Krooninen sairaus

tiivistelmä

toimintahäiriöstä Paneth ja pikari soluja suolistossa myötävaikuttaa tulehduksellinen suolistosairaus (IBD) ja koliitti -associated peräsuolen syöpä (CAC). Täällä me raportoimme rooli NAD

+ – riippuvaista histonideasetylaasin SIRT1 valvonnassa antibakteerinen puolustus. Hiiret, joilla suoliston erityisiä

SIRT1

puutos (

SIRT1

int – /-

) on enemmän Paneth ja pikari soluja minkä seurauksena uudelleenjärjestely suoliston mikrobiston. Vuodesta mekanistinen näkökulmasta vaikutukset hiiren suolen solujen kypsymisen välittävät SIRT1 riippuvat muutokset asetylointi tilan SPDEF, Master säätelijä Paneth ja pikari soluja. Tuloksemme viittaavat siihen, että kohdistaminen SIRT1 voivat olla kiinnostavia hallinnassa IBD ja CAC.

Citation: Lo Sasso G, Ryu D, Mouchiroud L, Fernando SC, Anderson CL, Katsyuba E, et al. (2014) menetys SIRT1 toiminto parantaa Suoliston antibakteerinen Defense ja Suojaa Colitis aiheuttama peräsuolen syövän. PLoS ONE 9 (7): e102495. doi: 10,1371 /journal.pone.0102495

Editor: Salvatore Papa, Institute of Hepatology – Birkbeck College, Iso-Britannia

vastaanotettu: toukokuu 20, 2014; Hyväksytty: 19 Kesäkuu 2014; Julkaistu: 11 heinäkuu 2014

Copyright: © 2014 Lo Sasso et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: GLS tukee Lähtevän Italian Association for Cancer Research (AIRC) /Marie Curie Fellowship. JA KS laboratorio tukee avustuksilla École Polytechnique Fédérale de Lausanne, EU Ideat (ADG-231138), Swiss National Science Foundation (31003A-140780 ja 310030-143748), The Krebsforschung Schweiz (KFS-3082-02- 2013 ja KFS-2809-08-2011), ja NIH (R01AG043930). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Paneth ja pikarisolut ovat erittäin erikoistuneita ohutsuolen epiteelisolujen, jotka syntetisoivat ja erittävät antimikrobisten peptidien ja limaa. Nämä tekijät ovat ensimmäinen puolustuslinja taudinaiheuttajia vastaan ​​ja ovat tärkeää säilyttää hienovarainen tasapaino eri bakteerilajien että asuttaa nisäkkäiden suolisto [1]. Dysbiotic mikrobiston vaikutuksia terveyteen isännän ja edistää patogeneesiä useiden suolistosairauksien, kuten tulehduksellinen suolistosairaus (IBD) ja koliitti liittyvä peräsuolen syöpä (CAC) [2].

erilaistuminen ja kypsyminen of Paneth ja pikarisolujen ohjataan Wnt ja Notch signa- että yhteistyötä edistääkseen erittely eri solulinjojen [3]. Lisäksi SAM todennut domeenin, joka sisältää ETS transkriptiotekijä (SPDEF), alavirtavaikuttajainhibiittorit sekä Wnt ja Notch polkuja, jonka tiedetään lisäävän erilaistumista sekä Paneth ja pikarisoluissa niiden yhteinen kantaisä [4]. SPDEF identifioitiin aluksi säätelijänä eturauhasen-antigeenin [5], mutta myöhemmin myös liittyy rinta-, keuhko-, ja suolistossa epiteelin, jossa on mahdollinen osallistuminen syövän etenemisen näissä kudoksissa [6], [7].

Sirtuin 1 (SIRT1), NAD

+ – riippuvaista deasetylaasin [8], on mukana monenlaisia ​​solun prosesseja kuten aineenvaihdunta, solujen lisääntymisen ja apoptoosin, ja immuunivastetta [9]. Rooli SIRT1 säätelyssä suolen homeostaasin on vasta selvittämättä. Äskettäin osallistuminen suoliston SIRT1 systeemisen sappihappojen ja kolesterolin aineenvaihduntaan on ehdotettu [10]. Lisäksi tutkimukset keskittyvät roolia SIRT1 kolorektaalisyövässä kehittämiseksi käyttäen APC

min /+ hiirillä mallina, osoitti ristiriitaisia ​​tuloksia tukevat sekä kasvaimen edistämiseen [11] ja kasvaimen tukahduttamalla [12], [13] toimintoja.

käyttäminen hiirten suoliston erityisiä

SIRT1

poisto (

SIRT1

int – /-

), osoitamme tässä, että SIRT1 säätelee Paneth ja pikarisolutuottoon kypsymisen ja tuotanto anti-bakteeri-proteiineja. Nämä vaikutukset riippuvat SIRT1 välittämää muutokset asetylaatio tilan SPDEF. Lisäksi suoliston

SIRT1

poisto on suuri vaikutus suolen microbiome ja suojaa hiiriä IBD ja CAC. Erityisesti vaikutukset

SIRT1

vajauksen tuotanto anti-bakteeri proteiinit ovat evoluution säilytetty

C.elegans

korostetaan antiikin luonne tehtävän SIRT1. Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että kohdentaminen SIRT1 saattavat kiinnostaa hallintaan IBD ja CAC.

Materiaalit ja menetelmät

Generation of SIRT1

int – /- ja SIRT1

int – /- LGR5

EGFP-IRES-CRE-ert2 hiiret

tuottaminen

SIRT1

Floxed (

SIRT1

L2 /L2

) hiiret, genominen DNA kattaa

SIRT1

lokus monistettiin 129Sv rasitusta hifi-PCR. Tuloksena DNA-fragmentit koottiin kohdennusvektorin Institut Clinique de la Souris (Strasbourg, Ranska). Konstrukti, jossa eksonit 5, 6 ja 7 reunustaa loxP sitten elektroporaatiolla 129Sv alkion kantasoluja (ES-solut) (kuva S1B). G418-resistentit pesäkkeet valittiin ja analysoitiin homologista rekombinaatiota varten PCR: llä ja positiiviset kloonit varmistettiin Southern blot -hybridisaatiolla. Suunnata oikein ES-solujen kloonia injektoitiin blastokysteihin ja siirrettiin valeraskaana naisilla, jolloin kimeerinen jälkeläisiä, jotka olivat pariutuneet C57BL /6J-hiiriä, jotka ilmentävät Flp-rekombinaasia valvonnassa kaikkialla läsnä sytomegaloviruksen promoottori [14]. Jälkeläisiä, jotka lähetetään mutatoidun alleelin ja menetti Flp siirtogeenin (

SIRT1

L2 /WT

hiiriä) valittiin sitten, ja takaisinristeytettiin C57BL /6J-hiirten kymmenen sukupolville. Jotta suoliston mikrobiston analysointi SIRT1

int – /- ja SIRT1

L2 /L2 olivat yhteistyössä majoitettu erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa samassa huoneessa. Hiiret käsiteltiin AOM /DSS olivat yksittäin sijoitettu vieroituksen jälkeen vältetään erot DSS saanti. Kuitenkin SIRT1

int – /- ja SIRT1

L2 /L2 käsiteltiin erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa samassa huoneessa. Erityisesti SIRT1

int – /- ja SIRT1

L2 /L2 hiiriä peräisin samasta vanhemmista. Kaikki eläinkokeet tehtiin mukaisesti institutionaalisten ja Sveitsin ohjeita ja hyväksymä kantonien viranomaiset Waadt. Lisäksi kaikki eläinkokeet ovat sopeutui Sveitsin eläinsuojelulainsäädännöstä ja tarkistetaan valtion eettinen hallituksen Canton de Vaud (Animal Welfare Act 2005; Project lisenssi nro 2463-2463.1-2605 lisenssin professori Johan Auwerx). Lopuksi kaikki eläinkoe ​​hyväksyi riippumaton valtion Vaud eläinlääkintätoimisto eettisiä aluksella, joka toimii noudattaen eläinten hyvinvointia lain mukaan AAALAC kansainvälisten ohjeiden Sveitsin ja EU: n lainsäädännön. Hiiret surmattiin kivuttomasti käyttäen lyhyt altistus CO

2. Tämä menetelmä johtaa nopea ja kivuton tukehtumisen hiirillä. Kaikki kokeet suoritettiin lokakuun 2011 huhtikuu 2014.

Plasmidit

nisäkäsilmentämisvektoriin puse-SIRT1 ostettiin Upstate. SPDEF koodaava sekvenssi kuuluu Mouse transkriptiotekijä Resource [15]. Se monistettiin ja liitettiin pcDNA3-FLAG tai pGEX-GST. pCruzHA SIRT1G261A (plasmidi 10963) [16] ja pGL2Basic-EcadK1 (plasmidi 19290) [17] ostettiin Addgene. pGEX-GST SPDEFK294Q luotiin käyttäen kohdennettua mutageneesiä.

C.elegans

määrityksissä

C.elegans

kantoja kasvatettiin 20 ° C sukkulamato kasvualustaa agarmaljoilla (NGM) ympätään

E. coli

-kanta OP50 ellei toisin mainita. Käytetyt kannat olivat villityypin Bristol N2, VC199

sir-2,1 (ok434) B IV, SAL129 [

pha- 1

(e2123) III;

lys-1

: : GFP +

pha- 1

(+)], ja SAL105 [

pha- 1

(e2123) III;

lys-7 unionin :: GFP +

pha- 1

(+)]. Kannat toimittivat

Caenorhabditis

Genetics Center (University of Minnesota). Bakteerien ruokinta RNAi Kokeet suoritettiin, kuten on kuvattu [18].

sir-2,1

(R11A8.4) klooni ostettiin GeneService ja sekvensoitiin.

kvantifiointi GFP

ilmentyminen suoritettiin kuvattujen protokollien [19]. Saat kuvan hankinta

lys-7 unionin :: GFP: n ilmentymisen, eläimet kiinnitettiin 2% agaroosia tyynyjä 10 mM tetramisolia (Sigma) ja tutkittava käyttäen Zeiss Axioplan-2 mikroskooppia (Carl Zeiss).

mRNA louhinta ja RT-qPCR analyysi

RNA eristettiin kudoksista käyttäen TriPure reagenssia (Roche) mukaan valmistajan ohjeiden. cDNA tuotettiin 1 ug kokonais-RNA: sta käyttämällä QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen). qRT-PCR suoritettiin käyttäen LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix (Roche) ja analysoitiin ΔΔCT laskentaan. Arvot normalisoitiin syklofiliinistä ilme. Alukkeet on lueteltu taulukossa S1 File S1.

lusiferaasianalyysissä

PC3-solut (ATCC) 96 /kuopissa levyjä kotransfektoitiin reportteri, joka sisältää SPDEF vaste-elementti on ihmisen E -cadherin promoottori, pGL2Basic-EcadK1 ja pcDNA3, pCDA3-FLAG-SPDEF tai pCDA3-FLAG-SPDEFK294Q kanssa tai ilman puse-SIRT1 ekspressiovektoreita (jetPEI transfektio; Polyplus). Elatusaine poistettiin 24 tunnin kuluttua solut pestiin kylmällä PBS: llä, ja lusiferaasisubstraattia (Kirkas-Glo Luciferase Assay System, Promega) lisättiin ennen Luciferase mittausta Victor x 3. β-galaktosidaasi käytettiin normalisointi.

In vitro asetylaatio ja deasetylaatio määritykset

In vitro asetylaatio ja deasetylaatio määritykset suoritettiin kuten alun perin on kuvattu [20]. Lyhyesti, 1 ug rekombinanttia SPDEF proteiinia, joka on saatu BL21-kannan, inkuboitiin 500 ng yhdistelmä-DNA-p300 asetylaatiossa puskurissa (50 mM Tris-HCI, pH 8, 100 mM NaCl, 10% glyserolia, 1 mM PMSF, 1 mM DTT: tä, 1 ug /ml bepstatin, 1 ug /ml leupeptiiniä, 1 ug /ml pepstatiinia, 1 mM natriumbutyraattia ja 150 uM asetyyli-CoA) 1 tunnin ajan 30 ° C: ssa. Inkubaation jälkeen näytteet erotettiin SDS-PAGE: lla ja analysoitiin Western blot tai käyttää in vitro deasetylaatio määrityksissä. Sillä deasetylaatio määrityksissä, 1 ug asetyloitu SPDEF inkuboitiin 500 ng yhdistelmä-DNA-SIRT1 proteiinia deasetylointi puskuriin (50 mM Tris-HCI, pH 9, 4 mM MgCI2, 0,2 mM DTT: tä, 1 ug /ml bepstatin, 1 ug /ml leupeptiiniä, 1 ug /ml pepstatiinia, ja 1 mM NAD

+) 30 minuuttia sekoittaen jatkuvasti. Inkuboidut Näytteet erotettiin SDS-PAGE: lla ja analysoitiin western blot tai käytetään kartta asetyloitu jäännös nano-LC-MS /MS. Rekombinantti p300, SIRT1, SIRT6, ja SIRT7 proteiinit tehtiin Dr. Michael O. Hottiger (Zürichin yliopisto). Cell perustuu deasetylointi oli määritettiin Hek293T solujen transfektoitiin pCDA3-FLAG-SPDEF tai pCDA3-FLAG-SPDEFK294Q kanssa tai ilman puse-SIRT1 tai pCruzHA-SIRT1G261A ekspressiovektoreihin jetPEI transfektio kit (Polyplus). 22 tuntia myöhemmin, väliaine korvattiin tuoreella väliaineella (Dulbeccon modifioitua Eaglen väliainetta, jossa oli 4,5 g /l glukoosia, 10% vasikan sikiön seerumia, 0,1 mM NEAA, 50 ug /ml gentamysiini ja 1 mM natriumbutyraattia). 2 tunnin jälkeen, kokosolu-lysaatit valmistettiin käyttämällä IP lyysipuskuria (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10 mM natriumbutyraattia ja 10 mM nikotiiniamidi), jota oli täydennetty Complete proteaasiestäjäseostabletit Tabletit (Roche). 0,5 mg 1 mg kokosolu-lysaatit käytettiin immunosaostuksella (IP). IP suoritettiin FLAG-agaroosi Affinity Gel, kuten toimittaja on kuvannut (A2220, Sigma-Aldrich). Sen jälkeen, kun IP-näytteet pantiin SDS-PAGE: lla ja analysoitiin Western blot -menetelmällä.

Soluviljely, transfektio, ja vasta-aineet

HEK293 ja PC3-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa, kuten 4,5 g /l glukoosia, 10% vasikan sikiön seerumia, 0,1 mM NEAA ja 50 ug /ml gentamysiini, 37 ° C: ssa, 5% CO

2-ilmakehässä. HEK293T ja PC3-solut transfektoitiin käyttäen JetPei reagenssia (

Polyplus Transfektiot

, Illkirch, Ranska) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Vasta-aineet: Lysotsyymi (Abcam, Ab36362), CHRA (Santa Cruz, sc-13090), asetyloitua lysiiniä (Soluviestintä, 9441L), SIRT1 (Abcam, ab12193), β-kateniinin (Sigma, A5441), L-FABP (Santa Cruz , sc-50380), PCNA (Santa Cruz, sc-56), HSP90 (BD Transduction Laboratories, 610418), anti-FLAG (Sigma, F1804), Tubulin (Santa Cruz, sc-5286), SPDEF western blot (Sigma , AV32533), SPDEF IHC oli ystävällisesti professori J. Whitsett.

Subsellulaariset

Solulima ja nucleoplasm jakeet saatiin

SIRT1

L2 /L2

ja

SIRT1

int – /-

isolated kryptassa. Kryptissa eristettiin jälkeen julkaistun protokollan [21]. Yhden crypt peräisin olevat solut pestiin lopuksi jääkylmällä PBS: llä ja inkuboitiin puskurissa A (10 mM KCI, 1,5 mM MgCI2, 0,5 mM DTT10 mM, 10 HEPES-KOH, pH 7,4), joka sisältää proteinaasinestäjä cocktail (Roche) for 5 min. Sen jälkeen, kun 50 iskulla Dounce-homogenisaattorissa, sytoplasmaan fraktio kerättiin sentrifugoimalla (1,4 k x g 5 min, 4 ° C). Pelletit pestiin kahdesti puskurilla A. Tumat inkuboitiin puskurissa B (150 mM NaCl, 0,1% NP-40, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4), joka sisälsi proteinaasi-inhibiittoriseoksen 30 minuuttia jäillä. Nucleoplasm kerättiin sentrifugoimalla (2 k x g 5 min, 4 ° C). Proteiinit kvantifioitiin käyttäen Lowryn menetelmällä ja käsitellään western blot -määritys.

GFP

+ solujen analyysi

kryptissa iältään

SIRT1

L2 /L2-

ja

SIRT1

int – /- LGR5

EGFP-IRES-CRE-ert2

suolet eristettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla (katso

Subsellulaariset

kohta) [22]. Yhden solut analysoitiin FACS: llä havaitsemiseksi GFP

+ solut.

fraktiointi solujen pitkin krypta-nukkalisäkkeen akselin

peräkkäinen eristäminen hiiren ohutsuolen epiteelisolujen pitkin crypt- nukkalisäke akselin suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [23] vähäisin muutoksin. Lyhyesti, koko ohutsuolessa (pohjukaissuolessa liittimeen sykkyräsuoli) poistettiin, huuhdeltiin, ja leikataan pieniksi palasiksi (2-5 mm) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan 15 ml: ssa puskuria A (96 mM NaCl, 1,5 mM KCI, 27 mM Na-sitraattia, 8 mM KH

2PO

4, ja 5,6 mM Na

2HPO

4, pH 7,3). Sitten sitä inkuboitiin 10 minuutin ajan 15 ml: aan puskuria B (PBS plus 1,5 mM EDTA: ta, 0,5 mM ditiotreitolia ja 1 mg /ml naudan seerumin albumiinia) ravistellen 37 ° C: ssa inkubaattorissa. Tällä loppuun 15 minuutin inkuboinnin, erillinen enterosyyttien kerättiin (fraktio 1) ja 15 ml tuoretta puskuria B lisättiin kudokseen. Tämä menettely toistettiin neljä kertaa, vaiheet kestävät 25, 25, 25 ja 30 min, vastaavasti (fraktiot 2, 3, 4 ja 5), ​​eli yhteensä 120 min inkubaation ajan. Vuoden loppuun lopullisen itämisaika, solut kerättiin kustakin 5 fraktiot otettiin talteen sentrifugoimalla nopeudella 1500 rpm 4 ° C: ssa 5 min. Solupelletit pestiin kahdesti ja lyysattiin RIPA-puskurissa. Alkalinen fosfataasiaktiivisuus määritettiin Alkaline fosfataasimääritys Kit (BioVision).

Massaspektrometria-analyysi

Geelikaistat leikattiin paloiksi ja suoritettava in-geeli hajottamalla endoproteinaasi Glu-C tai trypsiini. Peptididigestioita resuspendoitiin ja analysoitiin nano-LC-MS /MS käyttäen Orbitrap Elite massa spektrometri (Thermo Fischer Scientific) kytketty ultraperformance LC (UPLC) järjestelmä (Thermo Fischer Scientific Ultimate 3000 RSLC). Tietojen analysointi suoritettiin Proteome Discovererin (v. 1.3) ja hakuja tehtiin Mascot ja Sequest vasten hiiren tietokanta (UniProt release 2013_01). Tiedot jatkokäsitteli, tarkastettu ja se värjätään Rakennustelineiden 3 -ohjelmiston.

In situ

-hybridisaatio

in situ

antureista käytetään tässä tutkimuksessa vastaavat ilmenevän geenin osiksi tai kokonaan sekvensoitu cDNA saatu Open Biosystems. Hakunumerot nämä koettimet ovat seuraavat: hiiren

Olfm4

BC141127 (9055739), hiiren

Defa4

BC134360 (40134597). Varmistaakseen koettimien spesifisyys, me syntyy sekä sense ja antisense-koettimia

in vitro

transkriptio käyttäen DIG RNA merkintöjä mix (Roche) mukaan valmistajan ohjeiden ja julkaistujen menetelmien [24]. ISH tehtiin käyttäen täysin automatisoitu väline Ventana XT (Roche). Kemikaalit olivat Roche Diagnostics. Lyhyesti, formaliinilla, parafiiniin upotetut leikkeet oli de-paraffinized ja hydratoida uudelleen ja esikäsiteltiin entsymaattisella digestiolla (Proteaasi1, 4 min 37 ° C: ssa). Hybridisaatio suoritetaan lisäämällä kunkin kuvan 50 tai 100 ng koetinta laimennetaan Ribohybe 65 ° C: ssa 6 tunnin ajan.

bakteereja määrityksessä

bakteereja määritykset suoritettiin, kuten on kuvattu [25] kanssa, muutamia muutoksia. Lyhyesti, ohutsuolen aikuisen hiiren huuhdeltiin jääkylmällä PBS: llä ja segmenttejä inkuboitiin 30 mM EDTA eluoimiseksi epiteelisoluihin. Yhteensä proteiineja epiteelisolujen uutettiin käyttäen NP40-lyysipuskuria (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 5 mM EDTA, 5% [tilavuus /tilavuus] glyserolia, 1% [tilavuus /tilavuus] NP40) täydennettynä täysin proteaasinestäjä. 100 ug proteiineja inkuboitiin 60 minuuttia 37 ° C: ssa 10 mM iPIPES puskuria, joka sisältää eksponentiaalisesti kasvavan

E. coli

K12 (ATCC, 10

6 CFU /ml). 20 ui näytettä laimennettiin ja maljattiin LB-agar kiinteän alustan. Elossa bakteerit määrällisesti CFU lautasille Yön yli 37 ° C: ssa. Bakteereja inkuboitiin iPIPES ilman lisättyä proteiineja pidettiin kontrolleina.

paksusuolitulehdus ja Colitis liittyvät kolorektaalisyövän mallit

DSS-indusoidun koliitin indusoitiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [26]. Päivittäin painon muutoksia arvioitiin. Peräsuolen verenvuoto pisteytettiin asteikolla 0-5, mikä osoittaa ei (0) tai erittäin vaikea (5) verenvuoto peräsuolesta. Ilea ja kaksoispisteet olivat snap-jäädytetyt tai kiinnitettiin 4% Forma-Fixx (Thermo tieteellinen) ja upotettiin parafiiniin.

In vivo

suolen läpäisevyyttä tutkittiin hiirissä, kuten on kuvattu [27]. Colitis aiheuttama kolorektaalisyöpä (AOM /DSS malli) aiheutettiin aikaisemmin kuvatulla [28]. Lopettamisen jälkeen hiiren kaksoispisteitä avattiin pitkittäin ja 2 tunnin kuluttua fiksaatio 4% muodollisesti-Fixx lyhyesti värjättiin Coomassie Blue visualisoida kasvaimia. Kasvaimet laskettiin sokkona patologi. Kasvaimet koko määritettiin mittari. Pieniä paloja terminaalin Ilea ja proksimaalinen kaksoispisteet olivat snap-jäädytetty ja loput kiinnitettiin 4% Forma-Fixx (Thermo tieteellinen) ja upotettiin parafiiniin.

Tilastollinen

Data tarkastettiin kanssa Shapiro-Wilk testi normaaliuden tutkimus- ennen suorittamista merkitsevyystestit. Muuttujat, joiden W arvo ≥0.80 pidettiin suunnilleen normaalisti jakautunut. Kaksi muuttuja vertailut laskettiin käyttäen Welch kaksiosaisella

t

-testi. Monimuuttujille, Bartlettin testi suoritettiin tarkistaa yhtä suuri varianssi (p 0,10) ja sitten yksisuuntainen ANOVA suoritettiin Bonferronin post-hoc-testi. Muuttujat, joiden Shapiro-Wilk W arvo 0,80 katsottiin ei-normaali ja vertailut laskettiin käyttäen Wilcoxonin-rank-testi. Kaplan-Meier-menetelmää käytettiin eloonjäämisen analyysi matoja. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM, ja kaikkien merkitys vertailuissa,

p

arvot pienempi kuin 0,05, pidettiin tilastollisesti merkittävinä.

* p 0,05;

** p 0,01;

*** p 0,001. Tutkimuksessa oli valmisteleva luonne ja ei ollut ennalta määritetty vaikutus koko. Näytteen koko valittiin tutkimuksen perusteella toteutettavuutta ja mahdollisia tilastollinen voima. Otokset ovat yhdenmukaisia ​​raportoitu vastaavia tutkimuksia. Tilastollinen analyysi suoliston mikrobiston analyysista täydentävien tietojen.

Tulokset

SIRT1

poisto parantaa antimikrobisia vasteen nisäkkäillä ja sukkulamadot

ensin määritellään lokalisoinnin SIRT1 proteiinin pitkin nukkalisäke /krypta akselilla. Koska SIRT1 vaikuttaa hyvin rikastettu ohutsuolessa crypts (kuvio S1A), me kasvatettu villiiniä-Cre siirtogeenisiä hiiriä, joiden hiiriin, joissa eksonit 5-7

SIRT1

geenin, jota reunustavat loxP (

SIRT1

L2 /L2

) tuottaa suoliston erityisiä

SIRT1

hiirten (

SIRT1

int – /-

) (Kuva S1B-C). Toisin kuin aiemmin raportoitu poisto

SIRT1

eksonin 4 [29], ei typistetty ja potentiaalisesti aktiivisen SIRT1 fragmentteja havaittiin

SIRT1

int – /-

hiirissä (kuvio S1C).

SIRT1

int – /-

suolet osoitti merkittävää kasvua määrän Paneth (lysotsyymiä

+ ja Defa4

+) ja pikari (PAS

+), mutta ei enteroendokriinisessä (CHRA

+) soluja (kuvio 1A, Kuva S1D). Näin ollen mRNA tasoilla Paneth (

Lys, Crypt1, Crypt4, Defa-R

) ja pikarisolujen (

Klf4, Muc2

) solun markkereita, sekä lysotsyymiproteiiniin runsaus ja

Defa4

mRNA havaita

in situ

-hybridisaatio, indusoitiin proksimaalisen ja distaalisen suolistossa

SIRT1

int – /-

hiirissä (kuviot 1 B-C, kuva S1D-E ).

, edustavat kuvat Paneth (lysotsyymin

+ solut), pikari (perjodihappo- Shiff

+ solut), ja enteroendokriinisessä (kromograniini a

+ soluja) solujen värjäys. (N = 3 hiirtä, 5-10 kenttä hiirtä kohti, 50-100 krypta /Villi per kenttä). Bar = 50 pm. B-C, mRNA ja proteiini tasoilla Paneth (

Lys, MMP7, Crypt1, Crypt4, Defa-R

) ja pikari (

Klf4 Muc2

) markkereita lisääntyvät proksimaalisen ja distaalisen ohutsuolen

SIRT1

int – /-

hiiriä (N = 6-8). Sillä RTqPCR analyysi,

rps12

käytettiin viite-geenin. p-Actin käytettiin lastaus valvonta Western blot. D, lisääntynyt ilmentyminen liittyvien geenien taudinaiheuttajan puolustus

sir-2,1

(

ok434

)

C. elegans

mutantti (N = 6; kukin N tarkoittaa yhtä populaation ~500 matoja).

OLO1

ja

Y45

käytettiin viitteenä. E,

sir-2.1

siRNA indusoi

lys-1

ja

lys-7

ajettu GFP ekspression

lys-1 :: GFP

ja

lys-7 :: GFP

toimittaja matoja. Samassa kuvassa edustava kuva

lys-7 :: GFP

ennen ja jälkeen

sir-2.1

siRNA näkyy (DIC, ero häiriöitä kontrasti). Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.

Seuraava arvioida, onko

SIRT1

korreloi geenien antibakteerinen puolustus käyttäen BXD hiirtä geneettinen perusjoukon (www.genenetwork. org) [30]. Koska ei suoliston geenien ilmentyminen saatiin tietoja, analysoimme hematopoieettiset solut, jotka ovat osa arsenaali solut, jotka suojaavat taudinaiheuttajia. Mukaisesti havaintojemme

SIRT1

ilme on negatiivinen korrelaatio ilmaisu useiden Defensin liittyvien geenien (kuvio S1F).

Voit testata, onko yhteys

SIRT1

ja anti-bakteeri puolustus oli evoluution säilytetty, käytimme

C. elegans

. Huomattavaa on, ilmaus monenlaisia ​​osallistuvien geenien antimikrobisen puolustuksen (

LYZ-1, LYZ-7, LYZ-8

) [31], samoin kuin geenien aiheuttamaa erityisiä patogeenejä ( F01D5.5, F56D6.2, C17H12.8, C29F3.7, K08D8.5) [32] parannettiin

sir-2.1

[33] mutanttimatojen (kuvio 1 D). Lisäksi

lys-1 :: GFP

ja

lys-7 :: GFP

toimittaja kantoja [31], s

IR-2.1

siRNA merkittävästi indusoi sekä

lys-1

– ja

lys-7

-riippuvaisella GFP: n ilmentymisen (kuvio 1 E). Nämä tiedot siis osoittavat, että vaikutus

SIRT1

anti-mikrobi vaste evoluution konservoitunut nisäkkäistä matoja.

Suoliston

SIRT1

poisto vaikutuksia suoliston mikrobiston

Kun otetaan huomioon olennainen rooli, joka Paneth ja pikari soluilla suojella nisäkkään suolen poikkeavasta bakteerikolonisaatiota, me seuraavaksi analysoi vaikutusta

SIRT1

poiston suoliston mikrobiston.

SIRT1

int – /-

suolet eivät vain ole suurempaa umpisuoli (kuvio 2A), joka ilmaisee muunnetun microbiome [34], heillä oli myös korkeampi bakterisidisen kapasiteetti (kuva 2B). Käyttämällä DNA uutetaan joko suolistossa cecum sisältöä tai paksusuolikudos, amplifioimme V3 alueen bakteerin 16S rRNA. Poistamisen jälkeen huonolaatuisia lukee ja kaikki Singleton Operational Taksonominen Units (Otus) (taulukko S2 File S1), 98% lukee joutui Core Measurable Microbiome (CMM-katso menetelmät). Mikrobien hallitsi 4 phyla,

firmicutes, Bacteroidetes, proteobacteria, ja Verrucomicrobia

(kuvio 2C) [35]. Kartoittaa mikrobien koostumuksen ja rakenteen poikki

SIRT1

mutaatio käytimme OTU perustuva menetelmä. Verkossa käytettävillä analyysien, umpisuoli mikrobien yhteisöt

SIRT1

L2 /L2

ja

SIRT1

int – /-

hiirillä esiin yhteisö eroja genotyyppien (kuvio 2D), havaintoa tukee myös Principal koordinaatit Analysis (PCA, kuvio 2E). Indikaattori mikrobilajeihin edistää yhteisö erot

SIRT1

L2 /L2

ja

SIRT1

int – /-

hiiret tunnistettiin ja Otus esitetty kuviossa 2F ja taulukossa S3 Tiedoston S1. Kiinnostavaa kyllä, suurin osa rikastettua Otus in

SIRT1

int – /-

hiiret olivat suvun

Barnesiella

,

Bacteroides

, ja

Prevotella

(phylum

Bacteroidetes

), löytyy normaalin ihmisen ja hiiren suoliston, jotka erityisesti vähentynyt IBD [36], [37]. Sen sijaan suvun

Clostridium

(phylum

firmicutes

) laajennettiin

SIRT1

L2 /L2

hiirissä (kuvio 2F ja taulukossa S3 File S1). Nämä tulokset osoittavat, että suoliston

SIRT1

poisto ja sen seurauksena muutoksia Paneth ja pikari soluja muuttaa suolen microbiome.

, edustaja kuva osoittaa merkittävä kasvu umpisuoli kooltaan

SIRT1

int – /-

hiirillä. B, bakteereja kapasiteetti ohutsuolen (pohjukaissuolen) in

SIRT1

int – /-

ja

SIRT1

L2 /L2

hiirissä määritettiin pesäkkeitä muodostava yksikkö määrityksessä. Tulokset ilmaistaan%: n kontrolli (ei-proteiinit) (N = 7). C, jakautuminen mikrobien phyla paksusuolen kudoksessa ja umpisuoli sisältö

on SIRT1

L2 /L2

ja

SIRT1

int – /-

hiirillä. D, Verkko perustuvia analyyseja umpisuolen bakteeri yhteisöjä

SIRT1

L2 /L2

ja

SIRT1

int – /-

hiirillä. Jokainen suuri ympyrä merkitsee eläinten ja kukin pienempi piste edustaa OTU;

SIRT1

L2 /L2

(sininen) ja

SIRT1

int – /-

(punainen). E, Principal Coordinate Analysis (PCA) (PERMANOVA p = 0,012, ja ANOSIM p = 0,007) osoittaa merkittävää erottaminen mikrobiyhteisöjä välillä

SIRT1

L2 /L2

ja

SIRT1

int – /-

hiirissä. F, Heatmap osoittaa top 20 eri Otus välillä

SIRT1

L2 /L2

ja

SIRT1

int – /-

hiirillä. Runsaus arvot log-muunnettiin ja standardoituja ja piirretään sisällä Matlab. * Tarkoittaa

Barnesiella

,

Bacteroides

, ja

Prevotella

; ° osoittaa

klostridit

suku (katso myös taulukko S3 File S1). Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.

Suoliston

SIRT1

poisto suojaa koliitti ja koliitti aiheuttama kolorektaalisyöpä

Näiden viime havaintoja, tutkimme vaikutus

SIRT1

patogeneesiin sekä koliitin ja CAC.

SIRT1

int – /-

hiiriä, altistettiin dekstraanisulfaatin natriumia (DSS), osoitti lievempi koliitti ominaista alavartalo laihtuminen, verenvuoto pisteet, suuntaus kohti alennettua suolen läpäisevyyttä ja vähentynyttä ilmentymistä tulehdus- geenien (kuvio S2A-D). Nämä tulokset houkutti meitä tutkimaan, miten

SIRT1

int – /-

hiiret reagoivat CAC. Hiiret siten injektoitiin AOM (azoxymethane) karsinogeeni ennen myöhempää altistumista kolme sykliä DSS (kuvio 3A). Merkillistä, määrää ja kokoa kasvaimia

SIRT1

int – /-

suolet olivat pienempiä (kuviot 3A-B). Paremmin terveystilanne

SIRT1

int – /-

hiirillä korostettiin entistäkin pidempi paksusuolen pituutta ja nopeuttaa kehon painoa toipuminen viimeisen DSS sykli (kuviot 3C-D).

A-B, Kaavamainen esitys AOM /DSS-protokollaa (ylhäällä vasen paneeli) ja edustava kuva kaksoispisteitä alkaen

SIRT1

int – /-

ja ohjaus hiirillä CAC induktion (Bar = 200 nm) (alhaalla vasemmalla paneeli).

SIRT1

int – /-

hiiret osoittavat merkitsevästi vähemmän kasvaimia (oikea paneeli). B, edustaja kuva paksusuolen -osio

SIRT1

int – /-

ja valvonta hiiri jälkeen CAC induktion (vasen paneeli). Kasvaimen kokoa (oikea paneeli). C, Colon pituus aikaan uhri (AOM /DSS). D, Prosenttia kehon painon muutos. Sillä AOM /DSS kokeen 8 hiirtä kutakin genotyypin käytettiin. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001. E-F, Principal Coordinate Analysis (PCA) on bakteerisekvenssejä koolonkudoksesta suoritetaan käyttämällä painottamaton UniFrac etäisyys matriisi. E,

SIRT1

int – /-

paksusuolikudos ennen ja jälkeen AOM hoidon (PERMANOVA p = 0,003, ANOSIM p = 0,016). F,

SIRT1

L2 /L2

paksusuolikudos kanssa ja ilman AOM hoitoa (PERMANOVA p = 0,067, ANOSIM p = 0,038). G-H, Most tilastollisesti merkitsevä Otus ennen ja jälkeen AOM sekä

SIRT1

L2 /L2

(G), ja

SIRT1

int – /-

(H), paksusuolen kudokset; * Osoittaa

Helicobacter

ja

Desulfovibrio

(katso myös taulukko S4 File S1). I, PCA bakteeri sekvenssien koolonkudoksesta jälkeen AOM (PERMANOVA p = 0,767, ANOSIM p = 0,167).

analyysi mikrobien jälkeen DSS /AOM altistuksen paljasti merkittäviä muutoksia

SIRT1

int – /-

hiirissä (kuvio 3E), kun muutos oli pienempi

SIRT1

L2 /L2

hiirissä (kuvio 3F). Indikaattori mikrobilajia, ennen ja jälkeen DSS /AOM, tunnistettiin (kuviot 3G-H ja taulukossa S4 File S1). Huomattavaa on, että Otus kuuluvat sukuun

Helicobacter

ja

Desulfovibrio

vasta lisääntynyt kuluttua DSS /AOM

SIRT1

L2 /L2

hiirissä (kuvio 3G ja taulukossa S4 File S1). Mielenkiintoista, vaikka rooli

Helicobacter

peräsuolen syöpä on edelleen kiistanalainen [38],

Desulfovibrio

katsotaan osallistua synnyssä haavainen paksusuolen tulehdus ja Crohnin tauti [39]. Mikrobien yhteisöjä

SIRT1

L2 /L2

ja

SIRT1

int – /-

hiirillä DSS /AOM hoito eivät olleet merkittävästi erilaiset (kuva 3I). Kaikkiaan oletamme, että muutokset yleisessä mikrobien normaaliolosuhteissa (kuva 2), sekä tiettyjen sukujen jälkeen DSS /AOM, voisi määrittää eri alttius kahden genotyypit on paksusuolentulehdus ja CAC.

Hyper-asetyloitu SPDEF asemat Paneth ja pikarisolu- kypsymisen upon suoliston erityisiä

SIRT1

poisto

Ymmärtääksemme molekyylimuutokset taustalla näitä näkyvästi fenotyyppejä, selvitimme erilaisia ​​mahdollisia reittejä, jotka edistävät Paneth ja pikarisolu- kehitystä ja kypsymistä.