Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

Huolimatta parannuksista hoitostrategioiden pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC), tulokset eivät ole merkittävästi parantunut; korostetaan identifioida uusia hoitomenetelmiä kohdistaa tähän tautiin. Puuttua tähän haasteeseen etenimme arvioida roolia raudan HNSCC.

Experimental Suunnittelu

Expression raudan liittyviä geenejä tutkittiin HNSCC solulinjoissa käyttäen kvantitatiivista RT-PCR. Cellular fenotyyppivaikutukset arvioitiin käyttäen elinkelpoisuuden (MTS), klonogeeniset selviytyminen, BrdU, ja kasvaimen muodostumisen määritykset. Prognostisia merkitys rauta-sukuiset proteiinit määritettiin käyttämällä immunohistokemiaa.

Tulokset

paneelin HNSCC solulinjojen, hemochromatosis (HFE) oli yksi yliekspressoitu osallistuvia geenejä rautaa asetuksessa.

In vitro

knockdovvn HFE vuonna HNSCC solulinjoissa vähensi merkittävästi hepcidin (HAMP) ilmaisun ja solunsisäisen rauta tasolla. Tämä puolestaan ​​aiheutti huomattavan laskun HNSCC solujen elinkelpoisuuden, kyky muodostaa klooneja, DNA-synteesin, ja Wnt signalointia. Näitä solumuutoksia palautettiin uudelleen käyttöön rauta takaisin HNSCC soluihin jälkeen HFE Knockdown, mikä osoittaa, että rautaa välittävät tämän fenotyypin. Yhtäpitävästi, hoitoon HNSCC solujen rautaa kelatoiva, siklopiroksiolamiini (CPX), vähentää merkittävästi elinkelpoisuutta ja klonogeeniset selviytymistä. Lopuksi potilailla, joilla on korkea HFE ilme kokenut vähentynyt selviytymisen verrattuna potilaisiin, joilla on alhainen HFE ilme.

Johtopäätökset

Tuloksemme tunnistaa HFE mahdollisesti uusia prognostinen markkeri HNSCC joka edistää syövän etenemiseen

kautta

HAMP ja suurentaa solunsisäisen raudan tasoja, mikä johtaa lisääntyneeseen soluproliferaatioon ja kasvainten muodostumiseen. Näin ollen nämä havainnot viittaavat siihen, että rautakelaattorit saattaisi olla terapeuttista roolia HNSCC hallintaan.

Citation: Lenarduzzi M, Hui ABY Yue S, Ito E, Shi W, Williams J, et al. (2013) hemochromatosis Parantaa syövän etenemiseen

kautta

lisääntymisen merkkejä Solunsisäiset Iron pään ja kaulan syöpä. PLoS ONE 8 (8): e74075. doi: 10,1371 /journal.pone.0074075

Editor: Seema Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 22 heinäkuu 2013; Julkaistu: 26 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Lenarduzzi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ on tukenut varoja Ontario Institute of Cancer Research, Kanadan Institutes of Health Research, ja Dr. Mariano Elia professuurin Pään ja kaulan Cancer Research. Kirjoittajat kiitollisena tunnustavat hyväntekeväisyys tukea Wharton Family, Joe Team, ja Gordon Tozer. Michelle Lenarduzzi on vastaanottaja stipendejä Terry Fox Foundation Strategic Training Initiative for Excellence in Radiation Research 21st Century (EIRR21) at Kanadan Institutes of Health Research (CIHR), Ontario Graduate Scholarship (OGS) ja Medical biofysiikka Excellence myöntää. Tuki on myös päässä Campbell Family Institute for Cancer Research ja terveysministeriön ja pitkän aikavälin suunnittelua. CIHR – https://www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html, EIRR21 – https://www.eirr21.utoronto.ca/, OGS – https://osap.gov.on.ca /OSAPPortal/en/A-ZListofAid/TCONT003465.html. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) on kuudes yleisin syöpä maailmassa, jossa ~ 650000 sairastuneiden ja ~ 350000 kuolemantapausta vuosittain [1,2]. Suurin osa potilaista on paikallisesti edennyt sairaus, ja vaikka uudet hoitomuodot, 5 vuoden taudista vapaan eloonjäämisluvut ovat jääneet 30-40% [3]. Nämä huono tulokset korostavat tärkeää kehittää uusia hoitostrategioita kohdistaa tähän tautiin.

Rauta on olennainen osa osallistuu useisiin avainprosessit lukien DNA ja hemin synteesin, Wnt signalointia, ja solujen aineenvaihduntaan [4,5]. Monet syöpäsolujen näytteille lisääntynyt kysyntä raudan säilyttääkseen korkean solujen vaihtuvuus ja DNA-synteesiä. Näin ollen geenit mukana rautaa asetuksessa usein vapautettiin syövissä. Täällä raportoimme yliekspressio hemochromatosis (HFE) in HNSCC, ja osoittavat sen kyky muuttaa solunsisäisiä rauta- ja lisännyt solujen jakautumista.

hemochromatosis on transmembraaninen glykoproteiini, samanlainen major histocompatibility luokan 1 tyypin molekyyli ( MHC), joka assosioituu B

2-mikroglobuliinin solunsisäiseen kuljetusta solukalvon [6]. Tällä kalvo, HFE voi sitoutua joko transferriini-reseptori-1 (TRF1) tai transferriini-reseptori 2 (TFR2). Sitoutumiskohtien HFE ja rauta sitoutuu transferriini päällekkäisyyttä TFR1 [7], jolloin säätämiseen rauta sisäänottoa soluihin. Kuitenkin uudempi todisteita viittaa myös siihen, että keskeinen rooli HFE on edistää ilmaus rauta säätelyhormoni, hepcidin (HAMP), joko sitova TFR2 [8], tai itsenäisesti [9]. Funktio HAMP on sisäistää ja hajottamaan ferroportin (FPN), ainoa solu viejä raudan [10]; mikä johtaa solunsisäisten raudan tasoja estämällä rauta julkaisu [10]. Esimerkiksi yli-ilmentyminen HFE makrofageissa ja paksusuolen adenokarsinooman solulinjoja esti ulosvirtaus solun raudan [11,12].

Toisaalta geneettiset mutaatiot

HFE

johtaa raudan ylikuormitus kunto, perinnöllinen hemochromatosis (HH). Yleisin muoto HH johtuu yhden emäsparin mutaatio HFE mikä johtaa C282Y vaihdon [6], joka häiritsee vuorovaikutus HFE B

2-mikroglobuliinin, ja näin ollen ohjausta HFE soluun kalvo. Potilaat, joilla on HH epäasianmukaisesti alhainen HAMP [8], jossa korostetaan HFE varten HAMP. Alhainen HAMP johtaa vapautuminen raudan retikuloendoteliaalijärjestelmän makrofagit ja mahdollistaa jatkuvan raudan imeytymistä suolistosta, mikä johtaa liiallinen rauta liikkeessä [13]. Näin ollen kiertävä transferriini kyllästyy, jolloin kertyminen rautaa parenkymaalisolut eri end-elimissä, johtaen kirroosi, diabetes, kardiomyopatia, ja syöpä [13,14].

Tässä olevassa tutkimuksessa, raportoimme yli ilmentymistä HFE vuonna HSNCC, mikä puolestaan ​​lisäsi solujen tasot HAMP, ja solunsisäinen rautaa. Häiritsemällä solunsisäisiä rauta tasoja, HFE voi edistää solujen lisääntymistä, DNA-synteesi, Wnt signalointia, ja kasvainten muodostumisen

.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki eläinkokeet suoritettiin mukaisesti ohjeiden on animal Care komitea yliopiston Health Network (Toronto, Kanada). Protokolla hyväksyttiin Animal Care komitea yliopiston Health Network (Protocol Number: 342,19).

Patient kerättiin 26 HNSCC potilailla, joilla hyväksyntää yliopiston Health Network Institutional Research Ethics Board, (REB hyväksyntä # 07-0521-CE). Nämä yksilöt mukana Hyväksytty ryhmä 12 uusiutuneen ja 14 ei-uusiutunut potilailla, joiden mediaani seuranta-aika on 3 vuotta. Kliiniset tiedot näistä 26 potilaille annetaan taulukossa S1. Kirjallinen tai suullinen suostumus ei saatu potilailta johtuen ajan meidän kohortin (2003-2007). Siksi meidän University Health Network Institutional tutkimuseettiseltä luopunut vaatimasta kirjallinen lupa osallistujilta tämän tutkimuksen.

Solut Lines ja reagenssit

Ihmisen hypopharyngeal HNSCC Fadu solulinja saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA), ja viljeltiin mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ihmisen kurkunpään levyepiteelisyöpä linjat, UTSCC-8 ja UTSCC-42a (laji lahjoja R Grenman, TYKS, Turku, Suomi) [15,16] pidettiin DMEM täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Wisent, Inc) ja 100 mg /l penisilliiniä /streptomysiiniä. Normaali suun epiteelisolujen (NOE) hankittiin kaupallisesti ja niitä viljeltiin suositeltu väliaineessa (Celprogen). Kaikki soluja pidettiin 37 ° C inkubaattorissa kosteutetulla 5% CO

2, todennettu Centre for Applied Genomics (Hospital for Sick Children, Toronto, Kanada) käyttämällä AmpF /STR Identifier PCR Amplification Kit (Applied Biosystems) ja testattiin rutiininomaisesti mykoplasmakontaminaation käyttäen Mycoalert detektioreagenssipakkaus (Lonza Group Ltd).

kvantifiointi mRNA

Kokonais-RNA uutettiin solulinjoista käyttämällä kokonais-RNA-puhdistuskittiä (Norgen), sitten käänteistranskriptio käyttämällä SuperScript II käänteistranskriptaasia (Invitrogen Kanada) käsittelyssä. Transcript raudan säätelemällä geenien: ferroportin (FPN), hepcidin (HAMP), hemochromatosis (HFE), transferriini-reseptori 1 (TFR1), ferritiinin raskaan ketjun (FTH1), ferritiini kevyt ketju (FTL) ja mitokondrioita ferritiini (FTMT) arvioitiin by qRT-PCR: llä käyttämällä SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), ja ABI PRISM 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA), kuten aiemmin on kuvattu [17]. Alukesekvenssit käytettiin tässä tutkimuksessa kaikki lueteltu taulukossa S2.

Transfektio Kokeet

biologiset vaikutukset HFE tutkittiin käyttämällä siRNA: t kohdistaminen HFE. siHFE1 (Hs_HFE_5 FlexiTube siRNA) ja siHFE2 (Hs_HFE_2 FlexiTube siRNA) hankittiin Qiagen. Salatun siRNA (Hs_Control_ss Flexitube siRNA) toimi negatiivisena kontrollina. Kaikki transfektiot suoritettiin täyteen kasvatusliuokseen ilman antibiootteja käyttäen Lipofectamine 2000 ja 20 nM siRNA, kuten aiemmin on kuvattu [18].

Reagenssit

siklopiroksiolamiini (CPX), deferoksamiinia hydrokloridisuola (DFO), ferriammoniumsitraattia (FAC) saatiin Sigma-Aldrich.

elinvoimaisuus ja klonogeeninen Analyysit

elinkelpoisuuden HNSCC transfektoitujen solujen siHFE + säteilyä (RT), tai solut, joita käsiteltiin CPX, on määritetään CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) (Promega Biosciences) mukaan valmistajan suositusten mukaisesti. Pesäkkeitä muodostava kyky HNSCC transfektoitujen solujen siHFE + RT, tai solut, joita käsiteltiin CPX + RT määritettiin käyttäen klonogeenisten määritystä kuten aiemmin on kuvattu [19]. Lyhyesti, 48 tuntia transfektion jälkeen siHFE tai 72 tuntia hoidon jälkeen CPX, Fadu solut uudelleen siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille, ja niitä inkuboitiin 37

0 ° C: ssa 5% CO

2 10-12päivä. Tämän jälkeen levyt pestiin ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla 50% metanolia, ja pesäkkeiden lukumäärä laskettiin sitten. Elossa olevien solujen laskettiin vertaamalla siHFE vs. siCTRL tai CPX vs. CTRL.

virtaussytometria

Virtaussytometria analyysit suoritettiin FACSCalibur -virtaussytometrillä (BD Biosciences), analyysit suoritettiin käyttäen FlowJo 7,5 ohjelmistoa (Tree Star, San Carlos, CA, USA), kuten aiemmin on kuvattu [17].

labiili Iron

solujen labiili rauta-allas mitattiin käyttäen kalseiini-acetoxymethylester (kalseiini-AM) kuin valmistajan ilmoitus (Invitrogen). Transfektoituja soluja inkuboitiin 1 uM kalseiini-AM 15 minuuttia 37 ° C: ssa. Solut pestiin PBS: llä, sitten mitattiin virtaussytometrillä, kuten on aiemmin kuvattu [18].

BrdU

BrdU inkorporaatio mitattiin käyttämällä Exalpha biologista BrdU Colorimetric ELISA Kit. Lyhyesti, transfektoituja soluja inkuboitiin BrdU reagenssin 24 tuntia, värjäsimme ja analysoinut valmistajan spesifikaatioiden, kuten aiemmin on kuvattu [18].

ROS Kokeet

Solunsisäinen reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tasot mitattiin käyttämällä epäspesifisiä 5- (ja 6) kloorimetyyli-2 ’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diasetaatti (CM-H2DCFDA; eksitaatio 488 nm, emissio 525 nm) ohjeiden mukaisesti valmistaja (Invitrogen). Transfektoituja soluja inkuboitiin 5 uM CM-H2DCFDA 30 minuuttia 37 ° C: ssa. Solut pestiin PBS: llä, sitten mitattiin virtaussytometrillä [18].

Western Blot

Fadu solut transfektoitiin siHFE tai ohjaus, 48 ​​tuntia transfektion jälkeen solut lyysattiin 1 M Tris- HCl: lla (pH 8), 5 M NaCl: a, ja 1% NP40: tä ja proteaasi-inhibiittoriseosta (Roche Diagnostics). Proteiinipitoisuus arvioitiin kuten aiemmin on kuvattu [17]. Membraanit tutkittiin käyttämällä koettimena anti-B-kateniini kanin monoklonaalista vasta-ainetta (Cell Signalling, 8814) tai anti-HFE monoklonaalinen vasta-aine (Abnova) ja sen jälkeen sekundaarisia vasta-aineita on konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (Abcam). GAPDH ja α-tubuliinin proteiinin ilmentyminen käytettiin lastaus valvontaa. Western blotit määrällisesti Adobe Photoshop Pixel kvantifiointi Plug-In (Richard Rosenman Mainonta suunnittelu).

Iron Rescue Kokeet

Fadu solut transfektoitiin siHFE tai valvontaa; 24 tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin joko 5 uM ja DFO, 5 uM FACS tai negatiivinen kontrolli (DMSO). Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen, Fadu soluja käsiteltiin kanssa tai ilman sitä 2 Gy RT. Viisi päivää transfektion jälkeen solujen elinkelpoisuus mitattiin kuten edellä on kuvattu.

Kasvaimen muodostumisen määritys

Fadu solut transfektoitiin siCTRL tai siHFE. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin, elävät solut otettiin talteen ja 2.5×10

5 solut suspendoitiin 100 ui median ja lihakseen vasempaan kaksoiskantalihas 8-10 viikkoa vanhoja naaraspuolisia sekamuotoinen immuunivajavuustila (SCID) BALB /c hiirillä. Kasvaimen kasvua seurattiin mittaamalla tuumorin plus jalan halkaisija (TLD) kaksi tai kolme kertaa viikossa; hiiret tapettiin kun TLD saavutti 13 mm kuin inhimillinen päätepisteenä.

Kasvaimen muodostumisen määritys kanssa CPX

CPX tutkimuksessa kahden viikon Fadu kasvainsolujen istutuksen edellä kuvatulla tavalla, hiiret hoidettiin päivittäin maanantaista perjantaihin suuonteloon kanssa CPX (25 mg /kg) veteen tai auton hallinnan yhteensä kaksi viikkoa. Kasvainten kasvua seurattiin mittaamalla kasvaimen plus jalan halkaisija (TLD) kolme kertaa viikossa; hiiret tapettiin kun TLD saavutti 13 mm kuin inhimillinen päätepisteenä.

immunohistokemia of Iron Proteiinit

Expression of TFR1 ja HFE arvioitiin 26 ensisijainen diagnostinen HNSCC biopsiasektioiden käyttäen mikroaaltouuni antigeeni haku yhdessä Level-2 Ultra streptavidiini System, ja anti-HFE (Sigma HPA017276, 1/300 laimennus) tai anti-TFR1 (Sigma HPA028598, 1/500 laimennus), kuten aiemmin on kuvattu [17]. Lyhyesti, 4-um leikkeet deparaffin, käsiteltiin antigeenin haku reagenssi, blokattiin 3% vetyperoksidia, ja inkuboitiin joko anti-HFE tai anti-TFR1 4 ° C: ssa yön yli. Seuraavana päivänä leikkeitä inkuboitiin biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen ja streptavidiiniin loppuun värjäystä. Soluliman värjäys anti-HFE tai anti-TFR1 pisteytettiin 0-3 perustuu värjäytymisintensiteettiä joka määriteltiin tämän mukaisesti: 0 (ei värjäys); 1 (lievä lisääntynyt värjäytyminen verrata vastaaviin normaalin epiteelin); 2 (kohtalainen lisääntynyt värjäytyminen) ja 3 (voimakas lisääntynyt värjäytyminen).

Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet on suoritettu vähintään kolme riippumatonta kertaa, ja tiedot esitetään keskiarvona + keskivirhe keskiarvosta (SEM). Vertailtaessa kahden hoitoryhmän analysoitiin käyttäen Studentin

t

testiä. Kaksipuolinen testejä sovellettiin. Tulokset pidettiin merkittävinä, jos p-arvo oli alle tai yhtä suuri kuin 0,05. Analyysi ja kaaviot saatiin valmiiksi käyttäen Graphpad Prism Software (Graphpad Software, Inc).

Tulokset

HFE yliekspressoituu HNSCC solulinjoissa verrattuna NOE solulinjaan

Tunnistaa differentiaalisesti ilmaisi rauta säätelevä geenien HNSCC, pohjapinta-mRNA: n ekspressio tasoille kolme HNSCC solulinjoissa verrattuna on NOE käyttäen qRT-PCR: ää. HFE todettiin olevan korkeimman ilmentymistason 80-kertainen yliekspressio HNSCCs vs. NOE solulinjassa (kuvio 1A). Ferritiini (FTH1) oli toiseksi korkein yli-ilmeneminen Fadu ja UTSCC 42a soluja verrattuna NOE. Huomattavaa on, että TFR1 myös näytti olevan hieman yli-ilmentynyt HNSCC verrattuna NOE solulinjaan.

(A) qRT-PCR-analyysi FPN, HAMP, HFE, TFR1, FTH1, FTL ja FTMT ilmaisun Fadu, UTSCC 42a ja UTSCC8 HNSCC syöpäsolulinjat, normalisoitu niihin geenejä NOE-soluissa. (B) Fadu solut transfektoitiin 20 nM siCTRL tai siHFE1. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin Fadu soluissa MTS-määritys 24-72 tuntia transfektion jälkeen. (C) Fadu solut transfektoitiin 20 nM siCTRL tai siHFE1, säteilytettiin sitten 48 tuntia transfektion jälkeen (4 Gy). Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTS-määritys 5 päivää transfektion jälkeen. (D) klonogeeninen eloonjäämistä Fadu solujen mitattiin 10-12 päivä sen jälkeen, kun uudelleen ymppäämällä solut käsiteltiin siCTRL (20 nM) tai siHFE1 (20 nM) 72 tunnin ajan. (E) Solujen elinkelpoisuus NOE solujen arvioitiin MTS-määritys 24, 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen 20 nM siCTRL tai siHFE1. (F) NOE-solut transfektoitiin 20 nM siCTRL tai siHFE1 tai 2 ?, säteilytetään sitten 48 tuntia transfektion jälkeen (4 Gy). Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTS-määritys 5 vrk transfektion. * P 0,05, ** P 0,005, P = ns (ei merkitsevä).

In vitro vaikutukset HFE alas asetuksen

Jotta voidaan arvioida biologisen merkityksen HFE yli-ilmentyminen, pudotus kokeet suoritettiin HNSCC soluissa käyttäen siRNA lähestymistapaa. Jatkuva Knockdown saavutettiin Fadu soluissa jopa 72 tuntia käyttäen kahta itsenäistä siRNA kohdistaminen HFE sekä transkriptio ja proteiini tasoilla (kuviot S1A ja S1B). HNSCC solut osoittivat merkittävää vähenemistä solujen elinkelpoisuuden kanssa tai ilman säteilyä transfektion jälkeen siHFE verrattuna siCTRL (kuvio 1 B-C, S1C-E). Lisäksi kyky HNSCC solujen muodostamiseksi pesäkkeitä oli merkittävästi vähentynyt tai ilman säteilyä transfektion jälkeen siHFE verrattuna siCTRL (kuvio 1D, S1F-G). Sen sijaan elinkelpoisuutta NOE solujen kanssa tai ilman säteilyä pysynyt ennallaan transfektion jälkeen siHFE verrattuna siCTRL (kuva 1 E-F, S1H). Kaiken kaikkiaan nämä havainnot osoittivat, että vähentämällä HFE ensisijaisesti pienentää elinkelpoisuutta ja kyky muodostaa klooneja in HNSCC verrattuna NOE soluihin. Jotta ymmärtää paremmin mekanismi (t), joka vastaa välittävät tämän fenotyypin, tutkimme kyky HFE säädellä solujen rautaa.

HFE säännelty HAMP ja labiilin rauta altaan HNSCC soluissa

Määritä jos HFE oli mukana säännellä hepcidin (HAMP), mittasimme mRNA tasot HAMP by qRT-PCR jälkeen transfektion siHFE. Fadu solut osoittivat merkittävää laskua HAMP mRNA-transkriptin tason ( 0,5-kertainen) jopa 72 tuntia transfektion jälkeen, jossa siHFE verrattuna siCTRL (kuvio 2A). Lisäksi labiileja rauta-allas (LIP) väheni myös merkittävästi (by ~ 20%) sen jälkeen, kun HFE pudotus on HNSCC soluissa verrattuna siCTRL (kuvio 2B). Sen sijaan ei ollut merkittävää muutosta huuli NOE solujen siHFE transfektiota (kuvio 2C). Kaiken kaikkiaan nämä kokeet osoittivat, että käytettäessä HFE muuttaa solun raudan tasoja tapahtuu ensisijaisesti HNSCC verrattuna NOE soluihin. Sen määrittämiseksi, onko solunsisäisiä rauta tasot olivat mukana välittämässä näiden siHFE fenotyyppejä, suoritimme sarjan rautaa pelastus kokeissa.

(A) qRT-PCR HAMP tasojen 24, 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen 20 nM kutakin siHFE1 tai siHFE2 suhteessa taittuva muutos siCTRL käsiteltyjä soluja. (B) Cellular labiilin rauta-allas (LIP) in Fadu ja UTSCC8 transfektoitujen solujen 20 nM kutakin siCTRL tai siHFE, havaittiin virtaussytometrialla kalseiinipitoiset AM at 24-72 tuntia transfektion. (C) Cellular LIP NOE transfektoitujen solujen 20 nM siCTRL tai siHFE, havaittiin virtaussytometrialla kalseiini-AM on 24-72 tuntia transfektion jälkeen. * P 0,05, ** P 0,005, P = ns (ei merkitsevä).

Rauta välittää solun leviämisen HFE

Solujen elinkelpoisuus mitattiin HNSCC käsitellyissä soluissa jossa siHFE yksin, siHFE jossa rautakelaatti deferoksamiinia (DFO), tai siHFE yhdistettynä liukoisen rauta (FAC), sekä ilman RT (kuviot 3A S2A-B). Nämä tutkimukset osoittivat, että lisäämällä DFO edelleen vähentää elinkelpoisuus HNSCC solujen jälkeen HFE knock-down, joka oli täysin pelasti lisäämällä FAC; RT ei ollut merkittävää ero vaikutusta tähän prosessiin. Nämä havainnot vahvistivat, että rauta oli kriittinen välittäjänä näistä vaikutuksista. Sitten eteni vaikutusten arvioimiseksi siHFE tuotantoketjun loppupään riippuvaisia ​​raudasta prosesseja.

(A) Fadu-solut transfektoitiin 20 nM kutakin siCTRL tai siHFE1, sitten käsiteltiin 5 uM DFO tai 5 um FAC 24 tuntia transfektion jälkeen, minkä jälkeen ± RT (4 Gy), 48 tuntia transfektion jälkeen. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTS-määritys 5 päivää transfektion jälkeen. (B) BrdU arvioitiin Fadu soluissa 5 päivää transfektion jälkeen 20 nM kutakin siCTRL tai siHFE1, ± RT (4 Gy, 48 tuntia transfektion jälkeen). (C) Fadu-solut transfektoitiin 20 nM kutakin siCTRL tai siHFE, ± RT (4 Gy, 48 tuntia transfektion jälkeen). Solun kokonais ROS taso havaittiin virtaussytometrialla CM-H2DCFDA 24-72 tuntia post-RT. (D) Western blottaus B-kateniinin mitattiin Fadu soluissa 24-72hr tuntia transfektion kanssa siCTRL (20 nM) tai siHFE1 (20 nM); kuvat (yllä), kvantifiointi (alla). * P 0,05, ** P 0,005, *** P 0,0005, P = ns (ei merkitsevä)

BrdU käytettiin mittaamaan muutoksia DNA-synteesin. HNSCC transfektoiduissa soluissa siHFE osoitettu merkittävä väheneminen (60%) on BrdU verrattuna siCTRL-käsitellyissä soluissa (kuvio 3B, S2C). Sen sijaan ei ole merkittävää muutosta BrdU havaittiin NOE transfektoitujen solujen siHFE verrattuna siCTRL-hoitoa (kuvio S2D). Virtaussytometria käytettiin mittaamaan muutoksia ROS tasoilla jälkeen siHFE. Kuten odotettua, Fadu solut osoittivat merkittävä väheneminen ROS tasoilla transfektion jälkeen siHFE verrattuna siCTRL, sekä ilman RT (kuviot 3C ja S2E). Lopuksi Wnt polku tutkittiin analysoimalla muutoksia B-kateniinin. Fadu transfektoiduissa soluissa siHFE osoitettu merkittävä väheneminen (~ 40%) B-kateniinin tasoilla jopa 72 tuntia verrattuna siCTRL-käsiteltyjen solujen (kuvio 3D).

siHFE marginaalisesti vähentää kasvaimen muodostumista in vivo

Seuraavaksi arvioitiin vaikutuksia HFE knock-down käytettäessä

in vivo

kasvain malli. Tuumorigeenisyystesti mitattiin

in vivo

käyttäen SCID pistetään lihakseen kanssa Fadu transfektoitujen solujen siHFE tai siCTRL. Suppressio siHFE marginaalisesti vähentynyt kasvainten muodostumista verrattuna negatiiviseen kontrolliin, havaittavissa myöhempinä ajankohtina ( 27 päivää) (kuvio S2F).

rautakelaatti CPX vähennetään soluproliferaatiota HNSCC solulinjoissa

kun otetaan huomioon haasteita terapeuttinen soveltaminen siRNA strategian, HNSCC soluja käsiteltiin kliinisesti hyväksytty rautaa kelatoiva, siklopiroksiolamiini (CPX), sen määrittämiseksi, onko siHFE fenotyyppi voisi toisteta. Hoito HNSCC solulinjojen kanssa 5 uM CPX johti merkittävään vähenemiseen pesäkkeiden muodostumisen kanssa tai ilman RT, verrattuna vehikkelillä käsiteltyjen solujen (kuvio 4A, S3A-B). Sen sijaan, CPX oli paljon pienempi vaikutus elinkelpoisuuden NOE verrattuna Fadu soluihin (kuvio 4B). Valitettavasti hallinnon CPX 2 viikon ajan 25 mg /kg ei pienennä kasvaimen kasvua Fadu ksenograftimallia (kuvio S3C).

(A) klonogeeninen eloonjäämistä Fadu solujen mitattiin 10-12 päivä jälkeen uudelleen solujen istutusta, joita käsiteltiin etanolilla (5 uM) tai CPX (5 uM) 72 tunnin ajan, minkä jälkeen RT (0, 2, 4 tai 6 Gy). (B) Solujen elinkelpoisuus Fadu ja NOE solut arvioitiin MTS-määritys 72 tunnin käsittelyn jälkeen CPX (2,5 uM, 5 uM tai 10 uM). * P 0,05, ** P 0,005, *** P 0,0005, P = ns (ei merkitsevä).

Rauta proteiineja de-säädellään ensisijaisesti HNSCC kudosnäytteistä

immunohistokemia (IHC) käytettiin visuaalisesti vahvistamaan ilmentymistä HFE ja TFR1 in HNSCC kudoksissa. Voimakas immuno-ilmentymisen sekä HFE ja TFR1 havaittiin sytoplasmassa kasvainsolujen, mutta ei viereisen strooman tai tunkeutuvia lymfosyyttejä (kuvio 5A ja 5B). Sitä vastoin minimaalinen immuno-ilmentymisen HFE ja TFR1 havaittiin normaalissa kurkunpään (kuvio 5C-D), mikä vahvistaa korkeampi ilmentyminen HFE ja TFR1 in HNSCC vs. normaaleissa kudoksissa. Kun ilmaus HFE tai TFR1 oli kaksijakoinen välillä korkea (IHC ≥2)

vs.

Alhainen (IHC 2) tasossa, entinen ryhmät kokenut lyhyempää kokonaiselinaika verrattuna jälkimmäisen (kuva 5E-F ; p = 0,08); vaikka tilastollista merkitsevyyttä ei saavutettu johtuen pienestä näytteen koosta. Samoin mediaani IHC pisteet sekä HFE ja TFR1 oli suurempi uusiutunut vs. ei-uusiutunutta potilaiden näytteistä (kuvio S4A-B), mutta oli tilastollisesti merkitsevä vain HFE ilmaisun (p = 0,04).

(A) edustaja kuva HFE immunohistokemiallinen ilmentymisen ensisijainen HNSCC koepala; nuolet osoittavat kasvainsolut näytteille sytoplasmista signaali. (B) edustaja kuva TFR1 immunohistokemiallinen ilmentymisen ensisijainen HNSCC koepala; nuolet osoittavat kasvainsolut näytteille solukalvoon signaali. (C) Edustava kuva HFE immunohistokemiallinen ilmaisun normaalista kurkunpää. (D) edustaja kuva TFR1 immunohistokemiallinen ilmaisun normaalista kurkunpää. (E) Kaplan-Meier juoni kokonaiselinaika varten HNSCC potilaiden kahtia perustuu korkeaan (≥2)

vs

. alhainen (alle 2) HFE immunohistokemiallisesti tulokset. (F) Kaplan-Meier juoni kokonaiselinaika varten HNSCC potilaiden kahtia perustuu korkeaan (≥2)

vs

. alhainen (alle 2) TFR1 immunohistokemiaa tulokset.

Keskustelu

Tässä raportoimme ensimmäistä kertaa, että HFE yliekspressio näyttää olevan tuntematon mekanismi vastaa HNSCC taudin etenemistä. N yli-ilmentyminen HFE vuonna HNSCC johtaa lisääntyneeseen hepcidin, mikä puolestaan ​​edistää solunsisäisen raudan kerääntymisen, mikä lisää DNA-synteesin, kohonnut ROS tasoilla, Wnt signalointia, kaikki ajo kasvainsoluproliferaation ja kyky muodostaa klooneja, rauta kriittiseksi välittäjänä tässä prosessissa (kuvio 6). Yksi mahdollinen terapeuttinen strategia tässä yhteydessä on hyödyntäminen rautaa kelatoiva siklopiroksiolamiini (CPX), joka ensisijaisesti vähensi klonogeeniset selviytymisen ja kannattavuuden vuonna HNSCC soluissa, minimaalisella vaikutuksia NOE. Lisäksi HFE ja TFR1 yliekspressio osoittivat suuntaus huonompi tulos, jotka yhdessä dokumentoida kriittinen rooli raudan sääntelyn purkamisen HNSCC etenemiseen.

Schema osoittaa, että HFE overexpresion johtaa B2M sitova solukalvon kaupan. HFE lisää HAMP joko suoraan tai TFR2. HAMP sitten poistuu solun kautta tuntematon mekanismi, ja puolestaan ​​hajottaa FPN, mikä johtaa raudan kerääntymisen. Yhdessä tämä johtaa lisääntyneeseen DNA-synteesin, kohonnut ROS, ja Wnt signalointia, kaikki ajo kasvainsoluproliferaation ja kyky muodostaa klooneja. Laatikot punaisena Merkitään tiedot osoittivat tässä nykyisessä tutkimuksessa.

Muita todisteita relevanssia rautaa säännellä geenit tarjoavat tarkastelu julkisesti saatavilla HNSCC tietokannat (www.oncomine.org) [20 ], saatiin merkittäviä yliekspressio sekä HFE [21], ja TFR1 [21-23] in HNSCC potilasnäytteistä, mikä osoittaa, että tämä on todellakin yleisesti väärin säädellystä väylän tätä tautia. Lisäksi HFE oli yli-ilmentyy myös muissa syövissä, mukaan lukien aivojen [24], ja munuaiskarsinoomia [25]. Tunnistaa mahdolliset mekanismi (t), joka johtaa niiden yli-ilmentymisen, TCGA HNSCC tietokantaan käyttäen cBIO Cancer Genominen -portaaliohjelmisto [26] kuulustelivat vertaamalla kasvaimen transkriptipitoisuuksissa DNA kopioluku 295 erillisiä potilaan aineistoja. Suurin osa näistä HNSCCs olivat diploidinen

HFE

; siten kromosomi muutos ei näytä olevan vastuussa sen yli-ilmentymisen. Kuitenkin monistus

TFR1

geenin havaittiin 18%: HNSCC näytteistä, jotka vastasivat kohonnut TFR1 mRNA: n ekspression tasoa, joka osoittaa genomista muutos on yksi mekanismi TFR1 yliekspressio HNSCC. Koska kyseessä on monimutkainen verkko osallistuvien proteiinien rautaa asetuksessa [27], on selvää, että useita mekanismit ovat vastuussa raudan vapauttamiseen ihmisen syövissä. Esimerkiksi mTOR, joka usein aktivoidaan HNSCC [28] on hiljattain yhdistetty TFR1 vakautta ja rauta asetuksen [29], joka tarjoaa vielä toinen mekanismi raudan sääntelyn purkamista HNSCC. Näin ollen on todennäköisesti useita erilaisia ​​mekanismeja osuus HFE yli-ilmentymisen HNSCC, jolloin rauta hämminki.

hemochromatosis (HFE) on läpäisevä glykoproteiini, ilmentyy laajasti koko ihmiskehon [30]; yhtenä pääasiallisena tehtävistä on säädellä hepcidin (HAMP) [8], joka puolestaan ​​sisäistää ja huonontuneen ferroportin (FPN) (katso kuva 6) [10]. HAMP jotenkin poistuu solun, sitoutuu sitten FPN solukalvolle, jolloin tyrosiinin fosforylaation, joka johtaa sisäistämisen FPN. Kun sisäistetty, FPN on de-fosforyloitu, sitten ubiquitylated vajaatoiminnan kautta lysosomireitin [31]. Lopulta hajoaminen FPN mukaan HAMP johtaa solunsisäisen säilyttäminen rautaa.

Fysiologisissa olosuhteissa HAMP oletettavasti erittyy maksan vastauksena muutoksiin plasman rautaa tasoilla. Kuitenkin viime aikoina osoittavat, että HAMP voi olla patologinen merkitys ihmisen maligniteettien; esimerkiksi alhainen FPN ja korkea HAMP on yhteydessä huonoon ennusteeseen rintasyövän [32]. Kohonneet HAMP mRNA-tasot korreloivat alhainen FPN ilmaisua kolorektaalikarsinoomasta [33]. Tarkkaa mekanismia (t), jolloin kohonnut HAMP edistää syövän synnyn vielä selvittämättä; mutta se on mahdollista, että HAMP voidaan erittää syöpäsolujen hajottamaan FPN, mikä lisää solunsisäisiä raudan tasoja, kuten on ehdotettu meidän tiedot. Itse asiassa, seerumin HAMP tasot on liitetty munuaissolukarsinooma etäpesäkkeitä [34]; samoin, korkeat virtsan HAMP tasoja on havaittu multippelia myeloomaa sairastavilla potilailla [35], sekä viittaa patologinen eritystä HAMP syöpäsolut. Lisäksi, HeLa-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti plasmidilla, joka sisälsi FPN ja altistetaan HAMP, johti sisäistämisen FPN [10], jotka osoittavat, että kasvaimet eivät reagoi HAMP samalla tavalla kuin hepatosyyteissä tai makrofageissa.

rauta sääntelyverkon sisältää yli 151 kemiallista lajia ja 107 reaktioita vaiheet [27], mikä on tiukasti säädeltyä. Ilmiö syöpäsolujen vaativat enemmän rautaa säilyttämään suuren solujen vaihtuvuus ja DNA-synteesin havaitaan monissa eri syöpäsairauksia.