi arvioitiin (kuvio 6B). Yhdistelmä BEZ235 ja paklitakselin merkittävästi parantunut sytotoksisuutta yli Monoterapiassa neljässä solulinjoissa. BEZ235, irinotekaanin myös parempi terapeuttinen teho, varsinkin kun enemmän soluja vaikuttaa. BEZ235 plus etoposidia vain hieman lisääntynyt sytotoksisuus.

vuorovaikutukset BEZ235 ja jokainen kemoterapeuttisen aineen määritettiin laskemalla CI Chou-Talalay yhtälön (kuvio 6C). Synergiavaikutuksen tunnistettiin yhdistelmälle BEZ235 ja paklitakselin kaikilla ATC linjat (CI, 8305C = 0,77-0,86, 8505C = 0,43-+0,59, KAT4C = ,66-,81 ja KAT18 = 0,64-0,71).

yhdistelmä BEZ235 irinotekaanin kanssa vaihteli synergisoivat antagonisti 8305C, 8505C ja KAT18 (CI, 0,86-1,34, 0,97-1,23 ja 0,74-1,14) ja oli antagonisti KAT4C (CI, 1,09-1,36). Yhdistelmä BEZ235 etoposidia oli hieman synergistinen sen antagonisti 8305C (CI, 0,95-1,15) ja antagonisti 8505C, KAT4C ja KAT18 (CI, 1,16-1,17, 1,13-2,05 ja 1,05-1,19, vastaavasti).

Nämä tulokset osoittavat, että BEZ235 ja paklitakselilla oli paras yhdessä vaikutukset hoidossa ATC. Laskettua DRI kemoterapian tekijällä tarkoitetaan taitteen lääkkeen annos, joka voitaisiin vähentää läsnäollessa BEZ235 (kuvio 6D). Niistä kolme kemoterapeuttiset aineet, paklitakseli oli suurin Dris on 8505C (2,55-4,2), KAT4C (2,25-3,19) ja KAT18 (2,59-2,63), ja osoitti myös suotuisa Dris on 8305C (1,55-2,16).

keskustelu

BEZ235 tehokkaasti esti solujen lisääntymistä kahdeksalla kilpirauhassyöpä linjat peräisin neljästä suuresta histologisia tyyppejä. ATC oli herkin, jonka jälkeen follikulaarinen erilaistumaton, medullaarinen ja hyvin kilpirauhassyöpäpotilailla solulinjoissa. Syöpäsolut kätkeminen PI3K voitto-of-function mutaation tai

PTEN

poisto osoittaa korkeampi PI3K /mTOR signalointia ja herkemmäksi BEZ235 [22]. Tuloksemme viittaavat siihen, että ATC perustuu PI3K /mTOR aktiivisuutta, ja keskeytys tämän reitin kanssa BEZ235 heikentää ATC kasvu merkittävämmin kuin muita kilpirauhassyövän histologialtaan. Suhteellisen alhainen mediaani vaikutus annoksilla BEZ235 kaikissa kilpirauhassyövän linjat ( 44 nmol /l), viittaavat siihen, että BEZ235 voi olla käyttöä hoidettaessa spektrin kilpirauhasen maligniteetti. Tulenkestävät syöpiä, jotka kehittävät aktivoituminen PI3K /mTOR signalointi prosessissa kasvain de-eriyttäminen voi olla erityisen houkuttelevia kohteita terapia.

epäonnistuminen BEZ235 tukahduttamiseksi p-AKT (Ser473) in 8505C ja KAT4C voi olla liittyvä negatiivista palautetta esto. Aiemmin on osoitettu, että inhibitio mTORC1 johtaa inaktivaatioon S6-kinaasi 1, joka voi tämän jälkeen overwhelms estävää vaikutusta BEZ235 on mTORC2, aktivoi mTORC2, ja lisää p-AKT (Ser473) in 8505C [35]. Ennen raportit osoittivat myös, että pienemmillä annoksilla BEZ235 eivät estää p-AKT (Ser473) joissakin solulinjoissa, ja suurempia annoksia BEZ235 voi voittaa negatiivinen palaute mTORC1 /S6-kinaasi 1 silmukka [18], [20]. Vaikka p-AKT (Ser473) aktivoitiin 8505C ja KAT4C, BEZ235 oli parempi estäviä vaikutuksia näissä solulinjoissa verrattuna TT ja BHP7-13, mikä viittaa siihen, että muut molekyylit vaikuttavat BEZ235 tärkeämpi rooli päätettäessä hoitotulokseen.

Huomasimme, että ilmentyminen p-S6 ribosomaalisen proteiinin (Ser235 /236) ja p27 korreloi kanssa herkkyys BEZ235 kilpirauhassyövän hoitoon. S6-ribosomaalinen proteiini on alavirtaan S6-kinaasi 1, joka aktivoituu mTORC1 [6] – [8]. Fosforylaation S6-ribosomaalinen proteiini lisää translaation kontrollisekvenssit proteiinisynteesiä ja parantaa solujen kasvua. Solut, joissa korkeampi p-S6 ribosomaalinen proteiini (Ser235 /236) ovat alttiimpia BEZ235, mikä viittaa siihen, että inhibitio mTORC1 ja S6-ribosomaalinen proteiini on merkittävä terapeuttinen vaikutus BEZ235.

p-S6 ribosomaalisen proteiinin (Ser235 /236) on myös hiljattain tunnustettu merkki ennustaa terapeuttista vaikutuksen on mTOR inhibiittorin sarkooma [36]. Tässä tutkimuksessa kilpirauhassyöpä linjat korkeampi ilmauksia p-S6 ribosomaalisen proteiinin (Ser235 /236) osoittivat myös alemmilla p27. Tämä havainto viittaa siihen S6 ribosomaalinen proteiini on vaimennin p27 in kilpirauhassyöpä, ja voivat selittää, miksi molemmat p-S6 ribosomaalisen proteiinin (Ser235 /236) ja p27 olivat ennustajia herkkyys BEZ235. Mielenkiintoista, P27 oli aiemmin todettu olevan käänteinen yhdessä toiminnan PI3K /mTOR väylän kilpirauhasen syöpäsoluja, ja tukahduttaminen tämän reitin lisää p27 [37].

4E-BP1 on toinen proteiini alavirtaan mTORC1. Esto mTORC1 johtaa defosforylaatio (aktivointi) ja 4E-BP1, parantaa sitoutumista 4E-BP1to EIF4E, ja estää proteiinin translaation ja soluproliferaatiota [7], [8]. Vaikka BEZ235 vaikuttaa sekä S6 ribosomaalisen proteiinin ja 4E-BP1 tehokkaasti, vain p-S6 ribosomaalisen proteiinin (Ser235 /236) ilmaisun ennustaa herkkyyttä BEZ235 tässä tutkimuksessa. Munasarjasyövän, biomarkkerit ennustaa herkkyyttä BEZ235 on raportoitu [22], ja ilmaisu p-4E-BP1 (Thr37 /46) ei korreloi herkkyys BEZ235.

estämisen lisäksi solusyklin etenemisen , BEZ235 aiheutti apoptoosin kaksi kuudesta solulinjoista. Inhibitiota solusyklin etenemisen on tunnettu vaikutus BEZ235, jopa pienillä annoksilla (≤100 nmol /l). Kuitenkin apoptoosin näkyy vain osa syöpäsolulinjoissa ja on ilmeistä, suuremmilla annoksilla (100-1000 nmol /L) BEZ235 [17] – [22]. BEZ235 estää tehokkaasti mTORC1, molekyylin ohjaamiseksi sekä solusyklin ja apoptoosin, jotka voivat johtaa solukierron pysähtymisen ja apoptoosin KAT4C ja KAT18 [7]. Ymmärtäminen mekanismeja, joiden kautta BEZ235 edistää apoptoottista solukuolemaa vaatii lisätutkimuksia.

ATC on ylivoimaisesti aggressiivinen neljä suurta histologinen tyyppisiä kilpirauhasen syöpä. Kemoterapia on sovellettu potilaiden hoitoon ATC hoitovaste noin 20 50%. Novel strategiat tulosten parantamiseksi tarvitaan. Niistä kolme yhdistelmä terapiaohjelmlssa, BEZ235 yhdistettynä paklitakselilla oli paras synergistinen vaikutus neljässä ATC solulinjoissa. Syöpäsolut aktivointiin PI3K /mTOR signalointi ovat vastustuskykyisempiä paklitakselia, ja samanaikainen antaminen PI3K /mTOR inhibiittorit paklitakselilla parantaa terapeuttisia vaikutuksia [38] – [40]. Tämä havainto on kliinistä merkitystä, koska paklitakseli, mikroputkeen stabilointiaine, on osoittanut saavuttaa 53% vaste potilailla, joilla ATC faasin II kliinisessä tutkimuksessa [41]. Yhdistelmä BEZ235 kanssa mikrotubulusten depolymeroinnilla lääkkeen vinkristiini paljasti myös lupaava vaikutus hoidettaessa sarkooma [20]. Tuloksemme osoittivat, että monimuotoiset vaikutukset BEZ235 estäjien DNA topoisomeraasi tyypin I (irinotekaani) tai tyypin II (etoposidi) hoidettaessa ATC olivat suurelta osin vastakkaisia. Samanlaisia ​​antagonistiset vaikutukset eston topoisomeraasi aktiivisuuden ja PI3K /AKT-reitin on havaittu munasarjasyöpäsoluja [42]. Soluja S-vaiheessa ovat alttiimpia topoisomearse estäjiä. BEZ235 aiheuttama kerääntymistä solujen G0 /G1 vaihe voi siis vähentää terapeuttista hyötyä samanaikaista hoitoa topoisomeraasin estäjät, selittää epäedullinen yhdistelmä vaikutukset BEZ235 irinotekaanin kanssa ja etoposidin.

Päivittäinen hoito BEZ235 merkittävää hidastumista 8505C ksenografti kasvaimen kasvua aikana terapeuttinen aikana. Estovaikutus oli vähemmän näkyvästi jälkeen hoidon lopettamisen, mikä viittaa siihen, että pitkäaikainen hoito voi olla tarpeen säilyttää terapeuttista tehoa. BEZ235 huonontuu merkittävästi kaspaasi-3 in 8505C ksenograftikasvaimissa, osoittaa tämä yhdiste voi apoptoosin

in vivo

. Lopettamisen jälkeen BEZ235 volyymi 8505C ksenograftikasvaimissa kasvoi myöhemmin. Tämä laajentuminen kasvain lopettamisen jälkeen hoito saattaa johtua normalisoitumista solun koon ja uudelleen solujen lisääntymistä, kuten mTOR ja sen loppupään proteiineja S6-kinaasi 1 ja 4E-BP1 pelata keskeisiä rooleja tässä suhteessa [43]. Mitään merkittäviä laihtuminen tai sairaus ei havaittu tutkimuksen aikana, mikä viittaa siihen, että tämä hoito voi olla lupaava turvallisuusprofiili.

ennen raportti osoitti, että läsnäolo geneettisiä muutoksia on

PTEN

,

PIK3CA

ja

AKT1

korreloivat hyvin herkkyys AKT- estäjällä, mutta oli heikompi korrelaatioita kanssa mTOR-estäjä [44]. Tämä discrepency viittaa siihen, että mTOR toiminta ei riipu pelkästään PI3K /AKT-vaikutusta. Raportoitiin data geneettisiä muutoksia 8 kilpirauhassyöpä solulinjoissa oli tiivistää (liite S2). Limited geneettisiä muutoksia RAS /RAF /ERK ja PI3K /mTOR reittejä tunnistettiin. Käytettävissä olevat tiedot eivät osoita mitään korrelaatiota geneettisten poikkeavuuksien PI3K /mTOR reittejä ja herkkyys BEZ235, koska mitään mutaatiota tämän reitin näissä solulinjoissa on raportoitu. Mutaatiot p53 ja BRAF näyttävät myös ei voida korreloida herkkyys BEZ235, koska molemmat herkkiä (8305C) ja vähemmän herkkiä (WRO82-1) solulinjat satama mutaatiot. Exploration of geneettisiä muutoksia mTOR, suuret tavoite BEZ235, saattaa jonain päivänä antaa tietoja, jotka voivat ennustaa terapeuttista tehoa.

esto mTORC1 voi aktivoida MAPK-reitin kautta PI3K riippuva silmukka [45], mikä selittää miksi BEZ235 nähtiin täällä aktivoida ERK1 /2 kilpirauhasen syöpäsoluja. Yhdistämällä BEZ235 inhibiittorilla kohdistaminen MAPK reitti voi olla mahdollinen tapa parantaa terapeuttista tehoa. Äskettäin yhdistelmä yleiseurooppalaisen RAF estäjän ja BEZ235 osoitettiin indusoivan solusyklin pysähtymisen G0 /G1 vaiheeseen, ja ollut myönteisiä yhdistelmätehosteita hoidettaessa kilpirauhassyöpä [46].