Krooninen sairaus

tiivistelmä

Oseltamiviirifosfaatti on laajalti käytetty anti-influenssa sialidaasi estäjä. Sialyloinnin säätelevät sialyylitransferaasit ja sialidases, on vahvasti sekaantunut synnyssä ja etenemisessä rintasyöpä. Tässä tutkimuksessa arvioitiin biologinen käyttäytyminen koiran nisäkasvainsoluja upon oseltamiviirifosfaatti hoito (a sialidaasi estäjä)

in vitro

ja

in vivo

. Meidän

in vitro

tulokset osoittivat, että oseltamiviirifosfaatti heikentää sialidaasia toiminta johtaa lisääntynyt sialyloituminen vuonna CMA07 ja CMT-U27 koiran rintarauhasen syöpäsoluja. Yllättäen oseltamiviirifosfaattia kannustanut, CMT-U27 solumigraation ja invaasiota kapasiteetti

in vitro

, annoksesta riippuvalla tavalla. CMT-U27 kasvaimien vierassiirrettä oseltamiviirifosfaatin käsiteltyjen nude-hiiriin kohonneen Sialyloinnin nimittäin α2,6 terminaali rakenteet ja SLE (x) lauseke. Yllättävää kyllä, lisääntymässä keuhkoetäpesäkkeet havaittiin oseltamiviirifosfaatti hoidetuilla nude-hiiriin. Yhdessä havaintomme paljasti, että oseltamiviirille haittaa koiran rintarauhasen syöpäsolun sialidaasia aktiivisuutta, muuttamalla sialylointia malli koiran nisäkasvaimia, ja johtavat yllättäen ja

in vitro

ja

in vivo

lisääntynyt rintarauhasen kasvaimen aggressiivisuus.

Citation: de Oliveira JT, Santos aL, Gomes C, Barros R, Ribeiro C, Mendes N, et al. (2015) Anti-influenssaneuraminidaasin Inhibitor Oseltamiviirifosfaatti indusoi Koirien rintasyöpä Cell Aggressiivisuus. PLoS ONE 10 (4): e0121590. doi: 10,1371 /journal.pone.0121590

Academic Editor: David Wai Chan, The University of Hong Kong, HONGKONG

vastaanotettu: 12 syyskuu 2014; Hyväksytty: 13 helmikuu 2015; Julkaistu 7 huhtikuuta 2015

Copyright: © 2015 de Oliveira et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Portugalin virasto ”Fundação para a Ciência ea Tecnologia, Programa Operacional Ciência e Inovação 2010 (POCI 2010) do Quadro Comunitário de Apoio III ”ja Project myönnä. PTDC /CVT /117610/2010. RB (SFRH /BPD /68276/2010) ja CG (SFRH /BPD /96510/2013) tunnustaa Portugalin Foundation for Science and Technology. Institute of Molecular Pathology ja immunologian on Associate laboratorio Portugalin ministeriön tiede-, teknologia- ja korkeakoulutusministeri ja osittain jota Portugalin Foundation for Science and Technology.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, että ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on edelleen suuri sosiaalinen ja taloudellinen rasite länsimaissa. Huolimatta kaikista ponnisteluista tällaisen vaivan potilaiden määrä on lisääntynyt räjähdysmäisesti viime vuosina. Rintasyöpä erityisesti on yleisin syöpä naisilla ja yleisin syy syövän liittyvät kuolemat, lähinnä kehittämiseen etäispesäkkeitä [1].

mekanismeja perustamiseen syövän siirtomaiden etäinen elimiä ei ole läheskään ymmärretään, koska ovat todellisia syitä, jotka johtavat etäpesäkkeitä liittyvä kuolema. Siten selvittämiseen ja tällä hetkellä kliinisesti käytetään lääkkeitä, jotka saattavat vaikuttaa taudin etenemiseen on pakollinen [2]. Esimerkiksi häiritsemällä lukuisten solujen polkuja, jotka ovat yhteisiä tai samankaltaisia ​​taudinaiheuttajia ja isännät, lääkkeet, kuten rapamysiiniä ja niclosamide (alun perin käytettiin antifungaaliset ja antihelmintic huumeet vastaavasti) ovat osoittautuneet lupaavalta syöpälääkkeiden [3, 4] .

Oseltamiviirifosfaatti on anti-influenssa huume, joka on tullut laajalti käytetty profylaktista terapiaa ajoista lähtien H1N1 pandemioiden [5]. Se annetaan aihiolääkettä oseltamiviirifosfaattia, joka muunnetaan karboksyyliesteraasi entsyymien aktiiviseen oseltamiviirikarboksylaatiksi. Oseltamiviirifosfaatti on siaalihapon analoginen joka on vuorovaikutuksessa ja estää aktiivisten kohtien sialidaasi entsyymien influenssaviruksen, se sitoutuu viruksen entsyymit, estämällä niiden kyky katkaista siaalihappojäännösten pinnalla infektoituneen solun, joka johtaa kyvyttömyyteen vapauttamaan jälkeläiset virionien [6].

Joitakin ehdotuksia on aiemmin tehty koskien mahdollisesti merkitystä farmakologisia vaikutuksia tämän ja muiden inhibiittorit viruksen sialidases käytetään klinikoilla, ihmisen endogeenisen sialidases [7]. Vaikka alhainen nanomolaarinen pitoisuudet Oseltamiviirikarboksylaatin riittävät estämään aktiivisuutta virus- sialidases, tämä lääke osoitti melkein mitään huomattavaa inhibitiota ihmisen sialidases [7, 8]. Kuitenkin ristiriitaisia ​​tuloksia saatiin, kun oseltamiviirifosfaatti testattiin syöpäsolujen käyttäen molempia

in vitro

ja

in vivo

malleissa [9, 10]. Eräät havainnot huomautti mahdollinen estävä vaikutus oseltamiviirifosfaatin huomiota sisäiseen sialidases rottien ja hiirien [11-14]. Hiljattain ehdotettiin, että oseltamiviirifosfaatti oli kyky kääntää epiteelin ja mesenkymaaliset (EMT) siirtymävaihetta ja lisäävät huumeiden herkkyyden solunsalpaajaresistentti ihmisen syöpäsoluja [10].

sialyloiduilla glykaaneja epidemiologisesti liittyy huonompi ennuste eri syöpätyyppien, kuten rintasyöpä [15]. Sialihapot ovat happamia monosakkarideja yleensä löytyy pääteasemaan hiilihydraattiketjuista läsnä glykoproteiinien ja glykolipidien [16]. Monimutkaisten vuorovaikutusten selektiinien kanssa ja siglecs muiden molekyylien, siaalihappoa ovat fysiologisesti läsnä eri solu-solu-vuorovaikutuksia. Sialihappoja lisätä vahvuus varaustiheys koko glykaanin ketju, läsnäolon vuoksi niiden karboksyylihappo-osa, liittämällä muutoksiin glykaanien ”adheesio-ominaisuudet [17]. Siaalihappoa siirretään luovuttajalta substraatin glykaanirakenteeseen läsnä tietyllä glykokonjugaatti, jonka sialyylitransferaasit [18, 19]. Toisaalta, niiden poistamisesta glykaanin ketjujen katalysoivat sialidases. Aktiivisuus näiden entsyymien uskotaan vaikuttavan konformaation glykoproteiinien, ja edistää siten joko kasvavaa huomiota tai peittäminen biologisesti merkittävistä sivustoja molekyylien ja solujen [20].

lisäys sialyloiduilla Lewis-tyyppinen veriryhmä antigeenejä kuten Sialyl Lewis x (SLE (x)) ja pieni katkaistu glykaanien kuten Sialyl Tn (STN) ovat yksi yleisimpiä glykaanin muutoksia syöpäsoluissa [21-24]. Useat toiminnalliset analyysit, joissa sialoidun glykaaneja osoitetaan rooli kasvanut muuttoliikkeen ja invaasio sekä

in vitro

ja

in vivo

löytyy kirjallisuudesta [19, 24]. Toisaalta, peukalointi sialyloituminen

in vitro

on myös osoitettu t joskus vähentää invasiivisen kapasiteettia syöpäsolujen [25]. Tämän seurauksena modulaatio sialyloidun glykaanien on kannattanut putatiivisena kohde neo-adjuvanttihoitona syövän [26]. Kuitenkin johtuen laaja valikoima ja monimutkaisuus sialyylitransferaaseista ja kaikkien muiden glykosyylitransferaaseja mukana sialylointia prosessissa, on hyvin tunnustettu vaikeuksia kääntämällä siaalihappoa osaksi kliinisesti merkittäviä terapeuttisia kohteita [27, 28]. Kuitenkin, vaikka on yli 20 tunnetaan erilaisia ​​sialyylitransferaasit, on vain neljä tunnistettu ja karakterisoitu nisäkkään sialidases [20]. Mielenkiintoista on, että kaikki neljä tunnetaan nisäkkäiden sialidases ovat homologisia niille sisältävät virukset, joissakin tapauksissa, tähteet, jotka ovat identtisiä aktiivisessa entsymaattista kohtaa [29].

Näin ollen on olemassa suuri tarve tutkia neoplastisia yhteyksissä joka oseltamiviirifosfaatti voisi kilpailevasti estää nisäkkäiden sialidases [30]. Eri tulokset ovat todennäköisesti ilmenee ja ne saattavat riippua kohde eston läsnä ja joukko vaikuttaa glykokonjugaattien [20]. Tässä työssä olemme tutkineet vaikutuksia sialidaasi esto kuin modulaattori Sialyloitumisen liittyvien mekanismien hyökkäyksen rintarauhasen kasvaimet käyttämällä sekä

in vitro

ja

in vivo

lähestymistapoja.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat ja viljelyolosuhteet

sen arvioimiseksi mahdolliset erot oseltamiviirifosfaatin hoidon hyvän- ja pahanlaatuisten solulinjojen, kaksi maitorauhasen solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa: yksi adenooma-solulinjaa (CMA07 vakiintunut meidän laboratorio spontaanisti esiintyvä koira monimutkainen adenooman leikattiin 6 vuotias nainen koira parantaviin tarkoituksiin paikan päällä omistajien suostumus [31]) ja yhden karsinooma-solulinjaa (CMT-U27 – erittäin metastaattinen koiran masolulinjassa, ystävällisesti professori Eva Héllmen, Ruotsista [32]). Kaksi solulinjoja viljeltiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa (Thermo Scientific) ja pidettiin RPMI 1640-alustassa, jossa oli Glutamax ja 25 mM Hepesiä (Gibco Life Technologies), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco Life Technologies) ja 1% penisilliini streptomysiini (P /S) (Gibco Life Technologies).

sialidaasia aktiivisuusanalyysiä

Korkeammat sialyloituminen pitoisuuksia voidaan olettaa olevan pahanlaatuisia soluja verrattuna hyvänlaatuinen kollegansa. Tämä on niin todennäköisesti riippuvainen aktiivisuus sekä sialyltranferases ja sialidaasi [17]. Vaikutuksen arvioimiseksi oseltamiviirifosfaattia aktiivisuuteen sialidases, joka on

in vitro

määrityksessä käyttämällä modifioitua siaalihapon (4-metyyli-umbelliferyl-Nacetylneuraminic happo-4-Muñana), suoritettiin käyttäen CMA07 ja CMT- U27 koiran nisäkasvainsoluja. Sialidaasia aktiivisuus määritettiin hankkimalla metabolisen konversion siaalihapon analogia, 4-Muñana, osaksi fluoresoiva yhdiste metyyli-umbelliferoni (sininen väri), käsittelemällä eri annoksilla oseltamiviirifosfaattia. Soluja kasvatettiin 12 mm pyöreä lasi konfluenssiin asti ja sen jälkeen inkuboitiin 24 tunnin ajan alustalla, joka sisälsi eri oseltamiviirifosfaatti pitoisuuksilla (0,305 uM, 3,05 uM, 30,5 uM ja 305 uM oseltamiviirifosfaatti liuotetaan PBS), ja ajoneuvo lääkkeen (PBS ) käytettiin kontrollina. 24 tunnin kuluttua hoidon, kukin 12 mm pyöreä lasi pantiin objektilasille ja inkuboitiin 2 uM 4-Muñana (2 ’- (4-metyyliumbelliferyyli) -α-DN-asetyylineuramiinihapon) (Sigma, Saint Louis, USA) liuos . Objektilasit heti havaittiin epi-fluoresenssimikroskopialla UV-valossa (viritys aallonpituudella 360 nm, ja emissio aallonpituudella 440 nm), kuten on kuvattu aiemmin [33]. Objektilasit analysoitiin ja kuvia otettiin Carl Zeiss fluoresenssimikroskoopilla (Carl Zeiss Mikroskopia).

Solumorfologia analyysi

CMA07 ja CMT-U27-solut maljattiin tiheydellä 1×10

4 solua per kuoppa 6-kuoppaisille levyille, kolmena kappaleena. Kolme eri oseltamiviirifosfaattia pitoisuudet tutkittiin: 0,305 uM, 3,05 uM ja 30,5 uM, ja PBS: ää käytettiin kontrollina. Analyysi solujen yhtymäkohdassa ja morfologia suoritettiin käyttäen kontrastin käännettyä mikroskooppia aikana 7 päivää. Valokuvat otettiin päivinä 0 ja 7 alla 200-kertaisella suurennuksella.

Soluproliferaatiomääritys

CMA07 ja CMT-U27-soluja viljeltiin 24-kuoppalevyillä kolmena rinnakkaisena kullekin tilalle: 0,305 uM, 3,05 uM, 30,5 uM ja 305 uM oseltamiviirifosfaatti ja PBS käytettiin kontrollina. Solut laskettiin joka päivä 7 päivän ajan Neubauer kammioon 1: 2 laimentaminen soluja 0,4% trypaanisinistä ja solumäärä tehtiin käyttäen äänenvoimakkuuden muuntokerrointa 1 mm3, joka on 1×10

4. Tämä määritys toistettiin 3 kertaa ja kasvukäyriä jäljitettiin.

solukasvumäärityksessä

Solun kasvu määritettiin CMA07 ja CMT-U27 solulinjoja käyttäen kaupallisesti saatavilla olevaa pakkausta CellTiter 96 vesikerros Solution reagenssia (Promega Corporation), ja suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, solut maljattiin 96-kuoppalevyille kolmena kappaleena (Orange Scientific), tiheydellä 5×10

3 solua kuoppaa kohti. Sen jälkeen, kun solun kiinnitys oseltamiviirifosfaatti lisättiin 0,305 uM, 3,05 uM, 30,5 uM ja 305 uM lopullisina konsentraatioina, ja PBS: ää käytettiin kontrollina. Soluaineenvaihduntaan mitattiin lisäämällä MTS tetratsoliumilla reagenssia ja absorbanssi rekisteröitiin 490 nm: ssä. Mittaukset suoritettiin 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24 ja 48 tuntia. Lisävalvontatoimenpiteenä mittaus suoritettiin ajankohdassa 0h, kulttuurissa hyvin ilman soluja. Kokeet suoritettiin kahdesti.

TUNEL-määrityksessä

CMA07 ja CMT-U27 solulinjoja viljeltiin 6-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin sitten eri pitoisuuksilla oseltamiviirifosfaattia (0,305 uM, 3,05 uM, 30,5 uM ja 305 uM, ja PBS: ää käytettiin kontrollina). 24 tunnin kuluttua hoidon, viljelyalusta ja tripsinized solut kerättiin ja sentrifugoitiin 10 minuuttia nopeudella 2000 rpm. Solut pestiin PBS: ssä ja kiinnitettiin kylmällä metanolilla 20 minuutin ajan. Kiinnityksen jälkeen solut ressuspended 1 ml: aan PBS: ää cytospin menettelyä. Lyhyesti, 100 ui solususpensiota sentrifugoitiin cytospin3 sentrifugissa käyttäen polilysine päällystetty dioja. Dioja käytettiin sitten

in situ

solukuoleman havaitseminen käyttäen kaupallista kittiä (

In situ

solukuoleman havaitseminen pakki, fluoreseiinin Roche), joka perustuu merkintöjä DNA kaksinkertainen katkeamisen (TUNEL teknologia) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Objektilasit havaittiin fluoresenssimikroskoopilla käyttäen 488 nm: ssä virityksen aallonpituus ja prosenttiosuus kuolleet solut laskettiin kirjaamalla positiivinen TUNEL solujen osuus koko soluihin käyttäen ImageJ ohjelmistoa. Tämä määritys suoritettiin kahdesti.

Haavan paranemista

haavan paranemista määritys suoritettiin käyttäen hyvänlaatuinen (CMA07) ja erittäin metastaattinen (CMT-U27) koiran nisäkasvaimen solulinja nopeutus mikroskoopilla. Lyhyesti, 20×10

4 solut maljattiin 24-kuoppaisen kuoppalevyn kuoppaa ja saavutettuaan korkean yhtymäkohta keinotekoinen ”haava” tehtiin pipetillä kärjestä. Viljelyalusta korvattiin eri oseltamiviirifosfaatti pitoisuudet: 0,305 uM, 3,05 uM ja 30,5 uM oseltamiviirifosfaatti ja PBS kontrollina. Haavan kuva hankinta tehtiin 5 minuutin välein 48 tuntia, käyttäen ohjelmaa Axio Vision Release 4.8.2. ja muunnetaan video. Solujen käsittely 305 uM oseltamiviirifosfaatti ei suoritettu, koska sen aiemmin osoittaneet sytotoksisuutta. Tämä määritys suoritettiin kahdesti.

matrigeelin invaasiomääritys

Matrigel invaasiomääritys suoritettiin arvioimaan invasiivisen kapasiteettia CMT-U27-solujen, hyvä malli tutkia soluinvaasiota [34]. Matrigel-insertit rehydroitiin RPMI 1640: ssa 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO 2-inkubaattorissa (Thermo Scientific). Tiedotusvälineet olivat samat ylä- ja alaosassa kuoppiin (RPMI 1640, jota oli täydennetty 10% FBS ja 1% PENISILLIINIT ja streptimicin).

Kun insertti nesteytystä, 1×10

5-soluja ympättiin Matrigelillä päällystetyt kammiot läsnäollessa eri oseltamiviirifosfaatin pitoisuuksilla (0,305 uM, 3,05 uM, 30,5 uM oseltamiviirifosfaatti) ja PBS kontrollina, ja pidettiin viljelmässä edelleen 6 tuntia (aikaisemmin optimoitu aika pisteen hyökkäystä, joissa käytetään tätä solulinjaa ). Lääkkeen käytettiin alkuun kuoppiin. Inkuboinnin jälkeen sisältö kunkin insertin poistettiin ja pestiin kahdesti PBS: llä poistamaan ei-tunkeutuvat soluihin. Invasiivisia solut kiinnitettiin kylmällä metanolilla 20 minuuttia, insertit siirrettiin dioja (Industrial Quality) ja asentaa Vectashield kiinnitysväliaine DAPI (Vector Laboratories). Tunkeutuvat solut kirjattiin laskemalla solujen lukumäärä läsnä insertin. Nämä kokeet suoritettiin 3 kertaa.

fluoresoiva sytokemian

Soluja viljeltiin lasipeitinlevyille ja viljelyalustaa täydennettiin 0,305 uM, 3,05 uM ja 30,5 uM oseltamiviirifosfaattia ja PBS kontrollina, ja 24 tuntia. Sitten solut pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin kylmällä metanolilla 20 minuuttia. Kiinnityksen jälkeen solut rehydroitiin PBS: lla ja blokattiin 10% BSA: ssa 20 minuuttia. Plant lektiinit SNA (Biotinylated Elderberry kuori lektiini, B-1305, Vector Laboratories), MAL I (Biotinylated Maackia amurensis lektiini I, B-1315, Vector Laboratories), ja MAL II (Biotinylated Maackia amurensis lektiini II, B-1265, Vector Laboratories ) laimennettiin 1: 300 5% BSA: ta PBS: ssä ja inkuboitiin dioja 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Objektilasit pestiin sitten kolme kertaa PBS: llä ja inkuboitiin 1 tunnin ajan streptavidiini-FITC: llä. Kahden pesun jälkeen PBS: llä, objektilaseja inkuboitiin 10 minuuttia DAPI (Sigma-Aldrich) PBS: ssä ja objektilasit asennettu Vectashield kiinnitysväliaine (Vector Laboratories) fluoresenssianalyysiä varten. Objektilasit analysoitiin ja kuvat on otettu Carl Zeiss fluoresenssimikroskoopilla (Carl Zeiss Mikroskopia).

Western Blot analyysi

Solut CMA07 ja CMT-U27 solulinjoja kasvatettiin konfluenssiin 6 hyvin -levyt ja eri pitoisuuksia oseltamiviirifosfaatin lisättiin väliaineen (0,305 uM, 3,05 uM ja 30,5 uM oseltamiviirifosfaattia). 24 tunnin inkubaation jälkeen solut pestiin kolme kertaa PBS: llä ja lyysattiin käyttäen RIPA lyysipuskuria (50 mM Tris-HCI, pH 8; 150 mM NaCl; 1% NP-40; 0,5% natrium- desoxicolate; 0,1% SDS: ää ), joka sisältää täydellisen proteaasiestäjäseostabletit (Roche), 1 mM PMSF (fenyylimetyylisulfonyylifluoridin), ja 1 mM Na

3Vo

4 (natriumortovanadaatti). Proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen biocinchoninic happoa menetelmän Pierce BCA Protein Assay Kit (Pierce /Thermo Scientific), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

kokonaisproteiinia uutteet erotettiin 10% SDS-PAGE, siirrettiin nitroselluloosamembraanille (Amersham Biosciences /GE Healthcare Life Sciences) ja inkuboitiin eri biotinylatedlectins: MAL I (B-1315, Vector Laboratories), MAL II (B-1265, Vector Laboratories) ja SNA (B-1305, Vector Laboratories) laimennettuna 1 : 500 5% BSA: ta (Sigma-Aldrich) PBS: ssä, jossa oli 0,05% Tween-20 (Sigma-Aldrich, USA). PBS-pesun jälkeen 0,05% Tween-20, membraaneja inkuboitiin avidiini-biotiini-peroksidaasi-kompleksin kit (Vectastain ABC-kitti Standard, Vector Laboratories) 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. SLE (x) ja STN-analyysi, membraaneja inkuboitiin hiiren monoklonaalisten vasta-aineiden, KM93 (Millipore), laimennettu 1: 500 ja TKH2 (varovasti tarjoamia tohtori H. Clausen, Tanska), jonka jälkeen inkuboitiin HRP-konjugoidun anti-hiiri- sekundaarinen vasta-aine 1 tunnin ajan. Analyysi tehtiin kemiluminesenssin käyttämällä ECL Western blotting detektointireagenssia ja elokuvia (molemmat GE Healthcare). Western blot aktiinin laimennettu 1: 4000 (Santa Cruz Biotechnology) käytettiin lastaus ohjaus.

2D-geelielektroforeesilla

erot yksittäisten proteiinit ovat vaikeita visualisoida käyttämällä tavallisia Western Blot-analyysi. Yritetään voittaa tämän, olemme suorittaneet 2D geelejä analyysi, joka paremmin erottelee proteiinin glykomuodot uutteissa. Proteiininäytteitä CMA07 ja CMT-U27-soluja käsiteltiin 3,05 uM oseltamivor ja PBS-käsiteltyihin kontrollieläimiin soluja saostettiin (ProteoExtract, Calbiochem) ja suspendoitiin uudelleen nesteytys puskuriin (7M urea, 2 M tioureaa, 4% (v /v), CHAPS ja 0,0002 % Bromifenolisini) ja 0,2% amfolyyttiä ja määrällisesti (2D Quant Kit GE Healthcare). Passiivinen nesteytys liuskojen suoritettiin yön yli 200 ug kokonais- proteiineista käyttäen IPG nauhat pH 3-10 NL (ReadyStrip; 0,5 x3 x70 mm, Bio-Rad, Hercules) huoneenlämpötilassa. Isoelektrinen fokusointi suoritettiin muuttuvaiseksi IEF cell (Bio-Rad), joiden alkuperäinen jännitteellä 250 V 15 min, ja sitten soveltamalla jännitegradienttikokoonpanon jopa 4000V kanssa rajoittamalla nykyinen 50 uA kohti nauhan ja lämpötila asetettiin 20 ° C: ssa. Ensimmäinen ulottuvuus tehtiin klo 14-20 KVH.

jälkeen isoelektrisen fokusoinnin proteiinit alennettu alkyloitu inkuboimalla 2% DL-ditiotreitolia (DTT) ja sen jälkeen 2,5% Jodiasetamidia käytettäessä tasapainotuspuskurilla (6 M ureaa, 2% SDS: ää, 0,002% bromifenolisinistä, 75 mM Tris, pH 8,8, 29,3% glyserolia) 10 min jokaisen kevyesti sekoittaen. Liuskat oli pakattu sitten 1% matalan geeliytymispisteen (1% agaroosia ajopuskurissa 25 mM Tris, 192 mM glysiini ja 0,1% (w /v) SDS: ää, pH 8,3; Bio-Rad) päälle 10% akryyliamidigeelissä (akryyliamidi /bisakryyliamidia 37,5: 1, 2,6% Bio-Rad). Toinen ulottuvuus elektroforeesi suoritettiin Mini-Protean tetra solusysteemiin (Bio-Rad) käyttäen 1xTris /glysiini /SDS-puskurissa vakiojännitteellä 125 V Western blot-analyysi käyttämällä SNA lektiini tehtiin kuten edellisessä osassa.

Eläinkokeet

Eläinkokeet suoritettiin mukaisesti Euroopan ohjeet Hoito ja käyttö Laboratory Animals, direktiivi 2010/63 /UE ja National asetus julkaistiin vuonna 2013 (Decreto-Lei n. ° 113/2013 de 7 de Agosto). N: NIH (S) II-nu /nu nude-hiirissä, asutettiin, kasvattanut ja ylläpidetään Ipatimup Animal House, joka taudinaiheuttajista vapaassa ympäristössä valvotuissa olosuhteissa valon ja kosteuden. Seuraavat Humane päätepisteet perustettiin: signaaleja kärsimystä, kärsimystä tai kipua, kehon painonpudotus yli 20-25% kehon massan, anoreksia ja kuolemaisillaan tila, jotka liittyvät tai eivät kokeellisen menetelmän.

Experimental hiiret ryhmissä ja lääkehoito

Nainen NIH (S) II-nu /nu nude-hiirissä, ikäinen 4-6 viikkoa, olivat ortotooppisesti inokuloitiin 1 x 106 elinkelpoista CMT-U27 koiran rintasyövän solujen utarerasvaa pad käytettäessä 25 gaugen neulalla. Yhteensä 8 hiiriin istutettiin. Kun kyhmyt saavutti tilavuus on noin 500mm3, hiiriä (n = 8) satunnaistettiin ja jaettiin kontrolliryhmään (n = 4) ja hoito (n = 4) kantavassa eläimet saivat intraperitoneaalisesti (IP) Dailly joko 100 ui PBS: ää ( kontrolliryhmä) tai 100 mg /kg Oseltamiviirifosfaatti (Tamiflu Roche) ostetaan apteekista, laimennettiin PBS (hoito ryhmä), kunnes kuolinpäivänään. Kasvaimen koko mitattiin käyttäen jarrusatulat, ja kasvaimen tilavuus (mm3) arvioitiin leveys x pituus x korkeus. Tarkkailla metastization, primaarikasvaimista ja kaikki hiiret poistettiin kirurgisesti, kun keskimääräinen tilavuus ~ 1000-1500mm3 saavutettiin. Hiiret nukutettiin IP-anto 100 ui seosta, joka sisälsi 50 mg /kg ketamiini (Imalgene® 1000) ja 1 mg /kg medetomidiinihydrokloridia (Medetor) ja kasvaimen leikattiin. Käytimme 2,5 mg /kg atipametsoli (Revertor) per hiiriä antagonisoinut anestesian. Hiiriä käsiteltiin oraaliliuos 10 mg /kg tramadolin chloridrate (Tramal) joka 8h 24-48h kivun. Eläimet seurattiin kirurgisen poiston jälkeen primaarikasvainten for invaasio ja /tai metastization merkkejä.

Kaikki hiiret lopetettiin vakiintuneita Humane päätepisteet ja niille tehdään ruumiinavaus. Kudokset kiinnitettiin 10% puskuroituun formaliiniin, käsitellään ja upotettiin parafiiniin. Kolme mikrometrin leikkeet leikattiin ja värjättiin hematoxilin eosiini (HE) edelleen histopatologista ja immunohistokemiallinen analyysi. Histopatologisissa primaarikasvainten ja vastaavia etäpesäkkeet sekä tulehdusta arviointi (laskemalla tulehduksellisten infiltraattien läsnä koko ksenograftissa) suoritettiin itsenäisesti kaksi patologia.

Histochemistry lektiinien ja immunohistokemia

ilmentyminen sialyloiduilla rakenteiden CMT-U27 ksenograftien hoidettujen hiirien oseltamiviiriä ja tarkastukset tehtiin käyttämällä kasvi lektiinejä SNA, MAL I ja MAL II.

Kalvot poistettiin parafiini ja rehydratoitiin seuraa antigeeni talteenotto kiehuvalla 0,005% Extran 8 minuuttia. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin 10% H2O2: ta metanolissa liuoksessa 10 minuuttia, ja levyt blokattiin 10% BSA: ta PBS: ssä (pH 7,4) 30 minuutin ajan.

Sitten kasvaimen Leikkeitä inkuboitiin 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa biotinyloidun SNA, MAL I ja MAL II (Vector Laboratories.) laimennettuna 1: 250, 1: 250 ja 1: 150 vastaavasti 5% BSA: ta PBS: ssä. Objektilasit pestiin sitten PBS: ssä, inkuboidaan avidiini-biotiini-peroksidaasi-kompleksin (ABC) 30 minuuttia ja kehitettiin diaminobentsidiinillä tetrahydroxychloride substraatin, DAB (Sigma FAST). Immunohistokemiaa leikkeitä inkuboitiin yli yön huoneen lämpötilassa, jonka ensisijaisena vasta-aineiden anti-Ki67 monoklonaalinen vasta-aine (MIB1 klooni, Dako), anti-kaspaasi-3 (5A1E klooni, Cell Signalling), ja anti-SLE (x) (KM93, Millipore ) 1:50, 1: 100 ja 1: 200 vastaavasti 5% BSA PBS: ssä. Objektilasit pestiin sitten PBS: ssä, inkuboitiin Novolink Max Polymer Detection System (1250 kivekset), Novocastra, (Newcastle, UK) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja kehitettiin soveltamalla DAB saman kit 5 minuuttia.

sitten lasit vastavärjättiin hematoksyliinillä, kuivattu, ja asennettu Histomount (National Diagnostics). Negatiiviset kontrollit ilman lektiinejä tai vasta-aineita, olivat mukana. Kaikki värjätyt leikkeet tutkittiin valomikroskoopilla ja tarkistaa kolme tarkkailijaa (de Oliveira J .; Ribeiro, C .; ja Gartner, F.).

Tilastollinen

Soveltuvissa tulokset esitetään keskiarvona ± keskihajonta. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen One Way ANOVA (varianssianalyysi) testi. MTS, soluproliferaatiota, ja solujen kasvua määritykset monivertailuja Dunnettin menetelmällä käytettiin. Student t-testi suoritettiin arvioida haavan paranemista määrityksen tulokset. Useat vertailut Tukeyn testiä käytettiin tutkittaessa solun Matrigel invaasiomääritys ja monivertailuja Bonferronin testiä käytettiin Tunel määrityksessä analyysiä. GraphPad Prism 5,02 version käytettiin suorittamaan näitä tilastollinen analyysi.

Imunohistochemical kuvia Ki-67 ja kaspaasi-3 ilmentyminen analysoitiin käyttämällä ImmunoRatio verkossa analyysityökalut, mukaan high-teho suurennus kullakin alueella [35] . Kasvaimen tapausta jaettiin 3 ryhmään mukaan Ki67 pisteet: alle 10% Ki67 positiivisia soluja (matala), 10 50% Ki67-positiivisia soluja (kohtalainen) ja yli 50% Ki67-positiivisia soluja (korkea). Arvioidaan kaspaasi 3 ja SLE

x ilmaisua, kasvaimet ryhmiteltiin prosenttiosuus immunoreaktiivisten solujen koko leesion, osaksi 3 luokat: 0% (Negative); alle 5% (harvinaisia ​​soluja) tai 6-10% (matala). Mitä SNA ja MAA I ilmaisun, semikvantitatiivinen analyysi, jossa näytteet sijoitettiin mukaan positiivisten solujen prosenttiosuuden. Kasvaimet ryhmiteltiin: alle 25% (matala); 25-50% (kohtalainen) ja yli 50% (korkea). Sitten yhdistys hypoteesit testattiin käyttämällä Chi-neliö testi erillisen muuttujan. SPSS (versio 22.0) käytettiin tilastolliseen analyysiin.

Tulokset

vaikutus oseltamiviirifosfaatin ottoa CMA07 ja CMT-U27 solujen endogeenisen sialidaasia aktiviteetti

in vitro

Oseltamiviirifosfaatti hoidon heikentynyt sialidaasia aktiivisuutta (neuramiinihappoyhdiste hydrolyysi), kuten on esitetty lasku metyyli-umbelliferoni fluoresenssi molemmissa solulinjoissa (kuvio 1). Lisäksi lasku sialidaasia toiminta oli yhä selvempää korkeampia oseltamiviirifosfaatti pitoisuuksia.

CMA07 ja CMT-U27-soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan eri pitoisuuksilla oseltamiviirifosfaatin (0,305 uM, 3,05 uM, 30,5 uM ja 305 uM) tai PBS kontrollina, ja inkuboitiin 2 uM 4-Muñana ratkaisu. Objektilasit heti tarkkailtiin epi-fluoresenssimikroskoopilla UV-valolla. Molemmat solulinjat osoittivat vähentynyt sialidaasia aktiivisuus arvioitiin fluoresoiva metyyli-umbelliferoni, joka johtuu aineenvaihdunnan muuntaminen 4-Muñana.

vaikutus oseltamiviirifosfaatin hoidon CMA07 ja CMT-U27-solujen morfologia, elinkelpoisuus ja ohjelmoidun solukuoleman

vaikutuksen arvioimiseksi eri annosten oseltamiviirifosfaatin solumorfologiaan, elinkelpoisuuden ja ohjelmoidun solukuoleman,

in vitro

määritykset alla tehtiin.

Lievä muutoksia solujen morfologia havaittiin CMA07 käsitellyissä soluissa oseltamiviirifosfaattia. Ei suuria muutoksia CMT-U27 solumorfologiaan havaittiin (S1 Kuva).

Tilastollinen analyysi ei osoittanut merkittäviä eroja kasvuvauhti molempien CMA07 (

p

= 0,6209) ja CMT-U27 (

p

= 0,9929) solulinjat, käsittelemällä oseltamiviirifosfaatti (kuvio 2A). Edelleen vaikutuksen arvioimiseksi oseltamiviirille hoidon CMA07 ja CMT-U27 solujen elinkykyä, MTS kolorimetristä, joka määrittää solun aineenvaihdunta, suoritettiin, 48 tuntia. Metabolinen aktiivisuus CMA07 ja CMT-U27 solulinjoissa oli merkitsevästi väheni 305 uM oseltamiviirifosfaatti hoito (

p

= 0.005 ja p 0,0001 vastaavasti) käyttämällä One Way ANOVA kivekset (varianssianalyysi). Sen sijaan ei havaittu tilastollisesti merkittäviä muutoksia havaittiin 0,305 uM (p = 0,9781), 3,05 uM (

p

= 0,7436) ja 30,5 uM (

p

= 0,9623) oseltamiviirifosfaattia hoitoja, kun verrattuna kontrolli-soluissa (kuvio 2B). Lopuksi vaikutusten arvioimiseksi oseltamiviirifosfaatin on CMA07 ja CMT-U27 ohjelmoidun solukuoleman, ja ottaen huomioon, että 305 uM oseltamiviirifosfaatti hoito alentunut solun aineenvaihdunta, ohjelmoidun solukuoleman mittaus suoritettiin TUNEL määrityksessä. Kaksikymmentäneljä tuntia oseltamiviirifosfaattia hoitoa, nimenomaan 305 uM, huomattavasti CMA07 (

p

= 0,0010) ja CMT-U27 (

p =

0.0002) DNA pirstoutuminen, mikä viittaa edistäminen ohjelmoidun solun kuolema, verrattuna pienempi oseltamiviirille pitoisuudet tai PBS (kuvio 2C ylempään ja alempaan paneeliin).

solun kasvu arvioidaan trypaanisinisellä (A) tai MTS-määritys (B) ja ohjelmoidun solukuoleman (C ) arvioitiin CMA07 ja CMT-U27-solujen käsittelyn jälkeen oseltamiviirifosfaatti (0,305 uM, 3,05 uM, 30,5 uM ja 305 uM) tai PBS kontrollina. (A) Soluja viljeltiin, kun läsnä oli eri oseltamiviirifosfaattia pitoisuuksia, ja solujen kasvua tarkkailtiin 7 päivää laskemalla elävien solujen lukumäärä päivässä. Mitään merkittäviä eroja kasvuvauhdin käsiteltyjen solujen todennettiin verrattuna ei-käsiteltyjä soluja, lukuun ottamatta vähentynyt kasvun CMA soluissa 4päivää 305 uM oseltamiviirifosfaattia hoitoa. (B) Soluja viljeltiin, kun läsnä oli eri oseltamiviirifosfaattia pitoisuuksia, ja solujen metabolinen aktiivisuus oli edelleen seurattiin käyttämällä MTS-määritys, aikakäyrän tavalla 48 tunnin ajan. CMA07 ja CMT-U27-solujen käsiteltiin 305 uM oseltamiviirifosfaatti osoitti merkittävää vähenemistä niiden aineenvaihdunta (***

p

0,001), mutta ei muutoksia todennettiin kanssa pienempiä pitoisuuksia. (C) CMA07 ja CMT-U27 käsiteltiin eri pitoisuuksilla oseltamiviirille 24. Soluja käsiteltiin 305 uM oseltamiviirifosfaatti oli myös tilastollisesti merkittävä kasvu ohjelmoidun solukuoleman (***

p

0,001) seuraavat 24 tuntia oseltamiviirifosfaatin hoitoa, mutta mitään muuttamatta todennettiin kanssa pienempiä pitoisuuksia (kuvaajat