Krooninen sairaus

tiivistelmä

resveratrolin, uutettu Kiinan kasviperäisten lääkeaineiden cuspidatum, tiedetään estävän invaasiota ja etäpesäkkeiden ihmisen peräsuolen syöpä (CRC), jossa pitkään ei-koodaava Etäpesäke Associated keuhkoadenokarsinooma Transcript 1 (RNA- MALAT1) on myös tärkeä rooli. Käyttäen MALAT1 lentiviruksen shRNA ja yli-ilmentyminen rakentaa CRC solulinjat, LoVo ja HCT116, olemme osoittaneet, että anti-kasvain vaikutuksia resveratrol CRC ovat estämällä Wnt /β-kateniinin signalointia, jolloin ilmaus sen kohdegeenien, kuten c-Myc, MMP-7, sekä ilmentymistä MALAT1. Yksityiskohtaisesti, resveratroli alas-säätelee MALAT1, mikä laski lokalisoituminen tumaan β-kateniinin siten heikennettyjä Wnt /β-kateniinin signalointia, joka johtaa inhibitioon CRC ja metastaasit. Tämä havainto meidän varmasti tarjoaa tärkeitä prekliinisiä todisteita tukemaan tulevaa käyttöä resveratrolin ehkäisyyn ja hoitoon CRC.

Citation: Ji Q, Liu X, Fu X, Zhang L, Sui H, Zhou L, et al. (2013) resveratrolin Estää Invasion ja metastaasin peräsuolen syövän solut kautta MALAT1 välittämä Wnt /β-kateniinin Signal Pathway. PLoS ONE 8 (11): e78700. doi: 10,1371 /journal.pone.0078700

Editor: Irina U. Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 toukokuu 2013; Hyväksytty: 15 syyskuu 2013; Julkaistu: 11 marraskuu 2013

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Natural Science Foundation of China (81202812, 81303102, 81303103), Program Shanghai Municipal Education komissio (2011JW57, 12YZ058), Shanghai Municipal Health Bureau (ZYSNXD-CC-YJXYY-JS20, 2011ZJ030, 20114Y001, 20114037), Shanghai Key laboratorio perinteisen kiinalaisen Kliininen (C10dz2220200). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on tulokset mutaation useiden geenien, mukaan lukien proto-onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille. Kuten onkogeenejä ohjaamiseksi solujen lisääntymistä jäljellä ilmentyy suuresti, tai tuumorisuppressorigeeneille on mutatoitu, tuloksena syöpäsolujen kiertää immuunijärjestelmän, muodostaa kasvaimia distaalisessa paikoissa /elimet, eli etäpesäkkeitä ja päätelaite vaiheessa syöpä alkaa [1].

uusien kiinalaisen lääketieteen monomeerin syöpälääkkeiden on tarjonnut uuden vaihtoehdon, että reptoire synteettisten huumeiden syövän hoitoon [2]. Cuspidatum on juurakoita ja juuren Tateshina monivuotinen yrtti – cuspidatum [3]. Edellinen data osoittaa, että cuspidatum oli useita inhiboivia vaikutuksia kasvaimen, bakteeri /virusinfektioiden ja tulehduksen [3] – [7]. Resveratrol uutetaan cuspidatum on luonnollinen antioksidantti, joka voi vähentää veren viskositeetti, estää verihiutaleiden aggregaatiota ja verisuonten laajenemista, ylläpitää verenkiertoa ja estää esiintyminen ja syövän kehittymisen [8] – [10].

Early vuonna 2003, Ji

et al

ensinnäkin todetut pitkän koodaamattomalla RNA – MALAT1. 225 tapauksessa vaiheen I ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), se todettiin 70 tapauksessa, metastaasin korreloi MALAT1 yli-ilmentyminen, on tietenkin ja kudosspesifisellä tavalla, mikä viittaa siihen, että MALAT1 ilmentyminen voi toimia mahdollisena merkkiaine selviytymisen vaiheessa 1 pienisoluista keuhkosyöpää [11]. Lisäksi muut ryhmät osoittivat, että MALAT1 yli-ilmentää maksassa, kohdunkaulan ja paksusuolen syöpä [12] – [14].

Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että Wnt /β-kateniinin signalointireitin säätelee kasvainsolun invaasiota ja etäpesäkkeiden. Soichi

et al

havaittu, että suun okasolusyöpä solujen kertyminen β-kateniinin sytoplasmassa indusoi TCF /LEF transkriptionaalisen aktiivisuuden, ja lisätä MMP-7 ilmentymisen, aiheuttaen siten muuntaminen epiteelisolujen mesenkyymisolujen sekä parantaa invaasiota ja etäpesäkkeiden [15]. Guo

et ai

osoitettu CRC HT29 solulinjassa, NGX6 geenituote esti siirtää ja β-kateniinin tumasta ja sytoplasmasta solukalvoon, estäen siten transkriptionaalista aktiivisuutta TCF ja alas-ekspressiota sääteleviä Wnt kohdegeenien c-Myc, cyclinD1 ja COX-2, mikä laski syöpäsoluinvaasiota ja etäpesäkkeiden [16].

Nykyinen tutkimukset kuulusteli mekanismeja, joilla resveratrol säätelee MALAT1 ja Wnt /β-kateniinin signaalireitin , jolloin tukahdutettua syöpäsoluinvaasiota ja etäpesäkkeiden.

Materiaalit ja menetelmät

in situ -hybridisaatio on kudosnäytteitä Potilaat, joilla on CRC

parafinoidut kasvain ja vieressä normaali kudosnäytteiden 60 CRC potilailla, joille tehtiin tuumoriresektion at Putuo sairaala, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (SUTCM) vuosien 2010 ja 2012 valittiin hybridisaatio digoksigeniinillä (DIG) -merkattua MALAT1 DNA-koetin (Shinegene Molecular Biotechnology, Shanghai, Kiina). Koe suoritettiin menetelmän mukaisesti, kuvattu julkaisussa Tanner

et ai

[17]. Tutkimuksen hyväksyi etiikkaa komitean Pu Tuon Hospital, SUTCM ja kaikki potilaat toimitettiin kirjallinen suostumus.

Screening of Chinese Medicine monomeerillä syöpälääkkeiden on MALAT1 Expression LoVo Solut

LoVo -soluja (jotka ovat peräisin vasemmalta supraclavicular alueen etäpesäke, Dukes ’C-tyypin, luokka IV, peräsuolen adenokarsinooma) viljeltiin F12K väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia, 100 ug /ml streptomysiiniä, 100 U /ml penisilliiniä, 37 ° C: ssa, 5% CO2, ja suuri ilmankosteus. Kaikki kiinalaisen lääketieteen monomeerin syöpälääkkeiden laimennettiin sarjoittain havaitsemaan puoli esto keskittyminen leviämisen LoVo soluja. Leviämisen LoVo-solujen määritettiin Cell Counting Kit-8 (CCK-8) määritystä kuten aiemmin on kuvattu [18]. Reaaliaikainen PCR käytettiin havaitsemiseen estoaste ehdotettujen lääkkeiden MALAT1 ilme. Reaaliaikaista PCR-analyysiä, forward-aluketta, reverse-aluketta, ja Taqman koetinta suunniteltiin seuraavasti: eteenpäin (5-AGGCGTTGTGCGTAGAGGA-3), reverse (5-GGATTTTTACCAACCACTCGC-3), TaqMan-koetin (5-fam + CCTAGACCAGCATGCCAGTGTGCC + tamara-3). Reaaliaikainen PCR suoritettiin Applied Biosystems 7300 System (Applied Biosystems Deutschland GmbH) käyttämällä Premix Ex Taq (Takara, Dalian, Kiina). GAPDH: ää käytettiin sisäisenä viitteenä.

pudotus ja yli-ilmentyminen MALAT1 Gene

Ihmisen MALAT1 cDNA: n (Gene ID: 378938) monistettiin RT-PCR: llä RNA: ta LoVo-soluja, ja kloonattiin sitten pLV4 vektoriin. MALAT1 etsittiin sopivia siRNA kohdesekvenssien, kolme siRNA sekvenssit suunniteltiin, syntetisoitiin ja varmistettiin sekvensoimalla vastaavasti. Lentivirus- partikkeleita tuotettiin kotransfektoimalla ekspressiovektori pLV4-MALAT1 cDNA: n tai pLV4-MALAT1 shRNA kanssa viruspartikkelin pakkaus auttaja vektori 293T-soluihin. Alustavat kokeet poiminut tehokkain siRNA sekvenssit pudotus edellä mainitut kolme ehdokasta siRNA (kuvio S1): sense 5′-GAGGUGUAAAGGGAUUUAUTT-3 ’, anti-sense 5′-AUAAAUCCCUUUACACCUCTT-3′; negatiivisella kontrolli siRNA järjestyksessä: sense 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ’, anti-sense 5’-ACGUGACACGUUCG.

GAGAATT-3′. Tiitteri viruspartikkelien sisältävien MALAT1 shRNA ja MALAT1 cDNA määritettiin rajoitettu sarjalaimennuksella. Tehokkuus Knockdown tai yli-ilmentyminen määritettiin reaaliaikainen PCR. LoVo-solujen tai HCT116-solut infektoitiin lentivirus kanssa pLV4-MALAT1 cDNA, pLV4-MALAT1 shRNA tai pLV4-vektori.

Luciferase Reporter Assay

testata MALAT1 promoottori tai LEF /TCF-promoottori aktiivisuus, LoVo-soluja kotransfektoitiin joko yhdistelmä-DNA-plasmidi pGL3-basic-MALAT1 promoottori tai pGL3-basic-LEF /TCF-promoottorin kontrolliin positiivinen plasmidi PRL-SV40, kuten aiemmin on kuvattu [19]. Promoottori aktiivisuus analysoitiin käyttämällä kaupallista dual-lusiferaasi iinianalyysikitissä (Beyotime Biotekniikan instituutti, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden.

Muuttoliike ja invaasiomääritys

Yhteensä 5 x 10

5 LoVo-soluja viljeltiin 100 ul F12K jossa oli 0,5% FBS: ää ympättiin ylempi osa transwell kammion (Corning Incorporated, Corning, NY). Siirtolaisuuden analyysin alaosassa kammion, 600 ui F12K 15% FBS ja 10 ug /ml fibronektiiniä lisättiin ja määritys suoritettiin 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja 5% CO2. Siirtyneet solut analysoitiin kristallivioletilla värjäämällä, minkä jälkeen tarkkailemalla alle DMI3000 B käännettyä mikroskooppia (Leica, Saksa). Invaasiolle analyysi, 100 ui matrigeeliä (BD, USA) oli aluksi lisättiin asti pohja transwell kammion ennen LoVo-soluja ympättiin, ja seuraavat toimenpiteet olivat samat kuin muuttoliike analyysi, paitsi invasiivisia solut analysoidaan sen jälkeen, co-kulttuuri 48 tunnin ajan. Kuten HCT116 soluihin, menettelyt olivat samanlaisia, ainoa ero oli soluja ollessa viljelty RIPM 1640.

Western Blot

Kokosolun, solulimassa, ja ydinvoiman proteiinien LoVo tai HCT116-soluja valmistettiin mukaan valmistajan ohjeiden ProteoJET Sytoplastiset ja Nuclear Protein Extraction Kit (Fermentas, USA). Proteiinit ladattiin SDS-PAGE-geelit, elektroforeesilla, siirrettiin PVDF-kalvoille ja blokattiin 5% maitoa ennen inkubointia, jossa on esitetty ensisijaisen vasta-aineita ja sekundaarisia vasta-aineita. Tuloksena immunokompleksit visualisoitiin tehostetulla kemiluminesenssin. Proteiinimäärän normalisoitiin β-aktiinin (koko proteiini tai solulimassa proteiini) tai PCNA (tumaproteiini).

RNA-sitovan proteiinin immunosaostus

RNA-sitovan proteiinin immunosaostus (RIP) kanssa suoritettiin valmistajan protokollien EZ-Magna RIP Kit (Millipore, USA). Lyhyesti, LoVo solut huuhdeltiin jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), hajotettiin RIP hajotuspuskuria. Sekä β-kateniinin (CST, USA) ja epäspesifinen kontrolli kani-lgG-vasta-aineita käytettiin immunosaostukseen. RIP lysaatit ja magneettiset helmet sidottu β-kateniinin vasta-inkuboitiin yhdessä pyörivät yön yli 4 ° C: ssa. Jälkeenpäin proteiinit immuunisaostumassa digestoitiin proteinaasi K: lla ja sitoutuneet RNA: t puhdistettiin supernatanteista, käänteiskopioitiin käyttäen PrimeScript RT reagenssia Kit seuraa kvantitatiivinen analyysi.

Inmunofluorescence Microscopy

LoVo-soluja ( 2,5 x 10

5) kasvatettiin kammion dioja (Millipore, USA), 8 tuntia, nälässä 12 tunnin ajan. Solut kiinnitettiin 40 minuuttia 4% paraformaldehydillä PBS: ssä huoneen lämpötilassa, permealized ja blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa, 1% BSA: ta, 0,5% Triton X-100, ja inkuboitiin yön yli kanin monoklonaalista anti-β-kateniinin ( CST, USA). Sen jälkeen, kun pesuun, Cy3-konjugoitu anti-kani-IgG-vasta-ainetta (Beyotime Biotekniikan instituutti, Kiina) lisättiin blokkausliuoksessa 1 tunnin ajan. 4-6-diamino-2-fenyyli-levitettiin tahra ytimiä. Immunofluoresenssikoe kuvat oli otettu DMI3000B käänteismikroskooppi (Leica, Saksa).

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot esitettiin keskiarvoina SEM. Keskiarvot kahdesta ryhmästä verrattiin Studentin

t

testi. Liitot välinen ilmaus MALAT1 ja kliinis muuttujat analysoitiin käyttämällä Fisherin testiä, Khin neliö kokeet tai jatkuvuus korjaus chi-neliö testien SPSS18.0 ohjelmisto.

Tulokset

1. MALAT1 yli-ilmentyy siinä peräsuolen syövän kudoksia ja korreloi tuumorimetastaasin ja Invasion

käyttäminen

in situ

-hybridisaatio, löysimme oli korkeampi ilmentyminen MALAT1 että peräsuolen syövän kudoksen (CRC) kuin viereiseen normaaliin peräsuolen kudokseen (kuvio 1 ja taulukko 1). Me seuraavaksi suoritettu korrelaatioanalyysiä välillä MALAT1 ilmaisun ja kliinis ominaisuudet CRC. Tilastollisesti merkittävä assosiaatio välillä havaittiin MALAT1 ilmaisun ja laajuudesta etäpesäkkeiden ja hyökkäystä. Toisin kuin viereiseen normaaliin kudoksia, MALAT1 ilmentymisen CRC kudoksissa resektoitiin potilaista, joilla on metastaattinen sairauksia oli suurempi kuin ne, joilla ei ole etäpesäkkeitä (taulukko 2). Tämä assosiaatio MALAT1 ilmaisun ja laajuudesta etäpesäkkeiden ja invaasio vahvisti myös reaaliaikainen PCR (Kuva S1).

In situ

-hybridisaatio levitettiin tutkimaan MALAT1 ilmentymistä 60 parafinoidut kasvainkudoksessa ja viereisen normaali kudosnäytteistä CRC potilaista.

2. Resveratrol Estää leviämisen, Migration and Invasion Lövön Cells

seulomiseksi kiinalaisen lääketieteen monomeerin syöpälääkkeiden joka esti MALAT1 ilmentymistä LoVo soluissa, ensin tutkineet vaikutus ehdotettujen lääkkeiden leviämisen LoVo soluja, ja lasketaan puoli esto pitoisuus (IC 50) kaikista lääkekandidaatteina (taulukko 3). Seuraavaksi tarkasteltiin vaikutus ehdotettujen lääkkeiden inhibition MALAT1 ilmaisun. Tuloksemme osoittivat, että resveratroli ja tätä osthole olivat 2 alkuun syöpälääkkeitä suhteen estämällä MALAT1 ilmaisu, jossa resveratrol on paras näistä kahdesta (kuvio 2A). Siksi valitsimme resveratroli meidän lisätutkimuksia MALAT1 ja niihin liittyviä mekanismeja. Meidän data esittää resveratrolin IC50 55 uM LoVo soluissa (kuvio 2B), lääkeaineen annokset 15, 30 ja 50 uM oli siis valittu tutkimiseksi resveratrolin vaikutuksesta invaasio ja muuttoliike ominaisuuksia syöpäsoluja. Tuloksemme osoittivat LoVo solut merkittävästi estivät niiden kyvystä tunkeutua ja siirtyy käyttämään resveratrol, annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 2C).

(A): Kaksikymmentäkaksi ehdokas kiinalaisen lääketieteen monomeerin syöpälääkkeiden testattiin tehokkaan eston annokset on MALAT1 ilmaisun LoVo soluissa. (B): Korrelaatio resveratrolin lääkeannoksia ja kasvun esto LoVo soluissa. Y-akseli: prosenttiosuus kasvun inhibition; X-akseli: resveratrolin pitoisuudet (uM). (C): arviointi ja kvantifiointi Solujen migraation ja invaasion LoVo soluja. Arvot edustavat useita muuttavien /invasiivisen solua kohti 5 HPF. *

p

0,05 tai **

p

0,01, verrattuna kontrolli LoVo- soluihin.

3. Resveratrol Estää Nuclear sijainnilla β-kateniinin, tasot sen Downstream Proteiinit, ja MALAT1 Expression LoVo Solut

Seuraavaksi, huomasimme, että resveratroli heikennetty solu lokalisaatio β-kateniinin, proteiinin säätelevä syöpäsoluinvaasiota ja etäpesäke. Kuten kuviossa 3A on esitetty, annoksesta riippuvalla tavalla, resveratrol parannettu pitoisuudet sytoplasmassa β-kateniinin, ja vähentää sen läsnäolo tumassa, joilla on vain vähän vaikutusta solun kokonais-β-kateniinin proteiinia.

( A): Total tai solu-uutteita eri solun osiin alkaen LoVo soluista käsitelty resveratrolin koetettiin varten β-kateniinin. β-kateniinin proteiinin tasojen määrä. *

p

0,05 tai **

p

0,01, verrattuna kontrolliryhmään. (B): Yhteensä solu-uutteista LoVo käsiteltyjen solujen resveratrolin koetettiin c-Myc, MMP-7, ja proteiini kvantitoitiin. *

p

0,05 tai **

p

0,01, verrattuna kontrolli LoVo soluihin. (C): Ilmaisulla tasot MALAT1 peräisin LoVo-soluja käsiteltiin osoitetulla annoksella resveratrolin määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä. Suhteellinen MALAT1 promoottoriaktiivisuuksien LoVo käsitellyissä soluissa osoitetun resveratrolin annoksia mitattiin. *

p

0,05 tai **

p

0,01, verrattuna kontrolli LoVo- soluihin.

vieressä tutkineet ilmentymistä loppupään β-kateniinin kohdegeenien läsnä ollessa resveratrol, että tärkein tehtävä β-kateniinin ydin on kautta asetus geenin transkription. Ei ole yllättävää, löysimme ekspressiota β-kateniinin alavirran kohdegeenejä c-Myc: n ja MMP-7 heikkeni huomattavasti resveratrol, annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 3B). Nämä tulokset osoittivat, että resveratroli voi estää syöpäsolujen invaasiota ja maahanmuuton tukahduttamiseen Wnt /β-kateniinin signaalireitin.

Lisäksi olemme havainneet, että resveratroli alassäädetty ilmentymistä pitkän ei-koodaavan RNA-MALAT1 annoksesta -riippuvaista tavalla (kuvio 3C). Voit tarkistaa vaikutusta resveratrolin MALAT1 ilmaisua, käytimme MALAT1 promoottori dual-lusiferaasireportterisysteemillä ja totesi, että resveratrol suoraan esti promoottorin aktiivisuutta MALAT1, esim. vain 10% promoottorin aktiivisuus saavutettiin 50pM resveratrolin kontrolliin verrattuna (kuvio 3D). Nämä tiedot osoittivat, että resveratroli on suora vaikutus MALAT1 geenin transkription.

4. MALAT1 Edistää leviämisen, Invasion ja Migration, ja lisää Nuclear sijainnilla β-kateniinin ja tasot sen Downstream geenituotteiden LoVo Solut

Seuraavaksi käyttäen lentivirus välittämä konstruktioita, me pudotti tai yli ilmaistuna MALAT1 geenistä ilmentymistä LoVo soluissa. Tuloksemme osoittivat selvästi, että leviämisen ja invaasion /migraatiokykyä Lövön soluja väheni merkittävästi MALAT1 Knockdown, ja kasvoi MALAT1 yli-ilmentyminen (kuvio 4A, 4B).

(A):

In vitro

kasvu LoVo soluja, jotka ilmentävät MALAT1-shRNA, MALAT1-yliekspressio, tyhjä vektori vs. vanhempien soluja. (B): arviointi ja kvantifiointi Solujen migraation ja invaasion ilmoitettu LoVo solujen A. Arvot edustavat useita muuttavien /invasiivisen solua kohti 5 HPF. *

p

0,05 tai **

p

0,01, verrattuna kontrolli LoVo- ryhmään.

Kun me tippuu alas, MALAT1 geenin ilmentymistä käyttäen shRNA rakentaa LoVo soluissa, olimme yllättyneitä siitä, että β-kateniinin proteiini pysyy sytoplasmassa, kun sen läsnäolo ytimet oli remarkedly lisääntynyt (kuvio 5A). Lisäksi olemme huomanneet, MALAT1 pudotus vähentää ilmentymistä β-kateniinin alavirran kohdegeenien, kuten c-Myc, MMP-7, kuten MALAT1 yli-ilmentyminen ei päinvastainen (kuvio 5B). Tämä joukko tietoja vahvasti ymmärtää, että resveratroli inhiboivat, invaasion ja muuttoliike ominaisuuksia CRC solujen kautta alas-säätelemällä MALAT1 ilmaisua.

(A): Koko tai solu-uutteita eri solun osiin alkaen LoVo soluista, jotka ilmentävät MALAT1 -shRNA, MALAT1-yliekspressio, tyhjä vektori koetettiin varten β-kateniinin ja proteiinin tasojen määrä. *

p

0,05 tai **

p

0,01 verrattuna vektorisäätö. (B): Koko tai solu-uutteista eri soluosastoihin päässä LoVo soluista, jotka ilmentävät MALAT1-shRNA, MALAT1-yli-ilmennetään, tyhjä vektori koetettiin c-Myc, MMP-7, ja proteiini kvantitoitiin. *

p

0,05 tai **

p

0,01 verrattuna vektorisäädön.

5. Yliekspressio MALAT1 pelastaa LoVo Solut Tukahdetut Migration ja Invasion Resveratrol

Vahvista meidän toteaminen resveratrolin tukahduttaa muuttoliikkeen ja invaasio LoVo solujen kautta MALAT1, eli MALAT1 pelastus koe suoritettiin. Tuloksemme osoittivat, että lentivirus-välitteinen yliekspressio MALAT1 vaimensi merkittävästi resveratrol inhiboivan on solujen vaeltamiseen ja hyökkäyksen LoVo-soluissa (kuvio 6A). Toisin sanoen, yliekspressio MALAT1 voisi kääntää resveratrolilla. Lisäksi Western blot tulokset osoittivat, että yli-ilmentyminen MALAT1 käänteinen vaikutus resveratrolin ydinaseiden β-kateniinin ja proteiinin ilmentymistä c-Myc: n ja MMP-7: LoVo-soluihin (kuvio 6B).

(A) : LoVo solut, jotka ilmentävät MALAT1-yliekspressoituina tyhjä vektori hoidettiin tai ilman 50pM resveratroli 48 tuntia ja solujen maahanmuuton ja invaasion kyky mitattiin. (B): Koko tai solu-uutteista eri soluosastoihin päässä LoVo soluista, jotka ilmentävät MALAT1-yli-ilmennetään, tyhjä vektori käsiteltiin kanssa tai ilman 50 uM resveratrol koetettiin varten β-kateniinin, c-Myc, MMP-7, ja proteiini kvantitoitiin . *

p

0,05 tai **

p

0,01, verrattuna LoVo soluja käsiteltiin 50 uM resveratrol.

6. Resveratrol Estää Wnt /β-kateniinin Signaling kautta MALAT1

Oletimme, että resveratroli inhiboi Wnt /β-kateniinin signaalireitin kautta MALAT1 asetuksella. Tämän hypoteesin testaamiseksi käytimme immunovärjäykseen ja Western blot -analyysit tarkkailla onko β-kateniinin trans-sijaitsee välillä sytoplasmassa ydin- läsnäolo resveratrolin ja manipuloinnin MALAT1 ekspressiotasoja. Jotta vaikutus selvempää, käytimme LiCI estämään GSK3p sitoutumasta p-kateniinin proteiinia, lisätä aktiivisen tilan Wnt /β-kateniinin signaalireitin. Tuloksemme perustettu, kuten LiCI: todellakin indusoi translokaatio β-kateniinin proteiinin sytoplasmasta tumaan, resveratrolin (50 uM) olennaisesti estää tätä prosessia (kuvio 7A). Myöhemmin alas-säätely MALAT1 tehosti vaikutusta resveratrolin on inversio β-kateniinin translokaatio välillä sytoplasmasta tuman shRNA /MALAT1 LoVo soluja, kun taas säätely ylöspäin MALAT1 heikentänyt sitä (kuvio 7B, 7C).

(A): Resveratrol romutettu LiCl aiheuttama tumaansiirtymiseen of β-kateniinin. Immunofluoresenssi β-kateniinin LoVo-soluja käsiteltiin LiCl: kanssa tai ilman resveratrol. (B): Nuclear otteita LoVo soluista, jotka ilmentävät MALAT1-shRNA, MALAT1-yli-ilmennetään, tyhjä vektori, käsiteltiin LiCl: kanssa tai ilman resveratrol, koetettiin varten β-kateniinin, c-Myc, MMP-7. (C): kvantifiointi β-kateniinin, c-Myc, MMP-7-proteiinin tasoja tiedot on esitetty (A). **

p

0,01, verrattuna tyhjä ryhmä tai LiCl yksin ryhmä. (D): Suhteellinen LEF /TCF promoottoriaktiivisuuksien LoVo soluissa, jotka ilmentävät MALAT1-shRNA, MALAT1-yliekspressoituina tyhjän vektorin, hoitaa LiCl, tai ilman resveratrol. **

p

0,01, verrattuna tyhjä ryhmä tai LiCl yksin ryhmä. (E): Ei vuorovaikutusta MALAT1 ja β-kateniinin. Aseta: RT-PCR tulos osoittaa määrän RNA vedetty alas RNA sitovan proteiinin immunosaostus. Negatiivisina kontrolleina ei cDNA (tyhjä) tai IgG yksin käytettiin. Alempi ruudussa: määrällinen tulos insertin.

Lisäksi testasimme vaikutus resveratrolin Wnt /β-kateniinin signalointi käyttäen reportteri LEF /TCF promoottori dual-lusiferaarikonstrukti. Tuloksemme osoittivat selvästi, että resveratrol esti promoottorin aktiivisuutta LEF /TCF aiheuttama LiCI, ja co-tukahduttaminen MALAT1 johti parantamiseksi tämä vaikutus, toisena yliekspressio MALAT1 vastustavat sitä (kuvio 7D). Kaikki nämä tiedot tuettava että resveratroli inhiboi Wnt /β-kateniinin signaalireitin kautta tukahduttaa MALAT1 ilmaisua. Koska MALAT1 ja β-kateniinin proteiinin sekä olemassa ydin, joten se on erittäin kiinnostava, että tiedämme, ovatko nämä kaksi molekyyliä voivat suoraan vuorovaikutuksessa toistensa kanssa, mikä voidaan havaita käyttämällä RNA-sitovan proteiinin immunosaostus tekniikkaa. Yllättäen meidän tiedot osoittivat vähän vuorovaikutusta MALAT1 ja β-kateniinin (Kuva 7E). Tämä osoitti, että MALAT1 saattaa epäsuorasti vuorovaikutuksessa β-kateniinin vaikuttavaa signaalia kaskadi.

7. Vahvistus meidän Keskeiset tulokset Another CRC Cell Line HCT116

Vahvista tärkeimmistä havainnoista LoVo soluissa, testasimme toinen CRC HCT116 solulinjaan käyttämällä samanlaisia ​​lähestymistapoja. Tuloksemme osoittivat, että resveratroli inhiboi proliferaatiota HCT116-soluissa IC 50 100 uM (kuvio 8A). HCT 116 solua oli paljon pienempi MALAT1 ilmaisu kuin LoVo soluja, mutta kuitenkin, kun samanlainen LoVo soluihin, yliekspressio MALAT1 edistänyt leviämisen HCT116-soluja (kuvio 8B, 8C, 8D).

(A): Resveratrol inhiboivat HCT116-soluja, jonka IC50 on 100 uM. (B): HCT 116 solut osoittivat alempi MALAT1 ilmaisu kuin LoVo soluja. **

p

0,01 verrattuna LoVo soluihin. (C): n yli-ilmentyminen MALAT1 in HCT116-soluissa. (D): n yli-ilmentyminen MALAT1 edistää in vitro kasvua HCT116-soluja. (E): n yli-ilmentyminen MALAT1 lievensi estävä vaikutus resveratrolin siirtolaisuudesta ja hyökkäyksen HCT116-soluissa. HCT116-solut ilmentävät MALAT1-yliekspressoituina tyhjä vektori hoidettiin tai ilman 50pM resveratroli 48 tuntia ja solujen maahanmuuton ja invaasion kyky mitattiin. (F): Koko tai solu-uutteita eri solun osiin alkaen HCT116 soluista, jotka ilmentävät MALAT1-yliekspressoituina tyhjä vektori käsitelty tai ilman 50pM resveratroli 48 tuntia koetettiin varten β-kateniinin, c-Myc, MMP-7 ja proteiinin tasot kvantifioitiin. *

p

0,05 tai **

p

0,01, verrattuna HCT116-solujen hoidettiin 100 uM resveratrol.

Lisäksi resveratrolin myös merkittävästi esti muuttoliike ja hyökkäys kyky HCT116. Kuten LoVo soluissa, yliekspressio MALAT1 pelastettiin HCT116-solujen tukahduttaminen muuttoliikkeen ja hyökkäystä resveratrolin (kuvio 8E). Western blot Tulokset osoittivat myös, että yli-ilmentyminen MALAT1 käänteinen vaikutus resveratrolin ydinaseiden β-kateniinin ja proteiinin ilmentymistä c-Myc ja MMP-7 HCT116-soluissa (kuvio 8F).

Keskustelu

peräsuolen syöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia maailmassa, korkea korko toistumisen ja etäpesäke. Mekanismit toistuminen ja etäpesäke ovat edelleen hyvin monimutkainen. Tällä hetkellä hoito peräsuolen syöpä on pääosin kirurginen resektio yhdistettynä kemoterapia, immunoterapia, ja muut vaihtoehtoiset huolet kuten perinteinen kiinalainen lääketiede. Perinteinen kiinalainen lääketiede ja sen viime aikoina saatu uutettu monomeeri hoito voi parantaa syövän oireita, vähentää syövän etäpesäke, sekä vähentää toistumisen riskiä paksusuolen syöpä. Kuitenkin terapeuttiset tavoitteet ja mekanismit ovat edelleen vaikeasti. Näistä uutettu monomeerien, resveratroli on täydellinen esimerkki. Jo vuonna 1993, Jayafilake

et ai

on havaittu, että resveratroli on syövän ominaisuus, koska se tukahduttavaa vaikutusta proteiini-tyrosiinikinaasin aktiivisuuden [20]. Muut tutkijat edelleen havaittu, että resveratroli on estävä vaikutus suuri kirjo pahanlaatuisten syöpäsolujen, jotka ovat peräisin rinta-, maha-, paksusuoli-, eturauhas-, munasarja-, ja ihosyöpä [21] – [26]. Nykyinen tutkimukset osoittivat, että resveratroli estää proliferaatiota, invaasio ja etäpesäkkeiden paksusuolisyövän soluja.

Koska keskeinen transkription aktivaatiotekijää Wnt /β-kateniinin signaalireitin, kun alkupään aktivointi, β-kateniinin usein translokoituu tuma solulimassa, koordinoidusti muiden transkriptiotekijöiden kuten TCF /LEF, aktivoi sen kohdegeenien c-Myc, cyclinD1, MMP-7, ja CD44, joka puolestaan ​​pelata keskeinen rooli kasvaimen aloittamisen ja kehittämisen [27] – [ ,,,0],30]. Tuloksemme osoittivat, että resveratrol estetty translokaatio β-kateniinin on ydin, jolloin alennettu ilmentyminen c-Myc: n ja MMP-7.

Long ei-koodaavat RNA-MALAT1 oli aluksi raportoitu invasiivisia ei-pienisoluisen karsinooma, ja tapahtumat on löydetty yli-ilmentävät monissa muissa syöpäsoluissa, että ilmoitettu MALAT1 liittyy ja metastaasit [11] – [14]. Meidän tutkimukset osoittivat MALAT1 yli-ilmentynyt 60 CRC kudoksissa verrattuna viereiseen normaaleissa kudoksissa, ja MALAT1 yli-ilmentyminen korreloi CRC invaasiota ja etäpesäkkeiden ominaisuuksia. Meidän seulonta kokeissa olemme tunnistaneet kaksi perinteisen kiinalaisen lääketieteen uutetaan monomeerit, joilla on suora vaikutus MALAT1 ilme. Resveratrol on paras niistä. Meidän nykyiset tutkimukset, me havainnollistaa, että shRNA välittämä knockdovvn MALAT1 ilmeisesti vähensi hyökkäyksen ja muuttoliike valmiuksia CRC LoVo ja HCT116-soluissa. Samanlaisia ​​tuloksia resveratrol hoidon knockdovvn MALAT1 esti trans-sijainti β-kateniinin välillä sytoplasmasta tumaan, mikä laski c-Myc: n ja MMP-7 ilmentymisen, kun taas MALAT1 yli-ilmentyminen ei päinvastoin.

käyttämällä LEF /TCF-promoottori dual-lusiferaasireportteri- konstrukti ja aktivoimalla Wnt /β-kateniinin signaalireitin LiCl, olemme edelleen osoittaneet, että pudotus on MALAT1 parannettu estävää vaikutusta resveratrolin on promoottorin aktiivisuus LEF /TCF indusoi LiCl, kun taas yli-ilmentyminen MALAT1 heikentänyt sitä. Kaikki nämä tulokset viittasivat siihen, että korostetaan mekanismi resveratrolin voi olla läpi tukahduttaminen Wnt /β-kateniinin signaloinnin kautta alas-säätely MALAT1 ilmaisun.

MALAT1 on nimenomaan säilytetty ydin- pilkkujen liittyvät varastointi tai muuttaminen pre-mRNA: n koneet, on mahdollinen vaikutus geenien toiminnan sääntelyä, kaikki nämä tarkoita, että MALAT1 voi olla tärkeä rooli syövän synnyssä [31] – [33]. Siitä syystä, että MALAT1 ja β-kateniinin proteiini molemmat asuvat tumassa, tutkimme onko suora vuorovaikutus näiden kahden molekyylin tumassa. Valitettavasti huomasimme vähän suoraa vuorovaikutusta MALAT1 ja β-kateniinin, mikä viittaa siihen, että saattaa olla olemassa muita molekyylejä säätelyyn osallistuvan välillä MALAT1 ja β-kateniinin. Ei suoraa korrelaatiota korkea MALAT1 ilmaisun kliinisissä näytteissä ja ydinvoiman kertymistä β-kateniinin todettiin. Ehdottama Brabletz T

et al

, β-kateniinin (kuva S1) in paksusuolikarsinoomat osoitti vahvaa ydinvoiman rikastumiseen hyökkäyksen edessä, kun taas suuressa osassa Keski kasvaimen alueelle, β-kateniinin havaittiin sytoplasmassa ja kalvo [34] – [36]. Tämä tarkoittaa, että meidän pitäisi erottaa hyökkäyksen edessä muusta CRC kudosten ja mitata ekspressiotasot MALAT1, β-kateniinin ja niiden lokalisointi, niiden korrelaation. Suunnittelemme tulevissa tutkimuksissa, käyttäen tekniikoita, kuten ennustus analyysin ohjelmisto, samanaikainen immunosaostus proteiinisekvensointiin, proteiini-sirut ja geenilastut, tunnistaa erityisiä yhteyksiä MALAT1 ja β-kateniinin.

Yhteenvetona tuloksemme paljastui mekanismeja, joilla resveratrol säätelee MALAT1 puolestaan ​​muuttaa ydinvoiman lokalisoinnin β-kateniinin, jolloin alensi Wnt /β-kateniinin signalointi ja lopulta eston ja metastaasit. Tämä löytö antaa varmasti elintärkeä prekliinisen todisteita tukemaan tulevaa käyttöä resveratrolin ehkäisyyn ja hoitoon CRC.

tukeminen Information

Kuva S1.

valinta tehokkain shRNA varten MALAT1, havaitsemiseksi MALAT1 mRNA ja β-kateniinin proteiinin ilmentymisen CRC kudoksissa ja viereisten normaaleissa kudoksissa. (A): LoVo-soluja infektoitiin lentivirus kolme pLV4-MALAT1 shRNAs tai pLV4-vektori. Niiden tehokkuus naistaintumisprosenttia havaittiin reaaliaikainen PCR. *

p

0,05 tai **

p

0,01 verrattuna vektorisäätö. (B): MALAT1 mRNA: n ilmentymisen tasot mitattiin reaaliaikaisella PCR: llä, CRC kudosten ja viereiset normaalit kudokset. **

p

0,01, verrattuna normaalissa kudoksessa tai CRC kudoksiin ilman etäpesäkkeitä.