Krooninen sairaus

tiivistelmä

kystatiini C uskotaan estämään kasvaimen etenemistä estämällä toimintaa perheen lysosomaalisen kysteiiniproteaaseja. Kuitenkin vähän tiedetään tarkkaa mekanismia kystatiini C toiminto eturauhassyövässä. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme ilmaus kystatiini C ja sen yhdessä matriisimetalloproteinaasit 2 (MMP2) ja androgeenireseptorin (AR) kudoksessa microarray vertaillaan hyvän- että pahanlaatuisia näytteitä 448 potilasta, joille tehtiin eturauhasen lokalisoitu eturauhassyöpää. Kystatiini C ilmentyminen oli merkitsevästi pienempi syövän yksilöiden kuin hyvänlaatuinen kudoksissa (p 0,001) ja oli tilastollisesti merkitsevä käänteinen korrelaatio ilmaus kystatiini C ja MMP2 (r

s

2 = -0,056, p = 0,05 ). Oli selvä suuntaus, että potilaat, joilla alentunut taso kystatiini C oli alhaisemmat kokonaiselossaolo. Kohdennettu esto kystatiini C käyttämällä erityisiä siRNA johti lisääntyneeseen invasiivisuus PC3-solujen, kun taas induktio kystatiini C yli-ilmentymisen vähentää huomattavasti hyökkäys nopeus PC3 in vitro. Vaikutus kystatiini C moduloimalla PC3 soluinvaasiota aiheutettiin Erk2 estäjän että nimenomaan esti MAPK /Erk2 aktiivisuutta. Tämä viittaa siihen, että kystatiini C saattaa välittää kasvainsolun invaasiota moduloimalla MAPK /Erk porrastetusti. Vastaa meidän immunohistokemiallisella havaintoja, potilailla, joilla on alhainen ilmentyminen kystatiini C ja korkea ilmentyminen androgeenireseptorin (AR) on yleensä huonompi kokonaiselossaoloaikaa kuin potilailla, joilla on korkea ilmentymä kystatiini C ja korkea AR ilmaisun aiheuttama yliekspressio AR PC3 soluissa, jotka ilmentävät kystatiini C siRNA suuresti parannettu invasiivisuus PC3-solujen. Tämä viittaa siihen, että voi olla välistä ylikuulumista kystatiini C ja AR-välitteistä reittejä. Tutkimuksemme paljastaa uuden roolin kystatiini C ja siihen liittyvien solureiteillä eturauhassyövässä ja metastaasit.

Citation: WEGIEL B, Jiborn T, Abrahamson M, Helczynski L, Otterbein L, Persson JL, et ai. (2009) Kystatiini C vaimentua eturauhassyövässä ja säätelee Invasion eturauhassyöpäsolujen

kautta

MAPK /Erk ja androgeenireseptorin Pathways. PLoS ONE 4 (11): e7953. doi: 10,1371 /journal.pone.0007953

Editor: Tšad Creighton, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 17, 2009; Hyväksytty: 29 lokakuu 2009; Julkaistu: 23 marraskuu 2009

Copyright: © 2009 WEGIEL et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Ruotsin Research Council (myönnä. 20760 ja 09915), Ruotsin Cancer Society (Projects nro 07-0458 ja 02-4573), tutkimus- rahaston ja Cancer Research Fund Malmön yliopistollisen sairaalan, tiedekunnan lääketieteen, Lundin yliopisto, Gunnar Nilssons Cancer Foundation, ja Crafoord STF, ja hallitus Health Grant (ALF) ja A. Oesterlund Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on edelleen yleisin ja toiseksi eniten tappava kasvain miehillä länsimaissa [1]. Noin kolmasosa saaneista potilaista uusiutumisen eikä parantavaa hoitoa tällä hetkellä olemassa etäpesäkkeitä [2]. Etenemisen kautta hormoniriippuvaiset että kastraatio kestävä ja metastaattisen eturauhassyövän ymmärretään huonosti. Prosessit ja metastaasit kasvainsolujen ovat riippuvaisia ​​niiden kyvystä hajota ympäröivään proteiinien ja muiden kudosten osat. Proteolyyttisen entsyymien ja proteaasit kuten kollagenaasi ja katepsiini tarvitaan tähän tarkoitukseen, ja näin keskeisessä asemassa ovat moniportaisuudesta syövän kasvua ja etäpesäkkeiden [3], [4]. Niistä proteaasit, matriisin metalloproteinaasien MMP ja lysosomaalisen katepsiini B on jaettu merkittäviä rooleja eturauhassyövän etenemiseen [5] – [9] [10], [11]. Äskettäin MMP2 liittyi myös invasiivisen fenotyypin eturauhassyöpäsolujen [12] ja ilmentyminen MMP2 pahanlaatuisia eturauhasen epiteelin osoitettiin olevan itsenäistä ennustaja eturauhassyövän tautivapaan elinajan [13].

kystatiini C on erittyvä kysteiini proteaasinestäjän joka säätelee luukadon neutrofiilikemotaksista ja kudosten tulehdus sekä vastustuskykyä bakteeri- ja virusinfektiot. Se toimii myös voimakas estäjä katepsiini B ja muita ihmisen lysosomaalisen kysteiiniproteaaseihin [14]. Kystatiini C on myös tiedetään olevan parempi merkkiaine munuaisvaurion kuin kreatiniinin [15], [16]. Inaktivoimalla katepsiini proteaasiaktiivisuutta, kystatiini C estää syöpäsolujen invaasiota ja etäpesäkkeiden [17], [18]. Epänormaali seerumin kystatiini C tai katepsiini B /kystatiini C kompleksi on ehdotettu diagnostiikka sekä varoituksia indikaattorit syöpiä ihon, paksusuolen ja keuhkojen [19]. Kystatiini C on ehdotettu olevan tärkeä rooli neuroendrocrine erilaistumiseen eturauhassyövän [20]. Viime aikoina seerumin kystatiini C on ehdotettu käyttökelpoinen markkeri lisääntyneen osteoblastien liittyy bisfosfonaatti hoitoja eturauhassyöpäpotilailla luumetastaasipotilailla [21]. Kuitenkin rooli kystatiini C eturauhassyövässä etenemiseen ja siihen liittyvät solu- ja molekyylitason verkostoja vielä tutkittava.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että aikana tumorigenesis ja etäpesäkkeiden eri proteolyyttisten kaskadeja koostuu entsyymejä, kuten kysteiiniproteaaseista ja MMP toimivat synkronoidusti ja tukiin kasvaimen kasvu, invaasio ympäröiviin kudoksiin [10]. Katepsiini B on liitetty hajoamista solunulkoisen matriisin (ECM) joko erittyvänä muodossa solunulkoiseen tilaan tai kiinni solun pinnalla [10]. Erityisesti, MMP-2 ja MMP-9 on ehdotettu liittyvän eturauhassyövän etäpesäkkeiden kuten korkea näiden proteiinien mitattiin plasmasta ja virtsasta potilailla, joilla on metastaattinen sairaus [5], [22], [23]. MMP-9 on myös tutkittu intensiivisesti ja on tosin merkittävä rooli kahdessa tärkeitä näkökohtia syövän etenemisen, angiogeneesiä ja vaskulogeneesiä [8].

metastaattinen Prosessissa koordinointia useiden solu- ja signaalin transduktion polkuja, jotka mahdollistavat syöpäsolujen lisääntyä, uudistaa ympäristönsä, hyökätä kaukaisiin päällä ja muodostaa uusia kasvaimia. MAPK signalointireittejä tärkeä rooli eritystä indusoiva proteolyyttisiä entsyymejä, jotka hajottavat tyvikalvon, parantaa solujen vaeltamiseen ja ylläpitää kasvainsolujen kasvua [7]. Kohonneita MAPK aktiivisuuden on havaittu kehittyneen PCa viittaa siihen, että konstitutiivisesti aktiivinen Ras polku saattaa liittyä eturauhasen syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden [7], [24]. Tärkeää on, että MAPK: n aktivaatio on liitetty kehittämiseen androgeenista riippumaton eturauhassyöpä, nyt yleisesti kutsutaan kastraation kestävä eturauhassyöpä (CRPC) [25], [26], [27].

Androgeenireseptori (AR), jäsen superperheen ligandin aktivoimien tumareseptorit, on keskeinen rooli patogeneesissä primaarinen ja metastaattinen eturauhassyöpä [28], [29]. AR-geenin monistaminen on todettu yksi kolmasosa kehittyneiden eturauhasen syöpiä ja niiden uskotaan osaltaan etenemistä ja etäpesäke eturauhassyövän [30], [31], [32], [33]. AR ei toimi itsenäisesti sääntelyssä kasvaimen kasvua, mutta vaatii vuorovaikutusta yhteistyössä sääntelyviranomaisten [34]. Mutaatiot geenissä tai sanomaa AR ovat syyt lisääntynyt androgen herkkyys näiden kasvaimia. Paikallinen autokriinistä tuotantoa dihydrotestosteronin ja testosteronin syöpäsolujen pienentäisivät kastraation vaikutus [35]. Välinen ylikuuluminen AR ja muut signaalinvälitysreittien (esim MAPK) sekä muutokset AR yhteistyössä sääntelyviranomaisten [34] nopeuttaa ligandin riippumattoman aktivaation AR. Siten AR on tärkeä rooli sekä kliinisesti paikallisesti ja kehittyneen eturauhasen syöpiä.

Tässä tutkimuksessa pyrittiin arvioimaan ilmaus kystatiini C ja sen kliinistä merkitystä eturauhassyövässä ja valottaa uusi rooli kystatiini C eturauhassyövässä hyökkäystä. Kystatiini C liittyy proteolyyttisten Cascade ja MAPK /Erk-reitin yhdessä AR voi toimia synkronoidusti edistää kasvaimen kasvua ja invaasio ympäröiviin kudoksiin. Täällä, loimme ensimmäistä kertaa välillä on toiminnallinen yhteys kystatiini C ja MAPK-Erk signalointi ja AR-välitteistä reittejä eturauhasen syöpäsoluja.

Tulokset

Tissue Expression of kystatiini C Eturauhassyöpä liittyy MMP2 merkkiaineena invasiivisuus ja kliinistä hyötyä

Vähentynyt kystatiini C mRNA: n ekspression on raportoitu useita erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien rintasyöpä, paksusuolen syöpä ja munuaissyöpä [36], [37]. Kuitenkin erityinen rooli kystatiini C-proteiinin ilmentyminen eturauhassyövässä etenemiseen ja sen yhteyksiä kliinisiin ominaisuuksiin ei ole raportoitu. Hyödynsimme kudoksen-mikrosirulla (TMA), joka sisältää näytteitä eturauhasen hyvänlaatuisen kudoksesta ja pahanlaatuisia kasvaimia 448 potilasta, joille tehtiin eturauhasen lokalisoitu eturauhassyöpää. Expression of kystatiini C tutkittiin immunohistokemiallisesti. Lähes kaikki hyvänlaatuiset näytteet osoittivat selvästi korkea sytoplasmisen proteiinin ilmentymisen kystatiini C, kun taas sovitettu eturauhassyöpäkudoksille jatkuvasti näkyvissä heikompi tai havaitsemattomia immunovärjäyksellä (kuvio 1A, B). Ero oli tilastollisesti merkitsevä (p 0,001), mikä viittaa siihen, että kystatiini C proteiinin ilmentyminen on yleensä alassäädetty eturauhassyövässä verrattuna hyvänlaatuinen epiteelin. Sitten jakaa kasvainnäytteestä kahteen ryhmään perustuen Gleason laadut yksittäisten ydin koepaloja, Gleason asteen 2 tai 3 (ryhmä 1) vs. Gleason asteen 4 tai 5 (ryhmä 2) [38]. Löysimme vähentynyt ilmentyminen kystatiini C 61%: Tuumorinäytteissä ryhmästä 1 verrattuna 72% näytteistä ryhmän 2 (kuvio 1A). Sekä MMP2 ja MMP-9, erityisesti, on havaittu liittyvän eturauhassyövän etäpesäkkeiden [13], [39]. Äskettäin, kystatiini C tunnistettiin uutena substraattina MMP2 solu-pohjainen proteomiikka-analyysi viittaa siihen, että on olemassa suora toiminnallinen yhteys MMP2 ja kystatiini C [40]. Siksi tutkitaan mahdollisen yhteydestä kystatiini C ilmaisun ja ilmentymistä MMP2 potilaan näytteiden immunohistokemiallinen analyysi meidän kudos microarray konstruktio (TMA). Mielenkiintoista, ilmentyminen kystatiini C proteiinin käänteisesti yhteydessä MMP2 vuonna 448 potilaalla materiaali oli tilastollisesti merkitsevä (r

s

2 = -0,056, p = 0,05). Tutkimme lisäksi, onko kystatiini C ilmaisu korreloi kliinisten tutkimusten tulosten kanssa eturauhassyöpäpotilailla, ja jaoimme potilaat kahteen ryhmään perustuu tasoon kystatiini C ilmaisun: kystatiini C korkea (intensiteetti värjäystä 2 tai 3) tai kystatiini C alhainen (intensiteetti värjäystä alle 2) ryhmä. Löysimme mitään merkittävää eroa kliinisten parametrien kuten Gleason pisteet, T vaihe /patologia vaiheessa etäpesäke vapaa aika, esikäsittely PSA-arvot, Biokemiallinen toistuminen PSA-arvot, biokemialliset vapaa-aikaa ja positiivinen kirurgiset marginaalit välillä kystatiini C korkean ja kystatiini C alhainen ryhmä (taulukko 1 ). Sitten tutkittiin, kliinisen tuloksen mukaan lukien yleinen-(OS) vaihteli kystatiini C korkean ja kystatiini C alhainen potilailla. Potilaat kystatiini C korkean ryhmä 100 kuukautta diagnoosista oli OS noin 40% verrattuna 25% potilaista kystatiini C matalan ryhmässä (p = 0,307) (kuvio 1 C). Vaikka emme aikaan tilastollisesti merkitystä, on olemassa selvä suuntaus, että potilaat, joilla on alhainen taso kystatiini C ilmaisun oli huonompi tulos verrattuna korkeasti. Kun arvioidaan, onko biokemiallinen uusiutumista elinaika erosivat ryhmien välillä oli myös merkittävää eroa (p = 0,401) (kuvio 1 D).

A). Immunohistokemiallinen analyysi kystatiini C ilmaisun hyvän- ja PCa yksilöitä. Osiot edustavat hyvänlaatuinen, kudosten ja kasvain Gleason asteen 3 ja 5 on esitetty. Edustaja kuvat saatiin käyttämällä 40x tavoite. B). Kuvaaja kvantitatiivisen analyysin immunohistokemiallisella värjäyksellä kystatiini C (pisteet 0-negatiivinen, 1- kohtalainen, 2- vahva, 3- erittäin vahva) osoittaa vertailu 448 hyvänlaatuinen ja syöpä yksilöt (keskiarvo värjäytymisen kaksoiskappaleita kunkin yksilön). Pariksi Wilcoxonin rank sum testiä analyysejä arviointiin käytettiin vertailussa ryhmien välillä. Keskiarvojen voimakkuudet värjäyksen (vaakarivillä) kanssa virhejanat edustavat 95%: n luottamusväli keskimääräisen näkyvät. Laatikot edustavat jakelu ilmentymisen kystatiini C ryhmissä. C) Kokonaiselinaika potilailla, joilla on korkea tai matala ilmentymisen kystatiini C eturauhassyöpänäytteissä. Kaplan-Meier-eloonjääminen analyysi suoritettiin. D) Eloonjäämiskäyrät aikaa taudin uusiutumiseen arvioituna kuin biokemiallinen toistumisen mitattuna mukaan korotuksella PSA [57] heikosti (intensiteetti pisteet 0-1,5) ja korkea (intensiteetti pisteet 2-3) kystatiini C ilme.

Tissue Expression of androgeenireseptorin Is käänteisesti yhteydessä kystatiini C Expression

monistaminen ja mutaatioiden AR-geenin tunnistetaan kriittisiä tekijöitä, jotka liittyvät huonoon ennusteeseen eturauhassyövän. Halusimme tutkia, kystatiini C ilmentymistä yhdessä AR voi ennustaa lopputulos tauti. Arvioimme ilmentyminen kystatiini C osajoukko meidän TMA näytteiden käsittää 99 potilasta, joilla pisimmällä taudin ja oli korkea AR ilmaisua. Jaoimme nämä 99 potilasta kahteen ryhmään: kystatiini C-low /AR-korkean ryhmän ja kystatiini C-high /AR-korkea ryhmässä (kuva 2). Potilaat, joilla on alhainen kystatiini C ja korkeat AR ilme oli alhaisemmat kokonaiselinaikaa (40%, 100 kuukautta) verrattuna potilaisiin, joilla on korkea kystatiini C ja korkeat AR lauseke (60%, 100 kuukautta), vaikka nämä tulokset eivät saavuttaneet tilastollista merkitys (p = 0,094). Tämä osoittaa, että potilailla, joilla oli alhainen kystatiini C ja korkea AR ilme on yleensä huonompi tulos verrattuna potilaisiin, joilla on korkea kystatiini C ja korkea AR ilme.

Kokonaiselinaika ryhmässä 99 potilasta, joilla on eniten edenneen eturauhassyövän (Gleason arvosana 4-5) joille oli ominaista korkea ilmentyminen AR ja erotettiin eri ryhmiin perustuu kystatiini C tasoilla (matala- intensiteetti pisteet 0-1,5 ja korkean intensiteetin pisteet 2-3).

kystatiini C ilmentäminen eturauhassyöpäsolulinjat

Koska kystatiini C oli alassäädetty eturauhassyövässä kudoksissa ja liittyy lisääntynyt ilmentymä MMP2, jonka tiedetään edistää kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden, halusimme tutkia roolia kystatiini C eturauhasessa syöpäsolujen kasvua, selviytymistä ja hyökkäystä. Tutkimme kystatiini C ilmentymisen kolmen eturauhassyövän solulinjoissa, mukaan lukien androgen-herkkien LNCaP-solujen ja androgeenin-tunteeton PC3 ja DU-145-soluja (kuvio 3). Kystatiini C-proteiinia supernatanteissa mitattiin ELISA: lla sen jälkeen, kun soluja on viljelty in seerumittomassa alustassa 24 ja 48 tuntia, vastaavasti. Mielenkiintoista on, LNCaP-solut, joiden tiedetään olevan ei-invasiivisen tuotti suuria kystatiini C, kun taas invasiivisia solulinjat PC3 ja DU-145 oli vähäisempää kystatiini C eritystä (kuvio 3). PC3-soluja, joilla on kohtalainen ekspressiotaso kystatiini C valittiin myöhempää toiminnallisia tutkimuksia vaikutusten arvioimiseksi pakko yli-ilmentymisen ja pudotus kystatiini C PC3 soluinvaasion.

ELISA-määrityksessä supernatanttien kolmesta eri eturauhasen syöpäsoluja linjat, jotka maljattiin 24 h tai 48 h ennen koetta suoritettiin. Data näytetään keskiarvo kolmen rinnakkaisen ± SD 3 kokeita.

Down-asetus kystatiini C liittyy invaasiota PC3 Cells

Koska PC3-solut ovat invasiivisia, ilmaista kohtalainen kystatiini C ja on puute toiminnallinen AR, mikä voi olla erinomainen malli yhdistettynä tutkimuksiin kystatiini C ja Jälleenkytkentätoiminto. PC3-solut transfektoitiin kystatiini C siRNA vektori tai ohjaus siRNA vektorin 24 tuntia. Immunoblot-analyysi vahvisti, että kystatiini C siRNA erityisesti esti proteiinin ilmentymistä kystatiini C PC3-soluissa (kuvio 4A). Vaikutuksen tutkimiseksi kystatiini C kaataa päälle moduloimalla invasiivisen aktiivisuuden PC3-solujen in vitro invasiivisia aktiivisuuden analyysit suoritettiin arvioimaan osuutta PC3 soluja, jotka ilmentävät kystatiini C siRNA tai kontrolloida siRNA jotka ovat tunkeutuneet läpi Matrigel päällystetty kalvoja. Merkittävästi suurempi osuus PC3-soluja, jotka oli transfektoitu tilapäisesti kystatiini C siRNA, muuttivat kautta matrigeeliä päällystetty kammioiden verrattuna PC3-soluja, jotka on transfektoitu ohjaus siRNA (kuvio 4B-C). Seuraavaksi arvioi kystatiini C Knockdown saattaa olla vaikutusta leviämisen eturauhasen syöpäsoluja. PC3-solut transfektoitu kystatiini C siRNA tai ohjaus siRNA alistettiin BrdU. Solujen lisääntyminen arvioitiin 24 tunnin kuluttua tai 48 tunnin transfektion. Ei merkittäviä eroja leviämisen hinnat välillä PC3-solut transfektoitiin siRNA: lla on kystatiini C: n tai kontrolli-siRNA: havaittu (tuloksia ei ole esitetty), mikä viittaa siihen, että inhibitio kystatiini C ei ollut vaikutusta PC3-solujen lisääntymisen. Olemme myös arvioida vaikutuksia kystatiini C solusyklin jakeluun. Virtaussytometrianalyysin suoritettiin transfektoiduissa soluissa kystatiini C siRNA tai kontrolloida siRNA, emme todeta, että hiljentäminen kystatiini C ollut merkittävää vaikutusta jakautumiseen solusyklivaiheista PC3-soluissa (tuloksia ei ole esitetty). Seuraavaksi halusimme testata onko esto kystatiini C voi olla mitään vaikutusta jäänteitä PC3-solujen vastauksena hoidon sytotoksisen aineen. PC3-solut transfektoitiin siRNA: lla on kystatiini C: n tai kontrolli-siRNA käsiteltiin sytotoksinen aine kamptotekiinillä 10 ng /ml aiheuttamaan apoptoosin. Hoito PC3-solujen camptothecin menestyksekkäästi indusoi solukuolemaa PC3-soluissa. PC3-solut transfektoitiin siRNA: lla vastaan ​​kystatiini C, mutta ei osoittanut mitään merkittävää eroa kamptotekiini indusoiman apoptoosin verrattuna PC3-soluja, jotka on transfektoitu ohjaus siRNA (tuloksia ei ole esitetty).

A). Immunoblottauksen kystatiini C PC3-soluissa hoidon jälkeen ohjaus (siCtr) ja kystatiini C (siCys) siRNA. B-C) Invasion määritystä matrigel- päällystetty Boyden kammioihin PC3-solujen knockdown kystatiini C. edustajan kuva hyökkäävän solujen on esitetty (B) ja kvantitatiivinen analyysi hyökkäystä mittaamalla absorbanssi värjäyksen jälkeen hyökkäävän solujen Cell Stain Solution sisältävien kristalliviolettia toimitetaan TranswellTM invaasiomääritys (Chemicon, Millipore, CA) (C) Data ± SD edustavat vähintään 3 kokeet; * p 0,01 (Student T-testi).

Koska esto kystatiini C PC3-soluissa oli merkittävä vaikutus PC3 soluinvaasiota, me siis arvioi yliekspressio kystatiini C saattaisi olla estäviä vaikutuksia invasiivisen käyttäytymisen PC3-solujen. Indusoida yli-ilmentyminen kystatiini C PC3-soluissa, PC3-solut transfektoitiin kystatiini C ekspressiovektoriin tai tyhjällä ekspressiovektorilla. Vakaa yli-ilmentyminen kystatiini C PC3-soluissa saavutetaan antibioottiselektiolla. Yliekspressio kystatiini C PC3-soluissa varmistettiin immunoblot-analyysillä (kuvio 5A). Kun tutkimme vaikutus yliekspressio kystatiini C PC3 soluinvaasion, olemme huomanneet, että merkittävästi pienempi osuus PC3-solujen yli-ilmentävät kystatiini C siirtää läpi Matrigel-pinnoitettu Boyden kammiot verrattuna soluihin, jotka ilmentävät kontrollivektorilla (kuvio 5B-C). Yhdessä nykyisen tiedon perusteella tärkeä rooli kystatiini C estää eturauhassyövän soluinvaasiota.

A) Immunoblotti kystatiini C PC3-soluissa, kun vakaa transfektion pcDNA3.1 ja kystatiini C-pcDNA3.1 plasmidit . Vakaa klooneja perustettiin 2 viikon kuluttua valinta neomysiiniä. B-C) invaasiomääritys PC3-solujen yli-ilmentymisen kontrolli tai kystatiini C plasmideja. Edustavat kuvat solujen esitetään B ja kvantifiointiin (absorbanssi) Tietojen + SD 3 erilliselle kokeelle on esitetty C. * p 0,05 (Student T-testi).

rooli Erk2 Pathway in kystatiini C välittämä vaikutukset Invasion

Seuraavaksi halusimme tutkia solumekanismeja ja kanavat, joita kystatiini C kykenee sen vaikutus PC3 soluinvaasiota. MAPK signalointipolkujen ja TGFp väyliä on osoitettu olevan toiminnallinen yhteys proteolyyttisten entsyymien kuten katepsiini perheen proteiineja, jotka edistävät hajoamista tyvikalvon, tehostaa solujen invaasiota ja ylläpitää kasvaimen solujen kasvua. Smad 2/3 proteiinit ovat loppupään efektoreita TGFp signalointi ja tavoite MAPK /ERK reittejä samoin, siksi halusimme tutkia, onko kystatiini C voi olla välitön toiminnallinen yhteys näihin signalointireittejä. Olemme ensinnäkin tutkittava, kystatiini C saattaa välittää toimintaan MAPK ja TGFp reitit säätelemällä ilmaisua ja fosforylaatiota Smad2 ja Erk1 /2 PC3-soluissa. Tutkimme fosforylaatiota Smad2 ja Erk1 /2 PC3-soluissa, jotka on transfektoitu kystatiini C siRNA tai ohjaus siRNA (kuvio 6A). Immunoblot-analyysi paljasti, että tason korottamisesta fosforyloidun Smad2 ja Erk1 /2 havaittiin PC3 transfektoiduissa soluissa kystatiini C siRNA, mikä viittaa siihen, että molemmat Smad2 ja Erk1 /2 voi olla alavirran efektorit estyy kystatiini C (kuvio 6A).

A). Immunoblottianalyysi P-Smad2 PC-3-solujen jälkeen hiljentäminen of Smad2. B-C). Invaasiomääritys PC-3-solujen jälkeen hiljentäminen of Smad2 samanaikaisesti knockdown kystatiini C. edustaja kuvaa esitetään B ja määrällisten tulosten 3 itsenäisen kokeen esitetään C. * p 0,05 (Student T-testi). D). Immunoblottauksella vasta-aine fosforyloidun (Ser383) -Elk1 ja kystatiini C lysaatit PC3 transfektoitu lyhytaikaisesti siRNA kystatiini C ja hallita siRNA ja yhteistyötä käsiteltiin Erk2 estäjän (25 uM). Huomaa, että Erk2 estäjä estää alavirtaan fosforylaatiota Elk1 tavoitteeksi Erk2 soluissa kanssa knockdovvn kystatiini C. Tiedot edustavat 2 kokeita. E-F). Invaasiomääritys PC-3-solujen samanaikaisen vaiennettu kystatiini C ja estämällä Erk2 kanssa selektiivinen. Edustaja kuvat näkyvät D ja määrällisten tulosten 2 itsenäisen kokeen on esitetty E. * p 0,05, # p 0,01 (Student T-testi).

toiminnallisesti tutkia roolia Smad2 aktivaatio PC3-soluissa, testasimme jos kohdistettuja Smad2 knockdown ollut vaikutusta kasvainsolun invaasiota. Suunnittelimme siRNA nimenomaan kohdistaa Smad2. Esto Smad2 fosforylaation kautta Smad2 siRNA-välitteisen knockdovvn-saavutettiin PC3-soluissa ja vahvistettiin immunoblottauksella (tuloksia ei ole esitetty). In vitro invasiivisia -aktiivisuusmääritykset paljasti, että osuus muuttavien ja hyökkääviä PC3-solut olivat samanlaisia ​​PC3 transfektoiduissa soluissa Smad2 siRNA ja PC3 transfektoiduissa soluissa ohjaus siRNA (kuva 6B-C). Sitten suoritetaan samanaikaisesti kohdennettua knockdovvn Smad2 ja kystatiini C PC3-soluissa. PC3-solut, jotka oli kotransfektoitiin kystatiini C siRNA ja Smad 2 siRNA tai ohjaus siRNA oli edelleen sovellettu hyökkäystä kammio invaasiomääritys. Ei ollut eroja hyökkäyksen nopeuden välillä PC3-solut ilmensivät samanaikaisesti kystatiini C siRNA ja Smad 2 siRNA ja PC3-solut ilmensivät samanaikaisesti kystatiini C siRNA ja hallita siRNA (kuva 6B-C), mikä viittaa siihen, että esto Smad2 ollut mitään ylimääräisiä vaikutuksia moduloiva invaasio PC3 soluja, jotka ilmentävät kystatiini C siRNA ja että Smad2 voivat ole mukana kystatiini C-välitteistä kasvainsolun invaasiota.

Koska kasvu tason fosforyloidun Erk1 /2 havaittiin myös PC3 transfektoiduissa soluissa kystatiini C siRNA edellä kokeissa siksi Tutkimme lisäksi aktivointi Erk1 /2: n välittämien estävää vaikutusta kystatiini C PC3 soluinvaasion. Hoito MEK-inhibiittorin (PD98059), yleinen inhibiittori MAPK polkuja ei ollut vaikutusta invasiivisen käyttäytymisen PC3-soluja, jotka ilmentävät kystatiini C siRNA tai ohjaus siRNA (tuloksia ei ole esitetty). Päätimme selektiivisesti inhiboi Erk 1 tai Erk2.

Ensinnäkin esti Erk 1 ilme kautta siRNA kohdennettuja knockdown. Inhibition of Erk 1 ei ollut vaikutusta hyökkäyksen PC3-soluja, jotka ilmentävät kystatiini C siRNA (tuloksia ei ole esitetty), mikä viittaa siihen, että Erk1 voidaan ole mukana kystatiini C liittyy kasvainsolun invaasiota. Seuraavaksi käytimme selektiivinen Erk2 toimintaa, joka esti fosforylaatio Elk-1, alavirran kohde Erk2, PC3-solut, jotka ilmentävät kystatiini C siRNA (kuvio 6D). Havaitsimme, että Erk 2 estäjä estivät merkittävästi nopeuden invaasiokyvyn soluissa, jotka ilmentävät kystatiini C siRNA verrattuna soluihin, jotka ilmentävät ohjaus siRNA (kuvio 6E-F). ERK2 estäjä ei ollut vaikutusta solujen lisääntymiseen PC3-soluissa samoissa olosuhteissa (tietoja ei ole esitetty). Nämä tulokset viittaavat siihen, että Erk2 voi olla myötävirtaan kohde kystatiini C. Tämä viittaa siihen, että PC3-soluja, jotka on alhainen kystatiini C ja korkea Erk2 toiminta voi tulla enemmän invasiivisia verrattuna solujen normaalin kystatiini C ja Erk 2 toimintaa. Edelleen, kystatiini C voidaan välittää kasvainsolun invaasiota kautta MAPK /Erk2 signalointireittejä.

AR Tehostaa Cell Invasion puuttuessa kystatiini C

AR on tärkeä alavirtaan tavoite MAPK /Erk kulkuväylillä ja inhibitio Erk1 /2: n aktiivisuuden johtaa vähentynyt ilmentyminen AR eturauhassyöpäsoluissa [41]. Yliekspressio AR PC3-soluissa on osoitettu vaikuttavan solujen invaasion ja kasvun in vitro [42]. Koska olemme luoneet välitön toiminnallinen yhteys kystatiini C ja Erk2 toimintaa, ja olemme osoittaneet, että PCa potilaalla on matala kystatiini C tasoja ja samanaikainen korkea AR osoitti taipumusta huonompaa tulokseen kuin potilailla, joilla on korkea kystatiini C ja korkea AR tasoilla, siksi halusimme arvioida solu- ja molekyylitason yhteydestä kystatiini C ja AR. Käytimme PC3-soluja, joista puuttuu toiminnallinen AR tutkia yhteistoimintaan rooli välillä AR ja kystatiini C. PC3-solut kotransfektoitiin AR ilmentävällä vektorilla yhdessä kystatiini C siRNA vektori on nimetty ”siCysC, AR”, tai kontrollivektorilla nimetty ”sictr, AR”. Samalla tavalla, PC3-solut olivat myös ko-transfektoitiin CMV-vektorin ja kystatiini C siRNA (nimetty ”siCysC, CMV”) tai CMV-ilmentävällä vektorilla ja ohjaus siRNA ( ”sictr, CMV”). Transfektoidut PC3 jälkeen solut altistettiin varten invaasiomääritys. Yliekspressio AR samanaikaisen knockdovvn kystatiini C johti merkittävään kasvuun määrä hyökkäyksen PC3-solujen kontrolleihin verrattuna (kuvio 7A-B). Näin ollen, nämä tulokset viittaavat siihen, että PC3-soluja, joilta puuttuu kystatiini C, mutta on korkea AR voi olla invasiivisia kuin ohjaus solujen normaalin kystatiini C: n ja AR.

A-B). Invaasiomääritys PC3 transfektoitujen solujen ohjaus siRNA tai vastaan ​​kystatiini C ja ilmensi AR. Otettuja kuvia edustavasta kokeesta esitetään A ja määrällisen absorbanssit hyökkäävän soluja (* p 0,05, kystatiini C siRNA versus siRNA ohjaus, # p 0,05 AR vs. CMV, Student T-testi) todettuaan, jossa Cell Stain Solution toimitetaan Transwell invaasiomääritys (Chemicon, Millipore, CA) on esitetty B ovat edustavia 3 itsenäistä koetta.

keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että

in vitro

vaiennettu kystatiini C erityisillä siRNA lisääntynyt syöpäsoluinvaasiota yhteistyössä Erk2 ja AR signalointi. Me purkautui romaani molekyylitason mekanismeja, joilla kystatiini C vaikuttaa tuumorisolujen invaasio osoittavat, että kystatiini C ilmentyminen säädeltiin vähentävästi perusterveydenhuollossa eturauhaskasvaimissa verrattuna hyvänlaatuinen kudosten 448 potilaalla. Käyttämällä TMA sisältää hyvänlaatuinen ja kasvain näytteet 448 potilasta, osoitimme käänteinen korrelaatio kystatiini C ja MMP2 ilme. Useat tutkimukset ovat vakuuttavasti osoittaneet, että kystatiini C on tärkeä estäjä katepsiini B ja kasvainsolun invaasiota [43], [44]. Katepsiini B vaikuttaa kasvaimen mikroympäris- hajoamisen soluväliaineen ja aktivoimalla muita proteolyyttisiä entsyymejä, kuten pro-urokinaasi plasminogeeniaktivaattorin (pro-uPA) ja matriksimetalloproteaaseja (MMP: t) siten, että kasvainsolut voivat aktiivisesti hyökätä ja etäispesäkkeitä [45]. Yliekspressio kystatiini C on osoitettu estävän invasiivisia potentiaalia ihmisen melanooman ja glioblastoomasolulinjoissa [36], [43]. Nykyinen havainto tutkimisesta kliinisten materiaaleista osoittaa, että on olemassa suora yhteys kystatiini C ja soluväliaineen proteiinien MMP2 eturauhassyövässä. Emme ole tutkineet roolia kystatiini C modulaatioon katepsiini B toiminnan eturauhassyövän soluissa, mutta se on avoin mahdollisuus huomioon vastaavat seurantatietoja muu kasvaimia. Proteomi allekirjoitukset ovat tunnusmerkkejä proteolyysin paljasti pilkkomisen monia tunnettuja MMP-2 alustoille solujen yhteydessä. Proteomiikan näyttöä MMP-2 käsittelyä uusien substraattien todettiin. Kystatiini C-proteiini on yksi substraatti, joka pilkotaan MMP-2 [40]. Tarjoamme edelleen todisteita aiemmin ehdotettu rooli kystatiini C estää kasvaimen kehittymisen ja syöpäsolujen invasiivisuus, mikä mahdollisesti johtuu sen kyvystä inhiboida soluväliaineen proteiinien [46], [47].

toiminta-analyysi PC-3-solut osoittivat lisäksi, että esto kystatiini C kautta siRNA-välitteisen knockdown johti merkittävään kasvuun määrä hyökkäyksen PC3-solujen. Tämä havainto on johdonmukainen aiempien mielenosoituksessa ensisijainen Eturauhaskasvainten jossa kaikkein invasiivisia kasvaimia oli hyvin alhainen tai havaita kystatiini C ilme. Täten kystatiini C voi olla toiminnallisesti tärkeitä solujen käyttäytyä normaalisti, mikä on yhdenmukaiset nykyisen tulokset PC3-solut yli-ilmentävät kystatiini C kautta ohimenevän transfektion näkyy vähemmän invasiivisia fenotyyppejä.

Erk-MAPK-reitin on yhteiset merkinantomekanismi useita kasvutekijöitä, jotka ovat mukana metastaattisen leviämisen ja lääkeresistenssideterminantit [48]. Käyttämällä siRNA vastaan ​​kystatiini C, osoitimme, että kystatiini C käänteisesti yhteydessä invasiivisen käyttäytymisen PC3 soluja, ja että kystatiini C oli mukana säätelyssä Erk kinaasiaktiivisuutta.