Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Suuri haaste hoidossa haimatiehyen adenokarsinooma on solunsalpaajahoito, mikä johtuu todennäköisesti läsnäolo syövän kantasolut (CSCS).

tavoite

tunnistaa puolella väestöstä (SP) solut ja luonnehtivat s kaltaisia ​​ominaisuuksia ihmisen haimasyövän solulinjoissa (h-PCCLs) ja hyödyntää tehoa samanaikaisesti kohdentaa useiden keskeisten transkriptiotekijöiden säätelevät stemness haiman CSCS tukahduttamaan CSC kaltainen fenotyyppejä.

Methods

virtaussytometria ja Hoechst 33342-DNA-sitoutumisen väriaine ulosvirtaus määrityksessä käytettiin lajitella SP ja ei-SP (NSP) solujen kolmesta h-PCCLs: PANC-1, SW1990, ja BxPc-3. Itsestään uudistumiskykyä, invasiivisuus, muuttoliike ja lääkeresistenssin SP soluja arvioitiin. Expression of CSC markkerigeenejä analysoitiin. Kasvainten muodostumiseen arvioitiin käyttämällä ksenograftimallia nude-hiirissä. Effects of monimutkainen houkutuslintuna oligonukleotidi (cdODN-SCO) on suunniteltu samanaikaisesti kohdistaminen Sox2, Oct4 ja c-Myc arvioitiin.

Tulokset

CSCS rikastuneet sivussa suhteessa (SP) solut sisälsivät että h-PCCLs ja he omistivat aggressiivinen kasvu, invaasio, maahanmuutto ja huumeiden kestävyys verrattuna NSP soluihin. SP solut yli-ilmentynyt kantasolujen merkkiaineita CD133 ja ALDH1, pluripotenttisuus ylläpitäviin tekijöihin Nanog, Sox2 ja Oct4, onkogeeninen transkriptiotekijä c-Myc, signalointi molekyyli Notch1, ja lääkkeille vastustuskykyiset geeni ABCG2. Lisäksi SP solut osoittivat johdonmukaisesti merkittävästi suurempi kasvainten muodostumiseen kuin NSP solut ksenograftimallia nude-hiirten. CdODN-SOC tehokkaasti tukahdutetaan kaikki CSC ominaisuuksia ja fenotyyppejä, ja minimoidaan kasvaimia kykyä SP solujen ja kestävyys kemoterapiaa. Vertailun vuoksi negatiivinen kontrolli eivät ole tehneet.

Johtopäätös

Tulokset osoittavat, että kohdistaminen avaimen geenejä joka antaa stemness on CSCS voi tehokkaasti poistaa CSC kaltainen fenotyyppejä, ja siten voidaan harkita uusi lähestymistapa syövän hoidossa. Erityisesti tässä tutkimuksessa vahvistetaan yhdistelmä Sox2 /Oct4 /c-Myc kohdistaminen mahdollisena anti-haimasyöpä agentti ansaitsee lisätutkimuksia prekliinisissä asetuksista.

Citation: Wang X, Liu Q, Hou B, Zhang W, Yan M, Jia H, et al. (2013) samanaikainen kohdentaminen Multiple Key transkriptiotekijöiden tehokkaasti häiritsee Cancer Kantasolut Rikastettu Side populaatio ihmisen haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 8 (9): e73942. doi: 10,1371 /journal.pone.0073942

Editor: Kamyar Afarinkia, Univ of Bradford, Iso-Britannia

vastaanotettu: 19 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 24 heinäkuu 2013; Julkaistu: 11 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDAC), joka tunnetaan sen aggressiivisuus luonnossa, on erittäin tappava maligniteetti, joka on yleensä diagnosoidaan vasta myöhäisessä vaiheessa, jolle optimaalinen terapeuttinen vaihtoehtoja on ohitettu [1]. Köyhät ennuste voidaan selittää myöhään havaitseminen neoplastisen prosessin puute tehokasta hoitoa, ja vähän tietoa sen biologisia ominaisuuksia. Siksi ymmärtää paremmin solu /molekyyliominaisuudet liittyy tämän ehdon tarvitaan kiireesti tutkia uusia paikkoja diagnostiikan ja hoidon tämän synkkä taudin.

Kehittyvät todisteet osoittavat, että pahanlaatuiset kasvaimet koostuvat pieni joukko erillisiä syöpäsolut, joita kutsutaan ”syöpä kantasolut” (CSCS), tyypillisesti vähemmän kuin 5% koko syöpäsolujen perustuu solupinnan ekspressio [2-6]. CSCS löytyy sub-solupopulaatio, joka eroaa valtaväestön sisällä kasvaimia tai hematologisia syöpiä, nimeltään ”puoli väestö” solut (SP-solut), joilla kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia. CSCS on kapasiteettia itse uudistaa ja tuottaa heterogeeninen suvusta syöpäsolut muodostavat kasvain; ne ovat siis tuumorigeenisiä, toisin kuin muut ei-tuumorigeenisiä syöpäsoluja, ja ne ovat olennaisia ​​ajureita kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden. Kliinisesti vielä tärkeämpää on kuitenkin se, että CSCS myös antaa virulenssi kautta immuunijärjestelmää kiertämisen ja monilääkeaineresistenssin kemoterapiaa ja sädehoitoa johtaen niiden suhteellinen rikastamiseen hoidon aikana ja nopea uusiutuminen taudin [2-6]. Teho syöpähoitojen mitataan usein ablaation murto syöpäkasvaimen, ja tavanomaiset kemoterapiat tappaa eriytetty tai erottamaan soluja, jotka muodostavat suurimman osan kasvaimen, mutta eivät pysty tuottamaan uusia soluja. Koska CSCS muodostavat melko pienen osan kasvaimen, he voisivat jäädä un-hyökkäsi aiheuttaen uusiutumisen tauti. Siksi kehittämällä erityisiä hoitoja suunnattu CSCS omaa suuret toivoa parantaa selviytymisen ja elämänlaatua syöpäpotilaiden, erityisesti kärsiville etäpesäkkeitä.

CSCS on tunnistettu PDAC ja haimasyövän solulinjoissa useat laboratoriot [7-14]. Ihmisen haiman CSCS ilmentävät korkeita CD133, CD24, CD44, ESA, ja aldehydidehydrogenaasin (ALDH1) on myös runsaammin Nanog, Oct4, Notch1, MDR1 ja ABCG2 normaalia haiman kudoksista ja ensisijainen haimasyöpäsoluissa [10-12,14, 15]. Näyttää siltä, ​​että PDAC ei vain yksi homogeenisen populaation CSCS sijaan erilaisia ​​alapopulaatioita, jotka voivat ovat kehittyneet aikana kasvaimen etenemiseen, joka perustuu yhdistelmien käyttö pinnan markkereita, jotka sallivat eristyksen, eteneminen, ja edelleen karakterisointia varten. Yksi näistä populaatioista on nimeltään siirtymässä CSCS ja nämä solut kykenevät kiertämästä primaarikasvaimen ja matkustaa kaukaisiin kohteisiin, kuten maksassa, kun ensisijainen sivusto metastaattisen leviämisen.

Siksi onnistunut hoidot syöpien ole riippuvaisia ​​vain tunnistamaan lähde syöpäsolujen ja syöpähoitoa varten eriytetty syöpäsoluja, mutta myös löytää mahdollisia CSC väestö ja saavuttaa riittävä hävittämisestä CSCS kasvain. Todellakin, CSC-lähestymistapojen ovat osoittaneet suurta lupausta kokeellisissa malleissa [2-6]. Näitä lähestymistapoja ovat suoria strategioita, kuten ablaatiota kohdentamalla molekyyli- merkkiaineiden CSCS tai CSC-erityisiä koulutuslinjoja, purku resistenssimekanismit, ja erilaistumista terapia, ja epäsuora strategioita, kuten angiogeneesin vastainen terapia, immunoterapeuttiset lähestymistapoja, ja häiriöitä protumorigenic vuorovaikutukset CSCS ja niiden mikroympäristön.

Tämä tutkimus tehtiin saavuttamaan seuraavat kaksi ensisijaista tavoitteita. Ensinnäkin on kattava luonnehdinta CSC väestön ihmisen haimasyövän solulinjoissa, vertasimme SP solut BxPc-3, PANC-1 ja SW1990 solulinjoissa. Toiseksi hyödyntää mahdollisuutta samanaikaisesti moniosaisia ​​transkriptiotekijät säätelevät stemness haiman CSCS häiritä CSCS siten kasvainten synnyssä ja etäpesäkkeiden, suunnittelimme syötti oligonukleotidejä fragmentti ”yksi aine, useita tavoitteita” käsite ja testattu tehoa tämän molekyylin hiljaisuus stemness haiman CSCS.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

käyttää kaikkien eläinten tutkimuksen hyväksyi, ja kaikki operatiiviset menettelyt ja eläinten hoito tiukasti sopeutui suuntaviivojen asettamien, eläinten eettisen komitean Xinjiangin Medical University ja Sun Yat-sen University.

Soluviljely

ihmisen haimasyövän solulinjoissa BxPc-3, PANC-1 ja SW1990 perustettiin alun perin ihmisen ensisijainen haiman adenokarsinooma ATCC ostettiin Shanghai Cell Bank (Shanghai, Kiina) ja tuotettu laboratoriossamme. Kaikkia solulinjoja pidettiin yllä Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM). Medium oli täydennetty 1% penisilliini /streptomysiiniä, 3 mM L-glutamiinia ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco). Soluja pidettiin kosteutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa, joka sisälsi 5% CO

2.

Virtaussytometrianalyysi ja solulaji

SP solut ovat pieni joukko soluja, jotka värjäytyvät heikosti tai ei lainkaan, kun käsitellään Hoechst 33342 väriainetta. Nämä solut voidaan eristää käyttäen virtaussytometrialla protokollia alun perin perustettiin Goodell et al. tutkimuksessa hiiren luuytimen [16,17]. H-PCCLs irrotettiin viljelymaljasta 0,25% trypsiiniä, pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ja suspendoitiin 1 x 10

6 solua /ml elatusaineessa, joka sisälsi 2% FBS: ää. Kasvaimen soluissa ja solulinjoissa inkuboitiin Hoechst 33342 väriainetta (Sigma-Aldrich), jonka lopullinen konsentraatio on 5 ug /ml kanssa tai ilman verapamiilin (100 uM, Sigma-Aldrich), 37 ° C: ssa 90 minuutin ajan ajoittain ravistellen joka 15 min. Verapamiili käytettiin tarkistaa SP fenotyyppi, koska se voi vähentää sivuhaaran estämällä usealle kuljettajat. Sen jälkeen pestiin kahdesti PBS: llä, solut suspendoitiin uudelleen jääkylmään PBS: ään, joka sisälsi 2% FBS: ää, johdettiin 40-um sihdin saamiseksi yksisoluiset suspensiot, ja pidettiin jäissä, kunnes virtaussytometria-analyysi. Propidiumjodidia (PI; 2 ug /ml; Sigma-Aldrich) lisättiin merkitä ja jättää kuolleita soluja. Solujen analyysi ja fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) suoritettiin käyttäen FACS Vantage SE varustettu versio 6.0 FACS DIVA ohjelmisto (BD Biosciences, Erembodegem, Belgia). Hoechst 33342 väriaine viritetään 350 nm ultravioletti laser, ja fluoresenssiemissio oli dual-aallonpituus analysoitu (Hoechst sininen 402-450 nm suodattimen; Hoechst punainen 650-670 nm suodatin).

Solujen proliferaatio ja solusyklin määritykset

tuhat järjestetty SP ja ei-SP (NSP) soluja siirrostettiin erillisiin kuoppaan 96-kuoppalevylle kolmena kappaleena, ja viljeltiin Leibovitzin L-15-elatusaineessa, jossa 1% penisilliini /streptomysiiniä ja 10 % FBS 3 päivää. Kasvu mitattiin käyttäen 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) menetelmällä. Lyhyesti, 20 ui MTT-liuosta (5 mg /ml PBS: ssä, Sigma) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 h. 150 ul: n alikvootti Sitten lisättiin DMSO, ja absorbanssi mitattiin mikrolevylukijalla (Multiscan MK3, Thermo Labsystem, USA) aallonpituudella 490 nm.

solukierron määrityksessä, 5 x 10

5 juuri lajitellut solut pestiin kahdesti PBS: llä ja kiinnitettiin 2 ml 70% jääkylmää etanolia 4 ° C: ssa yön yli. Solut siirrettiin sitten PBS: ään, värjättiin 20 ug /ml PI: n ja 1 mg /ml RNaasi, ja analysoitiin virtaussytometriaa käyttämällä. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina solujen kunkin vaiheen solusyklin.

Clone muodostumisen määritykset

Seuraavat vaiheet sovellettiin määritykset (1). Agar (10 g /l; DNA grade) sulatettiin mikrossa ja 2 x DMEM täydennetty 200 ml /l FBS lämmitettiin 40

oC: ssa vesihauteessa. Yhtä suuret tilavuudet nämä kaksi liuosta sekoitetaan sitten, jolloin saatiin uusi ratkaisu on 5 g /l agaria + 1 x DMEM + 100 ml /l FBS: ää (2). Seuraavaksi 1 ml sekoitettua liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan 6-kuoppalevyllä, jolloin muodostuu pohja agar (3). Sitten 7 g /l agaria (DNA grade) sulatettiin mikroaaltouunissa ja jäähdytetään 40

oC vesihauteessa, ja 2 x DMEM ja 200 ml /l FBS lämmitettiin samassa lämpötilassa (4). Juuri järjestetty SP ja ei-SP-solut johdettiin 40-um: n suodattimen tarjota yksisolususpension ja laskettiin. Kolme ml DMEM, 1,5 ml 2 x DMEM, joka sisälsi 200 ml /l FBS: ää ja 1,5 ml agaria, mukaan lukien 500 lajitellut solut sekoitettiin sitten yhteen, ja 1,5 ml solususpensiota tätä liuosta pantiin jokaiseen kuoppaan 6-kuoppalevylle kuin top-agar (5). Lopuksi 100 solua siirrostettiin jokaiseen kuoppaan, ja inkuboitiin 37

oC kosteutetussa inkubaattorissa 2-3 vk. Pesäkkeet olivat joko vasemmalle värjäämätön tai värjättiin 5 g /l MTT (Sigma-Aldrich) 1 h, ja laskettiin leikemikroskoopil- (menettely toistettiin kolme kertaa) (6). Sen jälkeen, kun SP-soluja ympättiin pehmeässä agarissa määrityksissä, pesäkkeitä, jotka sisältävät enemmän kuin 50 solua (ensisijainen pesäke) poistettiin pehmeän agarin kanssa steriilillä Pasteur pipetit, käsitellään trypsiinillä ja mekaanisesti hajotetaan yksittäisiksi soluiksi. Sitten vaiheesta (5) toistettiin toisen pesäkkeitä.

Sphere muodostumisen määritykset

Lajiteltu SP ja NSP-solujen kolmen h-PCCLs vietiin läpi 40 um: n suodattimen saamiseksi yksisolususpensio. Sitten, 4 ml: ssa alustaa, joka sisälsi 100 solua, lisättiin 6-kuoppaisille levyille seerumittomalla elatusaineessa DMEM-F12 (Invitrogen-Life Technologies), jota oli täydennetty epidermaalinen kasvutekijä (10 ug /l), insuliini (20 mg /L) ja bFGF (10 ug /l). Alikvootit epidermaalista kasvutekijää, insuliinin ja emäksinen fibroblastikasvutekijä lisättiin kahdesti viikossa. Kun 10 d, levyjä visuaalisesti määritettiin muodostumista kelluvan aloilla ja aloilla laskettiin alla preparointimikroskooppia.

Invasion määrityksessä

invasiivisuuden järjestetty SP ja NSP-soluissa määritettiin käyttämällä 6-kuoppaisilla Matrigel invaasio kammiot (BD Biosciences Discovery Labware). Solut ympättiin yläkammiossa päälle Matrigel päällystetyn Kalvo (24-kuoppaiset insertin, huokoskoko, 8 mm, Corning Costar) 2 x 10

5 per insert seerumittomassa DMEM 37

oC 5 % CO

2 48 tuntia. Ulompi kuopat täytettiin DMEM, joka sisälsi 5% FBS: ää, kuten kemiallis-houkutinta. Ei-tunkeutuvat solut poistettiin swabbing pintakerroksen matrigeelin Q-tip. Kalvo, joka sisältää tunkeutuvat solut värjättiin hematoksyliinillä 3 min, ja sitten se pestiin ja kiinnitettiin dioja. Hyökkääviä solujen koko kalvo laskettiin valomikroskoopilla 40 × tavoite.

TranswellTM migraatiokokeessa

Lajittele SP tai NSP soluja 1 x 10

5 maljattiin yläkammio päälle ei-päällystetty kalvo (24-kuoppaisilla insertin, huokoskoko, 8 mm, Corning Costar), ja annettiin siirtyä kohti seerumia sisältävässä väliaineessa alemmassa kammiossa. Solut kiinnitettiin 24 h inkubaation metanolilla ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla (2 mg /ml, Sigma-Aldrich). Solujen lukumäärä valtaavat kalvon läpi laskettiin valomikroskoopilla (40 ×, kolme satunnainen kentät per kuoppa).

Lääkeaineresistenssi analyysi

alikvootteja 2 x 10

3 tuoreeltaan lajitellaan SP ja NSP-solut ympättiin 96-kuoppalevyille kolmena kappaleena 200 ui DMEM kuoppaa kohti. Sen jälkeen, kun 12 tunnin toipumisjakson jälkeen solut altistettiin eri pitoisuuksia gemsitabiinin 72 tuntia. Vaikutukset solujen kasvuun tutkittiin MTT-menetelmää edellä kuvatulla tavalla. Solu eloonjäämisaste (SR) laskettiin käyttämällä kaavaa: SR = (absorbanssien keskiarvo testin hyvin /absorbanssien keskiarvoa ohjaus) x 100%; solun resistanssi määrä (RR) laskettiin käyttämällä kaavaa: RR = 100% -SR.

Apoptoottiset solut määritettiin fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) -Annexin-V menetelmiä. Lyhyesti, juuri lajitellut solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille tiheyteen 1 x 10

5 solua /kuoppa. 12 tunnin kuluttua parantumisesta, solut altistettiin vaihtelevia pitoisuuksia gemsitabiinin 48 tuntia. Sitten solut värjättiin anneksiini-V: n ja PI käyttämällä ApoAlert ™ anneksiini V Apoptosis Kit (Clontech, Cosete Tech, Jinan) kohti valmistajan protokollaa. Lyhyesti, solut kerättiin trypsinisaatiolla ja pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä. Pelletit suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan 1 x anneksiini sitovaa puskuria ja 5 ui FITC-anneksiini-V. A1-il työliuos PI 100 ug /ml lisättiin kuhunkin 100 ul: aan solususpensiota. Soluja inkuboitiin jäillä 1 tunnin ajan, pestiin jälleen kylmällä PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen 300 ui: aan 1 x anneksiini-sitomispuskuria. Värjätyt solut analysoitiin välittömästi virtaussytometrialla.

In vitro erilaistuminen tutkimuksessa

vasta järjestetty SP ja NSP soluja viljeltiin tiheydellä 1 x 10

5 solua /kuoppa 6-kuoppaisen kuoppalevyn kuoppaa Leibovitzin L-15-elatusaineessa, jossa 1% penisilliini /streptomysiiniä ja 10% FBS: ää ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Jälkeen 7 päivää, SP-ja ei-SP peräisin olevat solut analysoitiin uudelleen läsnäolo SP osa käyttäen edellä kuvattuja menetelmiä.

kasvaimia aiheuttavan kyvyn määritys in vivo

Kateenkorvattomiin 4- 5 -week ikäisiä hiiriä (BALB /c nude-hiirissä) toimitti SLAC Laboratory Animal (Shanghai). Hiiriä pidettiin ja ylläpidetään laminaarisen virtauksen kaappien alle patogeenivapaissa olosuhteissa. Ryhmää hiiriä ortotooppisesti inokuloitiin s.c. vasemmalle selkä kylkeen hiirten juuri lajitellaan SP soluja 1 x 10

3, 1 x 10

4, 1 x 10

5, ja 1 x 10

6 tai NSP solujen 1 × 10

3, 1 x 10

4, 1 x 10

5, ja 1 x 10

6 (neljä hiirtä ryhmää kohti). Kasvaimen kasvua seurattiin välein 2 päivää sen jälkeen toisella viikolla ymppäyksen. Hiiret tapettiin päivänä 50, tai kun kasvaimet kasvavat enintään 1000 mm

3. Kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla 0,52 × pituus × leveys

2. Kertainen ero aiheuttavan kasvaimia laskettiin seuraavalla kaavalla: NSP

min /SP

min, jossa NSP

min on vähimmäismäärä NSP solujen aikaansaantiin tarvitaan kasvaimen ja SP

min on pienin määrä SP-solujen, joita tarvitaan tuottamaan tuumori. Lopuksi, kasvaimet pilkottiin myös tehdä yhden solususpension SP uudelleen analyysin mukaan Hoechst33342 väriaine ulosvirtauksen määritystä edellä kuvatulla tavalla.

Kun h-PCCL aiheuttama kasvaimet saavuttivat tilavuuden noin 200 mm

3, yksi ryhmä hiiriä sai gemsitabiinin (200 mg /kg kehon painoa ip, 1 injektio joka 3 päivä, 6 injektiota yhteensä) ja toinen ryhmä (jossa on vastaavat kasvaimia) injektoitiin vehikkeliä (0,9% NaCl; kontrolliryhmän ). Tuumorin halkaisija mitattiin joka 3 päivä ensimmäisen injektion jälkeen. Gemsitabiini pidettiin tehokas, kun kasvain pieneni vähintään 50%. Kolme päivää viimeisen injektion jälkeen, hiiret lopetettiin ja kasvaimet analysoitiin osuus SP-soluja, kuten edellä on kuvattu.

RNA ja reaaliaikaista PCR-analyysiä

Lajittelu-soluja ja viljellään soluja käsitelty TRIzol reagenssilla (Invitrogen Kiina Limited, Shanghai) ja sekoitetaan huolellisesti pipetoimalla. Trizol-lysaatit sekoitettiin sitten kloroformilla ja sentrifugoitiin 15000 x g 15 minuuttia. Sentrifugoinnin jälkeen kokonais-RNA saatiin isopropanolisaostuksella mukaan valmistajan ohjeiden.

Yksisäikeinen cDNA käänteiskopioitiin kokonais-RNA käyttämällä satunnaisia ​​aluketta standardiolosuhteissa kanssa High Capacity cDNA käänteistranskriptiolle Kit (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR yhteensä cDNA suoritettiin SYBR Green Master Mix Real-Time Core Reagenssit ABI 7500 (Applied Biosystems) mukaan valmistajan ohjeiden. Monistamiset suoritettiin 95 ° C: ssa 10 sekunnin ajan, jota seuraa 40 sykliä 95 ° C: ssa 5 s, 60 ° C: ssa 30 s. Määrällisesti suhteellisen ilmentymisen kunkin geenin, Ct (raja-sykli) arvot normalisoitiin endogeenisen viite (

ACt = Ct kohden- Ct β-aktiini), ja verrattuna kalibraattori, käyttäen ”

ΔΔCt menetelmä ”(

ΔΔCt =

ACt

näyte –

ACt

kalibraattori). Käyttäen

ΔΔCt arvo, suhteellinen ilmentyminen laskettiin (

2-ΔΔCt). Koska

ACt soveltuu ainoastaan ​​silloin, kun vahvistus hyötysuhteet kohde ja viite ovat oleellisesti yhtä, määritimme tehostunut 5 laimentumiset sekä delta Ct-arvoja (Ct

kohde-Ct

β- aktiini) piirrettiin laimennus (log). Kulmakerroin asennettu linjan määritettiin sitten. Kaikki näytteet testattiin kolmena kappaleena, ja keskiarvoja käytettiin kvantifiointiin.

Western blot-analyysi

Kalvo ja sytosoliproteiiniin näytteet uutetaan SP ja NSP soluja kaikista kolmesta h-PCCLs. Proteiinipitoisuus määritettiin proteiinipitoisuus määritettiin BCA Protein Assay Kit käyttäen naudan seerumin albumiinia standardina (Pierce, USA). Yhtä suuret määrät proteiinia näytteistä (~ 50 ug) fraktioitiin SDS-PAGE (12% polyakryyliamidigeeleillä) ja siirrettiin elektroforeettisesti PVDF-membraanille (Millipore, Bedford, MA) käyttäen Mini Trans-blot (Bio-Rad Laboratories, Shanghai). Proteiini Näytteet (kalvo näyte ABCG2 ja CD133, sytosolin näyte ALDH1, Oct4, Sox2 ja Nanog) inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineiden 1: 200 4 ° C: ssa yön yli. Affinity puhdistettuja kaniinin polyklonaalisia anti-ABCG2 (Shanghai Ruiqi Biotekniikka Co Ltd), kanin polyklonaalinen anti-CD133 (Shanghai Xiangsheng Biotech Co Ltd), kanin polyklonaalinen anti-Oct4 (Cell Signaling Shanghai), kanin polyklonaalinen anti-Sox2 (Shanghai ExCell Bio Co Ltd), kanin polyklonaalinen anti-ALDH1 (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA), ja kaniinin polyklonaalista anti-Nanog (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA) käytettiin ensisijaisena vasta-aineita. Seuraavana päivänä kalvo inkuboitiin toissijaisen vasta-aineita (Molecular Probes) laimennettiin PBS: ssä 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Lopuksi membraani huuhdeltiin PBS ennen skannausta käyttämällä Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences). GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina yhtä suuri panos proteiinia näytteitä, käyttäen anti-GAPDH vasta-aine. Western blot kvantitoitiin käyttäen QuantityOne ohjelmistoa mittaamalla bändi intensiteetti (Area × OD) kunkin ryhmän ja normalisoi GAPDH. Lopulliset tulokset ilmaistaan ​​kertamuutoksia normalisoimalla datan kontrolliarvoihin.

valmistaminen monimutkaisten houkutuslintuna Oligodeoksinukleotidin (cdODN) B

Suunnittelimme cdODN laakeri konsensussekvenssejä neljälle transkriptiotekijöiden Sox2, Oct4, ja c-Myc, seuraavat periaatteesta Gao et al. [18]. Yksijuosteisia fosforotioaatti oligodeoksinukleotideja syntetisoitiin IDT sisällyttäminen (Coralville, IA). ODN: ien pestiin 70% etanolilla, kuivattiin ja liuotettiin steriloituun Tris-EDTA-puskuriin (10 mM Tris + 1 mM EDTA). Supernatantti puhdistettiin käyttämällä Micro Bio-spin30 pylväät (BioRad, Shanghai) ja kvantitoitiin spektrofotometrillä. Kaksijuosteista dODNs valmistettiin sitten pariutua komplementaarinen yksijuosteinen oligodeoksinukleotideja kuumentamalla 95

oC: ssa 10 min, minkä jälkeen jäähdyttämällä huoneen lämpötilaan (RT) hitaasti 2 tunnin ajan. Yksinkertaisuuden vuoksi me nimetty tämä cdODN-SOC. Negatiivinen kontrolli fragmentti (NC-cdODN) kuljettavat emäsparin korvaaminen syntetisoitiin myös.

elektroforeettinen liikkuvuus shift (EMSA) B

EMSA suoritettiin mukaisesti kuvattujen menettelyjen Gao et al. [18]. Lyhyesti, cdODN-SOC tai NC-ODN leimattiin [γ-

32P] ATP. Sitten näyte ladattiin G-25-pylväässä ja sentrifugoitiin 7000

g

2 min. Ihmisen rekombinantti-proteiinien Sox2, Oct4 ja c-Myc ovat (Santa Cruz Biotechnology) inkuboitiin erikseen cdODN-SOC tai NC-ODN RT: ssä 15 min ajan 10 ul: H

2O ja 8 ui master mix (12 x ), joka sisälsi 1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 M EDTA, 5 M NaCl: a, 1 M ditiotreitolia, 50% glyserolia, 100 ug /ul naudan seerumialbumiinia, ja 1 ug /ul poly (dldC). Sillä supermuutoksena kokeissa vasta-aineita (1 ug) oli mukana reaktiossa. Kilpailevan kokeita, leimaamaton cdODN-SOC 100-kertainen ylimäärä leimattua dODNs lisättiin sitoutumisreaktioihin. DNA-proteiini-kompleksit erotettiin denaturoivassa polyakryyliamidigeelissä (7,5% 0,4 x Tris-boraatti /EDTA) elektroforeesilla. Geelit kuivattiin ja kuvattiin.

transfektio cdODN-SOC solulinjoihin

lajiteltu SP tai NSP solut transfektoitiin cdODN-SOC käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen Kiina Limited, Shanghai). Solut ympättiin 96-kuoppaisille kudosviljelylevyille. 50% konfluenssiin, solut pestiin seerumittomalla alustalla kerran ja inkuboitiin sitten 50 ui tuoretta naudan sikiön seerumia (FBS) vapaalle väliaineessa. Decoy ODN vaihtelevia pitoisuuksia ja lipofektamiinin (0,25 ui) sekoitettiin erikseen 25 ui Opti-MEM® I Reduced Serum Medium (Invitrogen Kiina Limited, Shanghai) 5 min. Sitten kaksi seosta yhdistettiin ja inkuboitiin 20 minuuttia huoneenlämpötilassa. Lipofektamiini: cdODN seos lisättiin tipoittain soluihin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5 h. Sen jälkeen, 25 ui tuoretta väliainetta, joka sisälsi 30% FBS: ää lisättiin kuoppaan ja soluja pidettiin viljelmässä käyttöön asti.

anto cdODN-SOC BALB /c-nude-hiiriin

kasvaimen koko saavutti ~ 200 mm

3 (noin 7 päivää inokulaation jälkeen), cdODN-SOC annettiin päivittäin yhdellä kasvaimensisäistä injektiota (20 ui 100 nM cdODN-SOC sekoitettuna Lipofectamine 2000). Kasvaimen kasvua seurattiin säännöllisesti, ja tilavuuden (V) kasvainten 5. päivänä cdODN-SOC hoito laskettiin käyttäen kaavaa V = 1/2 x pituus x (leveys)

2.

Data analyysi

Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM kaikkien kokeelliset tiedot. Ryhmä vertailut suoritettiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVA. Jälkikäteisanalyysi merkittäviä tärkeimpiä vaikutuksia tutkittiin edelleen käyttäen Fisherin PLSD testeissä. Kahden pyrstö

P

0,05 arvo otettiin osoittamaan tilastollisesti merkitsevä ero kahden ryhmän välillä. Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS 11.5 ja käyrä istuva suoritettiin Graphpad Prism-ohjelmiston.

Tulokset

Ominaisuudet ihmisen haimasyövän solulinjoilla viljelmässä

Normaalissa happi kulttuuri medium, ihmisen haimasyövän solulinjoissa (h-PCCLs) PANC-1, SW1990, ja BxPc-3 kaikki osoittivat selkeitä Solurajat, rikas solulimassa, erillinen tuma, ja näkyvä nucleoli, käynnissä useita jakautuvat solut vieläkin solumorfologiaan pääasiassa epiteelin kaltainen monikulmainen muoto ja harvoin karan muotoaan käännettyä mikroskooppia (kuvio 1A). Hypoksisissa viljelyolosuhteet kuitenkin Solurajat tuli samea ja solukoko suurenivat mutta kutistunut solulimassa, laajentuneen tuma, ja sumea nucleolus vähemmän jakamalla solujen ja kara-muotoinen soluja.

(A) edustaja fotomikrograafeja PANC-1 ja BxPc-3-soluissa 72 tuntia ymppäyksen jälkeen. (B) (C) kasvukäyrät PANC-1 ja BxPc-3-soluissa. Symbolit ovat kokeelliset tiedot ja käyrät edustavat parhaiten sopii eksponentiaalista kasvua yhtälö: Y = Y0 × exp (k x X), jossa Y0 on Y: n arvo, kun X (aika) on nolla ja K on nopeusvakio. τ on aikavakio (päivä) ja DT (kaksinkertaistamalla-aika) on aikayksikköä X-akselin, lasketaan ln

2 /K.

kasvu PANC-1 ja BxPc-3-soluissa arvioitiin. Alkuperäisten yhtäläiset istutustiheyteen, nämä solut osoittivat samanlaisia ​​kasvuvauhdin mukaisesti normoxic olosuhteissa. Kolme päivää ymppäyksen jälkeen solut tuli logaritmisen kasvuvaiheen ja muodostivat kasvuvyöhykkeellä joka vähitellen laajenee säteittäin. Solut oli yhdenmukainen morfologia ja hallittu Aligned (kuvio 1 B). Vertailun, hypoksisissa viljelyn olosuhteissa, solujen kasvu oleellisesti hidastunut ilman ilmeistä logaritmisen kasvuvaiheen (kuvio 1C). Solut disarranged ja solujen kasvua vyöhykkeellä osoitti heterogeeninen morfologia.

tunnistaminen SP solujen ihmisen haimasyövän solulinjoissa ja vaikutukset cdODN-SOC

Saamiemme Hoechst33342-FACS analyysi, h-PCCLs PANC-1, SW1990, ja BxPc-3 kaikki sisälsi pienen alapopulaation SP-solujen osuus 8,7 ± 0,8, 4,6 ± 0,6, ja 2,2 ± 0,4%, vastaavasti (kuvio 2A, B). SP osa solulinjoissa oli oleellisesti vähentynyt, kun läsnä oli verapamiilia.

(A) Esimerkkejä floe taussytometria-analyysi SP-solujen läsnä tai poissa ollessa 30 uM verapamiilia, cdODN-SOC (monimutkainen houkutuslintuna oligodeoksinukleotidia kuljettavat

cis

-elementin varten Sox2, Oct4 ja c-Myc) tai NC-ODN (negatiivinen kontrolli cdODN). (B) SP osuudet prosentteina koko väestöstä. ***

p

0,001

vs

valvonta; n = 4.

hyödyntämiseksi onko SP solut voitaisiin muuntaa NSP kohdistamalla avainmolekyylejä määritettäessä stemness of CSCS, testasimme vaikutuksia monimutkaisen houkutuslintuna oligodeoksinukleotideja fragmentti (cdODN) SP solut. Monimutkainen houkutuslintuna Oligodeoksinukleotidin (cdODN-SOC) on suunniteltu tätä tutkimusta varten sisälsi tyypillinen

cis

LINJASÄÄTÖVENTTIILIT elementtejä Sox2, Oct4, ja c-Myc. Silmiinpistävän jälkeen esikäsitelty cdODN-SOC: ssa 48 tuntia, SP-soluja lähes katosi kaikissa kolmessa h-PCCLs, 0,05 ± 0,03, 0,03 ± 0,1 ja 0,03 ± 0,2% PANC-1, SW1990, ja BxPc-3, vastaavasti (kuvio 2A, B). Negatiivisena kontrollina, NC-cdODN ei merkittävästi muuta SP jakeet näissä solulinjoissa.

sekvenssi Tämän cdODN-SOC on esitetty kuviossa 3A ja kyky tämän cd-ODN-SOC sitoa Sox2, Oct4 ja c-Myc-proteiinien varmistettiin meidän EMSA yhdessä supermuutoksena käyttämällä vasta-aineita vastaan ​​suunnattuja nämä transkriptiotekijät. Kuten on esitetty kuviossa 3B, siirretyn bändejä osoittavat cdODN proteiinin sitoutumista ja supersfift kaistojen erityinen cdODN-proteiineihin.

(A) sekvenssit cdODN-SOC kuljettaa

cis

-elementeillä varten Sox2, Oct4 ja c-Myc ja negatiivinen kontrolli ODN nukleotidikorvautumisesta (NC-ODN). (B) Esimerkkejä EMSA kuvat osoittavat kykyä cdODN-SOC sitoa ihmisen rekombinantti Sox2, Oct4 tai c-Myc-proteiinia. Siirtymä nauhat osoittavat kantojen DNA-proteiini kompleksit ja supermuutoksena nauhat osoittavat erityinen DNA-proteiiniin sitoutumisaste poimima kunkin vasta-aineen. Kaista tarrat: 1, ohjaus ilman proteiineja; 2: n läsnä ollessa kylmä tai leimaamatonta cdODN-SOC; 3: n läsnä ollessa cdODN-SOC; 4: n läsnä ollessa NC-ODN; ja 5: vasta-aineen kanssa.

Differential geenin ilmentymisen välillä SP ja NSP solujen

vieressä verrattuna ilmentymisen kantasolujen merkkiaineiden CD133 ja ALDH1 (aldehydidehydrogenaasin-1) [19, 20], pluripotenttisuus ylläpitäviin tekijöihin Nanog, Sox2 ja Oct4, onkogeeninen transkriptiotekijä c-Myc, signalointi molekyyli Notch1, ja lääkkeille resistentti geeni ABCG2 [21,22] ja lajitellun SP ja ei-SP (NSP) soluissa qRT-PCR: llä transkriptio taso ja Western blot proteiinitasolla. Kuten kuviossa 4, SP soluja PANC-1 ilmaisivat huomattavasti runsaampaa selostukset näiden geenien verrattuna NSP soluihin, selvästi osoittaa kantasolujen ominaisuuksia SP soluja. Tulokset Western blot-analyysi olivat yhdenmukaisia ​​muutoksia mRNA tasoilla (kuvio 4B). SP solut muista kaksi h-PCCLs osoitti määrällisesti samat tulokset (Kuva S1 ja Kuva S2 verkossa).

(A) Expression of CD133, ALDH1, ABCG2, Sox2, Oct4, Nanog, c-Myc, ja Notch1 mRNA-tasolla, määritetään reaaliaikaisen RT-PCR. Arvot saadaan ensimmäisen normalisoitiin GAPDH sisäisen valvonnan ja sitten esitetään suhde SP yli NSP. **

p

0,01 SP

vs

NSP; ***

p

0,001 SP

vs

NSP; n = 4. (B) ekspressio CD133, ALDH1, ABCG2, Sox2, Oct4, Nanog, c-Myc, ja Notch1 proteiinitasolla, määritettiin Western blot -analyysillä. Arvot saadaan ensimmäisen normalisoitiin GAPDH sisäisen valvonnan ja sitten esitetään suhde SP yli NSP. CD133: 120 kDa; ALDH1: 55 kDa; ABCG2: 72 kDa; Sox2: 40 kDa; Oct4: 45 kDa; Nanog: 35 kDa; c-Myc: 62 kDa; Notch1: 300 kDa. ** P 0,01 SP

vs

NSP;