Krooninen sairaus

tiivistelmä

verihiutaleiden kasvutekijä (PDGF) signalointireitin on todettu tärkeitä rooleja kehittymistä ja etenemistä ihmisen syövissä säätelemällä prosesseja solujen lisääntymistä, apoptoosin, muuttoliike, invaasio, etäpesäke, ja hankinta epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) fenotyyppi. Lisäksi PDGF signalointi on myös havaittu muuttavan ilmentymisen profiili miRNA, johtaa käänteinen EMT fenotyypin. Vaikka rooli miRNA syövässä on dokumentoitu, on olemassa hyvin vähän tutkimuksia dokumentointia solu seuraukset kohdennettujen uudelleen spesifisten miRNA. Näin ollen, olemme tutkineet, onko hoito ihmisen haimasyövän soluja PDGF voisi muuttaa ekspression profiili miRNA, ja myös arvioida solun seurauksia. Tutkimuksemme osoittaa, että miR-221 on olennaista PDGF välittämän EMT fenotyyppi, muuttoliike, ja kasvua haiman syöpäsoluja. Down-regulation TRPS1 by miR-221 on kriittinen PDGF välittämää hankinnan EMT fenotyypin. Lisäksi PDGF-riippuvaisen kasvu soluproliferaatiota näyttää välittävän estämällä tietyn tavoitteen miR-221 ja alas-säätely p27Kip1.

Citation: Su A, hän S, Tian B, Hu W Zhang Z (2013) MicroRNA-221 välittää Effects PDGF-BB muuttoliikettä, leviämisen ja epiteelin-mesenkymaalitransitioon in haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 8 (8): e71309. doi: 10,1371 /journal.pone.0071309

Editor: Takashi Tokino, Sapporo Medical University, Japani

vastaanotettu: 02 huhtikuu 2013; Hyväksytty: Kesäkuu 27 2013. Julkaistu: 13 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Su et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on neljänneksi yleisin syy syövän -aiheiset kuolemaan Yhdysvalloissa [1], ja aggressiivisuus haimasyövän johtuu osittain sen ulkoisen ja sisäisen lääkeresistensseihin ominaisuuksia, jotka liittyvät myös hankintaan epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) fenotyyppi [ ,,,0],2], [3]. EMT on prosessi, joka on viittaavia syöpäsolujen ”varsi-ominaisuuksiltaan, jolloin epiteelisolujen mukulakivi fenotyypin hankkia mesenkymaalisten solujen ominaisuuksien kanssa kara-muotoinen fibroblastin kaltaisen morfologia [3], [4]. Tässä prosessissa purkaminen solu-solu-liittymien, myös alas-säätely epiteelisolujen fenotyypin markkereita (E-kadheriinin, Zonula occludens-1), sekä translokaatio β-kateniinin solukalvosta tumaan, uudelleenjärjestely aktiinisytoskeletonin, ja ylös-säätely mesenkyymisolun fenotyypin markkereita (vimentiinista, fibronektiini ja N-kadheriinin) [4]. Tämä prosessi vähentää liima kapasiteettia mesenkymaalisten fenotyypin soluja, mikä johtaa lisääntyneeseen solujen vaeltamiseen ja invaasio, jolloin kasvaimen aggressiivisuus [5].

Verihiutalekasvutekijät kasvutekijä (PDGF) voi säädellä monissa solun prosesseja, kuten solun leviämisen, transformaatio, muuttoliike, invaasio, angiogeneesin ja metastaasin, aktivoimalla sen vastaavan reseptorin [6]. Viime vuosina, PDGF-BB ja sukulais-tyrosiinikinaasi β-reseptorien on havaittu olevan tärkeitä rooleja hankinnan epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) fenotyyppi syöpäsolujen [5], [7]. Hoitoon epiteelin kaltaisten syöpäsolujen puhdistetulla PDGF-proteiinia tuloksena merkittävästi vähentynyt ilmentyminen E-kadheriinin ja lisääntyneen ekspression sinkki sormen E-box sitova homeo-box 2 (ZEB2) sekä mRNA ja proteiini tasot yhdessä induktio EMT ominaisuuksista [8]. ZEB2 on osoitettu olevan mukana alas-säätely ilmaisun monien geenien koodaavat ratkaisevaa proteiinien epiteelisolujen fenotyyppi, kuten E-kadheriinin, samanaikainen säätely ylöspäin ilmentymisen vimentiinista [9]. On tärkeää huomata, että PDGF myös merkitsevästi lisääntynyt ilmentyminen fibronektiinin, N-kadheriinin, ja vimentiinin kanssa menetystä E-kadheriinin. Kuitenkin edelleen perinpohjaisesti mekaaniset tutkimukset ovat tarpeen ymmärtää, miten PDGF säätelee prosessien EMT fenotyypin.

MikroRNA (miRNA) on tunnistettu, jotka parantavat useita näkökohtia haimasyövän patogeneesissä, mukaan lukien etäpesäkkeiden invaasio, ja itseuudistumisen [10]. Kehittyvät viittaavat siihen, että geenien ilmentymistä, jotka ovat olennaisia ​​hankinnasta EMT fenotyypin ja kasvainsolun aggressiivisuus säädellään miRNA jotka johtavat joko translaation sorron tai hajoamisen kohde-mRNA: iden [11], [12]. MIR-221 ilmentyy suuresti eri syövän peräisin olevat solut, mukaan lukien haiman karsinooma, eturauhasen syöpä ja kilpirauhassyöpä soluihin [13], [14], [15]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-221 säätelee EMT kohdentamalla TRPS1 (tricho-rhino-phalangeal oireyhtymä tyyppi 1) ja lievittää sen estäminen ZEB2 [16]. Lisäksi korkea miR-221 on osoitettu edistävän näiden solujen sitoutumisen kautta 3′-UTR solusyklin estäjä ja tuumorisuppressorigeenin p27Kip1 ja inhiboimaan sen ilmentymistä [13], [15]. Viime vuosina, PDGF signalointi on havaittu muuttavan ilmentymisen profiili miRNA, johtaa käänteinen EMT fenotyypin [17], [18].

Vaikka rooli miRNA syövän on dokumentoitu, on olemassa hyvin vähän tutkimuksia dokumentointia solu seurauksena kohdistettuja uudelleen spesifisten miRNA. Siksi me arveltu, että PDGF signalointi voisi moduloida EMT fenotyyppi säätelemällä miRNA biogeneesin. Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet, onko hoito ihmisen haimasyövän soluja PDGF voisi muuttaa ekspression profiili miRNA, ja myös arvioida solun seurauksia. Tulokset osoittavat, että PDGF osoittaa sen vaikutuksia sekä soluproliferaatioon ja EMT fenotyyppi indusoimalla miR-221 ilmaisua, joka johtaa alas-säätely p27Kip1 ja TRPS1 haiman syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

stabiili ihmisen haimasyövän AsPC-1 saatujen solulinjojen Tyypillisiä kulttuurin säilyttäminen komissio solujen pankki, Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina) viljeltiin DMEM-alustassa (Invitrogen, CA) täydennettynä 5% naudan sikiön seerumia (FBS), 2 mmol /l glutamiinia, 50 yksikköä /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä. Kaikki solut ylläpidettiin 5% CO2-kostutetussa atmosfäärissä 37 ° C: ssa.

Tutkimus Reagenssit ja vasta-aineet

Rekombinantti ihmisen PDGF-BB ostettiin R & D Systems. Kemiallisesti syntetisoitu miRNA estäjät, jäljittelee, ja salattu tarkastukset saatiin Dharmacon tai Ambion. Synteettiset, pieniä häiritseviä RNA: ita (siRNA: t) kohdistaminen ihmisen TRPS1 tai p27Kip1 olivat Stealth Valitse RNAi (Invitrogen) ja HP ​​validoitu siRNA (Qiagen). Solut ympättiin 100000 300000 solua /ml, ja transfektoitiin Oligofectamine (Invitrogen), DharmaFECT3 transfektioreagenssia (Dharmacon) tai RNAi MAX (Invitrogen) ilmoitettuina pitoisuuksina. Vasta-aineita ZEB2, N-kadheriinin, ja vimentiinin ostettiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Vasta-aineet ZEB1, Snail1, Snail2, Twist, E47, E-kadheriinin ja ZO-1 hankittiin Santa Cruz. Vasta-aineet TRPS1, p27Kip1 ja GAPDH hankittiin Abcam. FITC-konjugoitu anti-hiiri-IgG vimentiinista ja E-kadheriinin värjäys ostettiin Invitrogen. Mirvana miRNA Isolation Kit ja Taqman miRNA Analyysit ostettiin Ambion ja Applied Biosystems.

transfektio miRNA Mimics ja Specific Anti-miRNA

AsPC-1-solut ympättiin 3 x 10

5 solua kuoppaa kohti kuuden-kuoppalevyille ja transfektoitiin miR-221 jäljittelee tai miRNA salattu valvonnan lopulliseen konsentraatioon 20 nM käyttäen Oligofectamine (Invitrogen). AsPC-1-solut transfektoitiin anti-miR221 (miRNA-estäjät) tai anti-miRNA-ohjaus, jonka lopullinen konsentraatio oli 200 nM käyttäen DharmaFECT3 transfektioreagenssia (Dharmacon). Jälkeen 3 päivää transfektion jälkeen solut jaettiin ja transfektoitiin toistuvasti miR-221, miRNA-inhibiittorit tai valvoa jokaista 3-4 päivää varten ilmoitettu ajat.

Sirna ja transfektio

AsPC-1-solut transfektoitiin 100 nmol /l ihmisen TRPS1, p27Kip1 pieniä häiritseviä (si) RNA: ta tai kontrollina siRNA (Santa Cruz) käyttäen RNAi MAX transfektioreagenssia. Media poistettiin sen jälkeen, kun 24 tunnin transfektion jälkeen soluja inkuboitiin väliaineessa, joka sisälsi 5% FBS: ää vielä 24 tuntia. Solulysaatit valmistettiin Western blot -analyysiin, ja kokonais-RNA uutettiin ja reaaliaikaisen käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio määrityksessä.

proliferaatiomääritystä

MTT-määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [19]. Yhteensä 6 x 10

3-solut jaettiin 96-kuoppaisille levyille. Soluja käsiteltiin tai ilman 20 ng /ml PDGF-BB: ssa 24 tuntia, jonka jälkeen solujen lisääntymisen määrityksessä käyttäen CellTiter96-radioaktiivista soluproleferaatiomäärityksessä (Promega) valmistajan mukaan suuntiin. Absorbanssi 490 nm: ssä luettiin entsyymi-immunologinen määritys levylukijalla. Sillä proliferoivan solun tuma-antigeeni (PCNA) värjäys [20], AsPC-1 solut värjättiin FITC-konjugoidulla anti-PCNA-vasta-ainetta (klooni PC10) peräisin Biolegend sekä DAPI. Ainakin 150 solut laskettiin kohti kunnossa, ja prosenttiosuudet PCNA-positiivisten solujen esittelyyn.

haavan paraneminen Pitoisuus

haavan paranemista määritys suoritettiin tutkimaan kapasiteetti solumigraation ja invaasiota , kuten aiemmin on kuvattu [21]. Lyhyesti, kun solut kasvoi 90-95% konfluenssiin 6-kuoppalevyillä, yksi naarmu haava on tuotettu 200 ui kertakäyttöinen pipetin kärki. Scratch Haavat kuvannut yli 7 h Nikon -käänteismikroskoopissa, jonka yhteydessä on digitaalikamera, ja niiden leveydet kvantitoitiin kanssa ImageJ ohjelmiston. Tiedot piirrettiin prosenttiosuus haavan, jossa ensimmäinen alusta leveys 100%. Tulokset on esitetty keskiarvoa kolmesta mittausten hoitoa kohden kolmessa riippumattomassa kokeessa.

Cell Invasion määritys

invasiivisia käyttäytymisen solut testattiin käyttäen Matrigel transmembraaninen invaasiomääritys. TranswellTM kammiot (Millipore) (8 um huokoskoko) päällystettiin matrigeelin (15 ug /suodatin). -Soluja (2,0 x 10

4) seerumivapaassa väliaineessa maljattiin ylempään kammioon ja alhaalta kuopat täytettiin täydellistä elatusainetta. Solujen annettiin tunkeutua koko Matrigel-päällystetty kalvo 72 h 37 ° C: ssa 5% CO2: ta. Inkubaation jälkeen solut poistettiin ylemmältä pinnalta suodattimen kaapimalla pumpulipuikolla. Tunkeutuneet solut, jotka kiinni pohjaan kalvo kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin DAPI. Solujen lukumäärä, jotka tunkeutuivat kalvo määritettiin laskemalla keskimääräinen solujen lukumäärä viiden satunnaisesti valittu suuren tehon alueilla.

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

RNA puhdistettiin käyttämällä Rneasy (Qiagen) tai Mirvana (Ambion) sarjat DNaasi ruoansulatus on RNease sarakkeita. Täydentävä DNA (cDNA) on tuotettu High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Roche). Kvantitatiivinen analyysi muutoksen ekspressiotasot laskettiin reaaliaikainen PCR-kone (iQ5, Bio-Rad). PCR-syklien olivat 94 ° C 3 min ja 40 sykliä (94 ° C: ssa 15 s, 60 ° C: ssa 20 s ja 72 ° C: ssa 40 s). Reaaliaikainen PCR: ää käytettiin määrittämään mRNA: n ilmentymistä. Reaktiot suoritettiin kahtena kappaleena, ja delta-delta-Cycle Threshold (ddCt) arvot laskettiin perusteella keskiarvon normalisoinnin geenejä. Taqman miRNA määrityksiä käytettiin kvantitointiin miR-221, ja tulokset normalisoitiin keskiarvo saatuja tuloksia RNU6B.

Western blot -analyysi

Western blot -analyysi suoritettiin käyttäen yhteensä solulysaateista. Kokosoluliuotteista Eri kokeiden saatiin hajottamalla solut RIPA-puskurissa, joka sisälsi 50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 1% NP-40, 0,1% SDS: ää, 0,5% natriumdeoksikolaattia, 2 mM natriumfluoridia, 2 mM Na3VO42, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA: ta ja 1 mM proteaasinestäjä cocktail. Koko solulysaatit erotettiin SDS-PAGE-geeleillä, siirrettiin PVDF-kalvoille (Millipore), immunoblotattiin vasta-aineita ja visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssidetektiolla (Amersham Biosciences). Proteiinivyöhykkeet kvantitoitiin densitometrisesti käyttämällä geeliä analyysin ohjelmisto ImageJ (rsbweb.nih.gov/ij). Kaikki arvot normalisoitiin GAPDH.

Immunofluoresenssimikroskopia

Lyhyesti, solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä, tehdään läpäiseviksi 0,5% Triton X-100, ja sitten blokattiin 10% vuohen seerumia. Soluja inkuboitiin 1 tunnin ajan vasta-aineiden E-kadheriinin (1:200) tai vimentiinista (esilaimennettua) 5% vuohen seerumia, ja sitten ne värjättiin 1 tunnin ajan FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (1:250 ). Solut katsottu fluoresenssimikroskopialla ja kuvat analysoitiin käyttämällä Advanced Sport ohjelmistoa (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI).

Tilastollinen analyysi

Esitetyt tulokset ovat keskimäärin vähintään kolme koetta, kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena standardin virheitä. Tilastolliset analyysit suoritettiin varianssianalyysi ja sen jälkeen Tukeyn monivertailutesti tai Studentin t-testiä käyttäen SPSS15.0. p-arvot 0,05 pidettiin merkittävinä ja on merkitty tähdellä.

Tulokset

PDGF mainosvideosuositukset Cell Migration and Proliferation ja muutti Epithelial- mesenkymaalitransitioon fenotyypin AsPC-1 solut

ensin tutkittiin, PDGF edistää solujen maahanmuutto käyttäen in vitro naarmu haava määritys ja Matrigel transmembraanisen invaasiomääritys. In AsPC-1-solut, käsittelemällä PDGF edistää voimakkaasti solujen vaeltamiseen (kuvio. 1A, B). Olemme myös päättäneet, onko soluproliferaatiota tehostettiin PDGF-BB (20 ng /ml, 24 h) in AsPC-1-soluissa. Tulokset MTT soluproliferaation määritys osoitti, että PDGF lisäsi elävien solujen lukumäärä 1,9-kertaiseksi kontrolliin verrattuna (Fig. 1 C). Sitten vahvistivat nämä tulokset käyttäen kvantitatiivisen analyysin PCNA värjäystä. AsPC-1 solut, joita käsiteltiin vehikkelillä tai PDGF-BB (20 ng /ml) 24 tuntia värjättiin PCNA mittaamiseksi tarvitaan lisääntyvien solujen lukumäärän (Fig. 1 D). Tulos osoitti, PDGF-välitteisen lisäys solujen lisääntymistä (1,6-kertainen) oli yhdenmukainen tulosten kanssa MTT-määritystä kuviossa. 1B.

AsPC-1-soluja inkuboitiin ajoneuvon tai PDGF-BB (20 ng /ml) alistettiin tyhjästä haavan määrityksessä (A) ja Matrigel transmembraanisen invaasiomääritys (B). Tulokset ovat keskiarvoja ± SD. kolminkertaisten mittausten kolmen erillisen kokeen. AsPC-1-soluja inkuboitiin ajoneuvon tai PDGF-BB (20 ng /ml) 24 tuntia tehtiin MTT-solujen lisääntymisen määrityksessä (Tulokset on esitetty, kuten absorbanssin lukemista 490 nm: ssä) (C), tai värjättiin FITC- konjugoitu vasta-aine leviämisen merkki PCNA ja DAPI (150 solua laskettiin kohti kunnossa, ja prosenttiosuus PCNA-positiivisten solujen esitetään.) (D). Tulokset ovat keskiarvoja ± SD. varten kolmena kappaleena analyyseissä kolmen erillisen kokeen. Reaaliaikainen-PCR: ää käytettiin määrittämään mRNA-tasot arvioida ilmen- tymisen lisääntymisen ilmentymisen transkriptiotekijöiden (E) ja EMT-geenit (F) AsPC-1-soluja inkuboitiin ajoneuvon tai PDGF-BB (20 ng /ml, 24 tunnin ajan ). Suhteellinen mRNA-tasot normalisoitiin GAPDH. Kaikki hoidot tämä luku tehtiin kolmena kappaleena, ja tulokset näkyvät keinona ± SD. G: mikrovalokuvia AsPC-1-soluja inkuboitiin ajoneuvon tai PDGF-BB (20 ng /ml, 24 h). Alkuperäinen suurennos, 200X.

Tässä tutkimuksessa, käyttäen reaaliaikaista PCR, Huomasimme myös, että PDGF-BB (20 ng /ml, 24 h) hoito merkitsevästi voimistunut ilmentyminen transkriptiorepresso- vuonna prosesseja EMT aiheuttaen geenejä kuten ZEB2 in AsPC-1-solut (Fig. 1 E). Huomasimme, että sillä ei ole muutosta ilmaisun Snail 1, Etana 2, Twist ja E47. Nämä muutokset ilmentymisessä olivat samanaikainen menetys E-kadheriinin ja Zonula occludens-1 ja voitto vimentiinista, fibronektiiniä ja N-kadheriiniekspressiota (Fig. 1 F). Tärkeintä on, AsPC-1-soluja käsiteltiin PDGF-BB näkyy pitkänomainen /epäsäännöllinen fibroblastit morfologia, joka osoitti epiteelin cobblestone ulkonäkö (Fig. 1G). Nämä tulokset viittaavat siihen, että PDGF johti hankintaan EMT fenotyypin.

asetukseen miRNA Expression PDGF-BB: Käsittely AsPC-1 solut

Reaaliaikainen PCR käytettiin määrittämään, onko hoito solujen PDGF-BB (20 ng /ml, 24 h) voi muuttaa ekspression miRNA käsittelemättömiin soluihin verrattuna. Huomasimme, että miR-221-3p ja miR-221-5p olivat kaksi harvoista miRNA rikastettu AsPC-1-solut käsiteltiin PDGF-BB (Fig. 2A), mikä viittaa siihen, että miR-221 ilmaisua voidaan aktivoida PDGF signalointi. Aika-aikana ilmentymisen miR-221-3p, miR-221-5p, miR-222-3p ja miR-222-5p tutkittiin sen jälkeen, kun PDGF-BB: käsittely AsPC-1-soluissa. MiR-221-3p ja miR-221-5p indusoitiin 2,4-kertaiseksi ja 1,7-kertaiseksi 4 h hoidon PDGF ja vähitellen laski 10 h (Fig. 2B). Tärkeää on, että vahva induktio sekä ensiö- transkriptit (Pri-miR-221) ja välituote (Pre-miR-221) ja miR-221 havaittiin jo 2 tunnin kuluttua PDGF hoidon, mikä viittaa siihen, että miR-221 on todennäköisesti on transkriptionaalisesti indusoida PDGF signalointi (Fig. 2C).

: suhteellinen miRNA tasot AsPC-1 solut, joita käsiteltiin vehikkelillä tai PDGF-BB (20 ng /ml, 24 h) B, C: Time -kurssi ekspression suhteellista ilmentymistä miR-221-3p, miR-221-5p, miR-222-3p ja miR-222-5p (B), ja miR-221 transkriptien (Pri-miR-221), Pre- miR-221 tai kypsä miR-221 (C) normalisoitu GAPDH (PRI-miR-221 tai Pre-miR-221), tai U6 pieni ydin- RNA (mir-221-3p, miR-221-5p, asennuspalveli- 222-3p, miR-222-5p ja kypsä miR-221) in AsPC-1 solut, joita käsiteltiin vehikkelillä tai PDGF-BB (20 ng /ml, 24 h). D: AsPC-1-soluja käsiteltiin ajoneuvon tai PDGF-BB (20 ng /ml), tai transfektoitu negatiivinen kontrolli, MIR-221 jäljittelevät, anti-MIR-221, tai anti-MIR-221, ja sen jälkeen PDGF -BB hoitoon., ja altistetaan qRT-PCR miR221. Kaikki hoidot tämä luku tehtiin kolmena kappaleena, ja tulokset näkyvät keinona ± SD.

miR-221 on olennaista PDGF-välitteistä epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon fenotyypin Migration , ja kasvu AsPC-1 solut

Transfektoimme AsPC-1-solut synteettisellä miR-221 (miR-221 matkivat) tai ohjaamaan matkivat (joka sisältää sekvenssin GFP) ja tutki EMT fenotyyppi. Eksogeeninen miR-221 voimistunut ilmentyminen ZEB2 ja vimentiinin mRNA: ta ja proteiinia, ja se vähensi ilmentyminen E-kadheriinin mRNA: ta ja proteiinia, joka on samanlainen vaikutus PDGF (Fig. 3A, B, C). Seuraavaksi RNA oligonukleotidit vastaan ​​miR-221 (anti-miR-221) transfektoitiin AsPC-1-soluissa estää miR-221 toiminnon. Anti-miR-221 transfektio vähensi sekä pohjapinta ja PDGF-indusoitu ilmentyminen miR-221 yli 70% (Fig. 2C). Western blot -analyysi (kuvio. 3B) ja reaaliaikainen PCR (Fig. 3C) osoitti, että PDGF-BB-välitteisen EMT fenotyyppi oli merkittävästi alentunut, kun miR-221 estyi. Nämä tulokset vahvistavat, että miR-221 on keskeinen rooli PDGF välittämän EMT fenotyypin.

AsPC-1-solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin, MIR-221 matkivat tai antisenseoligonukleotideihin miR-221 ( anti-MIR-221). Solut käsiteltiin sitten PDGF-BB (20 ng /ml) 24 tuntia ja suoritettiin qRT-PCR: llä (A, C) tai Western blot -analyysi (B) transkriptiotekijöiden ja EMT-geenistä markkereita. AsPC-1-solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin, MIR-221 matkivat, tai antisense-oligonukleotidien miR-221 (anti-MIR-221) ja alistettiin Matrigel transmembraanisen invaasiomääritys (D) läsnä tai poissa ollessa 20 ng /ml PDGF-BB: tä. AsPC-1-solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin, MIR-221 matkivat, tai antisense-oligonukleotidien miR-221 (anti-MIR-221), jonka jälkeen PDGF-BB: hoito 24 h, ja sitten värjättiin FITC- konjugoitu vasta-aine leviämisen merkki PCNA ja DAPI. Kaikkiaan 150 solut laskettiin per kunnossa, ja prosenttiosuus PCNA-positiivisten solujen (E) on esitetty. Kaikki Hoitokokeissa tässä kuviossa tehtiin kolmena kappaleena, ja tulokset näkyvät keinona ± SD.

PDGF ei vain voi välittää EMT fenotyyppiä mutta voi myös edistää solujen vaeltamiseen ja lisääntymistä. Näin ollen, AsPC-1-solut transfektoitiin miR-221 jäljittelevät, anti-miR-221, tai anti-GFP (kontrolli) tutkia induktio miR-221 PDGF on tärkeä rooli solujen vaeltamiseen ja proliferaatiota. Kun miR-221 toiminto estettiin anti-miR-221, PDGF ei muuttanut tasoa solujen vaeltamiseen ja lisääntymistä, mikä viittaa siihen, että induktio miR-221 on olennaista PDGF-riippuvaisen solujen vaeltamiseen (Fig. 3d) ja lisääntymistä (kuvio . 3E). Kääntäen, transfektion miR-221 matkivat yksin merkittävästi kohonnut solujen vaeltamiseen (Fig. 3d) ja lisääntymistä (kuvio. 3E) tasolle samanlainen kuin transfektoimattomilla käsiteltyjen solujen PDGF. Nämä tulokset osoittavat, että PDGF-riippuvaisen induktion miR-221 on olennaista edistää solujen vaeltamiseen ja lisääntymistä.

Näin miR-221 välittää vaikutuksia PDGF maahanmuutto-, lisääntymistä ja erilaistumista AsPC-1-soluissa . Tämä tulos herättää kysymyksen siitä, onko yksittäisen miR-221 kohde voi olla vastuussa kaikista näiden ilmiöiden vai miR-221 voi lähettää signaalin läpi useita toiminnallisesti ja fyysisesti erillisiä tavoitteita.

MiR-221 Edistää EMT by kohdistaminen TRPS1

Aikaisempi tutkimus on osoittanut, että GATA perhe transkription repressori TRPS1 voi estää EMT vähentämällä ZEB2 ilmaisun [16], [22]. MiR-221 on aiemmin osoitettu kohdistaa TRPS1 mRNA, mikä vähentää geenin ilmentymistä tuotteiden kautta mRNA: n hajoamisen ja /tai translaation inhibition [16]. Ensin tutkitaan, onko TRPS1 mRNA tai proteiini tasot moduloidaan PDGF-BB AsPC-1-soluissa. TRPS1 mRNA taso laski noin 55% (Kuva. 4A), kun hoito AsPC-1-solujen PDGF-BB 24 tuntia olosuhteissa, jotka estivät merkitsevästi ilmaus EMT merkkiaineiden (Fig. 3B, C). Näin ollen, TRPS1 säätelee PDGF signalointi. Sen arvioimiseksi, onko miR-221 vastaa PDGF-riippuvaisen down-regulation TRPS1, MIR-221 matkivat transfektoitiin AsPC-1-soluissa, ja sitten proteiini ja mRNA tasot TRPS1, ZEB2, E-kadheriinin ja vimentiinista olivat tutkittiin Western blot analyysi ja reaaliaikainen PCR. Eksogeeninen miR-221 vähensi merkitsevästi ilmaus TRPS1 ja E-kadheriinin ja lisääntynyt ilmentyminen ZEB2 ja vimentiinin (Fig. 4B, C, D, E). Päinvastoin, kun yli 70% endogeenisen miR-221 on tyhjentynyt, jonka anti-miR-221, tasot TRPS1 mRNA: ta ja proteiinia koholla (Fig. 4A, B), ja AsPC-1-soluissa esitetään EMT fenotyyppi (Fig. 4F, G). Lisäksi havaitsimme, että eksogeeninen miR-221 ei vielä muuta ilmentymisen EMT fenotyypin jälkeen TRPS1 pudotus siRNA. Vielä tärkeämpää on, PDGF-BB hoito ei tukahduttaa TRPS1 läsnä ollessa anti-miR-221 (Fig. 4A). Nämä tulokset osoittivat, että miR-221 suoraan kohteena TRPS1 mRNA, kuten aiemmin on havaittu [16].

AsPC-1-solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin jäljitellä, MIR-221 matkivat, antisense-oligonukleotidit ja miR-221 ( anti-MIR-221) tai TRPS1 siRNA. Solut käsiteltiin sitten PDGF-BB (20 ng /ml) 24 tuntia ja suoritettiin qRT-PCR TRPS1. AsPC-1-solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin jäljitellä, MIR-221 matkivat, antisense-oligonukleotidit ja miR-221 (anti-MIR-221) tai TRPS1 siRNA 3 päivää ja suoritettiin Western blot-analyysi TRPS1, ZEB2, E- kadheriinin ja vimentiinista. AsPC-1-solut transfektoitiin antisense-oligonukleotidit miR-221 (anti-MIR-221). Solut käsiteltiin sitten negatiivisena kontrollina tai miR-221 matkivat ja 3 päivää, ja altistetaan qRT-PCR ZEB2 (C), E-kadheriinin (D) ja vimentiinin (E). AsPC-1-solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin matkivat, MIR-221 matkivat tai antisense-oligonukleotidien miR-221 (anti-MIR-221). Solut käsiteltiin sitten PDGF-BB (20 ng /ml) 24 tuntia ja suoritettiin immunofluoresenssivärjäystä vimentiinista (F) ja E-kadheriinin (G) Kaikki käsittelyt tässä kuviossa tehtiin kolmena kappaleena, ja tulokset ovat näytetään keinot ± SD.

PDGF estoa p27Kip1 by miR-221 edistää solujen Proliferation

p27Kip1 on jäsenenä CIP /Kip perheen sykliiniriippuvainen kinaasi (CDK) estäjät, jotka toimivat säädellä negatiivisesti solusyklin etenemisen G1: stä S-vaiheessa sitoutumalla CDK2 ja sykliini E kompleksit [23]. Voit testata roolin p27Kip1 in AsPC-1 solujen lisääntymistä, vähensimme endogeenisen tason p27Kip1 siRNA (si-p27Kip1) (Fig. 5A, B) ja mitataan solujen kasvua yli 4 päivää (Kuva. 5C). Leviämisen si-p27Kip1-transfektoiduissa soluissa oli merkittävästi lisääntynyt verrattuna kontrollisoluihin, viittaa siihen, että vähentynyt ilmentyminen p27Kip1 voi edistää solujen kasvua AsPC-1-soluissa. Siksi me arveltu, että PDGF-riippuvaisen edistäminen AsPC-1 soluproliferaatiota voidaan välittyvät säätely alaspäin p27Kip1. Kvantitatiivinen analyysi PCNA-värjäys osoitti, että p27Kip1 ilmentyminen inhiboitui PDGF-BB (20 ng /ml) 24 tunnin kuluttua hoidon, ja transfektio si-p27Kip1 määrä kasvoi lisääntyvien solujen samassa määrin kuin PDGF hoitoon (Fig. 5 C, D, E). MiR-221 on aiemmin osoitettu estävän p27Kip1 ja edistää soluproliferaatiota [13], [24], [25]. Siksi me tutkimme, PDGF välittämää leviämisen AsPC-1-soluissa vaikuttavat miR-221 estoa p27Kip1. Transfektion miR-221 matkivat vähensi merkitsevästi ilmaus p27Kip1 (Fig. 5A, B) ja kohonnut solujen lisääntymistä (kuvio. 5D, E), samalla tavalla kuin solujen, jotka on transfektoitu si-p27Kip1 (Fig. 5A, B, D, E ). Kun endogeeninen miR-221 on tyhjentynyt, jonka anti-miR-221, PDGF-BB hoito ei tukahduttaa ilmaus p27Kip1 (Fig. 5A, B). Näin ollen, PDGF-riippuvaisen lisäys solujen lisääntymisen näyttää välittävän estämällä tietyn tavoitteen miR-221 ja down-regulation of p27Kip1.

(A, B): AsPC-1-solut transfektoitiin negatiivisella kontrolli matkivat, MIR-221 matkivat, antisenseoligonukleotideihin miR-221 (anti-MIR-221) tai p27Kip1 siRNA. Solut käsiteltiin sitten PDGF-BB (20 ng /ml) 24 tuntia ja suoritettiin qRT-PCR: llä (A) ja Western blot -analyysi (B) p27Kip1. (C): AsPC-1-solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin tai p27Kip1 siRNA ja alistettiin MTT solulisäkasvumääritykselle (Tulokset on esitetty, kuten absorbanssin lukemista 490 nm: ssä). (C) (D, E): AsPC-1-solut transfektoitiin negatiivisen kontrollin jäljitellä, MIR-221 matkivat, antisense-oligonukleotidit ja miR-221 (anti-MIR-221) tai p27Kip1 siRNA. Solut käsiteltiin sitten PDGF-BB (20 ng /ml) 24 tuntia ja niille suoritettiin värjäämällä FITC-konjugoitua vasta-ainetta vastaan ​​leviämisen markkeri PCNA ja DAPI (E). Kaikkiaan 150 solut laskettiin kohti kunnossa, ja prosenttiosuus PCNA-positiivisten solujen esitetään (D). Kaikki kokeet tässä kuviossa tehtiin kolmena kappaleena, ja tulokset näkyvät keinona ± SD.

Keskustelu

Yhä kirjallisuutta viittaa vahvasti siihen, että PDGF voivat toimia avainasemassa kehittymistä ja etenemistä ihmisen syövissä säätelemällä prosesseja solujen lisääntymistä, apoptoosin, muuttoliike, invaasio, angiogeneesi, ja etäpesäke. On raportoitu, että PDGF signalointi usein vapautettiin ihmisen maligniteettien, ja upregulated ilmentyminen PDGF havaittiin haiman, eturauhasen, keuhkojen, munuaisten, munasarjojen ja aivojen syövät [6]. Viime vuosina, PDGF signalointi on havaittu tärkeitä rooleja hankinnan EMT fenotyyppi syöpäsoluissa [6], [8], [26]. Lisäksi se on tullut yhä selvemmäksi, että EMT on tärkeä rooli etenemistä syöpä ja se on myös vastuussa vastus syöpäsolujen tavanomaisia ​​kemoterapeuttisia aineita. Näin ollen, PDGF signalointi on pidetty tärkeänä ihmisen maligniteettien, ja siten, PDGF signalointi voi edustaa uutta terapeuttisen kohteen, mikä viittaa siihen, että kehitys aineita, jotka kohdistuvat PDGF signalointi on todennäköisesti merkittävä terapeuttinen vaikutus ihmisen syövissä. Nykyinen tutkimus osoitti selvästi, että PDGF-BB hoito edistää solujen vaeltamiseen ja lisääntymistä ja johti hankinta EMT fenotyyppi ylössäätöä mesenkyymisolun markkereita (ZEB1, ZEB2, Snail2, ja vimentiinistä) ja alas-säätely epiteelisolu merkki (E-kadheriinin) in AsPC-1-soluissa. Näin ollen, PDGF signalointi voi estää hankinnan EMT fenotyypin, joka johtaa käänteinen lääkeresistenssin metastaattisen sairauden.

Nykyisessä tutkimuksessa olemme edelleen osoittaneet, että miR-221-geenin transkriptio säätelee PDGF signalointi. PDGF reitti on tunnettu modulaattorin ilmentymisen eri proteiinia koodaavan geenien, mutta miR-221 on ensimmäinen miRNA-geenin havaittiin säänneltävä PDGF. On kiehtova spekuloida, että PDGF voi aktivoida miR-221 transkription kautta rekrytointi mikroftalmiaa liittyvien transkriptiotekijä tai muu E-box sitovia proteiineja. Huomasimme, että miR-221 indusoitiin 2,5-kertaiseksi 4 h hoidon PDGF, ja molemmat ensisijainen selostukset ja välituotteita miR-221 havaittiin jo 2 tunnin kuluttua PDGF hoidon, mikä viittaa siihen, että miR-221 ilmentyminen aktivoituu PDGF signalointi. miR-221 ilmentyy suuresti eri syövän peräisin olevat solut, mukaan lukien haiman karsinooma, eturauhassyöpä, ja kilpirauhasen karsinooma soluihin [14], [15]. Lisäksi miR-221 on osoitettu stimuloivan useita näkökohtia syövän synnyssä, kuten etäpesäkkeiden invaasio, ja itseuudistumisen [27], [28], [29]. Kun miR-221 toiminto estettiin anti-miR-221, huomasimme, että PDGF ei muuttanut tasoa solujen vaeltamiseen ja lisääntymistä ja johtaa hankinnan EMT fenotyypin. Nämä tulokset vahvistavat, että miR-221 on keskeinen rooli PDGF välittämää epiteelin-mesenkymaalitransitioon fenotyyppi, muuttoliike, ja kasvu AsPC-1-soluissa. MiR-221 ja miR-222 jakavat saman siemenen järjestyksessä, mikä osoittaa suurta verran toiminnallisia päällekkäisyyttä näiden kahden mRNA: t.