Krooninen sairaus

tiivistelmä

Irinotecan, analogi kiinilla käytetään usein yksinään tai yhdessä muiden syöpälääkkeiden hoitoon kolorektaalisyövän. Kuitenkin lääkeresistenssin kasvaimia on merkittävä este onnistuneen syövän hoitoon. Tässä tutkimuksessa olemme todettu, että solut saavat krooninen vastustuskykyä irinotekaania. Olemme profiloitu niiden ero geenin ilmentymistä käyttäen mikrosirulla. Sen jälkeen geeni ontologian (GO) ja Kegg polun analyysi microarray data, me erityisesti tutkittu, onko Sestrin3 saattaa heikentää irinotekaanin vastus. Tuloksemme paljasti, että Sestrin3 tehosti syövänvastainen vaikutus irinotekaanin

in vitro

LoVo soluissa, jotka oli hankittu resistenssi irinotekaania. Irinotecan kestävä LoVo solut osoittivat alempi reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tuotanto kuin niiden irinotekaania herkkä vanhempien soluissa. ROS tuotanto lisääntyi Sestrin3 Knockdown in irinotekaania resistenttien LoVo soluissa. Tuloksemme osoittavat, että Sestrin3 voisi olla hyvä tavoite kehittää hoitomuotoja, jotka voivat auttaa voittamaan resistenssin irinotekaania.

Citation: Choi SH, Hong HK, Cho YB, Lee WY, Yoo HY (2015) tunnistaminen Sestrin3 osallisena

in vitro

resistanssi peräsuolen syövän solut on Irinotecan. PLoS ONE 10 (5): e0126830. doi: 10,1371 /journal.pone.0126830

Academic Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu 4 marraskuuta 2014; Hyväksytty: 08 huhtikuu 2015; Julkaistu: toukokuu 14, 2015

Copyright: © 2015 Choi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Kaikki microarray data tiedostot ovat saatavilla GEO tietokannasta (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) kautta hakunumerolla GSE59501.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia Korea Health teknologian R Welfare, Korean tasavalta (HI14C3418), National Research Foundation of Korea (NRF-2013R1A1A2060410) ja Samsung Medical Center avustusta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolisyövän ilmaantuvuus on yli miljoona vuodessa maailmanlaajuisesti, jossa kuolleisuus on enintään 33% kehittyneissä maissa [1]. Peräsuolen syöpä on viides yleisin syöpä. Kemoterapia on tunnustettu tehokas hoidettaessa metastasized peräsuolen syöpä. Tyypillisesti, fluorourasiili (5-FU), on käytetty yhtä hoitoa. Kuitenkin viimeisten kahden vuosikymmenen aikana, kliininen käytäntö on käyttänyt sytotoksiset lääkkeet kuten fluoropyrimidiiniä, irinotekaani ja oksaliplatiini. Standard yhdistelmä kemoterapiahoitojen ovat FOLFIRI (foliinihappo, fluorourasiili, ja irinotekaani), CapIri (kapesitabiini ja irinotekaani), FOLFOX (foliinihappo, fluorourasiili, ja Oksaliplatiini), tai CapOx (kapesitabiini ja oksaliplatiinin). Korvaamalla irinotekaania oksaliplatiinin on osaltaan parantanut eloonjäämisaste [2, 3]. Irinotekaani (CPT-11), johdannainen luonnon kiinilla on tärkeä hoitava lääke metastasoituneen kolorektaalisyövän (CRC) potilasta [4]. Irinotekaani on kemiallisesti muunnettu sen aktiiviseen muotoon, 7-etyyli-10-hydroksikamptotesiinin (SN-38), joka estää DNA: n topoisomeraasi. Sakkauskohtaus- topoisomeraasi klo replikaatiohaarukan SN-38 indusoi pysyvä DNA kaksijuosteisen tauko, joka tuottaa DNA-vaurioita vastaus (DDR). DNA-vaurio on ensisijaisesti havaitaan kinaasien ATR ja ATM lisääntynyt aktiivisuus, joka johtaa aktivoinnin tarkastuspiste-kinaasien CHK1 /Chk2 ja myöhemmin fosforylaatiota p53. Fosforyloituu p53 on vakaampi, joka voi aktivoida apoptoosin tai säätelevät solusyklin pysähtymiseen. p53 on myös tärkeä rooli antioksidantti vasteen, joka löydettiin kautta tunnistaminen uusi Sestrin (

SESN

) geenin perhe, joka on mukana reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) asetuksen [5]. Perustuen ensisijaisen ja toissijaisen rakenteen analyysi käyttäen PSI-BLAST ja 3DPSSM ohjelmia,

SESN

perhe on raportoitu koodaamaan antioksidantti proteiineja [6, 7]. Sestrin proteiineilla on korkea homologia

Mycobacterium tuberculosis

proteiinia AhpD, niillä on yhtäläisyyksiä niiden N-pääaluetta [5]. Ne ovat vastuussa katalysoimaan vähentämiseksi peroxiredoxins (Prdx), joka metaboloi peroksidit [8]. AhpD proteiini, komponentti alkyyli-hydroperoksidi reduktaasin osallistuvat puolustus vastaan ​​ROS, vastaa elvyttämiseen AhpC jäsenen konservoituneen perheen tiolia erityisiä peroksidaasit (Prxs) [9].

Sestrin1

ja

Sestrin2

geenejä säädellään transkriptionaalisesti valvonnassa p53, kun taas

Sestrin3

säätelee AKT /FOXO akselin kautta FOXO1 /FOXO3a välittämän geeni ilme [5, 10].

Sestrin3

on mukana myös ROS vieroitus sekä viivästyttää solujen vanhenemista kautta FOXO [11]. Niistä kolme jäsentä Sestrin perheen kolmas jäsen,

Sestrin3

, on raportoitu kirjallisuudessa vähemmässä määrin kuin kahteen muuhun.

Vaikka irinotekaani näyttää voimakas aktiivisuus laajaa erilaisia ​​kasvaimia, mukaan lukien peräsuolen kasvaimet, lääkeresistenssin edelleen merkittävä este tehokkaalle kemoterapiaa. Siksi uudet tavoitteet voittaa lääkeresistenssin tarvitaan onnistuneen syövän hoitoon. Useita hypoteeseja on ehdotettu koskien mekanismeja vastustuskyvyn CPT, myös vähensi solujen kertyminen CPT takia aktiiviseen ulosvirtaus ATP: n sitoutuminen kasetti (ABC) kuljettajat, entsyymisysteemejä merkitystä metabolisen muuntaminen, muutos rakenteessa tai sijainti topoisomeraasi I ja muutokset soluvasteen CPT-TOPI-DNA ternäärinen kompleksin muodostumiseen [7]. Vaikka useita kokeellisia lähestymistapoja on yritetty kliinisesti voittaa yksittäisiä resistenssin [7], huomattavaa menestystä on vielä saavuttamatta.

Tässä tutkimuksessa olemme perustaneet solulinja, joka hankittiin krooninen vastustuskykyä irinotekaania. Tavoitteena oli verrata transkription profiili irinotekaani kestävä peräsuolen syövän solulinjan että vanhempien irinotekaania herkkien solujen, etsiä uusia merkkiaineita lisätä herkkyyttä irinotekaani. Tutkimme myös, onko Sestrin3 voisi parantaa syövän vastaista vaikutusta irinotekaanin

in vitro

, irinotekaanikohortissa kestävä peräsuolen syövän solulinja.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja kulttuuri olosuhteissa

ihmisen paksusuolen syövän solulinjat HCT116, HCT15, HCT29, KM12SM, SW620, DLD1, Colo205, ja LoVo saatiin American Type Culture Collection (ATCC). Solulinjoja viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, 1 mM natriumpyruvaattia, ja 2,05 mM L-glutamiinia, 37 ° C: ssa. Solulinjat tarkastetaan säännöllisesti identiteetin ja mykoplasmatulehduksen käyttäen MycoAlert mykoplasman detektioreagenssipakkaus (Lonza).

Western blot-analyysi

Solut lyysattiin RIPA-puskuriin (50 mM Tris, 150 mM NaCl: a , 1% NP-40, 0,5% natriumdeoksikolaatti ja 0,1% natriumdodekyylisulfaattia), johon oli lisätty proteaasi-inhibiittoreita ja fosfataasi-inhibiittorit. Vasta-aineita käytetään immunoblottauksella olivat kanin monoklonaalista anti-ATM (D2E2, Soluviestintä), kanin polyklonaalinen anti-fosfo-Chk1 (Ser317, Soluviestintä), kanin polyklonaalinen anti-ATR, TopBP1, CTIP (Bethyl laboratoriot), ja hiiren monoklonaalinen anti- NBS1 (1D7, Novus Biologicals). Polyklonaalisia vasta-aineita Sestrin3 ostettiin Abcam. Hiiren monoklonaalinen anti-Chk1 (G-4) ja anti α-tubuliinin ostettiin Santa Cruz biotekniikan. Vasta-aineita AMPKα (23A3), fosfo-AMPKα (Thr72, 40H9), p70S6K ja fosfori-p70S6K (Thr389, 108D2), mTOR (7C10), ja fosfo-mTOR (Ser2448) ostettiin Cell Signaling.

kehittäminen irinotekaani vastustuskykyisten solulinja

Jos haluat luoda vakaa peräsuolen syövän solulinja kroonisesti vastustuskykyinen irinotekaani, LoVo solut altistettiin irinotekaanilla aluksi 0,1 umol /l RPMI 1640 10% FBS: ää. Kun viljeltyjä soluja saavutti konfluenssiin 80%, 20% soluista maljattiin uudelleen seuraavan kanavan. Solut siirrostettiin 3 kertaa samana pitoisuutena irinotekaanin varmistaa niiden mukauttamiseksi ja käsiteltiin sitten 2 kertaa korkeampi pitoisuus irinotekaanin. Pitoisuus irinotekaanin peräkkäin kasvoi, kunnes se saavutti loppupitoisuuteen 8 umol /l. Irinotekaani ostettiin Sigma-Aldrich.

elinkykyyn ja sytotoksisuusmäärityksissä

peräsuolen syövän solulinjat ympättiin 96-kuoppaisille soluviljelylevyille RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen elatusaine korvattiin tuoreella alustalla, joka sisälsi irinotekaani. Eri pitoisuuksia irinotekaani käytetään hoidettaessa solujen 72 tuntia. Solujen elävyys tai sytotoksisuus arvioitiin käyttämällä Cell Counting Kit-8 (CCK-8) määrityksen mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 10 ui CCK-8-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyjä inkuboitiin 2 h ajan 37 ° C: ssa. Absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä.

klonogeeninen -eloonjäämiskoe

Soluja viljeltiin väliaineessa, joka sisältää irinotekaanin pitoisuuksina 0,05, 0,1, 0,4, 0,8, 1,5, ja 3 uM, tässä järjestyksessä . 24 tunnin kuluttua solut irrotettiin ja ympättiin 60 mm: n viljelymaljoille. Jälkeen 14 päivää, jäljellä olevat pesäkkeet pestiin PBS: llä, värjättiin kristallivioletilla, ja sitten lasketaan mukaan määritelty pesäkkeiden kokoa. Kaikki kokeet olivat itsenäisesti toistuvasti vähintään 3 kertaa. Tilastollinen merkitys ero pesäkemäärät määritettiin käyttäen kaksisuuntaista Studentin t-testiä.

Solusyklianalyysiä

solusyklin analyysit, virtaussytometria suoritettiin käyttäen LoVo soluja käsiteltiin tai ilman irinotekaanin. Lyhyesti, solut irrotettiin trypsiinillä, pestiin PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen 0,5 ml: aan PBS: ää. Kiinnityksen jälkeen 4,5 ml: lla 70% etanolia, soluja inkuboitiin jäillä 2 tuntia. Kiinnitetyt solut pestiin, suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan propidiumjodidivärjäys, joka sisälsi 0,1% (v /v) Triton X-100, 0,2 mg /ml RNaasi A: n ja 20 ug /ml PI, inkuboitiin huoneen lämpötilassa 30 min, ja sitten pidettiin jäillä, kunnes virtaussytometria-analyysi suoritettiin.

RNA Interference (RNAi) B

ohimenevä RNA vaiennettu, solut transfektoitiin siRNA-kohdistaminen Sestrin3 (siSESN3) tai ei-suunnattu siRNA (siControl), käyttäen lipofektamiini RNAiMAX transfektioreagenssia (Life Technologies).

mittaaminen solujen ROS

sukupolven solunsisäisten ROS arvioitiin käyttämällä CellRox vihreä oksidatiivisen stressin reagenssia ( Invitrogen). Lyhyesti, solut transfektoitiin siRNA: illa 48 tunnin ajan ja sen jälkeen inkuboitiin 5 uM CellRox reagenssin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Kun oli pesty kahdesti PBS: llä, fluoresenssin intensiteetti mitattiin käyttämällä fluoresenssimikroskopiaa.

RNA: n eristäminen ja geeniekspressioprofilointi

Esillä olevassa tutkimuksessa olemme suoritetaan globaali geenin ilmentymisen analyysit käyttäen Affymetrix GeneChip Human Gene 1,0 ST oligonukleotidisirujen käyttäen LoVo soluja ja irinotekaani kestävä LoVo-R8 soluja viljeltiin kanssa tai ilman irinotekaanin (8 uM). Näytteet laadittu ohjeita ja suosituksia, joita valmistaja. Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit pylväät (Qiagen). RNA laatu arvioitiin käyttämällä Agilent 2100 bioanalysaattorin RNA: n kanssa 6000 Nano Chip (Agilent Technologies). RNA-määrä määritettiin käyttäen ND-1000 spektrofotometriä (NanoDrop Technologies, Inc.). RNA-näytteet (300 ng kutakin) käytettiin syötteenä Affymetrix kuvatulla protokollassa. Lyhyesti, 300 ng kokonais-RNA: ta kustakin näytteestä muutettiin kaksijuosteiseen cDNA käyttämällä satunnaista heksameeriä, joissa on T7-promoottori. Amplified-RNA valmistettiin kaksijuosteinen cDNA mallia vaikka

in vitro

transkription ja puhdistetaan, ja Affymetrix näytteen siivous moduuli. cDNA uudistettiin käänteistranskriptiolla käyttämällä satunnaisia ​​alukkeita ja dNTP sisältävän dUTP. cDNA sitten pirstoutunut UDG ja APE 1 restriktioendonukleaaseilla ja lopun leimata terminaalitransferaasientsyymiä reaktio, joka sisällytetään biotinyloitua dideoksinukleotidisekven-. Hajanaiset ja end-leimattu cDNA hybridisoitiin käyttäen GeneChip- Human Gene 1.0 ST paneelit 16 tuntia 45 ° C: ssa ja 60 rpm, kuten on kuvattu Gene Chip Koko Transcript (WT) Sense Tavoite Merkinnät Pitoisuus Manual (Affymetrix). Hybridisaation jälkeen sirut värjättiin ja pestä GeneChip- Fluidics Station 450 (Affymetrix), ja skannattiin GeneChip- Array skanneri 3000 7G (Affymetrix). Tilastollista analyysiä, havaitseminen puhelu (Present /poissa) kertyi Affymetrix mikrosiru Suite 5 (MAS5) algoritmia. Skannattu raaka tiedostot tuotiin tilastollinen ohjelmointiympäristö R (Version2.3), tarkempaa analysointia työkaluja saatavilla Bioconductor Project. Expression data normalisoitiin ja log2-transformoitiin käyttäen vankka multichip keskiarvo (RMA) menetelmä toteutetaan Bioconductor pakkauksessa RMA (M2, M3). Melun vähentämiseksi merkityksen analyysiin, koetin asetetaan, jotka eivät osoittaneet havaitsemista puhelutaajuuden vähintään 50% näytteistä oli suodatettu pois. Erittäin ilmaistuna geenejä, jotka oli 2-kertainen muutos ilmeneminen. Tulokset luokiteltiin käyttäen hierarkkinen klusterointialgoritmeja toteutettu TMEV ohjelmiston 4.0. Array tiedot talletettiin Gene Expression Omnibus hakunumerolla GSE59501.

Tilastollinen

In vitro

kokeelliset tiedot saatiin kokeista kolme kertaa kolmena kappaleena. Keskiarvot laskettiin, ja merkittävyys määritettiin käyttäen Student kaksiosaisella testi.

P

arvojen 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

perustaminen irinotekaania resistenttejä solulinjoja

Ennen tuottaa koolonisyöpäsolulinja kanssa kehittynyt resistenssi irinotekaani, testasimme sytotoksisuutta irinotekaani useaan peräsuolen syövän solulinjat tunnistaa herkin yksi. Kahdeksan solulinjat, Lövön solulinja oli herkin irinotekaani (kuvio 1A). Sytotoksisuutta irinotekaanin vanhempien ja kestävä LoVo (LoVo-R) soluihin määritettiin käyttäen CCK-8-määrityksessä. Lövön-R solut olivat vastustuskykyisempiä irinotekaania kuin vanhempien LoVo soluja. IC

50-arvot LoVo-R ja vanhempien LoVo olivat 10 uM ja 1,5 uM, tässä järjestyksessä. Olemme perustettu useita vastustuskykyisiä solulinjoja käyttämällä erilaisia ​​lopulliset pitoisuudet irinotekaanin. Kuitenkin samalla tasolla IC

50 havaittiin yli resistenttejä solulinjoja, joilla on erilaiset lopulliset pitoisuudet irinotekaanin (kuvio 1B). Vastus LoVo-R8 solulinja vahvistettiin käyttäen klonogeenisten määritystä (kuvio 1C). Lövön-R8 solulinja sovitettu irinotekaanilla loppukonsentraatioon 8 uM. On tunnettua, että irinotekaanin nimenomaan estää DNA: n replikaatiota pyytämällä topoisomeraasi I DNA-säikeet, asiakkuutta solukierron pysähtymisen G

2 vaihe. Vaikutuksen tutkimiseksi irinotekaanin solun syklin etenemisen LoVo-R8-solut, me analysoitiin edelleen solusyklin tämän solulinjan (kuvio 1 D). Lövön vanhempien soluja, joita oli käsitelty 5 uM irinotekaanin osoittivat vakavia G

2 /M pidätykseen. 24 tunnin kuluttua irinotekaanin hoidon (5 uM), solusyklin pysähtyminen G

2 /M-vaiheessa nähtiin ainoastaan ​​vanhempien LoVo soluja, mutta LoVo-8R käsiteltyjä soluja tai ilman irinotekaanin havaittu eroa niiden solusyklin etenemistä.

(A) herkkyys kahdeksan koolonsyöpäsolulinjoissa irinotekaanille mitattiin käyttäen CCK-8-määrityksessä. CCK-8 määrityksessä, solut altistettiin irinotekaani on annetut pitoisuudet 72 tuntia ennen mittausta. Solujen elävyys on esitetty prosentteina suhteessa käsittelemättömiin soluihin. (B) resistanssi perustettu LoVo-solujen irinotekaani mitattiin käyttäen CCK-8-määritys ja (C) nämä klonogeenisten -eloonjäämiskoe. Pesäkkeet, jotka selvisivät klonogeenisten -eloonjäämiskoe mitattiin sen jälkeen, kun vielä oli inkuboitu vielä 14 päivää. (D) solusyklin etenemisen Lövön-R8. *

p

≤ 0,05.

Geenien ilmentyminen erilaisia ​​analyysi irinotekaania vastustuskykyisten LoVo-R8 solujen

Kun perustamisesta irinotekaani vastustuskykyisten LoVo-8R solulinjoissa, tutkimme heidän geeniekspressioprofiilien käyttäen DNA-siru. Käyttäen suodatinta kriteerinä ainakin 2-kertainen muutos

p

0,05, määrä geenien ilmentymisen muutosten LoVo-8R soluja, verrattuna niiden vanhempien LoVo soluja, määritettiin. Kaikkiaan 599 ja 566 geenejä säädellään ylöspäin ja alassäädetty vastaavasti osuus 3,5% koko geenien testattiin (kuvio 2A ja 2B). Toimiva merkintä näiden geenien suoritettiin käyttäen geeni ontologian perustuva analyysi biologisista ominaisuuksista. Geenien luokiteltu 15 funktionaalisia ryhmiä (kuvio 2A ja 2B). Useimmat näistä geeneistä liittyi tulehdusvastetta, angiogeneesi, solujen lisääntymisen, tai solujen vaeltamiseen.

Genes valittiin käyttäen suodatinta kriteerinä ainakin 2-kertainen muutos verrattuna kontrolleihin, joissa

p

0,05. Geenit, joilla on muuttunut ilme irinotekaanikohortissa kestävä LoVo solulinja, verrattuna alkuperäiseen LoVo solulinja, on luokiteltu 15 toiminnalliset ryhmät perustuvat geeni ontologian. Geeni numerot näkyvät kuvaajat (A) ja tutkittiin geenin numeroita tässä erilaisia ​​analyysi ja prosenttiosuus arvot muuttuneet huomattavasti geenit esitetään taulukossa (B). (C) Hierarkkinen klusterin analyysi irinotekaani vastustuskykyisten LoVo kässoluilmentymisessä mikrosiruja. Klusteri-pohjainen esitys muuttaa geenien irinotekaania resistentit solut intensiteetillä, normalisoitu vanhempien LoVo solulinjaan. Geenit, jotka sääteli suhteessa vanhempien LoVo solut näkyvät punaisina, ja ne, jotka olivat alassäädetty näkyvät vihreinä. Ilmentymistasojen Näiden geenien muutettiin ≥1.5-kertaisesti tai ≤0.6-kertaisesti irinotekaanin kestävä LoVo solulinjat, verrattuna alkuperäiseen LoVo-solulinja. Gene symbolit näkyvät oikealla rivillä.

Hierarkkinen klusterointi lämpö kartta (kuvio 2C) kuvaa malleja muutoksen geeniekspressiotasot havaittu irinotekaanin kestävä LoVo soluissa. Kaikkiaan 24 geenien osoitettiin olla mukana irinotekaanin kautta tai olla solukierron pysähtymisen liittyviä geenejä, jotka perustuvat analyysiin biologisista ominaisuuksista suoritettiin käyttäen geeni ontologian. Yhteensä 53 polkuja todettiin, joka perustuu Kegg reitti analyysi. Koko klusterointi lämpö kartta esitetään lisätietovarasto S1 kuvassa. Analysoimme myös toimintoja tunnettujen geenien mukana irinotekaanin reitin paksusuolen syöpäsoluja. CYP3A4: n ja CYP3A5 osallistuvat muodostumiseen carbonyloxycamptothecin, inaktiivinen metaboliitti irinotekaanin. RNA tasot kaksi ATP-sitovaa kasetti transmembraaniproteiineja (ABC), ABCG2 (tunnetaan rintasyöpä resistance protein) ja ABCB1, dramaattisesti säädellään ylöspäin irinotekaani-resistenttien solujen (kuvio 2C ja S1 taulukko). Tämä ei ole yllättävää, ottaen huomioon, että ulosvirtaus irinotekaanin kasvainsoluissa paljastuu mahdollisena strategia voittaa lääkeresistenssi.

Expression liittyvien geenien koulutusjakson DNA-vaurion tarkistuspisteen

löytää uusia markkereita, jotka liittyvät irinotekaani vastus, olemme tutkineet useiden geenien ekspression mukana DNA-vaurioita tarkistuspiste signalointia. Irinotekaani-herkkien LoVo-solut osoittivat samaa tasoa CTIP (CtBP vuorovaikutuksessa proteiini) ja TopBP1 (topoisomeraasi (DNA) II sitovan proteiinin 1) ilmaisua, annoksesta riippuvalla tavalla. In irinotekaania kestävä LoVo-soluja, CTIP ekspressio oli enemmän tai vähemmän lisätä. Kuitenkin ilmaus TopBP1 ei ole muutettu. CHK1 (CHEK1, tarkistuspiste kinaasi 1) aktivoitiin 5 uM irinotekaanin että vanhempien LoVo soluja. Kuitenkin, CHK1 ei aktivoitu LoVo-8R solut, joita käsiteltiin saman pitoisuuden irinotekaanin (kuvio 3A). Näin ollen ainoastaan ​​fosforyloidun CHK1 osoitti ero ilmentämiskuviota irinotekaania herkillä versus-resistenttien solujen (S2 Kuva). Aktivointi CHK1 altistettaessa säteilylle (IR) tai ultraviolettisäteilyä oli normaali sekä irinotekaania herkkä ja kestävä soluja (kuvio 3B). Kuitenkin fosforylaation taso CHK1 vastauksena IR- ja UV oli suurempi irinotekaania herkkien LoVo soluissa. Nämä tulokset saivat meidät tutkimaan tarkemmin solukierron pysähtymisen liittyviä geenejä, löytää uusia merkkiaineita irinotekaanin vastus.

(A) ilmentyminen useiden geenien DNA-vaurio vasteen irinotekaania resistentit solut. CHK1 aktivoitiin 5 uM vanhempien LoVo soluissa, mutta resistenttejä LoVo solut eivät osoittaneet aktivointi CHK1. (B) DNA-vaurioita, kuten IR ja UV aiheuttama aktivointi CHK1 LoVo ja LoVo-8R soluissa. Fosforylaatio CHK1 vastauksena IR (10 Gy) ja UV (50 J /m

2) oli suurempi LoVo soluissa kuin LoVo-8R soluissa. Kaavio osoittaa fosforylaation taso CHK1. Erot katsottiin merkitsevä

p

0,05 t-testillä. *, Vertailu LoVo solujen vs LoVo-R8 soluissa.

Sestrin3 Knockdown parannettu irinotekaanin solusytotoksisuutta resistenttien LoVo soluissa

Saat merkkiaineita irinotekaanin vastus, olemme analysoineet sääteli geenejä havaittu olevan mukana solusyklin pysähtymiseen, joka perustuu microarray data. Sestrin3 dramaattisesti säädellään ylöspäin Lövön-R8 soluissa (taulukko 1). Sestrin3 pudotus ei vaikuttanut myrkyllisyyttä irinotekaanin vanhempien LoVo-soluihin. Suhteellinen määrä Sestrin3 mRNA-määrä lisääntyi LoVo-R8-solut, ja Western blot-analyysi osoitti, Sestrin3-proteiinin taso oli myös lisääntynyt LoVo-R8-soluissa (kuvio 4A ja 4B). Käyttäen qPCR-analyysi, Sestrin3 transkriptin on todettu säädeltiin transfektoimalla siSESN3, mutta elinkelpoisuus LoVo-solujen ei vaikuttanut siSESN3 jälkeen (kuvio 4C). Sestrin3 Knockdown vähentynyt vastus LoVo-R8 solujen irinotekaani, vähentää sen IC

50 arvoksi 4 uM (kuvio 4D). Sestrins, perheen stressi-indusoituvan proteiineja, jakaa korkea homologia bakteerin AhpD proteiini, joka on vastuussa katalysoimaan vähentämiseksi peroxiredoxins. Mittasimme ROS kertymistä valvotuissa Sestrin3 saavuttamiseksi kussakin solulinjassa (kuvio 4E). LoVo-R8 solut osoittivat alempaa ROS kertymistä kuin niiden vanhempien LoVo soluja. Sestrin3 Knockdown lisääntynyt ROS tuotanto kummassakin solutyypeissä.

(A) suhteellinen määrä Sestrin3 mRNA oli kasvanut LoVo-R8 solun reaaliaikainen PCR. (B) mukaan voimistunut Sestrin3 transkriptio, western blot-analyysi osoitti Sestrin3 proteiinin taso oli myös lisääntynyt LoVo-R8. Hoito Sestrin3 siRNA (siSESN3) tehokkaasti alassäädetty proteiinin taso nousi Sestrin3 LoVo-R8. (C) Sestrin3 Transkriptiä säädeltiin transfektoimalla siSESN3 vuonna qPCR analyysi (vasemmalla). LoVo solut oli altis Irinotekaanin annoksesta riippuvaa, ja elinkelpoisuus LoVo ei vaikuttanut edes siSESN3 hoito (oikealla). Soluja käsiteltiin siSESN3 48 tuntia. Elatusaineita muutettiin väliaineen kanssa, joka sisälsi ilmoitetun pitoisuuden irinotekaanin ja inkuboitiin edelleen 72 tuntia. Solujen elävyys on esitetty prosentteina suhteessa kuin käsittelemättömien solujen. (D) Sestrin3 transkripti oli myös alas säännelty LoVo-R8 transfektoimalla siSESN3 vuonna qPCR analyysi (vasemmalla). LoVo-R8-solut oli resistentti irinotekaani, mutta muuttui alttiita irinotekaani, jonka siSESN3 hoito (oikealla). (E) Fluoresenssikuvat solunsisäisten ROS värjätään CellRox vihreä reagenssia. Solut transfektoitiin ohjaus siRNA tai siSESN3. ROS mitattiin 48 tunnin jälkeen. (F) Western blot, joka osoittaa proteiinin tasot AMPK, p-AMPK, mTOR, p-mTOR, p70S6K, ja p-p70S6K LoVo ja LoVo-R8 tai ilman irinotekaanin. (G) Kaavio tasot proteiineja. Erot katsottiin merkitsevä

p

0,05 t-testillä. *, Vertailu ryhmä ilman irinotekaania vs ryhmä 10pM irinotekaanin LoVo ja LoVo-R8; #, Vertailu LoVo vs LoVo–R8.

Seuraavaksi tutkimme fosforylaatiota AMPK, mTOR ja p70S6K tutkia Sestrin3 vaikuttaa vastustuskykyä irinotekaania kautta AMPK /TORC1 reitin ( kuvio 4F ja 4G). LoVo-R8 solut osoittivat korkeampia ekspressiotasoja AMP aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK) sekä AMPK fosforylaation kuin vanhempien LoVo soluja. Fosforylaatiota mTOR ja S6K (p70S6 kinaasi), joka on mTORC1 substraatti nostettiin LoVo-8R soluissa. Lisäksi LoVo-8R solut osoittivat konstitutiivisen aktivaation AMPK ja mTOR tai ilman irinotekaania verrattuna LoVo- soluihin.

Keskustelu

Irinotekaani on laajalti arvioitu ainoana lääkkeenä sekä yhdistelmähoitoihin muiden kemoterapia huumeita. Sen jälkeen, kun hyväksyntä metastaattisen kolorektaalisyövän, irinotekaani on käytetty hoitamaan useita muita syöpiä, mukaan lukien keuhkosyöpä, mahalaukun syöpä, aivokasvaimet, ja rintasyöpä. Kuitenkin lääkeresistenssin kasvaimen irinotekaanin on rajoittanut sen tehokkuuden kliinisessä hoitoja. Olemme perustaneet vakaa solulinja, joka on vastustuskykyinen irinotekaani. Herkin solulinja valitaan kahdeksasta peräsuolen solulinjoista, jotka perustuvat sytotoksisuusmäärityksiä. Me aiheuttama krooninen vastus altistamalla solut yhä irinotekaaniannosta. Vahvistamaan sopeutumista, solut, jotka hankitun resistenssin viljeltiin huume-väliaineessa kolmelle kohtia. Viljelemisen jälkeen lääkeaine-väliaineessa, Lövön-R8 soluja, jotka oli hankittu resistenssi irinotekaania säilyttänyt sen samalle tasolle kuin juuri perustettu soluja. Microarray data analysoitiin yksilöidä keskeiset geenien tärkeä rooli vastustuskyvyn irinotekaani. Yhteensä 1165 differentiaalisesti ilmentyvien geenien (DEGS) saatiin. Geeni ontologia rikastamiseen analyysi paljasti, että taso Sestrin3 oli kasvanut dramaattisesti. Kuitenkin ekspressiotasot kaksi muuta jäsentä Sestrin perheen, Sestrin1 ja Sestrin2, oli hieman muutettu. Sestrins ovat perheen hyvin säilyneitä, stressi-reagoiva proteiineja. Sestrin1 ja Sestrin2 ovat transkriptionaalisesti säätelee p53. Sestrin3, säätelee forkhead transkriptiotekijä, osoittaa oksidoreduktaasi aktiviteetti

in vitro

. On raportoitu, että SESN3 voi suojata soluja oksidatiivista stressiä moduloimalla peroxiredoxin (Prx) palautuminen [10]. Odotimme, että Sestrin1 ja Sestrin2 ilme olisi säädelty, koska eri DNA-vaurioita aineita tunnetaan vaikuttavan solusyklin etenemisen kautta p53 aktivaation. Meidän array data, S2 Taulukossa esitetään ekspressiotasot Sestrins sekä geenit, jotka liittyvät p53-reitin. Niistä 24 geenit tunnistettu tässä tutkimuksessa olevan mukana irinotekaanin polulle kolorektaalisyövässä ekspressiotasot

CES1

ja

CES2

(mukana muuntaminen pro-lääkkeen irinotekaani ) on pienentynyt noin 25%. Niistä 24 geenit, niitä koodaavat ATP: n sitoutuminen kasetti (ABC) proteiineja, jotka liittyvät ulosvirtausta, kuten

ABCB1

ja

ABCG2

, olivat erittäin up geenien. Kestävyys irinotekaani vaikuttaa DNA: n korjaukseen järjestelmiä.

ERCC1

ja

ERCC2

, jotka osallistuvat nukleotidin Leikkauskorjauksessa, osoitti jonkin verran lisätä niiden ilmaisua. Ilmaisulla on

MLH1

ja

MLH6

(mukana epäsuhta korjausprosessin) muuttunut hyvin vähän. Niistä 24 geenit, jotka osallistuvat apoptoottisen reitin ei osoittanut mitään eroa ilmaisun välillä irinotekaania herkkä ja irinotekaania resistentit solut. Ottaen huomioon nämä vaihtelut geenien ilmentyminen, hankitun vastustuskyvyn irinotekaani LoVo-R8 soluissa saattaa johtua alentuneesta solujen kertyminen irinotekaanin tai muuntaminen irinotekaanin aktiivisen metaboliitin, koska SN-38 oli vähentynyt jonkin verran.

Irinotecan hoitoon liittyy G2 solusyklin pysähtymiseen. Tutkimme luokkaan solusyklin pidätyksen Gene ontologia, löytää päätavoitteisiin solukierron välittämän resistenssin. Sestrin3 oli osoitettu moduloivan Prx uudistumista syöpäsoluissa. Ilmaisu taso Sestrin3 korotettiin transkription aktivaation FOXO1. Vaikka Sestrin perhe on osallisena redox ohjaus [5, 8, 12], viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet rooli Sestrins on mTORC1 signalointia. mTORC1 estetään jäsenten Sestrin perhe (SESN1 /2), kautta AMPK-aktivaatio TSC1 /2 kompleksin [12]. Sestrin3 on raportoitu estää mTORC1, joka perustuu havaintoon, että FOXO1 /3a välittämä transkription säätely ylöspäin Sestrin3 etenee aktivoida AMPK /TSC1 /2, joka lopulta estää mTORC1 toimintaa [13]. Lisäksi, mTORC1 aktivoituminen johtaa kertyminen ROS, jolloin JNK: n aktivaatiota /FOXO signalointia, ja positiivinen takaisinkytkentäsilmukka on Sestrin ilmaisun [5, 14]. Kuitenkin rooli Sestrin3 kasvaimen synnyssä ja kestävyys syöpälääkkeitä edelleen epäselvä. Tutkiminen AMPK /mTOR väylän LoVo ja LoVo-R8 solut osoittivat, että AMPK signaali aktivoitiin irinotekaanin käsitellyistä soluista tai irinotekaania resistenttien solujen (kuvio 4F). Yleisesti odotetaan, että mTOR signalointi esteen alaisena aktiivisella AMPK aiheuttaisivat autophagy [15]. Tutkimuksessamme kuitenkaan AMPK aktivointi ei estänyt mTOR. Vaikka mTOR signalointi liittyy läheisesti AMPK signaali ja on itse asiassa alas-stream AMPK, TSC1 /2 ja Rheb ovat napa molekyylejä mTOR signalointireitin integroimalla erilaisia ​​panoksia [16, 17]. Tutkimuksemme osoittaa positiivista sijasta negatiivinen sääntely suhde AMPK ja mTOR.

tulokset ja tulkinnat keskittyivät antioksidantti vaikutus Sestrin3 vastustuskyvystä syöpälääkkeitä. Yleensä syöpäsoluja läpi aerobinen Glykolyysivaiheen tyydyttämään suuren ravinteiden kysyntä määrättiin solu ja solun ulkopuolelle niiden nopean leviämisen. Vaatimukset lisääntynyt energian tuotannossa aiheuttavat syöpäsolut vakavia oksidatiivisen stressin, joka aktivoi eri puolustus ja korjausmekanismit vastaan ​​genotoksinen huumeita, vaikka ROS voi toimia myös erityisiä toiseksi sanansaattajia signa- osallistuvat solujen lisääntymistä ja erilaistumista. Syöpäsoluissa, kertyminen ROS voi stimuloida solujen proliferaatiota, mutageneesi, ja genomin epästabiilisuuden [18, 19]. Näin ollen, kertyminen suuria määriä ROS havaitaan soluissa, jotka on transformoitu

RAS

onkogeeni [18, 20, 21].