Krooninen sairaus

tiivistelmä

Yhdistelmä molekyylitason kohdennettuja syövän kuvantaminen ja hoito on syntymässä strategia parantaa syövän diagnosointiin ja minimoida sivuvaikutukset tavanomaisten hoitojen . Täällä syntyy rekombinanttiproteiini, EC1-Gluc-p53C, fuusioimalla EC1 peptidi, keinotekoinen ligandi ErbB2, jossa

Gaussia

lusiferaasi (gluc) ja p53-aktivoiva peptidi, p53C. EC1-Gluc-p53C ilmennettiin ja puhdistettiin

E. coli

BL21.

In vitro

kokeet osoittivat, että EC1-Gluc-p53c oli vakaa luminoivat aktiivisuuden ja valikoivasti kohdennettua ErbB2-yliekspressoivia BT474 solujen bioluminesenssin kuvantamiseen. Lisäksi sisäistetty EC1-Gluc-p53C in BT474 soluissa aiheutti sen käyttötarkoitusta aktivoida p53 ja esti merkittävästi solujen lisääntymistä. Tuumoria kantavissa hiirissä, ErbB2-kohdennettuja bioluminenssin kuvantamiseen ja terapeuttista vaikutusta EC1-Gluc-p53C havaittiin myös erityisesti BT474 kasvaimia, mutta ei MCF7 kasvaimia, jotka eivät yli-ilmennä ErbB2. Näin ollen, esillä oleva tutkimus osoittaa, EC1-Gluc-p53C olevan tehokas teranostiikka- reagenssin kohdistaminen ErbB2 varten bioluminenssin kuvantamiseen ja syövän hoidossa.

Citation: Han XJ, Sun LF, Nishiyama Y, Feng B, Michiue H, Seno M, et al. (2013) teranostiikka- Protein kohdistaminen ErbB2 varten Bioluminescence Imaging and Therapy for Cancer. PLoS ONE 8 (9): e75288. doi: 10,1371 /journal.pone.0075288

Editor: Xiaoyuan Chen, NIH, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 12 elokuu 2013; Julkaistu: 17 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Han et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat apurahan-in-tukea nuorten tutkijoiden (B) opetus-, tiede-, urheilu ja kulttuuri Japanin (nro: 21790202, http: //www.waseda.jp/rps/en/manual/kaken hi_honbun.html) ja Grant-in-tuki tieteellisen tutkimuksen päässä Japanin Society for Promotion of Science (nro: 22,00119, http: //www.jsps.go.jp/english/e-grants/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ErbB2 on jäsen epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) perheen reseptorityrosiinikinaasit, jota kutsutaan myös erbB-perheen. ErB perheen neljä jäsentä, erbb1, ErbB2, ErbB3 ja ErbB4. On olemassa useita endogeenisiä ligandeja ErbB-reseptorien kanssa, lukuun ottamatta ErbB2 [1]. Tyrosiinikinaasiaktiivisuutta of ErbBs voidaan aktivoida endogeenisten ligandien ja homo- tai hetero-dimeroitumisesta ErbB reseptorien, joka osallistuu säätelyyn soluproliferaation ja solujen eloonjäämistä [1-3]. Lisäksi, ErbB2 on liitetty kasvaimen synnyssä ja etenemisessä [4-6]. Kliinisesti yliekspressio ErbB2 liittyy noin 30% rintasyövistä, munasarja- syöpiä [7] ja muiden yhteisten syöpiin kuten keuhko-, maha-, ja suusyöpä [8]. Yli-ilmentyminen liittyy myös etäpesäke, terapeuttinen vastus ja huonon ennusteen syövän [9-11]. Siten ErbB2 saattaa olla lupaava molekyylikohteena syövän kuvantamiseen ja hoitoon käytetään monoklonaalisia vasta-aineita ja peptidin-kohdennusvektorien [12,13]. Vuonna faagiesitte- tutkimus, useita pieniä keinotekoisia syklisiä peptidejä, joilla on erityisiä affiniteetti ErbB2 tunnistettiin. EC1, yksi näistä keinotekoisia peptidejä, sitoo solunulkoisen domeenin ErbB2 elävissä soluissa ja tuore ihmisen rintasyöpänäytteistä [14]. Lisäksi biotiinikonjugoidut EC1 ja rekombinanttiproteiinin EC1-eGFP säilytetään affiniteetti ErbB2 ja hoidettaviksi by ErbB2-yliekspressoivassa syöpäsoluja [14,15]. Äskettäin kaksiarvoisia ja moniarvoisia muotoja EC1-Fc ligandi liposomeihin raportoitu parantaa affiniteettia ErbB2 ja parantaa sisäistämisen [16]. Siten EC1 peptidi voi olla mahdollinen keinotekoinen ligandi kohdistamista ErbB2.

kasvain synnyssä, useita epänormaaleja mutaatiot löytyvät kasvaimen synnyssä. Yksi parhaiten tunnetuista tuumori-synnyssä on

p53

, joka on tärkeä säätelijä apoptoosin ja yleisimmin mutatoitu geeni syöpää [17,18]. Palauttaminen p53 toiminta on osoittautunut tehokkaaksi keinoksi hoidossa syöpäsolujen p53 mutaatioita [19,20]. Aiemmissa tutkimuksissa [21-23], täyspitkä rekombinantti p53 onnistui toimitettu ihmisen pahanlaatuinen gliooma soluja, suun ja virtsarakon syövän solujen fuusioimalla poly-arginiini, solu-tunkeutuva peptidi (CPP). Todettiin, että täyspitkän rekombinantin p53 oli merkittävä inhiboiva vaikutus syöpäsolujen lisääntymistä. Kuitenkin suuri molekyyli- koon ja nopea hajoaminen jonka Ubikitiini-proteasomireitillä vaikuttanut suuresti tehokkuutta proteiinin transduktion ja vaikutus transdusoitujen p53 syöpäsoluihin [24]. C-pää p53 on lysiini-rikas domeeni edellyttää erilaisia ​​translaation jälkeisiä modifikaatioita [25,26]. Peptidi on johdettu C-terminuksessa aktivoi spesifisen DNA-sitoutumisesta p53

in vitro

kautta tuntematon mekanismi [27]. On raportoitu, että p53-johdettu C-terminaalinen peptidi (p53C) indusoi nopeaa apoptoosia rintasyöpäsoluissa kuljettaa endogeenisen p53 mutaatioiden tai yli-ilmentyy villityypin (wt) p53, mutta ei ollut myrkyllinen ei-pahanlaatuisten ihmisen solulinjoja, jotka sisältävät villityypin p53 [28 ]. Lisäksi p53C fuusioituna kanssa CPP estää leviämisen syöpäsolujen aktivoimalla endogeenisen p53, ja lisää merkittävästi elinikä eläinmalleissa terminaalin vatsakalvon carcinomatosis ja virtsarakon syövän

in vivo

[29-31]. Nämä tutkimukset osoittavat aktivoituminen p53-proteiinin p53C peptidi olevan lupaava keino syöpähoitoa.

Bioluminescence kuvantaminen on nousemassa suhteellisen yksinkertainen, kustannustehokas ja erittäin herkkä tapa seurata dynaamisia biologisia prosesseja ennallaan solut ja elävien eläinten [32]. Viime vuosina tekniikka on kehittynyt nopeasti parannuksia lusiferaasin toimittajille ja instrumentoinnin [33]. Yleisin lusiferaaseista varten bioluminenssina kuvantamista

Firefly

lusiferaasi (FLuc),

Renilla

lusiferaasi (RLuc) ja

Gaussia

lusiferaasi (gluc). Jokaisella lusiferaasi on selviä ominaisuuksia soveltamisessa bioluminenssin kuvantaminen. FLuc (62 kDa) katalysoi lusiferiinin, jolloin bioluminesenssin läsnä ollessa O

2, magnesiumia ja ATP: tä [34]. RLuc (36 kDa) ja gluc (19,9 kDa) katalysoivat hapettavaa dekarboksylaatiota koelenteratsiini säteilemään valoa itsenäinen ATP. Kuitenkin RLuc on pienempi kvanttituotto kuin FLuc, ja myös vähemmän entsymaattista tehokkuutta [35,36]. Gluc saadaan noin 200- (

in vivo

) 1000-kertaisesti (

in vitro

) lisää bioluminesenssi nisäkässoluissa kuin FLuc ja RLuc [37]. Siksi sen pienen molekyylikoon (19.9kDa), riippumattomuus ATP ja tuntuviin päästöjen tehdä gluc paljon sopivampi bioluminenssina kuvantamisen

in vitro

ja

in vivo

[38,39].

käsite ”teranostiikka-” oli alullepanija Funkhouser vuonna 2002 yksi hänen arviot [40]. Theranostics on määritelty materiaalia, joka yhdistää yksityiskohtaiset hoidon ja diagnostisen kuvantamisen samanaikaisesti saman annoksen. Tavoitteena teranostiikka- on lahjoittaa materiaaleja, joiden kapasiteetti on seurata käsitellyn kudoksen ja tehoa pitkällä aikavälillä aikana [41]. Teranostiikka- reagenssit on kehitetty nopeasti viime vuosikymmenellä, etenkin sen jälkeen on joitakin uusia optisia antureista ja voimakas biomolekyylien kohdistamiseen ja hoitoa. Esillä olevassa tutkimuksessa, uusi ErbB2 kohdistamisen bioluminesenssi proteiini rakennettiin fuusioimalla EC1 kanssa gluc ja p53C peptidi. Kaksi ihmisen rintasyöpä solulinjat, MCF7 ilman ErbB2: n ilmentymiseen ja BT474, jotka yliekspressoivat ErbB2, käytettiin arvioimaan rooli EC1-Gluc-p53C tietyissä bioluminenssin kuvantamiseen ja syövän hoidossa. Havaitsimme, että EC1-Gluc-p53C paitsi suunnattu ErbB2 varten bioluminesenssi kuvantaminen, mutta myös valikoivasti esti solujen lisääntymistä ja kasvaimen kasvua BT474

in vitro

ja

in vivo

. Esillä olevat tulokset osoittavat, että EC1-Gluc-p53C voi olla lupaava teranostiikka- reagenssi kohdistaminen ErbB2 varten bioluminenssina kuvantaminen ja terapia.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja havaitseminen ErbB2 ilmaisun

MCF7 ja BT474-solulinjat saatiin American Type Culture Collection (ATCC). BT474 solut kantavat missensemutaatio (E285K) in p53-geenin [42], kun taas MCF7-solut yli-ilmentymisen villityypin p53 [28]. BT474-soluja kasvatettiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 100 ug /ml penisilliiniä-streptomysiiniä (P /S). MCF7-soluja viljeltiin DMED väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 100 ug /ml P /S. Medioissa, FBS ja P /S oli Invitrogen. Kaikkia viljelmiä pidettiin kosteutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2.

Ilmaisu ErbB2 MCF7 ja BT474-solujen tutkittiin Western immunoblottauksella. Lyhyesti, MCF7 ja BT474-solujen 35 mm astiat pestiin kerran PBS: llä, ja raaputettiin 1 × SDS-näytepuskuria. Solulysaatit altistettiin 6% SDS-PAGE, ja immunoblotattiin Rabbit anti-ErbB2-vasta-ainetta (1: 1000, Cell Signaling), yön yli 4 ° C: ssa. HRP-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Sigma-Aldrich) käytettiin 1: 2000. Immunoblottausmääritys signaaleja havaittiin Versa Doc 5000 kuvantamisjärjestelmä (Bio-Rad), jossa on parannettu kemiluminesenssidetektiolla (Amersham Biosciences, Pittsburgh, PA).

plasmidikonstruktion

pGLuc plasmidi ostettiin alkaen LUX biotekniikka Ltd (Skotlanti, UK). Gluc-geeni monistettiin plasmidista käyttämällä sense-aluketta (5′-GGATCCGAAACCAACTGAAAACAATGAAG-3 ’) ja antisense-aluketta (5′-GTCGACATCACCACCGGCACCCTTTAT-3′). PCR-tuote ligoitiin pCR2.1 TOPO-vektoriin (Invitrogen) ja vahvistusta, ja kloonattiin uudelleen, että pET52b-vektoriin (Invitrogen) rakentaa gluc-pET52b. Seuraavat sense ja antisense-oligonukleotidit (Hokkaido System Science, Japani) asianmukaiset vastus entsyymin sivustoja EC1 tai p53C peptidi valmistettiin; for EC1; 5’-GGGTGGACTGGCTGGTGCCTGAATCCAGAAGAATCTACTTGGGGATTCTGTACTGGATCTTTCGGTGGAGGTAGTTCAG-3 ’(sense, alleviivaus osoittaa

Sam

I ja

Bam

HI sivustoja) ja 5′-GATCCTGAACTACCTCCACCGAAAGATCCAGTACAGAATCCCCAAGTAGATTCTTCTGGATTCAGGCACCAGCCAGTCCACCC-3′ (antisense, alleviivaus osoittaa

Bam

HI ja

Sam

I sivustoja), ja p53C; 5’TCGACGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAAAAAGGCGC-3 ’(sense, alleviivaus osoittaa

Sal

Ⅰand

Ei

Ⅰsites), ja 5′-GGCCGCGCCTTTTTTATGGCGGGAHHTAGACTGACCCTTTTTGGACTTCAGGTGGCTGGAGTGAGCCCTGCTCCCG-3′ (sense, alleviivaus osoittaa

Ei

ⅰand

Sal

ⅰsites). Oligonukleotidit varten EC1 ja p53C muutettiin fosforylaatio 5 ’. Sense- ja antisense-oligonukleotideja (10 pmol kumpaakin) co-inkuboitiin 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, ja hehkutettu huoneenlämpötilassa, jolloin muodostuu kaksijuosteista DNA: ta. Kaksisäikeinen DNA EC1 tai p53C ligoitiin Gluc-pET52b käsitellään sopivalla vastus entsyymien rakentamiseksi EC1-Gluc-pET52b tai EC1-Gluc-p53C-pET52b. Kohdennettu mutageneesi otettiin käyttöön BamHI EC1-gluc ja EC1-Gluc-p53C käyttämällä QuikChange Kit (Stratagene) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Alukkeet mutageneesiä varten olivat 5’-GTGGAGGTAGTTCAGGAACCAAACCAACTG-3 ’(sense, alleviivaus ilmaisee mutatoitunut nukleotidi), 5′-CAGTTGGTTTGGTTCCTGAACTACCTCCAC-3’ (antisense). Gluc, EC1-gluc ja EC1-Gluc-p53C subkloonattiin sitten pGEX-6P-1 välillä

Bam

HI ja

Eco

RI sivustoja proteiinin puhdistukseen. Sekvenssit rakennettiin plasmidit varmistettiin käyttämällä ABI 3100 sekvensserin.

ekspressio ja puhdistus rekombinanttiproteiinien

ekspressio ja puhdistus rekombinanttiproteiinien suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [21]. Lyhyesti,

E. coli

BL21 (DE3), joka on transformoitu plasmidi Gluc, EC1-Gluc tai EC1-Gluc-p53C kasvatettiin LB-alustassa, joka sisälsi 100 ug /ml ampisilliinia 37 ° C: ssa. Kun OD600 saavutti 0,6, ilmentäminen GST-fuusioproteiineja indusoitiin lisäämällä 0,2 mM isopropyyli- 1-tio-β-D-galaktopyranosidi 25 ° C: ssa yön yli. Fuusioproteiinit puhdistettiin käyttäen kolonnia, glutationi Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare). Pilkkomiseksi GST päässä fuusioproteiineja, puhdistettujen proteiinien käsiteltiin lisäksi PreScission proteaasia (GE Healthcare) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Rekombinanttiproteiinit saatettiin 15% SDS-PAGE, ja vahvistettu Coomassie brilliant blue-värjäys ja immunoblottaus kanin anti

Gaussia

Luciferase seerumin (1: 1000, Nanolight). Proteiinit dialysoitiin lopuksi PBS: lla ja konsentraatiot määritettiin käyttäen proteiinin määrityskittiä (Bio-Rad Laboratories). Alikvootit proteiinia säilytettiin -80 ° C: ssa ennen käyttöä.

valmistus koelenteratsiinin (CTZ) B

substraatti gluc valmistettiin, kuten aiemmin on kuvattu [32]. Lyhyesti, CTZ (Nanolight) liuotettiin happamalla metanolilla (1 tippa väkevää HCI: a (12,4 N) 10 ml: ssa metanolia) pitoisuuteen 5 mg /ml. Alikvootit 100 ui säilytettiin -80 ° C: ssa. Sillä luminesenssikuvantamisessa, alikvootit on CTZ (5 mg /ml) laimennettiin PBS: llä (joka sisälsi 5 mM NaCl, pH 7,2) ja suurempi valoteho ja vakautta.

määritykset luminoivien aktiivisuus ja stabiilisuus rekombinanttiproteiinien

määrittämiseksi luminoiva aktiivisuus puhdistettuja proteiineja, 2 ug kutakin proteiinia siirrettiin 96-kuoppaiselle levylle. Bioluminesenssi mitattiin käyttämällä levyn luminometriä (MicroLumat plus LB 96V, Berthold teknologia) lisäämisen jälkeen 10 ui CTZ (20 uM). Bioluminescent aktiivisuus ilmoitettiin suhteellisina valoyksiköinä (RLU), mitattuna 10 s integrointi- ja lasketaan RLU kohti mikromoolin kutakin proteiinia. Arvot EC1-gluc ja EC1-Gluc-p53C oli normalisoitu gluc.

stabiilisuutta rekombinanttiproteiinien arvioitiin kuten aiemmin on kuvattu [38]. Alikvootteja proteiinia inkuboitiin yhtä suuren tilavuuden kanssa hiiren seerumia (Sigma) 37 ° C: ssa. Kunakin ajankohtana, näytteitä otettiin varten bioluminenssina kuvantamisen ja Western blotting. Analyysissä bioluminenssin vakautta, prosenttiosuus alkuperäisestä määrästä RLU kussakin aikapisteessä piirrettiin kullekin proteiinille. Havaita hajoamista proteiinien kanssa inkuboinnin jälkeen seerumin, näytteitä poistetaan kussakin aikapisteessä tehtiin elektroforeesi 15% akryyliamidi SDS-PAGE-geelissä, ja immunoblotattiin kanin anti-

Gaussia

Luciferase seerumin laimennoksella 1: 1000. HRP-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Rabbit; Sigma-Aldrich) käytettiin 1: 2000.

Bioluminescence kuvantamisen

in vitro

, internalisaatio jonka ErbB2-yli-ilmentävät solut ja WST-1-määritys

bioluminenssina kuvantamisen

in vitro

, MCF7 ja BT474-soluja viljeltiin 35 mm lasipohjaisella ruokia. Parantaa tarttumista MCF7 ja BT474-solut, kaikki lasipohjaisella astiat esipinnoitettiin laminiinin (Roche). MCF7 ja BT474-soluja inkuboitiin 1 pM kutakin proteiinia 24 tuntia. Kolmen pesun jälkeen DMEM: llä, bioluminesenssi havaittiin Olympus Luminoview LV 200 (Bio-luminesenssi mikroskoopilla) välittömästi sen jälkeen, kun on lisätty 1 ug /ml CTZ seerumittomassa DMEM. Kuvat otettiin ja analysoitiin Metamorph ohjelmisto (Molecular Devices).

Tutkia sisäistämisen EC1-fuusioproteiinien in ErbB2 yli-ilmentävät syöpäsolut, BT474 soluja inkuboitiin 1 uM gluc, EC1-gluc tai EC1- gluc-p53C. Estämään tutkimuksessa BT474-soluja käsiteltiin anti-ErbB2-vasta vastaan ​​solunulkoinen ErbB2 (Kana, 1,0 ug /ml, Abcam) 1 h ennen inkubointia EC1-Gluc tai EC1-Gluc-p53C. 24 tunnin kuluttua solut pestiin PBS: llä kolme kertaa ja trypsinisoitiin. Solulysaatti valmistettiin ja alistettiin 15% SDS-PAGE. Sisäistämisen fuusioproteiinia immunoblotattu kanin anti

Gaussia

Luciferase seerumia. β-aktiini käytettiin endogeenista ohjaus.

arvioimiseksi terapeuttista vaikutusta EC1-Gluc-p53C

in vitro

, solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttämällä WST-1-määritystä kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],21]. Sen jälkeen 3,0 x 10

3 MCF7 ja 1,0 x 10

4 BT474-solut ympättiin 96-kuoppaisille, tasapohjaisille levyille, niitä viljeltiin DMEM tai RPMI 1640, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia 24 tunnin ajan. Sitten solut täydennetty 1 uM proteiinia tai PBS: ää (day0) ja viljeltiin edelleen 96 h (Day4). Solujen elinkelpoisuus päivästä 0 päivään 4 mitattiin käyttämällä WST-1 määritys mukaan valmistajan ohjeiden (Roche Applied Science). Voit selvittää annoksesta riippuvaa vaikutusta EC1-Gluc-p53C proliferaatioon BT474-solujen proteiini käytettiin 0,1 ~ 2,0 uM, ja WST-1 määritys suoritettiin päivänä 4.

Reporter Assay p53-ajettu transaktivointi

reportteri määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [22]. Lyhyesti, lusiferaasireportteri- vektori pGL2-basic (Promega), joka sisälsi 2,4 kbp: n fragmentti ihmisen p21

WAF1

promoottori oli lahja tohtoreilta. T. Akiyama (Tokion yliopisto) ja K. Yoshikawa (Osakan yliopisto). BT474-soluja kasvatettiin, kunnes 80% konfluentteja 35 mm halkaisijaltaan maljaa transfektoitiin lusiferaasireportteri vektorin lipofektamiinin 2000 (Invitrogen). 24 tunnin kuluttua soluja inkuboitiin 1 pM Gluc, EC1-Gluc, EC1-Gluc-p53C tai sama määrä PBS: ää 24 tuntia, ja viljeltiin edelleen uudessa väliaineessa 2 tuntia ennen solujen keräämistä. Solulysaatti käytetään mittaamaan lusiferaasiaktiivisuuden luminometrillä ja Luciferase Assay System (Promega). Taustalla lusiferaasiaktiivisuus vähennettiin kaikissa kokeissa. Viisi toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin kullekin tilalle.

valmistaminen kasvainta kantavien hiirten

Nude-hiiret (Balb /c Slc-nu /nu, naispuolinen, 6 ~ 8 viikkoa) hankittiin Charlesriver , Japani. Suunnitelma Eläinkokeiden tarkasteli ja hyväksynyt eettinen komitea eläinkokeiden Okayaman yliopiston alla tunnukset OKU-2010378, OKU-2011400. 17β-estradioli pellettejä (0,72 mg; Innovative Research of America) istutettiin 4 vrk ennen kasvaimen solujen siirto ja pysyi paikoillaan loppuun saakka tutkimuksen. Viljelty MCF7 ja BT474-solut pestiin kahdesti PBS: llä, typsinized, ja otettiin talteen sentrifugoimalla. Solut (5,0 x 10

6 cell) suspendoituna Matrigel (BD Bioscience) istutettiin ihonalaisesti molempiin kylkiin Nukutettujen hiirten vatsaonteloon ruiskuttamalla 5 mg /100 g riumpentobarbitaalilla liuos aseptisesti. Hiiret kasvaimia kehitetty 10 ~ 14 päivää käytettiin

in vivo

kokeita. Aikana kasvainten kehittymiseen, hengityksen ja käyttäytymisen aktiivisuutta tarkkailtiin kahdesti päivittäin arvioida kipua hiirillä. Kokeet välittömästi pysäyttää, jos hiiret näyttivät merkittävän oire kipua. Kaikki hiiret tapettiin intraperitoneaalisesti injektiona 15 mg /100 g pentobarbitaalia liuosta jälkeen kokeissa.

ErbB2: n ilmentymiseen MCF7 ja BT474-ksenografteissa vahvistettiin immunofluoresenssilla (IF) värjäys. Parafinoidut siivuja kasvainten valmistettiin paksuus on 5 um. Ensimmäinen, histologisia havaintoja Ksenosiirretyn kasvaimia tehtiin käyttämällä H Invitrogen, Molecular probes). Ydin oli vasta-värjättiin 0,1 ug /ml Hoechst 33248 (Sigma) 5 min ajan. Fluoresenssisignaalien havaittiin käyttäen konfokaali laser mikroskoopilla (FV300, Olympus).

tuumoripaikkaan säilyttämistä EC1-Gluc-p53C in tuumoriksenografteja

Seuraavaksi 30 ui EC1-Gluc-p53C proteiini (0,5 ug /ui) injektoitiin kasvaimen MCF7 ja BT474 nude-hiirissä. 1, 3, 6, 12 ja 24 tuntia injektion jälkeen, hiiret tapettiin. Kasvaimet leikattiin irti ja välittömästi kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä. Parafinoidut siivuja MCF7 ja BT474 kasvaimia valmistettiin 10 um. Immunofluoresenssivärjäyksen suoritettiin analysoida jakelun EC1-Gluc-p53C kasvaimissa. Immunofluoresenssitutkimukset värjäys suoritettiin ohjeiden mukaisesti, että mukana kanin anti

Gaussia

Luciferase seerumia. Sekundäärinen vasta-aine oli FITC-konjugoitua kanin IgG: tä (1: 100, Invitrogen, Molecular probes). Fluoresenssisignaalien havaittiin käyttäen konfokaali laser mikroskoopilla (FluoView, Olympus, Japani).

Bioluminescence kuvantamisen

in vivo

bioluminenssina kuvantamisen

in vivo

, 30 ui EC1-gluc-p53C proteiini (0,5 ug /ul) kasvaimensisäisesti ruiskutetaan MCF7 ja BT474 ksenograftien perustettu nude-hiirissä. 6, 8, 12 ja 24 tuntia injektion jälkeen, hiiret kuvattiin injektiona häntälaskimon kautta 100 ui CTZ liuosta (3 mg /kg) anestesiassa käyttäen jäähdytettyä CCD-kameraa (IVIS Lumina-II, Etu Life Sciences ) kuten aiemmin on kuvattu [39]. Bioluminescent intensiteetti valitun alueen yli kasvain kirjattiin suurin fotonien s

-1 cm

-2 steradiaani

-1.

vaikutus EC1-Gluc-p53C syöpäkasvainten kasvuun

MCF7 ja BT474 ksenografteissa molemmin paljaiden hiirien kylkiin annettiin kasvaa, kunnes keskimääräinen tilavuus ~ 100mm

3 ± 10mm

3 saatiin ennen proteiinia injektiota. Sitten 30 ui puhdistettua rekombinanttiproteiinia (0,5 ug /ul) tai 30 ui PBS: ää intratumoraalisesti injektoitiin MCF7 ja BT474 ksenografteissa jokapäiväistä 5 päivää. Hiiriä tarkkailtiin päivittäin, ja niiden tuumorin tilavuus mitattiin käyttämällä digitaalista työntömitoilla kaksi kertaa viikossa. Koko hoitokuurin in kasvaintaakkaa kokeessa ilman hiirtä kuoli. Kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla: tuumorin tilavuus = pituus x W

2 x 0,5 (L on pisin halkaisija, W on lyhin halkaisija).

Tilastollinen

Data on esitetty keskiarvona ± SD tai keskiarvo ± SEM Tiedot analysoitiin käyttämällä joko t-testiä verrata kahta ehtoja tai ANOVA seurasi suunnitellut vertailut useita ehtoja, ja P 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Puhdistus ja biokemiallisia karakterisointi rekombinanttiproteiineja

kolmen GST-fuusioproteiini konstruktit ilmaistaan ​​

E. coli

BL21 ja puhdistettiin käyttäen pylvästä, glutationi Sepharose 4 Fast Flow. Puhdistuksen jälkeen GST tag pilkottiin PreScission proteaasin sato Gluc, EC1-gluc ja EC1-Gluc-p53C kuten on esitetty kuviossa 1a. Gluc ja EC1-Gluc käytettiin ohjaus proteiineja. Coomassie brilliant blue-värjäys paljasti puhtauden kaikki kolme proteiinia on 80%. Molekyyli- koot Gluc, EC1-gluc ja EC1-Gluc-p53C oli noin 20, 23, ja 25KDa, vastaavasti (kuvio 1 b). Western-blottauksessa, tärkein bändejä Gluc, EC1-gluc ja EC1-gluc-p53C ja muita pieniä vyöhykettä, jotka vastasivat GST-fuusioproteiinien havaittiin (kuvio 1c). Lisäksi menetys bioluminoivan aktiivisuuden aiheutettiin fuusio EC1 ja p53C peptidin kanssa gluc. Noin 30% ja 50% vähennys havaittiin bioluminescent aktiivisuuden EC1-gluc ja EC1-Gluc-p53C verrattuna Gluc, vastaavasti (kuvio 1 d).

a) Schema puhdistuksesta EC1-gluc -p53C GST ilme järjestelmän. GST tag pilkottiin PreScission proteaasin puhdistuksen jälkeen. b) Coomassie brilliant blue-värjäys puhdistettiin proteiinien jälkeen 15% SDS-PAGE. Kaista 1 ~ 4 ovat merkki, gluc, EC1-gluc ja EC1-Gluc-p53C, vastaavasti. c) puhdistettuja proteiineja sen jälkeen, kun 15% SDS-PAGE havaittiin käyttämällä VVestern-blottauksella kanin anti-

Gaussia

Luciferase seerumia. Kaistat 1 ~ 3 ovat gluc, EC1-gluc ja EC1-Gluc-p53C, vastaavasti. d) Bioluminescent toimintaa puhdistettuja proteiineja. Jokainen proteiini (2 ug) arvioitiin käyttämällä lautaselle luminometriä. Bioluminescent arvot EC1-gluc ja EC1-Gluc-p53C normalisoitiin kanssa gluc. n = 6 kussakin, * p 0,01.

vakaus Gluc, EC1-gluc ja EC1-Gluc-p53C arvioitiin inkuboimalla hiiren seerumissa 37 ° C: ssa. Vakautta gluc paransi fuusio EC1 ja p53C. Puoliintumisaika luminoivien aktiivisuuden gluc määritettiin 18,6 tuntia, kun taas EC1-gluc ja EC1-Gluc-p53C oli 189,5 ja 216 tunnin, vastaavasti (kuvio 2a). Tämän seurauksena, bioluminescent aktiivisuus EC1-Gluc-p53C saavutti 92%, kun gluc 3 h inkuboinnin jälkeen seerumissa (kuvio 2b). Lisäksi, hajoaminen kolmen proteiinin seerumin tutkittiin myös Western-blottauksella käyttäen anti-gluc-vasta-ainetta. Kaikki kolme proteiinia, olivat stabiileja hajoamista vastaan, kun inkuboitiin seerumissa 37 ° C: ssa (kuvio 2c). Nämä tulokset viittaavat siihen, bioluminescent aktiivisuutta ja stabiilisuutta EC1-Gluc-p53C olla soveltuvat sekä

in vitro

ja

in vivo

.

Proteiinit inkuboitiin saman tilavuuden kanssa hiiren seerumin 37 ° C: ssa otettiin ilmoitettuina ajankohtina pisteitä bioluminesoiviin aktiivisuuden arviointi (a) ja Western blotting (c). b) bioluminesoiviin aktiivisuus EC1-gluc-p53C ja Gluc tutkittiin 3 h inkubaation jälkeen seerumissa. Bioluminescent arvot EC1-Gluc-p53C normalisoitiin kanssa gluc. n = 6 kussakin.

EC1-Gluc-p53C kohdistetaan tiettyihin ErbB2 varten bioluminenssina kuvantamisen

in vitro

Kaksi ihmisen rintasyöpä- solulinjojen, MCF7 ja BT474, olivat avulla arvioidaan ErbB2 kohdistetun kuvantamisen

in vitro

. Yli-ilmentyminen ErbB2 BT474 vahvistettiin Western-blottauksella, kun taas ErbB2: n ilmentymiseen MCF7-soluissa ei ollut havaittavissa (kuvio 3a). Havaitsemiseksi ErbB2-kohdennettuja bioluminesenssi, MCF7 ja BT474-soluja käsiteltiin 1 uM rekombinanttiproteiineja. Vahva signaali havaittiin ErbB2-yliekspressoivia BT474 soluja inkuboitiin EC1-gluc ja EC1-Gluc-p53C (kuva 3b, kuva S1). Sen sijaan ei ole merkittävää bioluminesenssi havaittu MCF7-soluja inkuboitiin kunkin proteiinin (kuvio 3b, kuva S1). Lisäksi sisäistäminen rekombinanttiproteiineja havaittiin myös BT474 soluja inkuboitiin EC1-gluc ja EC1-Gluc-p53C, ja sisäistämisen EC1-fuusioproteiinien oli lähinnä havaita, kun solunulkoinen ErbB2 esti anti- ErbB2-vasta-aineen (kuvio 3c). Nämä tulokset viittaavat siihen, että EC1-gluc ja EC1-Gluc-p53C säilyttää affiniteetti ErbB2, ja sisäistetään in ErbB2-yli-ilmentävät solut

in vitro

.

a) ilmentäminen ErbB2 MCF7 ja BT474 solut. Solulysaattia kahden solulinjojen altistettiin 6% SDS-PAGE: lla ja immunoblotattiin anti-ErbB2-vasta-aine. β-aktiini käytettiin endogeenista ohjaus. b) Bioluminesenssi kuvantamisen

vitro

. Soluja inkuboitiin 1 uM: n ja Gluc-p53C pestiin elatusaineessa ilman seerumia. Kuvat otettiin, jossa bioluminescence mikroskoopilla välittömästi lisäyksen jälkeen 1 ug /ml CTZ. I ja III, bioluminenssi kuvia; II ja IV, vaihe-kontrastin kuvia. Bar = 100 pm. c) internalisaatio EC1-sulatettu proteiineja ErbB2-yliekspressoivia BT474 soluissa. Soluja inkuboitiin 1 uM proteiinia 24 tuntia, kaista 1: gluc; kaista 2: EY-Gluc-p53C; kaista 3: EY-gluc; kaista 4: anti-ErbB2 + EC1-Gluc-p53C; kaista 5: anti-ErbB2 + EC-gluc. Sisäistämisen fuusioproteiinia immunoblotattu kanin anti

Gaussia

Luciferase seerumia. β-aktiini käytettiin endogeenista ohjaus.

EC1-Gluc-p53C estää selektiivisesti proliferaatiota ErbB2-yli-ilmentävät BT474 Cells

WST-1-määritystä käytettiin arvioimaan vaikutusta rekombinanttiproteiinit proliferaatioon MCF7 ja BT474 soluja. EC1-Gluc-p53C merkittävästi inhiboivat BT474 mutta ei MCF7-soluja päivänä 3 ja 4 (kuvio 4a). Ohjaus proteiinit, gluc ja EC1-Gluc, ei ollut merkittävää vaikutusta proliferaatioon joko solulinja (kuvio 4a). Lisäksi vaikutus EC1-Gluc-p53C proliferaatioon BT474 oli annoksesta riippuvainen (kuvio 4b). Lisäksi, tulokset lusiferaasireportterigeenin määritys p53 perustuva transaktivointi osoitti, että p53C peptidi oli aktiivinen ja uudelleen endogeenisen p53 kun sisäistetään BT474-soluja (kuvio 4c). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että inhiboiva vaikutus EC1-Gluc-p53C on syöpäsolujen lisääntymistä on ErbB2-kohdistaminen omaisuutta ja johtuu tehoa p53C peptidin fuusioproteiinin.

a) Aika -riippuvaisella muutokset leviämisen MCF7 (yläpaneeli) ja BT474 (alapaneeli) soluja. Solut lisätty 1 uM kutakin rekombinanttiproteiinin tai PBS (kontrolli) päivänä 0 ja viljeltiin edelleen 96 tuntia (4. päivä). Solujen lisääntyminen arvioi WST-1 määritys 24 tunnin välein. ♦, PBS: ää (kontrolli); ■, gluc; ▲, EC1-gluc; ×, EC1-Gluc-p53C. n = 6 kussakin. * P 0,05 ** p 0,01 kontrolliryhmään verrattuna. b) Annos-riippuvainen vaikutus EC1-Gluc-p53C proliferaatioon BT474-solujen. BT474-soluja käsiteltiin EC1-Gluc-p53C eri pitoisuuksina tai PBS: ää (Cont.), Ja WST-1-määritys suoritettiin päivänä 4. n = 6 kussakin. *, P 0,05; **, P 0,01. c) p53-odotuksiin transkriptionaalisen aktiivisuuden kanssa p21

WAF1

luciferace reportterianalyysi. BT474 transfektoitu lusiferaasireportteri vektori inkuboitiin 1 pM gluc, EC1-Gluc, EC1-Gluc-p53C tai PBS 24 tuntia. p21

WAF1

lusiferaasireportterista toimintaa soluissa mitattiin lusiferaasimäärityssysteamiä. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM.

n

= 5 kussakin ryhmässä; ** P 0.01.

EC1-Gluc-p53C suunnattu ErbB2 varten bioluminenssina kuvantamisen

in vivo

Kokeissa

in vivo

, valmistimme hiiret jossa MCF7 ja BT474 ksenosiirrettyjä kasvaimia molemmissa kyljissä. Histologinen havainnot kasvainten tehtiin käyttämällä H & E-värjäystä (kuvio S2a). Korkea ErbB2: n ilmentymiseen BT474 kasvaimissa on vahvistanut myös IF värjäytymistä (kuvio S2b). Arvioidaan ErbB2 kohdistaminen ominaisuus EC1-Gluc-p53C

in vivo

, säilyttämistä EC1-Gluc-p53C kasvaimissa jälkeen kasvaimensisäistä injektion tutkittiin IF värjäys anti-gluc vasta-aine. EC1-Gluc-p53C oli havaittavissa BT474 kasvaimia jopa 24 tuntia injektion jälkeen. Sen sijaan, EC1-Gluc-p53C oli vain heikosti havaittu MCF7 kasvaimia jopa 6 h injektion jälkeen (kuvio 5). Tulos viittaa siihen, retentioaika EC1-Gluc-p53C on paljon pidempi BT474 kuin MCF7 kasvaimia. Perustuen retentioaika EC1-Gluc-p53C kasvaimissa, bioluminesoiviin kuvat hankittiin 6, 8, 12 ja 24 tunnin kuluttua proteiinin injektion. Signaali havaittiin BT474 kasvaimia jopa 24 tuntia samalla, kun se oli havaintorajan alapuolella MCF7 tuumorikohdissa 8 h kuluttua proteiinin injektio (kuvio 6). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ErbB2 kohdistaminen ominaisuus EC1-Gluc-p53C helpottaa sen kertyminen BT474 kasvaimia ja bioluminesenssi kuvantamisen

in vivo

.

Tällä ilmoitettuina ajankohtina jälkeen kasvaimensisäistä injektion EC1-gluc -p53C, hiiret tapettiin ja kasvaimet leikattiin irti. Kasvaimet sitten välittömästi kiinnitettiin 4% PFA. Parafinoidut siivuja kasvaimia valmistettiin, jonka paksuus on vähintään 10 um.