Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Syöpä kantasolut (CSC) uskotaan olevan vastuussa kasvaimen huolto- ja heterogeenisuus. Bona fide CSC puhdistettu kasvainbiopsioissa on rajoitettu tarjonta ja tämä vaikeuttaa tutkimusta CSC biologian. Lisäksi puhdistettu varsi kaltaiset CSC osapopulaatioiden nykyisistä tuumorilinjoja ovat epävakaita kulttuuriin. Löytää keino voittaa nämä tekniset haasteet olisi hyödyllinen tavoite. Ensimmäisessä askel tätä kohti, tutkimme onko kemikaali koetin, joka edistää selviytymistä hiiren alkion kantasolujen ilman lisättyä ulkoisista tekijöistä voi muuttaa toiminnallisia ominaisuuksia säilynyt kasvainlinjojen muoti sopusoinnussa CSC fenotyyppiin.

Menetelmät /Keskeiset havainnot

seitsemän kasvain linjat NCI60 paksusuolen aluslaatta altistettiin SC-1 (pluripotin), kaksi kinaasi ja GTPaasina estäjä, joka edistää itseuudistumiseen, ja sitten tutkitaan kasvainten muodostumiseen rajalaimennusolosuhteissa ja klonogeeniset toiminta pehmeässä agarissa. Tilastollisesti merkittävä kasvu kasvainmuodostusta seuraavissa SC-1 hoito havaittiin (p 0,04). Kloonaustehokkuudet ja ilmaisun oletettujen CSC pinta-antigeenien (CD133 ja CD44) on myös lisääntynyt. SC-1 hoito johti alalla käytössään muodostumista joissakin paksusuolen tuumorilinjoja. Lopuksi, SC-1 inhiboivat in vitro kinaasiaktiivisuus RSK2, ja toinen RSK2 estäjä lisäsi pesäkkeiden muodostumisen syytetään rooli tämän kinaasin herättämisessä CSC fenotyypin.

Johtopäätökset /merkitys

Nämä havainnot vahvistaa proof of concept tutkimuksessa altistuminen säilynyt kasvainlinjojen pieni molekyyli voi tarjota taipuisa in vitro mallin ymmärtämisessä CSC biologian.

Citation: Mertins SD, Scudiero DA, Hollingshead MG, Divelbiss RD Jr, Alley MC, Monks A, et al. (2013) pienimolekyylinen (Pluripotin) kuin työkalu Opiskelu Cancer Stem Cell Biology: Proof of Concept. PLoS ONE 8 (2): e57099. doi: 10,1371 /journal.pone.0057099

Editor: Libing Song, Sun Yat-sen University Cancer Center, Kiina

vastaanotettu: 30 tammikuu 2012; Hyväksytty: 22 tammikuu 2013; Julkaistu: 21 helmikuu 2013

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Division syövän diagnoosi ja hoito sekä Center for Cancer Research National Cancer Institute osarahoituksella NCI Sopimus HHSN261200800001E. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Dominic A. Scudiero, Anne Monks, ja Karen M. Hite sidoksissa SAIC -Frederick, joka on NCI-Frederick hallituksen urakoitsija. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen, tai markkinoille tuotteita julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Syöpä kantasolut (CSC) ovat alue paljon kiinnostusta syövän biologien ja ajateltu olevan vastuussa säilyttämiseksi pitkällä aikavälillä ja laajentamiseen sekä kiinteiden ja hematologiset kasvaimet [1], [2]. Alle syöpä kantasolujen hypoteesi, CSC voi selittää havaitun kasvain heterogeenisuus, joka muistuttaa normaalia urut kehittäminen ja kestävyys syövän standardin hoitojen [3]. Signalointipolkujen kuten moduloidaan Wnt, Hedgehog, ja Notch ovat sekaantuneet biokemiallinen luonnehdinta CSC mutta eivät johdonmukaisesti esiintyy kaikissa kasvaintyypeissä. Lisäksi roolit kasvaimen microenvironment säätelyssä CSC edelleen alueen intensiivisen tutkimuksen [4].

Useat toiminnalliset analyysit ymmärretään edustamaan itseuudistumisen, lisääntymistä ja erilaistumista kapasiteetin odotetaan CSC. Ensinnäkin rajoittavan laimennuksen tuumorigeenisuus määritykset ovat standardin avulla voidaan tunnistaa CSC. Tämä in vivo malli hyödyntää immuunivajaisiin hiirillä, jotka inokuloitiin kasvaimen solualipopulaatioissa, jotka on valittu ekspressiota normaalin kudoksen kantasolujen pinta-antigeenit [5] – [7]. Käyttämällä samaa mallia, toissijainen ksenografteissa voidaan määrittää ja tarkasteltava uudelleen lähettämiseen alkuperäisestä kasvaimesta heterogeenisyys, mikä edelleen vahvistaa läsnäoloa CSC. Toinen määrityksessä käytetään alalla muodostelma valita CSC ilmentävien kantasolujen merkkiaineita ja tuumorigeenisyystesti [8]. Kolmanneksi, klonogeenisten aktiivisuus pehmeässä agarissa on käytetty määrittelemään CSC [9]. Muut määritykset saatavilla luonteenomaiset CSC fenotyyppien keskittyä toimenpiteisiin lääkeresistenssin, liikkumattomuus, ja kestävyys apoptoosin [10].

Joissakin kasvaintyypit CSC odotetaan olevan harvinainen alaryhmässä ja keinot säilyttää ne kulttuuri ei tällä hetkellä ole. Tilannetta hankaloittaa raportoineet Gupta et al. osoittaa, että kun rikastuttaa ja viljelemällä CSC kaltainen alaryhmän rintasyöpä linja, fenotyyppisen tasapaino sisältävä sekoitettu osapopulaatioiden palautuu [11]. Ilmaisi genotyyppejä, voidaan kuitenkin käyttää ennustamaan operatiivisen signaalitransduktioreaktioteihin että perustaa CSC fenotyyppi. Modulaatio kyseiset asianomaiset reittejä kemiallisella antureista tarjoaa keinon ymmärtää paremmin CSC biologia. Pohjautuvien, tutkimme onko pienimolekyylinen, SC-1 (pluripotin), voisi muuttaa ja /tai aiheuttaa ominaisuuksiltaan CSC fenotyyppi seitsemän paksusuolen kasvain riviä NCI60 Kasvain Line Panel.

SC-1 löydettiin solupohjaisessa suurikapasiteettisten näyttö, joka arvioi, onko pieni molekyyli voisi säilyttää itseuudistumisen normaalin hiiren alkion kantasoluja ilman eksogeenisesti lisättyä tekijät, kuten leukemiaa estävä tekijä tai syöttösoluja [12]. Kemiallinen rakenne perustuu 3,4-dihydropyrimido (4,5-d) pyrimidiiniä telineen ja sen optimoitu rakenteen /aktiivisuuden tutkimuksissa. Affiniteettikromatografia vahvistettu, että molekyyli tavoitteet SC-1 sisältää RasGAP ja ERK1 /2, ja niiden estäminen on arveltu edistää itseuudistumiseen ja estävät erilaistumista.

Tässä raportissa tarjoamme proof of concept tutkimuksen määrittääkseen onko SC-1 käsitellään irtotavarana solupopulaatioiden on NCI60 paksusuolen tuumorilinjoja hallussaan ominaisuuksiltaan CSC fenotyyppi. Meidän havainnot muodostavat perustan jatkaa lisätutkimuksia, jotka voisivat vahvistaa läsnäoloa CSC on taipuisa in vitro mallissa, edistää ymmärrystä biokemiallisia reittejä että taustalla CSC fenotyyppejä, ja onko SC-1 on hyödyllinen työkalu ylläpitää Tuumorinäytteiden johdettuja CSC kulttuuriin.

tulokset

SC-1 Lisääntynyt kasvaimen muodostumisen

esikäsitellä suurin populaatiot seitsemästä paksusuolen kasvain riviä NCI60 paneelin 0,1 uM SC-1 ( for kemiallinen rakenne kuva S1), pieni molekyyli aiemmin osoitettu edistävän itseuudistumisen hiiren alkion kantasoluja [12]. Viiden päivän hoidon rajoittavan laimennuksen tuumorigeenisuus tutkimukset suoritettiin käyttäen ihonalaista injektiota ilman proteiinia tukea (taulukko 1). Arvioimalla kaikki tuumorilinjoja yhdestä osapaneelin on NCI60 auttaa määrittämään, onko vaikutus johtuu SC-1 on universaali tai kasvain linja-riippuvainen. Viisi seitsemästä paksusuolen kasvainlinjojen näytteillä korkeamman kasvain ottaa hinnan SC-1 käsitellään linjat verrattuna valvontaa 10000 soluympissä, COLO 205 kasvainlinjaan osoittaa suurin ero ottaa rate (ohjaus: 1 5 vs. SC-1 käsitelty: 4 5) ja sen jälkeen HCT-116 ja HT29 tuumorilinjoja. On myös tärkeää huomata, että niin vähän kuin 100-solut, kasvaimia muodostettu 2 5 hiiriä, joihin injektoitiin SC-1: llä käsitellyissä HT29 verrattuna 0 5 valvontaa käsiteltyjen solujen. Tilastollisesti merkitsevä kasvaimen muodostuminen 1000 soluympissä varten HT29 käsiteltyjä soluja samoin (taulukko 1). Sen sijaan ei havaittu kasvaimia kehitetty HCT-15 kasvainlinjaan missään laimennus (taulukko 1), vaikka kasvaimia muodostunut 16 päivän ajan rutiinia rokotus koko (1,5 x 10

6 solua per inokulaatti).

Koska yhdistämällä kasvain ottaa nopeus (at 10000 soluympissä) muistuttaisikin kliinisessä tutkimuksessa potilaiden kasvain heterogeenisuus, tilastollinen analyysi suoritettiin vaikutuksen arvioimiseksi SC-1 on kasvain ottaa nopeus paksusuolen kasvainlinjaan aluslaatta. Merkittävä ero havaittiin (n = 7, Cochran Mantel-Haenzel yhteinen riskisuhde, ohjaus kasvain ottaa: 10 35 hiirillä; SC-1 käsitellään ottaa nopeudella 19 35 hiirillä, p = 0,04). Lisäksi nämä samat tulokset piirretään graafisessa muodossa kuvassa S2. Taajuus kasvain aloittamista solujen laskettiin myös ja esitetään kaikille tuumorilinjoja ja kaikkein SC-1 herkkiä soluja viivoilla kuviossa S3.

Tiedot osoittavat lisääntynyt kasvain ottaa korko täydennettiin nopeutettua ulkonäkö mitattavia kasvaimia että SC-1 käsitellään paksusuolen tuumorilinjoja kun lasketaan piirtämällä keskimääräinen kasvaimen paino (jopa 2000 mg) vs. aika kussakin testiryhmässä (valikoima r asennettu riviä: 0,73-0,90). Ekstrapolointia käytettiin määrittämään päivän jossa 1000 mg kasvaimen voidaan olettaa, (taulukko 2). Tulokset ja myöhemmin laskelmien todettu, että 1000 mg kasvaimia, keskimäärin muodostettu esikäsittelyn jälkeen SC-1 alle puolet ajasta valvonnan hoidetun ryhmän (n = 5, pariksi Studentin t-testiä, keskiarvo ± sem, SC-1 käsitelty : päivä 83 ± 19 vs. kontrolli hoidettua päivä 211 ± 79). Vaikka tämä ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p = 0,16), on huomattava, että nämä 5 tuumorilinjoja, suuntaus oli sama: aikaisemmin 1000 mg kasvaimen ulkonäön SC-1 käsitellyt solut kontrolleja.

ei ole todennäköistä, että havaittu SC-1 indusoi kiihtyi

in vivo

kasvaimen kasvu voisi selittää lisääntynyt kasvain ottaa nopeudella SC-1 kasvaimen linjat koska tilastollisesti merkitsevä lasku solujen numero jälkeen

in vitro

SC-1 hoito havaittiin. (N = 6, pariksi Studentin t-testi, p = 0,02, taulukko S1). Lisäksi keskimääräinen GI

50 paksusuolen solulinjoista, kun arvioidaan NCI Syövän Screen (2 päivää altistus), oli 0,091 ± 0,07 uM (keskiarvo ± sem, n = 7, GI

50 (pitoisuus, joka yhdiste estää 50% valvonnan solujen kasvun)), mikä viittaa siihen, yhtenäinen

in vitro

kasvun esto keskuudessa tuumorilinjoja. Lopuksi edustaja SC-1 herkässä kasvaimessa line (HCT-116), ei ollut eroa jakauman SC-1: llä käsiteltyjen solujen populaation koko solusyklin verrattuna valvoa käsiteltyjen solujen (kuvio S4).

tutkia puute kasvaimia vaikutus SC-1: llä käsitellyissä HCT-15-solut, rajalaimennusmenetelmällä tuumorigeenisyyteen määritys toistettiin lisäämällä Matrigel on injektoitu soluja (10, 100, 1000, ja 10000 solua per injektio). Proteiini tukea, kuten Matrigel voi antaa ankkurointi, substraatti angiogeneesiä ja kasvutekijöitä. Tässä tapauksessa, kuten nähdään aiemmin [7], niin vähän kuin 10 solua tarvittiin muodostamaan kasvaimia (kestää nopeudella 2 5 hiiren), kun HCT-15 ohjaus solut ko-ruiskutetaan matrigeeliin. SC-1: llä käsitellyissä soluissa samanaikaisesti injektoida matrigeeliä, 5 5 hiirillä oli kasvaimen muodostumisen yli 99 päivän havaintojakson ajan klo 10 soluympissä (kuvio 1). Tällä jäljellä solun siirrosten (100, 1000, ja 10000 solua per injektion matrigeelin), kasvaimet muodostui kaikille hiirille, riippumatta kokeellista hoitoa.

Rajoittamalla laimennus tuumorigeenisyystesti koe suoritettiin samanaikaisesti injektion Matrigel. A. Ohjaus käsitelty HCT-15 kasvainlinjaan. B. SC-1 käsitellään HCT-15 kasvainlinjaan. Kasvaimen paino kullekin hiirelle on kuvattu. Kasvainmuodostusta lisääntyi SC-1 käsitellyt solut, kun 10 solua /hiiri injektoitiin (SC-1 käsitelty: 5 5 kasvainten muodostettu, ohjaus käsitelty: 2 5 kasvainten muodostettu). Suuremmilla solu siirrosten, kaikki hiiret muodostivat kasvaimia riippumaton hoito. Jokainen rivi molemmissa kaavioita edustaa kasvua yksi kasvain hiirtä kohti (A. A-E, B. F-J).

Kloonaus tehostettiin jälkeen SC-1 hoito Colon tuumorilinjoja

Koska tehostettu klonogeeniset kapasiteetti pehmeässä agarissa on yhdistetty CSC peräisin potilaasta CNS ja eturauhasen kasvaimia [9], [13], se oli kiinnostavaa arvioida, SC-1 käsitellään paksusuolen kasvainten linjat vahinkoa samankaltaisesti. 3 tuumorilinjoja suurimpien SC-1 kasvainmuodostusta aiheuttava (COLO 205, HCT-116, ja HT29) oli merkitsevä kloonaustehokkuudet (kuvio 2A, n = 3, pariksi Studentin t-testiä, p = 0,001 (COLO 205, HCT-116) ja p = 0,01 (HT29)) samoin kuin HCC-2998 ja KM12 tuumorilinjoja. On huomattava, että kaikki tuumorilinjoja oli kasvanut kloonaustehokkuuden seuraavat SC-1 käsittely, jos määritys suoritetaan käyttäen Matrigel sijasta pehmeän agarin (tuloksia ei ole esitetty). Näin ollen, SC-1 on havaittu parantavan pesäkemuodostuksen

in vitro

.

paksusuolen kasvainten linjat käsiteltiin viiden päivän ajan 0,1 uM SC-1, kerättiin ja analysoitiin sitten niiden kyky lomake pesäkkeitä pehmeässä agarissa, muuttaa ilmaus otaksuttu CSC pinnan markkereita, ja muodostaa palloja. A. kloonaustehokkuuteen paksusuolen kasvainlinjojen määritettiin hoidon jälkeen SC-1. Vuonna 5/7 tuumorilinjoja, SC-1 käsitellyt solut oli tilastollisesti merkitsevä kumulatiivinen pesäkkeitä muodostava yksikkö (CFU) massa verrattuna kontrolli käsitellyissä soluissa (*** p 0,001, ** p 0,1 * p 0,05, n = 3). Yhdessä tapauksessa (# p 0,05), SC-1 vähensi kloonaustehokkuuteen. B. CD133 positiivinen subpopulaatio nostettiin 2,5-kertaisesti SC-1 käsitellään HT29 paksunsuolen kasvain linjan (p = 0,03, n = 3). CD44 + CD24- subpopulaatio nostettiin jälkeen SC-1 kohtelun HCT-116 paksusuolen kasvain linjan (* p 0,05, n = 3). CD44 + subpopulaatio korotettiin merkittävästi seuraavien SC-1 hoitoja (* p 0,05, n = 3) SW-620 koolonin kasvainlinjaan. C. Kolme kasvaimen linjat (COLO 205, HCT-116, HT-29) on muodostettu tarttumattomat aloilla, kun läsnä on 0,1 uM SC-1 viljeltiin standardi väliaineessa, joka sisälsi 5% FBS: ää. Nämä havainnot olivat myös ilmeisiä 5. päivänä kulttuuriin. Kaikki kuvat valmistettiin 400 x suurennus.

ilmentäminen Oletetut CSC Markers korotettiin Colon tuumorilinjoja seuraavat SC-1 hoito

monoklonaalisia vasta-aineita määrittämällä pinta-antigeeneja juuri eristettyjä kasvainnäytteestä on käytetty välineinä eristää CSC. Esimerkiksi O’Brien et al. [6] ja Ricci-Vitiani et ai. [14] puhdistettu CSC alkaen Kolorektaalituumorien kautta glykosyloituneen CD133 epitoopin. Muut CSC markkereita ovat CD44 (joko läsnä ollessa tai ilman CD24), CD326, ja CD166 [5], [9], [15] – [18]. Näin ollen ilmentymistä näiden markkereiden tutkittiin seuraavien viiden päivän SC-1 hoidossa.

tilastollisesti merkitsevä lisääntyminen ilmentävien solujen CD133 glykosyloidun epitoopin löytynyt HT29 kasvaimen linja seuraavasti SC-1 hoidon (kuvio 2B, n = 3, pariksi kaksi tailed t-testiä, p = 0,003, keskiarvo ± sem, kontrollikäsitellyt: 11,6 ± 3,7% positiivisia, SC-1 käsitelty: 27,6 ± 3,6% positiivinen). SW-620 kasvainlinjaan, CD44 alaryhmästä nostettiin hoidon jälkeen SC-1 (kuvio 2B, n = 3, pariksi Studentin t-testiä, p = 0,03, keskiarvo ± sem, kontrollikäsitellyt: 39,6 ± 8,5% positiivisia, SC -1 käsitelty: 74,1 ± 13,4% positiivinen). Ei lisääntynyt ilmentyminen oletetun CSC markkereita oli ilmeistä, että COLO 205 kasvainlinjaan (SC-1 herkkä kasvain linja). Ei muutoksia CD326 ja CD166 pinnan ilmentyminen havaittiin tahansa kasvaimen linjat. Siten muutos ilmaisun tiettyjen CSC pintamerkkiaineita tapahtui seuraava SC-1 hoito paksusuolen tuumorilinjoja vaihteli kasvaimen linja.

Kuulat jälkeen muodostuneiden SC-1 hoito

Sphere muodostuminen on CSC ominaisuus, olivatpa ne sitten peräisin potilaasta kasvaimista [18] tai säilynyt tuumorilinjoja aivojen, rinnan, tai ihon kasvatettiin seerumittomassa olosuhteissa [8]. SC-1: llä käsitellyissä paksusuolen kasvainten linjat tutkittiin alalla muodostumisen käyttäen solutiheyksiin aiemmin julkaistu [19], [20] ja seerumin läsnä ollessa. Koska seerumi ajatellaan sisältävän eriyttää tekijöille [21], tätä määritystä voidaan pitää tiukempia kuin toiset [22]. Vuonna HCT-116 ja HT29 tuumorilinjoja, yhtenäinen tarttumaton pallojen kanssa hyvin määritetyt rajat muodostunut 24 tuntia (kuvio 2C) läsnäolosta huolimatta seerumin. Lisäksi pallo muodostuminen tapahtui osa viljellyistä COLO 205 kasvaimen line (kuvio 2C). Nämä samat muutokset morfologia oli myös läsnä 5. päivänä hoidon jälkeen (tietoja ei esitetty). Jäljellä tuumorilinjoja, pallo muodostuminen havaittiin pitoisuuksina suurempia kuin testattu tässä (tuloksia ei ole esitetty). Pallo muodostuminen määritys toistettiin käyttäen seerumia vapaissa olosuhteissa ja samanlaisia ​​tuloksia saatiin (kuva S5).

SC-1 hoito Vähentynyt Phospho-ERK1 /2 ja Lisääntynyt Oct4 Protein Expression Levels

edellinen raportissa [12] osoitti, että SC-1 esti fosfo-ERK1 /2-proteiinin tasot 30 minuutin kuluttua altistuksen hiiren alkion kantasoluja jolloin ylläpito itseuudistumisen

in vitro

ilman lymfosyyttien estävä tekijä tai syöttösoluja. Sen määrittämiseksi, SC-1 saavuttanut saman tavoitteen käsitellyssä paksusuolen tuumorilinjoja, muutokset runsaasti fosfo-ERK 1/2 (p-ERK) ja yhteensä ERK1 /2-proteiinin arvioitiin immunoblottauksella ajankohtina samankaltaiset kuin tutkittu (kuvio 3A). Vuonna HT29 kasvaimen linja, fosfori-ERK 1/2 proteiini tasoilla (suhteessa koko ERK1 /2-proteiinin tasot) pieneni 5 min (67 ± 0,06% vertailuarvosta), saavutti alimpien 1 h (46 ± 0,06 % kontrollista), ja pysyi laskivat jäljellä olevan ajan funktiona (4 tuntia, 68 ± 0,10% valvonnan arvosta). Näin ollen on todennäköistä, SC-1 on saavuttaa sitä vastaavan molekyylipainon tavoite HT29 kasvaimen linja.

Colon tuumorilinjoja käsiteltiin SC-1 (0,1 uM), kerättiin, hajotettiin ja koestettiin proteiineja kiinnostus elektroforeesin jälkeen SDS-PAGE-geelien osoitetuissa aikapisteissä. A. SC-1: llä käsitellyissä HT29 kasvaimen linja, fosfo-ERK1 /2 /yhteensä ERK1 /2-proteiinin tasot alenivat 67 ± 0,06% kontrollista -arvo, 5 min, 56 ± 0,06% kontrollista -arvo, 30 min, ja 46 ± 0,06% kontrollista -arvo, 1 h (n = 3, p 0,05). B. Lisääntynyt Oct4 proteiinin ilmentyminen johtuen SC-1 oli riippuvainen kasvain linjan. Edustavia kokeita esitetään kuviossa S4A-B (n = 2).

Lisääntynyt tasoilla Oct4 proteiinin ilmentymistä in SC-1 käsitellään paksusuolen tuumorilinjoja olisi yhdenmukainen tunnistaminen SC-1 on solu-pohjainen näyttö, joka havaitaan ylläpitäminen Oct4 välittämä GFP-signaalin hiiren alkion kantasoluja kasvavat ilman ulkoisten tekijöiden tai syöttösoluja [12]. Oct4 on transkriptiotekijä tärkeää sikiön kehityksen ja säätelee pluripotenttisuus [23]. Siksi muutokset Oct4 proteiinin tasot altistuminen SC-1 arvioitiin. 2: ssa 7 paksusuolen kasvaimen linjat (HCC-2998 ja HT29), Oct4-proteiinin ekspressio lisääntyi SC-1 käsittely (kuvio 3B). Jäljellä tuumorilinjoja, Oct4 proteiinin ekspressio oli ennallaan tai vähentynyt. Muuttuva vaikutus SC-1 Oct4 proteiinin ilmentymisen ei korreloinut kasvaimen muodostumisen. Sen vuoksi on epätodennäköistä, Oct4 on tärkeä rooli havaittu SC-1 vaikutukset.

SC-1 Inhibioitu RSK2

In vitro

ja RSK2 Inhibiittorin lisääminen Colony Formation

bioinformatiivinen polku analyysi [24], [25] geenien korreloi NCI60 GI

50 sormenjälki SC-1 ehdotti rooli RSK2 ja sen sääntelyn toimintaa mTOR kautta. RSK2 (90 kD: n ribosomaalinen S6-kinaasi), joka on kinaasi, jossa on sekä N- ja C-terminaaliset funktionaalisia domeeneja, fosforyloi useita tavoitteita ja fosforyloituu ERK1 /2, toisen SC-1 kohde. Koska alavirtavaikuttajainhibiittorit, RSK2 signaaleja monissa solun käyttäytymistä, mukaan lukien solujen eloonjäänti, kasvu, leviämisen, ja muuttoliike [26]. On myös huomattava, että yhdisteen SC-1 on yhteistyössä kiteytettyä Bcr-ABL1 kinaasi [27], mikä viittaa siihen, että SC-1 voi olla muita molekyyli tavoitteita. Me tutki SC-1 voi estää

in vitro

kinaasiaktiivisuutta RSK2 ja löysi EY

50 2,5 ± 1,8 uM (kuvio 4A, EY

50, pitoisuus, jolla yhdiste estää 50% säätelevää aktiivisuutta, n = 5). Mahdolliset estävä vaikutus SC-1 on satunnaisessa muiden proteiinikinaasien (Aurorakinaasi B, CHK1, ja Chk2) arvioitiin myös samassa määrityksessä ja mitään vaikutusta havaittiin (kuvio 4A). Sen määrittämiseksi, onko toiminta liittyvät (ja RSK2) proteiinikinaasien AGC-kinaasiryhmän estyi SC-1, lisätutkimuksia tehtiin (taulukko 3). Ei estävä vaikutus -kinaasiaktiivisuus löytynyt Akt1, PKA ja PKC tai sen alapuolella suurin testattu konsentraatio (10 uM); kuitenkin, SC-1 oli inhibitorisia p70S6K (1,4 uM IC

50). Koska SC-1 esti nämä valitut kinaasien mikromolaarisella alueella ja kinaasimääritys on erilainen kuin se raporttitietojen kuviossa 4A, positiivinen EY

50 vastinetta Abl1 kinaasi raportoitu taulukossa 3 samoin. Nämä löydökset olivat yhdenmukaisia ​​ennusteisiin raportoineet Okram et al. [27].

COLO 205 kasvaimen solulinja käsiteltiin SL0101 (1,25 uM) ja SC-1 (0,1 uM) 24 tunnin ajan ennen pehmeän agarin kloonaus, lysaatin valmistamiseksi, ja immunoblottaus. A. SC-1 esti RSK2 N-terminaalinen domeeni

in vitro

kinaasiaktiivisuutta EY

50 2,5 ± 1,8 uM (keskiarvo ± SD, n = 5), mutta ei muita kuin määrityksissä Aurora kinaasi B, CHK1 tai Chk2 kinaasien. B. Vähentynyt RSK2 proteiinin tasot (33%) oli 5 päivää SC-1 kohtelun COLO 205 kasvainlinjaan (n = 2). C. Treatment (24 h) COLO 205 kasvain mukaisesti SL0101, joka on kaempferol glykosidiannoksen RSK2 estäjä, pesäkkeiden muodostumisen (≥60 pm) pehmeässä agarissa (n = 2, edustava koe esitetään).

Koska SC-1 esti RSK2 kinaasiaktiivisuutta, ensin määritetään, onko RSK2 proteiinin tasot olivat muuttuneet. Jälkeen 5 päivää altistuksen 0,1 uM SC-1, RSK2 proteiinin tasot olivat merkittävästi vähentynyt 33% COLO 205 kasvaimen linjan (p = 0,007, n = 3, kuvio 4B).

Jos RSK2 tärkeä rooli soluviestitykseen välttämättömiä CSC fenotyyppi, olisi odotettavissa, että tehostettu pesäkkeiden muodostumisen tapahtuisi hoidon jälkeen, joiden tiedetään RSK2 estäjä. Tätä varten, COLO 205 kasvainlinjaan käsiteltiin SL0101, joka on kaempferol glykosidi, jolla ei ole aktiivisuutta MEK, Raf, tai PKC [28], 24 tuntia ennen kloonausta pehmeällä agarilla ja arvioitiin pesäkkeenmuodostusta 7 päivää myöhemmin. Tilastollisesti merkitsevä pesäkkeiden muodostumisen havaittiin 1,25 uM käsittelyä ja kaikilla pinnoitteen tiheydet (kuvio 4C, n = 3, pariksi kaksi tailed Studentin t-testi, p = 0,05). SC-1: llä käsitellyissä soluissa tämä lyhentää altistus (24 tuntia (kuvio 4C) vs. 5 päivää (kuvio 2A)), lisääntynyt pesäkkeiden muodostumisen todettiin vain suurimmalla pinnoitteen tiheys.

Keskustelu

Bulk populaatiot paksusuolen kasvain linjat NCI60 Panel altistettiin pienimolekyylinen joka antaa itseuudistumiseen ominaisuuksia ja tutkittiin ominaisuuksiltaan CSC fenotyyppi. Esikäsittely SC-1 kasvoi kasvainten muodostumiseen alhaisella solussa siirrosteiden HT29 ja HCT-15 tuumorilinjoja. Kloonaus pehmeässä agarissa lisääntyi useimmissa tuumorilinjoja. Osuus soluja, jotka ilmentävät CD133 ja CD44, oletetun CSC pinta-antigeenejä, lisättiin. Sphere muodostuminen vastauksena SC-1 hoito havaittiin myös alle sisältävää seerumia ja seerumitonta olosuhteissa. Sen vahvistamiseksi, että SC-1 muuttamatta sukulais molekyylitasolla, proteiinin ilmentymistä fosfo-ERK1 /2 mitattiin ja sen havaittiin vähentävän jälkeen 5 min ja jopa 4 tuntia altistuksen jälkeen. Expression of Oct4, transkriptiotekijä, joka ylläpitää pluripotenttisuus normaaleissa alkion kantasoluja, lisättiin joissakin (2/7) kasvaimen linjojen jälkeen SC-1 hoito. SC-1 esti RSK2

in vitro

kinaasiaktiivisuutta. Tuloksena sopusoinnussa tämän havainnon, toinen RSK2 inhibiittori parantaa kyky muodostaa klooneja paksusuolen kasvain linjan, sekaantunut tämä proteiini ehdokkaaksi molekyylikohteena välittävä CSC fenotyyppi.

havainnot proof of concept tutkimuksessa, kysyy pieni molekyyli voi muokata ja /tai aiheuttaa ominaisuuksiltaan CSC fenotyypin paksusuolen tuumorilinjoja tukemaan mahdollisuutta käyttää pieni molekyyli perustaa

in vitro

malli CSC biologian. HT29 kasvainlinjaan osoittautui kaikkein SC-1 herkkä, koska kasvainten voisi löytyä niin vähän 100 SC-1 käsiteltyjä soluja, kyky muodostaa klooneja kasvatettiin, palloja muodostuu olosuhteissa, jotka yleensä rajoittavat tällaiset morfologia ja olosuhteissa, jotka olivat salliva, ja ilme of CD133 ja Oct4 nostettiin. Siten useita mahdollisuuksia tutkimiseen CSC biologian ovat ehdottaneet. Ensinnäkin, SC-1 käsitellään paksusuolen kasvainlinjaan osapopulaatioiden ilmentävät otaksuttu CSC antigeenejä voidaan puhdistaa, sitten tutki uudelleen sillä ominaisuuksiltaan CSC fenotyyppi parantamiseksi

in vitro

mallissa. Olisi myös kiinnostavaa määrittää, jos SC-1 voi säilyttää otaksuttu HT29 CSC alaryhmän pitkäaikaiseen viljelyyn, voittaminen fenotyyppinen tasapainon kuvattu epävakaa varsi kaltainen subpopulaatio tunnistettu SUM159 rintasyöpäsolusarjan linjan [11]. Vaihtoehtoisesti, varsi kaltaisia ​​soluja löytyy SUM159 rinta- kasvaimen line voi altistua SC-1 sen määrittämiseksi, onko alaryhmästä palaa sekoitettu tasapainon varren kaltainen ja ei-kantasolujen kaltaisia ​​soluja tai ylläpidetään varren kaltainen. Ja lopuksi, kuten alun perin ehdotti, Tuumorinäytteiden peräisin CSC voitaisiin hoitaa SC-1 määrittää, jos sen fenotyyppi säilyy.

selvä määrittely alaryhmään tai kannan osiin vaikuttavat SC-1 ei voitu määrittää tässä, koska bulk populaatiot tuumorilinjoja hoidettiin. Voit lisätä todennäköisyyttä osoittaville SC-1 vaikutuksen, heterogeeninen tuumorilinjoissa käytettiin. Siten on mahdollista, että joko SC-1 säilyy CSC ominaisuuksia ennestään paksusuolessa tuumorilinjoja tai biokemiallisesti perustettu toiminnalliset mitattiin

de novo

. Jos jälkimmäinen on totta, tulokset tukevat käsitystä, että CSC fenotyyppi on muovia [29].

On tärkeää huomata, että SC-1 vaikutus ei ollut yhdenmukainen seitsemän paksusuolen kasvain linjat (taulukko 4 ). Esimerkiksi yleinen tuumorigeenisuus SC-1 kasvaimen soluihin lisääntyi merkitsevästi klo 10000 soluympissä mutta missä määrin tämä tapahtui riippui kasvainlinjaan ja edellytykset tuumorigeenisyyden määrityksen. HT29 kasvaimen linja pidettiin eniten SC-1 herkkä solulinja, koska vain 100 solua muodostamiseen tarvitaan kasvaimia, kun taas samoissa rajoittavat olosuhteet (puuttuminen proteiinin tuki), HCT-15 tuumorisoluja voineet muodostaa kasvaimia, vaikka hallinnassa olosuhteissa ja 10000 soluympissä. Lisäys Matrigel sekä valvontaa ja käsiteltiin HCT-15 kasvainlinjaan parantunut tuumorigeenisyyteen ja osoittaneet SC-1 vaikutusta 10 soluympissä. Olipa Matrigel oli yksinkertaisesti ansastusta mekanismi, tarjonta kasvutekijöitä, tai sopivaa matriisin angiogeneesiä ei ole selvää tällä hetkellä ja odottaa jatkotutkimuksia. Lisäksi kriittinen vaatimus matrigeelin varten HCT-15 kasvainlinjaan kasvaa

in vivo

viittaa siihen, että reseptorit kuten integriinit, jotka sitoutuvat soluväliaineen komponentteja ja signaali solujen selviytymistä saattavat olla välttämättömiä opiskeluun CSC biologian. On huomattava, että integriinin reseptorit ovat oletetun CSC pintamarkkereiden [30], [31]; SC-1 voi kuitenkin moduloida näiden reseptorien.

Tärkeää on kuitenkin, yhdenmukainen määritelmä CSC pinnan markkereita ei ole [32], [33]. Otaksuttu CSC pinta markkereita arvioitiin seuraavan SC-1 altistuminen paksusuolen kasvain linjat ja kaikki muuttunut ilme ei ollut yleistä, yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten. Kuitenkin CD133, merkittävä ja yhteinen paksusuolen CSC markkeri biopsianäytteissä, lisääntyi noin 2-kertaisesti käsiteltyjen HT29 kasvainlinjaan. Lisäksi HT29 kasvainlinjaan oli kaikkein SC-1 herkkä viiva suhteessa kasvainten muodostumiseen. Siksi SC-1 alttiina HT29 kasvainlinjaan voi olla sopiva malli CSC ilmentävien CD133. Mutta yhteenvetona, on yhä mahdollista, että mekaanisesti, SC-1 vaikutusta CSC ominaisuuksiin yleensä, ja pintamerkkiaine vaikutus, erityisesti, voi riippua taustalla geneettiset ja epigeneettiset heterogeenisyys eivätkä kaikki tuumorilinjoja alttiina SC-1 tulee hyödyllinen

in vitro

malleissa. Yhdessä nämä tiedot tässä raportissa tukevat edelleen käsitystä, että varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia ovat paitsi heterogeenisiä välillä kasvaintyypit, mutta myös välillä kasvaimia, jotka syntyvät saman elimen osoittaa, että on olemassa huomattava plastisuus sukupolven CSC.

SC-1 altistuksen aiheuttama tarttumaton pallo muodostumista ja lähes kaikissa soluissa HT29 ja HCT-116 kasvain rivit 0,1 uM tutkittu annostus. Tämä määritys suoritettiin eri tavalla aiemmista selvityksistä [19], [20] käyttämällä naudan sikiön seerumia ja kudosviljelmälaitteita aluksia, jotka helpottavat solun kiinnittyminen ja voidaan pitää tiukempia, koska seerumin voidaan indusoida erilaistumista [21]. Lisätutkimuksia, joissa seerumin ja kiinnittyneet pintoihin poistettiin, vahvisti tämän toteamuksen. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että SC-1 voi olla edistää yksi tarvittavat prosessit etäpesäke, irtoaminen primaarikasvaimen. Olipa opinnäytetyöt vaiheet ovat yhdenmukaisia ​​määritelmän syövän kantasolujen ole selvää hetkellä, mutta ehdottaa rooli SC-1 on EMT siirtyminen [34].

On todennäköistä, että SC-1 on saavuttanut osoitteessa ainakin yksi sen raportoitu molekyylikohteista (ERK1 /2) [12], koska jo 5 min altistuksen jälkeen, suhde fosfo-ERK1 /2 yhteensä ERK1 /2-proteiinin tasot aleni HT29 kasvainlinjaan. Lisäksi lipofiilisen luonteen SC-1 (mitattuna log P) ehdotti, että se pystyy läpäisemään solukalvon. Vaikka MAPK signalointi odotetaan edistävän kasvua ja sen estäminen olisi antitumorigenic [35], dynaaminen luonne ERK1 /2 eston sekä muita tunnettuja ja tuntemattomia tavoitteita SC-1 voi edistää toiminnalliset ominaisuudet tutkittiin.

vaikutusmekanismi SC-1 on tuntematon tällä hetkellä ja aloitimme tutkimukset hyödyntäen julkisesti saatavilla olevat tiedot, geenien ilmentyminen profiileja NCI60 syöpälääkettä Screen [24], [25] tarkastelemaan tätä. Erityisesti bioinformatiikan polun analyysi geenien korreloi SC-1 NCI60 GI

50 keskiarvossa ehdotti rooli mTOR väylän modulointiin havaitusta kasvua estäviä vaikutuksia (

in vitro

) kanssa RSK2 sisältyvät mTOR koulutusjakson [26]. Kaksi erillistä

in vitro

kinaasin eston määrityksiä, RSK2 inhiboitui SC-1. Lisäksi, kun COLO 205 kasvainlinjaan altistettiin tunnettu RSK2 estäjä (SL0101 pieninä pitoisuuksina), lisääntynyt klonogeenisten aktiivisuus havaittiin; merkitsemättä RSK2 voisi ainakin rooli edistämisessä kyky muodostaa klooneja. Kuitenkin

in vitro

EY

50 2,5 uM ylittää pitoisuuden SC-1 (0,1 uM) hyödyntää kaikissa tutkimuksissa esitetään tässä. Tämä ristiriita voidaan selittää hitaan catabolic määrä SC-1 tai kuljetuksen parametreja, jotka keskittyvät SC-1 solun sisällä tasolle lähestyy mitattuun EY

50. [40].