Krooninen sairaus

tiivistelmä

Nikotiini on tunnettu riskitekijä syövän kehityksen ja on osoitettu muuttavan geeniekspressiota solujen ja kudosten altistettaessa . Käytimme Illumina® Next Generation Sequencing (NGS) tekniikka saada puolueeton biologinen käsityksen transcriptome normaalien epiteelisolujen (MCF-10A) ja nikotiinialtistus. Meillä syntyy ilmaisun tietoja 54699 selostukset käyttävät triplikaatit valvonta- ja nikotiinin korosti soluja. Tämän seurauksena tunnistimme 138 ekspressoituu differentiaalisesti selostukset, mukaan lukien 39 tuntemattomia geenejä. Lisäksi 173 selostukset jotka liittyvät ensisijaisesti DNA: n kahdentuminen, rekombinaatio, ja korjaus osoitti todisteita vaihtoehtoisen silmukoinnin. Havaitsimme suurin nikotiini stressin vasteen HPCAL4 (up-säännellään 4,71-kertainen) ja NPAS3 (alas-säädellä -2,73 kertainen); molemmat ovat geenejä, joita ei ole aiemmin liitetty nikotiinialtistus, mutta liittyy syöpään. Olemme myös havainneet merkittäviä alassäätöä (-2,3 kertainen) ja vaihtoehtoisten silmukoinnin NEAT1 (lncRNA), joka voi olla tärkeä, vielä löytämättä sääntelytehtäviin. Gene ontologia analyysi paljasti nikotiinialtistus vaikuttaa geenien solujen ja aineenvaihduntaan. Tämä tutkimus paljastaa aiemmin tuntemattomia vaikutuksia nikotiinin stressiä transcriptome normaalien rintojen epiteelisolujen ja tarjoaa tietoa taustalla biologinen vaikutus nikotiinin normaaleihin soluihin, merkintä perustan tuleville tutkimuksille.

Citation: Bavarva JH, Tae H, Settlage RE, Garner HR (2013) kuvaavat Geneettinen perusta Nikotiini aiheuttama syöpä kehittäminen: transcriptome Sequencing Study. PLoS ONE 8 (6): e67252. doi: 10,1371 /journal.pone.0067252

Editor: Emmanuel Dias-Neto, AC Camargo Cancer Hospital, Brasilia

vastaanotettu: 05 helmikuu 2013; Hyväksytty: 15 toukokuu 2013; Julkaistu: 18 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Bavarva et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Medical Informatics ja Systems Division ohjaajan rahastoon Virginia bioinformatiikan instituutin. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maailmanlaajuisesti yli 1 miljoonaa naista rintasyöpä vuosittain ja yli 410000 kuolee taudin [1]. Suuri kohorttitutkimuksia suoritetaan Yhdysvalloissa ja Japanissa osoittavat, että rintasyövän riski liittyy aktiivisen ja passiivisen tupakoinnin [2], [3]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että 80-90% hengitettynä nikotiini imeytyy systeemisesti aikana tupakointi, 1 mg yhdestä savuke, jolloin pitoisuus plasmassa on noin 15 ng /ml heti tupakoinnin jälkeen [4]. In vivo tutkimukset osoittavat, nikotiinin edistää kiinteiden kasvainten kasvun, mikä viittaa siihen, että nikotiini voi edistää solujen lisääntymistä, invaasiota, ja angiogeneesissä [5] – [7]. Edelleen, nikotiini on osoitettu ohittaa DNA-vaurioita aiheuttama solusyklin G1 /S rajoitus ja siten edistää geneettinen epävakaus [8]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että nikotiini stimulointi voisi muuttaa geenin ilmentymistä endoteeli- ja neuroblastoomasoluja [9], [10]. Mikrosiru perustuva tutkimus liittyy nikotiini stimulaation transkriptiotekijä NF-kB, mutta todettiin, että tulevaisuudessa olisi syytä analysoida, koska ne arvioidaan ainoastaan ​​4,132 geenejä ja oli erittäin todennäköistä tärkeä geenit jäänyt [9]. Toinen mikrosirujen tutkimus neuroblastoomasoluja ehdotti, että fysiologisia ja psykologisia vaikutuksia nikotiinin altistus voi johtua vaikutuksista geenien ilmentymisen, mutta heillä oli samanlaisia ​​teknisiä rajoituksia [10]. Lisäksi tutkimukset nikotiinin puuttuu yksimielisyyteen nikotiinin annostus.

Hypoteesimme puuttuvan yhteyden nikotiinin stressi ja syövän löytyvät käyttämällä puolueetonta sekvensointia lähestymistavan sijasta kohdennettua array lähestymistapaa. Seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) tekniikat, toisin cDNA mikrosiruja käytetään aikaisemmin, mahdollistaa järjestelmällisen tutkimisen tunnettujen, karakterisoimattomat transkriptioekspressiokuvio laajalla dynaamisella alueella, ja vaihtoehtoisia ja uusia silmukointitapahtumia ilman teknologian ja /tai biologisia bias. Tämä all inclusive lähestymistapa voi tarjota parempia vihjeitä monimutkaisia ​​reittejä, ymmärrys karakterisoimattomat selostukset ja puuttuvien tietojen geenisäätelyn alle nikotiinia stressiä, jotka olivat aiemmin ole mahdollista mikrosiruja. Lisäksi valitsimme LD

50 annosta, koska se on standardoitu ja on perustettu tarkka tapa mitata vaikutusten [11]. Tässä kuvaamme havaintoja tämän systemaattisen analyysin ja löysi aiemmin tuntemattomia yhteenliittymien karakterisoimattomat selostukset.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit, kemikaalit ja soluviljelmissä

nikotiini hankittiin Sigma (St. Louis, MO, USA). MCF-10A, normaalin rintakudoksen epiteelisolujen-linja, saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). MCF-10A-soluja viljeltiin DMEM /F12-väliaineessa (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty hevosen seerumia (5%: n lopulliseen, Invitrogen), antibiotics- Pen /Strep (1% lopullisesta, Invitrogen), kasvutekijä-EGF: n (20 ng /ml lopullinen, Peprotech, Rocky Hill, NJ), hydrokortisonia (0,5 mg /ml lopullinen, Sigma), koleratoksiinia (100 ng /ml lopullinen, Sigma), ja insuliinia (10 ug /ml lopullinen, Sigma) 37 ° C: ssa kosteutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% hiilidioksidia.

kokeet

Kaksikymmentäneljä tuntia ennen kokeita, MCF-10A-soluja ympättiin tiheydellä noin 3 x 10

5 solua /kuoppa kuuden kuoppalevyillä tai 5 × 10

7/500 cm

2 square soluviljelymaljoille (Corning). Nikotiini laimennettiin täydelliseen kasvualustaan ​​vaadittu lopullinen sarjanumero pitoisuuksia. Nikotiini annostus kokeet toteutettiin kuudessa kuoppalevyillä 72 tuntia ja lopussa; määrä eläviä soluja laskettiin käyttämällä TC10 BioRad® solulaskijalla. Näitä annoksen kokeet edelleen analysoitiin ja verrattiin että nikotiinin LD

50 annosta (5 mM /811 ng /ml) 500 cm

2 levyä 72 tuntia. Valotuksen jälkeen ajan, kiinnittyneet solut kerättiin RNA uuttamalla käyttäen Qiagen n RNeasy® kit valmistajan ohjeiden protokollaa. RNA asianmukaisesti testattu laadun Nano-drop® ja Bioanalyzer® ennen transcriptome sekvensointi suoritettiin käyttäen Illumina HiSeq®.

transcriptome sekvensointi

RNA kirjastot valmistettiin mukaan TruSeq® RNA näytteen valmistus ohjata kohti valmistajan suositteleman protokollan (Illumina, San Diego, CA). Kokonais-RNA kolmen biologinen rinnakkaisnäytteiden kontrollista ja nikotiinin korosti solupopulaatioiden oli cDNA: ksi. Ilmainen DNA-näytteet leikataan sitten sumuttamalla (35 psi, 6 min). Duplexien olivat tasapäiseksi (suuri Klenow-fragmentti, T4-polynukleotidikinaasia ja T4-polymeraasilla) ja yksi 3’adenosine osan lisättiin Klenow ekso- ja dATP. Illumina adapterit, jotka sisältävät alukekohtia virtauksen solun pinnalla hehkutus, vahvistus ja sekvensointi, sidottiin kiinni korjattu päihin cDNA. Geelielektroforeesia käytettiin valita DNA-konstrukteja 200-250 emäsparia kooltaan, jotka myöhemmin monistettiin 18 sykliä PCR Phusion polymeraasia (NEB). Nämä kirjastot olivat denaturoitiin sitten natriumhydroksidilla ja laimennettiin 15:05 in hybridisaatiopuskurissa lastattavaksi yhden kaistan olevan Illumina HiSeq® virtausta soluun. Ryppäiden muodostumista, alukehybridisaation ja sekvensointi reaktiot olivat mukaan valmistajan protokollaa. Suurikapasiteettisten sekvensointi suoritettiin käyttäen pariksi-end, 100 emäsparin lukee. Yksi virtauksen kaista käytettiin cDNA sekvensointi, jolloin saatiin keskimäärin 45260000 lukee per näyte, jonka keskiarvo laatupisteet 36,3.

RNASeq tietojen analysointi

RNASeq analysoitiin menetelmän mukaisesti ovat kuvanneet Trapnell et ai., [12]. Lyhyesti, Tophat v2.0.3 käytettiin kohdista RNAseq lukee Ensemble GRCh37 genomin toimittamat Illumina iGenome lappuja. Geenien ilmentyminen mitattiin kunkin geenin Ensembl tietokannasta Mapped Fragments kohden kiloemästä eksoni mallin miljoonasosaa kartoitettu lukee (FPKM) lasketaan Cufflinks v2.0.1. Käytimme ohjelma CuffDiff v2.0.1 testata ero transkriptin ilmentyminen ja vaihtoehtoisen silmukoinnin tapahtumia kunkin ryhmän solulinjoissa. Oletus parametrejä käytettiin kaikissa analyyseissä. Geenit katsottiin ilmentyvät eri säätämisen jälkeen useita testejä; p≤0.05. Cummerbund paketti R tuotettiin sirontakuvaajiin esitetty täydentäviä tietoja. Geenit, joilla on näyttöä vaihtoehtoisen silmukoinnin (joiden Q-arvo 0,05 viittaa muutoksen suhteellinen runsaus eri transkriptien, jotka johtuvat yhden transkription aloituskohdasta) tunnistettiin CuffDiff. Kalvosinnapit suorittaa transkriptio päättely ja runsaus arvio seuraa erokokeella suhteellisen runsauden käyttämällä Jensen-Shannon Ero (JSD) havaitsemiseksi todisteita vaihtoehtoisen silmukoinnin [13]. Tässä yhteydessä JSD on toimenpide muutoksen suhteellinen runsaus useiden transkriptien Kunkin lokuksen kahdella eri koeolosuhteissa [14]. Gene toiminnot ja biologisia prosesseja tutkittiin käyttäen PANTHER luokittelujärjestelmän [15] ja transkriptiotekijä rikastaminen toteutettiin käyttäen Ingenuity Pathway Analysis (IPA) ohjelmisto (https://www.ingenuity.com). Sekvenssi lukee ovat saatavilla NIH Short Lue Archive alle kokeen hakunumerolla SRX254950.

Kvantitatiivinen RT-PCR

Kunkin näytteen, 1 ug kokonais-RNA: ta käänteiskopioitiin käyttäen Qiagen QuantiTect Käänteinen transkriptio Kit (Valencia, CA) valmistajan vakioyhteyskäytäntöä. Sillä Taqman reaaliaikainen PCR, 1,0 ui laimennettua cDNA: ta käytettiin 20 ul reaaliaikainen PCR käyttäen Taqman Gene Expression Master Mix mukaan valmistajan vakioyhteyskäytäntöä. Applied Biosystem Taqman käytettiin seuraavat: HPCAL4 (Hs04188853_g1), NEAT1 (Hs01008264_s1), Actin (Hs01060665_g1) ja 18S rRNA (Hs03928985_g1). Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin StepOnePlus reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Tulokset ja keskustelu

Laadunvalvonta ja differentiaalikaavojen analyysi

Tämä on ensimmäinen transcriptome sekvensointi tutkimus nikotiinin korosti normaali rintojen epiteelisolujen. Expression analyysin kautta suoran transcriptome sekvensointi (RNAseq) luotaa harvinaisin ja suurin solu- ja asiayhteyskohtaisia ​​selostukset. Lisäksi RNAseq menetelmiä ei jännitetty etukäteen tietoa liitos ja anna analyysi määrittää täydellisen valikoiman vaihtoehtoisesti liitettyjä isoformeja. Lopuksi, RNAseq kuin menetelmän on osoitettu olevan määrällinen määrä lukee tuotettu RNA-transkripti on funktio, joka transkriptin ja geenin ilmentymistä sijaan kemiallisen ominaisuuden koettimen hybridisaation, joka muuttuu koostumus näytteen [16 ] – [18].

tunnistamiseksi differentiaalisesti ilmentyvien geenien ja selostukset, ensin vahvisti RNAseq data oli vapaa sekvensointi harhaa ja esittää yhtenäinen kattavuus poikki näytteen (kuva S1). Sitten normalisoitui näytteet (FPKM), laskettu testi tilastollinen (p-arvo) ja säädettiin p-arvo (q-arvo). Tästä oli yhteensä 2015 ilmentyvät eri transkriptien (q-arvo 0,05), 1680 säädelty ja 335 alassäädetty (taulukko S1). Kaikkiaan 138 transkriptit differentiaalisesti ilmaistaan ​​± 2 kertainen muutos (107 säädelty ja 31 alassäädetty) upon nikotiinialtistus ja 39 näistä oli karakterisoimattomat (taulukko 1). Käytimme Taqman reaaliaikaisia ​​PCR validoimiseksi alkuun kaksi geeniä (HPCAL4 ja NEAT1) ja vahvistanut ylä- ja alassäätöä (kuvio S2).

Syöpä on monitekijäinen sairaus, joka liittyy määrän taustalla biologisia tapahtumia, kuten tulehdusreaktio, kasvainten synnyssä, onkogeenien ja transkriptiotekijät. Puolueeton, all inclusive lähestymistapa seuraavan sukupolven sekvensointi voi siksi antaa enemmän täydelliset tiedot ja auttaa meitä ymmärtämään paremmin puuttuvia yhteyksiä. Tuloksemme osoittivat, että HPCAL4, TREM1, EFNA2, SPATA22 ja KRT85 on viisi ilmen- tymisen lisääntymisen geenejä ja NPAS3, DEFB129, NEAT1, WDR96 ja VRK2 on viisi vaimentua geenejä päälle nikotiinialtistus. Hippocalcin kuten 4 (HPCAL4) ja liipaisu reseptori ilmentyy ydinsoluissa 1 (TREM1) on erittäin säädelty geenien yli nelinkertaisella muutos upon nikotiini stressiä. HPCAL4 on suhteellisen alle tutkittu geeni ja on tuntematon toiminto, mutta se on raportoitu olevan yli-ilmentynyt keuhkokarsinooma [19]. Kromosomin alue 1p34.2, jossa HPCAL4 sijaitsee, liittyy myös monia syöpätyyppejä, mukaan lukien rinta-, keuhko-, neuroblastooma, paksusuolen ja peräsuolen [19]. On mahdollista, että HPCAL4 geeni voisi olla syy tällaiseen järjestöjen näitä syöpiä. TREM1 on osoitettu olevan mukana tulehduksellinen vaste ja on positiivinen säätelijä TNF-α: n ja IL-8 [20]. TREM1 on myös kohde matriksin metalloproteinaasien (MMP: t), jotka voivat pilkkoa solunulkoisia proteiineja. Tämä läpäisevä glykoproteiini hallussaan Ig: n kaltaisen ektodomeeni helposti vuodattamansa MMP tuottaa Strem-1. Vaikka kalvoon ankkuroitua TREM-1 vahvistaa tulehdusreaktioita, sTREM1 on anti-inflammatorisia ominaisuuksia [21]. Tässä tutkimuksessa olemme myös havaittu säätelyä MMP2, jotka voivat viitata mahdolliseen lisääntymiseen sTREM1 ja siksi tulehdusta estäviä. Tämä vahvistaa edellisen nikotiinin havainnot, jossa se on raportoitu olevan immunosuppressiivista ja anti-inflammatorisia vaikutuksia. [22] EFNA2 aktivointi edistää endoteelisolujen tulehdusreaktio [23], SPATA22 on rooli meioottisiin DNA: n korjaukseen tai rekombinaatio ja tarvitaan meioottisiin edistystä hiiren sukusoluilla [24] ja KRT85 on hiusten keratiini geeni, joka on raportoitu olevan kopiointia aktivoida NF-KB: n efektori p65 /RelA [25]. Kaikkein alassäädetty geeni, NPAS3 on osoittanut tuumoria tukahduttavan aktiivisuuden [26] ja näin ollen sen alas sääntely nikotiini korosti soluissa on viittaavia NPAS3 mahdollinen tuntematon rooli kasvoi syöpäalttiutta. Mielenkiintoista, mikään alkuun geenien havaittiin, kuten differentiaalisesti ilmaistut edellisen microarray tutkimuksissa [9]. Tämä johtuu todennäköisesti useista syistä, mukaan lukien eri solutyyppejä käytetään, muun annoksen valotusaika ja teknologiset rajoitukset. Silmiinpistävää on, että lukuun ottamatta TREM1, kaikki muut top geenien ovat melko uusi ja tutkittu ilmiö. Tämän lisäksi perusteltua syytä sekvensoida transcriptomes nikotiinin korosti soluja, koska se todennäköisesti paljastaa aiemmin tuntemattomia linkkejä.

erillisiä alassäädetty geeni on NEAT1, joka on pitkän ei-koodaava RNA (lncRNA) tiedetään olevan olennainen rakenteellinen tekijä paraspeckles [27]. Toiminnallista roolia ei-koodaavat RNA: t eivät ole hyvin määritelty; kuitenkin, Chen et. al., äskettäin ehdottanut toiminnallista roolia NEAT1 säätelyssä mRNA vienti [28]. Olemme ensimmäistä kertaa, raportointi ero vaste lncRNA nikotiinin. Tämä luo mahdollisuuksia edetä uusille tutkimaton kaduista syöpätutkimuksessa ja esimerkkinä suurempi rooli lncRNAs transkription asetusten ja syövän kehittymisessä.

vaihtoehtoinen silmukointi analyysi

Viat mRNA ovat merkittävä syy tauti ja useat tutkimukset ovat raportoineet syöpää erityisiä vaihtoehtoisen silmukoinnin jopa ilman genomisen mutaatioiden [29]. Havaitsimme 173 geenejä, jotka osoittivat todisteita vaihtoehtoisen silmukoinnin (taulukko S2). Kaksikymmentä kolme näistä ovat myös ilmentyvät eri (taulukko S3). On myös tärkeää huomata, että NEAT1 on yksi säädeltiin lncRNAs että myös esittänyt näyttöä vaihtoehtoisen silmukoinnin yhteydessä nikotiinin stressiä. Top kahdeksantoista geenit neliöjuuri

Jensen-Shannon eroavuus

0,8 on esitetty taulukossa 2. Disher et. ai., ehdotettiin, että mis-silmukoinnin jälkeen, oksidatiivisen stressin edustaa uutta ja merkittäviä genotoksisia tuloksista ja että se ei ole pelkästään DNA-vaurioiden aiheuttama oksidatiivinen stressi, joka johtaa väärin liittämiseen, mutta muutokset vaihtoehtoisen silmukoinnin itse kone [30]. Nikotiini on raportoitu indusoivan oksidatiivista stressiä viljelmässä soluihin [31], ja sen vuoksi, että voisi olla syy havaitsemiseksi poikkeavan silmukointivarianttien nikotiinin korosti soluissa. Useita saumattu muotoja yhden geenin voinut vastakkaisia ​​biologisia ominaisuuksia. Esimerkiksi, silmukoitumisvariantteja MDM2 esittää sekä onkogeeninen ja kasvua estäviä ominaisuuksia [32]. Siksi paljastaa biologista merkitystä vaihtoehtoisesti liitettyjä geenien upon nikotiini stressi ansaitsee lisätutkimuksiin.

Gene ontologia

saadaan käsitys luonteesta säätelemät geenit ja vaihtoehtoisesti saumattu upon nikotiini stressi teimme geeni ontologian analyysi käyttäen PANTHER luokittelujärjestelmän analysoitiin käyttämällä binomi testisuureen ja Bonferronin korjauksen. Merkittävästi rikastettu biologiset prosessit ja geenin toiminnot näkyvät kuvassa 1. aikana nikotiini stressi, suurin osa geenien säädellään eri tavalla ja vaihtoehtoisesti liitettyjä olivat mukana aineenvaihdunnan, solu- ja kehitys- prosesseja ja on katalyyttinen ja sitovia toimintoja. Mielenkiintoista, ilmentyvät eri (DE) geenit olivat korkeammat yhdessä rakenteellisia molekyylitoimintaa jakeita transkriptionaalisen säätelytoimintaa vaihtoehtoisesti liitettyjä geenejä. DE-geenit analysoitiin edelleen kekseliäisyyttä Pathway Analysis (IPA) tunnistaa biokemiallisia reittejä, jotka voivat vaikuttaa. Kuvassa S3 näyttää verkon geenien, jotka liittyvät syöpään, hormonitoimintaa ja hermoston, jotka vaikuttavat nikotiinin. NF-KB-kompleksin ja estrogeenireseptori löytyy myös verkosta erilaisesti ilmaisivat geenien viittaa niiden yhteydet nikotiinin stressiä DE geenejä. Se ilmenee tämän analyysin, että nikotiini vaikuttaa immuunivasteeseen liittyvät geenit, mikä osoittaa, mahdollinen vaikutus nikotiinin modulaatio normaalin immuunijärjestelmän toimintaa. Epiteelin syöpä ja ihosairauksien olivat kaksi parasta biologisia toimintoja nikotiiniin liittyy korosti säännelty geenejä paljastui IPA. Mielenkiintoista, estrogeenireseptoripositiivinen liittyy välillisesti verkkoon viittaa etäinen suhde ja mahdollinen vaikutus nikotiinin stressiä. Myös ne geenit liittyvät solun liikkeen, signalointi, leviämisen, kuoleman ja selviytymisen toimintoja. Canonical munasarjasyöpä signalointipolkujen liittyivät merkittävästi näihin tuloksiin. Kolme molekyylien kanoninen munasarjasyöpä koulutusjakson, MMP2, CGA ja WNT7B kasvoi säädellään nikotiinialtistus. Toiminnallinen merkitys vaihtoehtoisesti liitettyjä geenien arvioidaan läpi IPA paljasti top verkon liittyvien geenien DNA: n kahdentuminen, rekombinaatio, ja korjaus (kuva S4).

Piirakkakuvio joka kuvaa eroja ja yhtäläisyyksiä GO termejä mukaan seuraaviin ryhmiin. (1A) Biologinen prosessi ilmentyvät eri geenit. (1B) Biologinen prosessi vaihtoehtoisesti liitettyjä geenejä. (1C) Molecular toiminto ilmentyvät eri geenit. (1D) Molecular toiminto vaihtoehtoisesti liitettyjä geenejä.

transkriptio säädin analyysi

mitkä transkriptio sääntelyviranomaiset säätelevät ero ilmentymistä näiden geenien kuvattu näissä kokeissa ylä- ja alas säännelty geenejä tuodaan takaisin IPA ja analysoitiin rikastamista transkription sääntelyviranomaisten liittyvän edistäjille differentiaalisesti ilmentyvien geenien. Oli viisi ylös säätelygeenien (S100A14, HEY1, CGA, IGFBP2 ja LGALS1) luettelosta. Tavoitteensa molekyylejä, kuten MMP2 ja PROX1, myös ylös säännelty tutkimuksessa osoittaa tiukka korrelaatio (taulukko 3). Kaikki mahdolliset transkription sääntelyviranomaisten joiden kohde-geenit ilmentyvät differentiaalisesti esitetään taulukossa S4. Säätelyn S100A14 liittyy pohjapinta-tyypin rintasyöpiä verrattuna ei-pohjapinta tyypit [33]. S100A14 on myös ehdotettu olevan käyttökelpoinen markkeri havaitsemiseksi metastasoituneen kolorektaalisyövän ja rintasyövän [34]. CGA tunnistetaan uutena ER-α reagoiva geenin ihmisen rintasyövän soluja ja mahdollisesti vahva merkki ennustamiseen tamoksifeenia reagointikykyä rintasyövässä [35]. Huomattavasti korkeampi ilmentyminen IGFBP2 on raportoitu rintasyövän kudoksissa verrattuna hyvänlaatuisia rintojen kudosta [36]. LGALS1 ehkäisee T-soluvälitteinen sytotoksinen immuunivasteita ja edistää kasvaimen angiogeneesiä [37]. Siksi yli ilmentymä S100A14, CGA, IGFBP2 ja LGALS1 nikotiinin korosti soluissa on viittaavia kumulatiiviset rooli kasvoi syöpäalttiutta tupakoitsijoilla. Tutkimuksessamme nikotiini stressi up-regulation HEY1 ja MMP2. Päinvastainen tilanne havaittiin arvioitaessa syöpälääkkeen vaikutuksia curcumin jotka johtivat alas-säätely HEY1 ja MMP2, koska inaktivoitumisen Notch-1 kurkumiini inhiboivat ja hyökkäys [38]. Nämä viittaavat rooli nikotiinin tukemisessa syövän kehittymisen ja mahdollisuus curcumin auttaa vähentämään riskiä ja syövän kehittymisen tupakoitsijoilla. MMP-2: n yliekspressio on raportoitu monissa kasvainten [39], mukaan lukien munasarjojen [40] ja rintojen [41] syöpiä. On ehdotettu, että MMP-2 voi olla vain riippumaton ennustaja lisääntynyt kasvaimen aggressiivisuus, mutta myös tärkeää aktivaation muiden proteaasien, jotka ovat suoraan mukana kasvaimen angiogeneesissä [42]. On todettu, että nikotiini lisää MMP2 ilmaisun ja stimuloi ruokatorven levyepiteelikarsinoomasolu (TE-13) muuttoliike ja hyökkäys [43]. Siksi säätely ylöspäin MMP2 kun nikotiinin stressi tutkimuksessamme vahvistaa edelleen aiempia havaintoja ja korostaa mahdollisuutta, että MMP2 on merkittävä biomarkkeri arvioimiseksi syöpäriskiä tupakoitsijoilla. PROX1 on transkription sääntelijä mukana neurogenesis sekä erilaisia ​​syöpätyyppejä. Muutoksia PROX1 on raportoitu useissa syövän muodoissa, vaikka se ei ole aina selvää, onko PROX1 kohdistaa kasvain ehkäisevästä tai onkogeenisten ominaisuuksia. Paksusuolen ja aivosyöpä osoittaa PROX1 yli ilme, kun taas rintasyöpä paljastaa alentunut ilmentyminen johtuu hypermetylaation [44]. Siksi Tutkimuksessamme vaikutuksia kohonnut PROX1 ilmaisun upon nikotiini stressi ovat tuntemattomia.

Mielenkiintoista, transkriptio säädin HEY1 sijaitsee sytogeneettisen bändi 8q21. Monistus 8q21 liittyy huono prognoosi potilaalle rintasyövän ja on riippumaton MYC [45]. Muita lähellä mielenkiintoisia geenejä, jotka vaikuttivat nikotiinin stressi ovat vaihtoehtoisesti liitettyjä NAPRT1 ja CPSF1 at sytogeneettisen bändi 8q24. Vaikka emme tutkia kromosomin vahvistusta tässä tutkimuksessa vaikutusta nikotiinin stressiä transkriptio säädin HEY1, NAPRT1 ja CPSF1 tai lähellä 8q21 on ajatuksia herättävää. Tutkia kokonaisvaikutukset nikotiinin geeneistä per kromosomi, analysoimme kaikki ilmentyvät eri ja vaihtoehtoisesti liitettyjä geenejä (väärä löytö korjaus q≤0.05) (kuva S5). Kaksitoista prosenttia sijaitsevat geenit kromosomissa 19 oli ilmennetty eri ja 14 selostukset kromosomissa 12: lla todettiin vaihtoehtoisen silmukoinnin yhteydessä nikotiinin stressiä. Kuitenkin kromosomi 17 oli sekä korkeatasoinen differentiaalisesti ilmaisi ja vaihtoehtoisesti saumattu selostukset ja se on mielenkiintoista huomata, että rintasyöpä markkeri BRCA1 sijaitsee myös kromosomissa 17. Vaikka syy kromosomi- bias on tuntematon, ilmentyminen epätasapaino on edellinen dokumentoitu hepatosellulaarinen kohdunkaulan [46]. Kromosominen bias ilmentyvät eri transkriptien upon nikotiini stressin vuoksi optio tulevaisuudessa perusteellisten tutkimusten.

Vaikka tämä pilottitutkimus pyrkii hyödyntämään standardoituja nikotiinipitoisuus dokumentoida fysiologisia ja genotoksisia vaikutuksia, alempi nikotiinipitoisuus identtisiä löytyy plasma jälkeen tupakointi voidaan käyttää tulevaisuudessa entisestään vaikutusten arvioimiseksi.

Yhteenvetona tämä tutkimus osoittaa, että nikotiini stressi laukaisee vastauksia useista tutkittu ilmiö ja karakterisoimattomat geenejä ja aiheuttaa poikkeava liitos tapahtumia, jotka voivat kumulatiivisesti kohti syövän kehittymistä ja muuttaa immuunijärjestelmän toimintaa tupakoitsijoilla. Lisäksi, geenit sijaitsevat kromosomissa 12, 17, ja 19 osoittavat esijännitetty herkkyyttä nikotiinin stressiä osoittaa tuntematon biologista merkitystä. Tämä tarkoittaa, että nikotiini olisi lisäaineena syövän etenemisen moduloimalla immuunijärjestelmän toimintaa ja munasarjasyövän signalointireitteihin. Tämä tutkimus on monia vaikutuksia kuin esittelemme uusia mahdollisia yhteyksiä geenien kuten HPCAL4 (säädelty), NPAS3 (alassäädetty) ja NEAT1 (vaihtoehtoisesti liitettyjä sekä erittäin alassäädetty lncRNA), joka voitaisiin kohdistaa eikä valvoa vähentää tai arvioida syöpäriskiä kehityksen tupakoivilla (erityisesti) ja syöpäpotilailla. Havainnot tästä transcriptome tutkimuksen siten tarjota tuoretta biologinen käsityksen nikotiinin stressiä normaali rintojen epiteelisolujen, joita voidaan hyödyntää kliinisissä yhteyksissä arvioida haitallisia vaikutuksia nikotiinin tupakoitsijoilla.

tukeminen Information

Kuva S1.

tiheys kuvaajan ja parvikuvio. (1A) cummerbund käytettiin tuottamaan tiheys kuvaaja tiheydet FPKM arvoja kaikissa geenit. Control ja Nikotiini näytteet olivat hyvin samankaltaisia, mikä osoittaa ei harhaa sekvensointi kattavuuden näytteiden välillä. (1 b) FPKM arvot kaikkien geenien piirrettiin valvontaa ja nikotiini näytteitä, seuraavat keskimäärin yli rinnakkaisnäytteiden ja normalisointi. Jokainen piste edustaa geeniä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0067252.s001

(JPG) B Kuva S2.

validointi alkuun kaksi geenien Taqman reaaliaikaisen RT-PCR. Taqman reaaliaikainen RT-PCR validointi arviointi HPCAL4 (ylös säännelty) ja NEAT1 (alas säännelty) kuvaa yleistä sopimusta RNASeq havainto ja määrällisiä PCR. Kertamuutoksia olivat suhteessa kontrolliin ja normalisoituna multipleksoidun taloudenhoito geenit (aktiini ja 18S rRNA). Virhe palkit kuvaavat keskivirheet.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0067252.s002

(JPG) B Kuva S3.

Nerokkuus reitin analyysi differentiaalisesti ilmentyvien geenien. Top verkko Ingenuity polku analyysi osoittaa, että DE geenit ovat tärkeä rooli syövän. Ne punaisella ovat säädelty, vihreä ovat alassäädetty ja ne, valkoinen palvelevat tehdä epäsuora yhteys DE geenien.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0067252.s003

(JPG)

Kuva S4.

Nerokkuus reitin analyysi vaihtoehtoisesti liitettyjä geenejä. Top verkko Ingenuity polku analyysi osoittaa, että vaihtoehtoisesti liitettyjä geenit ovat yhdessä DNA: n kahdentuminen, rekombinaatio, ja korjaus.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0067252.s004

(JPG) B Kuva S5.

Differentially ilmaistaan ​​ja vaihtoehtoisesti saumattu selostukset per kromosomi ja niiden suhteelliset osuudet. (4A) Sädekaavio osoittaa suhteellinen osuus DE selostukset per kromosomi. (4B) Sädekaavio osoittaa suhteellinen osuus vaihtoehtoisesti liitettyjä selostukset per kromosomi. (4C) Taulukko, joka kuvaa kokonaismäärä differentiaalisesti ilmaisi ja vaihtoehtoisesti saumattu selostukset per kromosomi.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0067252.s005

(JPG) B Taulukko S1.

Luettelo kaikista differentiaalisesti ilmentyvien geenien ja karakterisoimattomat selostukset (q 0,05).

doi: 10,1371 /journal.pone.0067252.s006

(XLS) B Taulukko S2.

Puhtaaksikirjoituksia jotka osoittivat todisteita vaihtoehtoisen silmukoinnin.

doi: 10,1371 /journal.pone.0067252.s007

(XLS) B Taulukko S3.

Päällekkäiset geenit, jotka osoittivat ero ilmaisun ja todisteita vaihtoehtoisen silmukoinnin.

doi: 10,1371 /journal.pone.0067252.s008

(XLS) B Taulukko S4.

IPA transkriptiotekijä rikastamiseen analyysi esitetään kaikki transkriptiotekijöitä, jotka ovat saattaneet vaikuttaa eri tavoin säädeltyjen geenien.

doi: 10,1371 /journal.pone.0067252.s009

(XLS) B

Kiitokset

Tätä työtä tukivat Medical Informatics ja Systems Division ohjaajan rahastoon Virginia bioinformatiikan instituutin.