Krooninen sairaus

tiivistelmä

soveltaminen phagocytic reseptoriagonistien syövän immunoterapiassa tutkittiin. Agonistit (laminariini, molekyylejä, joilla on terminaalinen mannoosi, N-formyyli-metioninyyli-leusyyli-fenyylialaniini) on lujasti ankkuroitu kasvainsolun pinnalla. Kun erityisesti agonistit phagocytic reseptoreita käytettiin yhdessä LPS (Toll-like-reseptoriagonisti), korkea synergia aiheuttaa kasvaimen kutistumista ja väliaikainen tai pysyvä katoaminen havaittiin. Menetelmät ankkurointi phagocytic reseptoriagonistien (lataus vuorovaikutukset, ankkurointi perustuu hydrofobisia ketjuja, kovalenttisia sidoksia) ja eri järjestelmien phagocytic agonistin /LPS seoksen sovelluksia testattiin maksimaalisen terapeuttisen vaikutuksen. Yhdistelmät mannaania /LPS ja f-MLF /LPS (hydrofobinen ankkurit) sopivissa (pulssi) järjestelmät johti 80% ja 60% talteen hiiriä, vastaavasti. Ehdotamme, että merkittäviä synergia agonistit fagosyyttisolujen ja Tollin kaltaiset reseptorit (TLR) perustuu kaksi tapahtumaa. TLR ligandi aiheuttaa varhaista ja massiivinen tulehduksellisten soluttautumisen kasvaimia. Tämän vaikutus soluinfiltraatin on suunnattu tuumorisoluissa, joissa agonistit fagosyyttisolujen reseptorien niiden pinnalla. Tuloksena näistä menetelmistä oli tehokas tappamaan tuumorisolut. Tämä uusi lähestymistapa edustaa hyväksikäytön luontaisen immuniteetin mekanismeja syövän hoitamiseksi.

Citation: Janotová T, Jalovecká M, Auerová M, Švecová I, Bruzlová P, Maierová V, et ai. (2014) Käyttö Anchored agonistit Fagosyyttiset reseptorit syövän immunoterapia: B16-F10 Hiiren Melanooma Model. PLoS ONE 9 (1): e85222. doi: 10,1371 /journal.pone.0085222

Editor: Lucia Gabriele, Instituto Superiore di Sanità, Italia

vastaanotettu: toukokuu 31, 2013; Hyväksytty 25 marraskuuta 2013 Julkaistu: 13 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Janotová et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat hanketta ei. CZ.1.07 /02.2.00 /15,0361 rahoittavat Euroopan sosiaalirahasto ja Tsekin valtion budjetti. Lisäksi se tukee yhtiön POLAK CZ s.r.o. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tämä tutkimus oli osittain tuettu POLAK CZ s.r.o. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

mukaan yleisesti hyväksytty syövän immunoediting hypoteesi [1] syöpäsoluja, joka voitti poistaminen ja tasapaino vaiheita, tuottaa kriittinen muutoksia tarpeen kiertää sekä synnynnäisen ja adaptiivisen immunologinen puolustusjärjestelmä (paeta vaihe). Lukuisat purkumekanismeja kuuluvat alas-säätely kasvaimen antigeenejä [2], menetys tai alas-säätely MHC-antigeenejä [3], puutteita antigeenin käsittely ja esittely [4], ilmentyminen immuuni-inhiboiva ligandien tuumorisoluihin [5] induktio keskus- tai perifeerisen toleranssin [6] tai sukupolven immunosuppressiivinen kasvaimen mikroympäris- [7].

Vaikka tärkein osa kasvaimen vastaisen immuniteetin edustaa sytotoksiset T-lymfosyytit [8], keskuudessa solujen luontaisen immuniteetin NK-solut näyttävät pelata merkittävin rooli [9]. Myös muiden luontaisen immuniteetin soluja on paljon vähemmän tutkittujen ja lähes mitään ei tiedetä tunnustamisesta kasvainsolujen aseettomia makrofagien tai granulosyyttien [10].

Kuitenkin, Cui et al. [11] ja Hicks et al. [12] osoitti, että hiiret SR /CR mutaatio, joka mahdollistaa tunnustamista kasvainsolujen kautta toistaiseksi tuntematon mekanismi, onnistuneesti tappoi kasvainsolut.

In vitro

kokeet osoittivat, että solut synnynnäisen immuniteetin (NK-solujen, makrofagien, neutrofiilien) vastasivat syöpäsolun tappaminen. Hyväksikäyttö hahmontunnistuksen reseptorin (PRR) agonistit stimuloimaan synnynnäinen signalointireittien [13] on toinen osittain onnistunut lähestymistapa syövän hoitoon. Monimutkaisessa PRR agonistivaikutus koostuu interferoni tyyppi I: n ja muiden proinflammatoristen sytokiinien, parannettu dendriittisolujen kypsyminen, erityksen Th1 sytokiinien, antigeenin rajat esitys, NK-solujen aktivaation ja tukahduttaminen säätelijä-T-solujen ja kasvaimen liittyvät makrofagit [ ,,,0],14]. Kliinisissä tutkimuksissa keskityttiin käyttö synteettisten ligandien Toll-kaltaiset reseptorit (TLR) 3,7,9 kasvainten hoitoon [15].

kuitenkin lisäksi se, että signaloinnin aktivaatioon reseptorien (pääasiassa TLR) johtaa että vahvojen vastaus tasolla luontaisen immuniteetin, kasvaimen infiltroivien immuunisolujen on tunnustettava kasvainsoluja todellisena tavoitteet hyökkäyksen. Suosittelemme manipuloimalla fagosyyttisoluista (tärkeä osa tulehdussuodoksen) ja löytää tavoitteensa kytkemällä agonistien fagosyyttisolujen reseptoreiden tuumorisolujen pinnalla, jotta saadaan voimakas antituumorivaikutus. Tämä vaikutus voidaan dramaattisesti parantaa samanaikaisesti hoidossa TLR-reseptorien agonistin (esim LPS).

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki kokeelliset menettelyt olivat mukaisesti suoritettu lakia Tšekin käytöstä koe-eläinten, turvallisuuteen ja käyttöön taudinaiheuttajien. Tutkimuksen hyväksyi instituutin parasitologia, Biology keskus tiedeakatemian Tšekin ja institutionaalisten ja kansallisia komiteoita (protokollien no. 138/2008).

Anaesthesia hiirten (käytetään elinsiirron aikana melanooman solua), joka perustuu intraperitoneaalisesti Ketamine.HCl (75 mg /kg) ja Xylazine.HCl (75 mg /kg). Hengissä analyysi Hiiriä seurattiin kahdesti päivässä. Kun kasvaimen kasvua rajoitetaan eläimen kyky liikkua normaalisti tai syödä tai juoda sitten hiiret tapettiin kautta kaula sijoiltaan.

Kemikaalit

Kudosviljelyalustat ja lisäravinteet, laminariinin alkaen

laminaria digitata

, mannaanisulfaatti alkaen

Saccharomyces cerevisiae,

lipopolysakkaridit (LPS) kohteesta

Escherichia coli

, lipoteichoic happo (LTA) kohteesta

Bacillus subtilis

, ditiotreitoli (DTT), Tris ( 2-karboksietyyli) fosfiini-hydrokloridi (TCEP), DAPI, ja f-MLF (N-formyyli-metioninyyli-leusyyli-fenyylialaniini) saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). 4 – (

N

-Maleimidomethyl) syklo-hexanecarboxylic-happo-N-hydroksisukkinimidiesteriä (SMCC) hankittiin Thermo Scientific (Erembodegem, Belgia). Bioyhteensopiva Anchor solukalvon (BAM, Mw 4000) ja N- (sukkinimidyylioksi-glutaryyli) -L-α-fosfatidyylietanoliamiini, dioleyyli (DOPE) saatiin NOF EUROPE (Grobbendonk, Belgia). Anti-CD11-FITC-konjugaatti saatiin MACS Miltenyi Biotec.

Monomannosyldekalysine syntetisoitiin Vidia (Praha, Tsekin tasavalta). Mannose- (G)

5- (K)

12, mannose- (G)

5- (K)

10-STE (STE tarkoittaa steariinihappo), f-MLF- (G )

5- (K)

12, f-MLF- (G)

5- (K)

10-STE, MLF- (G)

5- (K)

10-STE, ja f-MLFKK syntetisoitiin Schafer-N (Kööpenhamina, Tanska).

synteesi laminariinin-BAM, mannan-BAM, f-MLFKK-BAM, ja f-MLFKK-DOPE

Ensinnäkin sekä aminoidun laminariini ja mannaanioligosakkaridit valmistettiin pelkistävällä aminoinnilla [16]. Laminariini (mannaania) liuos ympäristössä ammoniumasetaatin väheni natrium syaaniboorihydridi pH: ssa 7,5 ja 50 ° C: ssa viisi päivää. Liuos edelleen dialysoitiin käyttäen MWCO 3500 dialyysiputkea (Serva, Heidelberg, Saksa) PBS: ää vastaan ​​4 ° C: ssa yön yli. Peptidi f-MLFKK jo sisältyy aminoryhmä.

Sitovat BAM (sisältää yhden alifaattisen ketjun) tai DOPE (kaksi alifaattista ketjua) on aminoryhmä Laminariinin (mannaania, f-MLFKK) suoritettiin pH: ssa 7,3 mukaan Kato et ai. [17]. Yhden tunnin aikana huoneen lämpötilassa N-hydroksisukkinimidiä (NHS) ryhmä BAM vast. DOPE reagoimaan aminoryhmän Laminariinin (mannaania), tai ε-aminoryhmä lysiinin vastaavasti. Solutions saatu (PBS) säilytettiin pakastettuna -20 ° C: ssa käyttöön asti.

synteesi Laminariinin-SMCC, mannan-SMCC, f-MLFKK-SMCC, ja niiden

in vivo

ja

in vitro

sovellus

valmistajan ohjeiden mukaisesti (Thermo Scientific, Pierce Protein Biology Products), samalla tavalla kuin edellisessä kappaleessa, NHS ryhmä SMCC reagoimaan aminoryhmän aminoidun laminariinin ja mannaanista tai kanssa ε-aminoryhmän lysiinin f-MLFKK (ekvimolaariset määrät), vastaavasti. Taata sitoutuminen SMCC sisältävien ligandien kasvainsoluihin, oli välttämätöntä varmistaa, onko -SH-ryhmien soluille. Se saatiin aikaan mukainen Christiaansen et ai. [18] pelkistämällä kystiinejä. Meidän

in vivo

kokeissa käytettiin 50 mM liuosta, jossa oli TCEP PBS: ssä tätä tarkoitusta varten. Tätä liuosta injektoitiin kasvaimen (i.t.) tunti ennen levittämistä Laminariinin-SMCC, mannan-SMCC tai f-MLFKK-SMCC ratkaisut (PBS: ssä). Meidän

in vitro

kokeissa käytettiin 5 mM liuosta TCEP PBS: ssä ja yhden tunnin inkubaation jäillä.

Solulinjat ja hiiret

Hiiren melanooma B16-F10-solujen ja peritoneaalimakrofageille PMJ2R hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Molemmat solulinjat kasvatettiin RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, USA), johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS, PAA, Itävalta) ja antibiootteja. Soluja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmassa, jossa oli 5% hiilidioksidia.

nainen SPF C57BL /6-hiiriä saatiin Charles River Laboratories (Sulzfeld, Saksa). Hiiriä pidettiin muovisissa häkeissä haketta vuodevaatteet sijaitsee tietyssä-taudinaiheuttajista vapaa huoneen vakiolämpötilassa 22 ° C ja suhteellinen kosteus 65%. Pellettiruokaa ja vettä steriloitiin. Hiiriä sijoitettu 12/12 tunnin valoisa aika ympäristössä vapaasti ruokaa ja vettä. Hiiret painavat 18-20 g käytettiin kokeissa.

kasvaimen siirron

4 × 10

5 B16-F10-solua per hiiri 0,1 ml RPMI ilman FCS istutettiin ihon alle (sc) on ajeltu alue oikeaan kylkeen.

hoito ja arviointi hoito

Hiiret satunnaistettiin ryhmissä kaksitoista päivää kasvaimen siirron jälkeen. Therapies aloitettiin välittömästi (kasvaimensisäisenä sovellukset 50 ui vastaavia ratkaisuja). Siitä lähtien, hiiriä pidettiin yksittäin.

Kasvaimet mitattiin joka toinen päivä käyttäen jarrusatulat. Tilavuus laskettiin kuten aiemmin on kuvattu [19] käyttämällä kaavaa V = π /6 AB

2 (A tarkoittaa suurin mitta syöpäkasvaimen ja B tarkoittaa pienin mitta).

keskimääräinen aleneminen kasvaimen kasvun ( %) B

vähentäminen kasvaimen kasvua (verrattuna kontrolli) määritettiin seuraavasti:

Mean (in%) arvojen mitattiin päivinä 4, 6, 8, 10, 12 ja 14 sen jälkeen, kun hoidon alussa laskettiin ja merkintä ”tarkoittaa vähentäminen kasvaimen kasvua”.

Analyysi soluinfiltraatin virtaussytometriaa käyttämällä. -sytokiinianalyysin

Kasvain leikattiin irti hiiren, joka oli lopetettiin kautta kaula sijoiltaan. Sen jälkeen se varovasti pestiin kylmällä RPMI 1640, leikattiin pieniksi paloiksi ja laitettiin 1 ml: aan kylmää RPMI 1640, joka sisälsi 0,33 mg /ml Liberase DL ja 0,2 mg /ml DNaasi I (sekä Roche Diagnostics, Saksa). 1 h kuluttua inkuboinnin pyörivässä ravistimessa 37 ° C: ssa, möhkäleitä kudoksen aggregaatit sentrifugoitiin 160

g

10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti käytettiin IL-1 beta, TNF-alfa, IL-6, (ELISA, eBioscience), ja IL-8: n (R 0,2 mg /ml), B-solut (anti-hiiri-CD19 APC; klooni eBio1D3 ; 0,2 mg /ml), T-solujen (anti-hiiri-CD3e FITC, klooni 145-2C11, 0,5 mg /ml), CD4 + T-solut (anti-hiiri-CD4-APC, klooni GK1,5, 0,2 mg /ml), CD8 + T -solut (anti-hiiri CD8a, klooni 53-6.7; 0,2 mg /ml), NK-solut (anti-hiiri-NK1.1 PE, klooni PK136, 0,2 mg /ml), granulosyytit (anti-hiiri-Ly-6G (Gr-1 ) Alexa Fluor 700; klooni RB6-8C5, 0,2 mg /ml) ja monosyyttien /makrofagien (MF-solut) (anti-hiiri-F4 /80-antigeenin PE-Cy7, klooni BM8, 0,2 mg /ml). Leimatut solujen näytteitä pestiin kahdesti PBS: llä sentrifugoimalla 160

g

2 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja analysoitiin käyttäen BD FACSCanto II virtaussytometrillä (BD Biosciences, USA), jossa on kaksi laseria, jossa heräte voimavaroja 488 nm ja 633 nm. Kaksikymmentä tuhatta tapahtumia mitattiin jokaisen suspension kolmessa riippumattomassa toistoja. Leimatut solujen populaatiot analysoitiin BD FACSDiva ohjelmisto 6.1.3. Absoluuttinen määrä valkosolujen osajoukon kvantitoitiin käyttäen CountBright

TM absoluuttinen laskenta helmiä (Invitrogen, USA). Ohjaus Kaikkien monoklonaalisia vasta-aineita tunnustaa hiiri pinta antigeenejä suoritettiin näyte pernasolujen kussakin välein kokeen. Solumäärä laskettiin uudelleen ja ilmaistiin solua /mm

3 kasvainkudoksen.

Histologia

Kasvaimet kiinnitettiin 4% neutraaleja formaldehydiliuosta. Parafiiniblokit valmistettiin. Leikkeitä värjättiin hematoksyliinillä /eosiinilla.

keuhkoetäpesäkkeet

Keuhkot kiinnitettiin 4% neutraali liuos formaldehydiä tutkittiin tuella preparointimikroskooppia. Läsnäolo etäpesäkkeitä (mustia) arvioitiin.

In vitro

analyysi sytotoksista vaikutusta makrofagien aktivoida TLR ligandin melanoomasoluja, joissa phagocytic reseptoreita

määritys perustuu aiemmin on kuvattu [20]. Hiiren B16-F10-melanoomasoluja kasvatetaan konfluenssiin 96-kuoppaisen kudosviljelylevyn (Nunc, Roskilde, Tanska) inkuboitiin (30 min, 37 ° C) liuoksella, jossa oli fagosyyttisen reseptorin agonistit (0,02 mM laminariinia-BAM tai 0,02 mM mannan- BAM tai 0,05 mM f-MLFKK-BAM viljelyalustassa) ja pestiin sen jälkeen. Solut hiiren makrofagisolulinjassa PMJ2R esi-inkuboitiin LPS: ää (1 ug /ml) 2 tuntia 37 ° C: ssa, sitten ne pestiin, suspendoitiin uudelleen RPMI 1640, 10% FCS: ää ja lisätään B16-F10 suhteessa 5:01 . Tätä seosta inkuboitiin 4 tuntia 37 ° C: ssa. Inkubaation jälkeen PMJ2R ja kuolleet solut pestään huolellisesti pois. Living B16-F10-melanoomasoluja vapautettiin trypsinoinnilla. Trypaanisinistä ilman soluja määrällisesti hemosytometriä.

Cell signaling

2 x 10

5 kutakin, B16-F10 ja PMJ2R solut ympättiin yhteen läsnä Laminariinin-BAM tai B16-F10-solujen kovalenttisesti sitoutunut laminariinin-SMCC käytettiin. Jälkeen ilmoitettuina ajankohtina inkuboinnin jälkeen solut hajotettiin modifioidussa RIPA-puskuria (1% Nonidet P-40, 0,25% natriumdeoksikolaatti, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, ja 50 mM Tris-HCl (pH 7,5)), kun läsnä on proteaasi-inhibiittorit (10 ug /ml aprotiniinia, 1 ug /ml leupeptiiniä, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 1 ug /ml pepstatiini), ja fosfataasi-inhibiittorit (25 mM natriumfluoridia ja 2 mM natriumortovanadaattia). Solulysaatit sekoitettiin 4x Laemmli-näytepuskurissa, kuin proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin Immobilon-P-membraanille. Blotteja inkuboitiin anti-fosfo-NF-KB: n p65 (Ser536, Cell Signalling) ja anti-β-aktiini Santa Cruz Biotechnology), vasta-aineen laimennus 1:1000. Proteiinit visualisoitiin ECL (tehostettu kemiluminesenssi, Pierce), ja niiden runsaus määritettiin käyttäen CCD-järjestelmä (ChemiDoc

TM MP Imaging System, BIO-RAD) ja ImageLab ohjelmistoja.

Kyky BAM ja DOPE ankkuroida molekyylejä solukalvoihin

konjugointi BAM tai DOPE B-fykoerytriini (PE) suoritettiin pH 7,3: ssa pimeässä kuten aikaisemmin on kuvattu [17]. Tunnin kestävät vuorovaikutuksia PE-BAM, PE-DOPE ja PE 1 x 10

5 melanoomasoluja suoritettiin 37 ° C: ssa pimeässä kolmena rinnakkaisena. Sentrifugoinnin (2 min. 4 ° C: ssa, 400 g), supernatantit kerättiin, ja sen fluoresenssi mitataan Infinite M200 (TECAN, Sveitsi) 545 nm: ssä.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi oli suoritettiin käyttäen kaksisuuntainen Studentin t-testiä. Hiiren selviytyminen arvioitiin käyttämällä Kaplan-Meier testi (MedCalc).

Tulokset

vaikutus Laminariinin syövän hoidossa

Vaikutus ankkuroitu Laminariinin (laminariinin-BAM) on kasvaimen kasvua ja sen synergia LPS.

melanooma B16-F10 oli istutetaan 20 C57BL /6-hiiristä. Kaksitoista päivää tämän jälkeen, hiiret satunnaistettiin neljään ryhmään, jotka sisältävät viisi hiirtä kussakin. Tänä päivänä kasvaimen tilavuus mitattiin ja kasvaimen hoito aloitettiin välittömästi tämän jälkeen. Kuten kuviossa 1A on esitetty, laminariinin-BAM ei ollut merkittävää vaikutusta kasvaimen kasvuun. Vaikutus LPS oli tilastollisesti merkitsevä tuloksena 63,2% keskimääräinen vähennys kasvaimen kasvua (katso materiaalit ja menetelmät laskettaessa keskimääräinen väheneminen kasvaimen kasvun). Yhdistelmä laminariinin-BAM ja LPS osoitti synergististä ja voimakas väheneminen kasvaimen kasvua (keskimääräinen väheneminen kasvaimen kasvua 90,2% kontrolliin verrattuna). Havaitsimme, että 60% kasvaimista väliaikaisesti hävinneet tai kutistuminen kasvaimen tilavuus tapahtunut. Pieneneminen kasvaimen kasvu oli tilastollisesti merkitsevä kontrolliin verrattuna ja vaikutus yksilön (Laminariinin-BAM, LPS) komponentteja. Mitä selviytymisen, sen pidentyminen siinä tapauksessa Laminariinin-BAM /LPS seosta ei ollut tilastollisesti merkitsevä.

C57BL /6-hiiriä (naaraita) inokuloitiin 4 × 10

5 hiiren melanooma B16-F10-solut hiirtä kohti 0,1 ml: ssa RPMI subkutaanisesti ajeltu alue oikeaan kylkeen. Hiiret satunnaistettiin ryhmiin 5-6 kaksitoista päivää kasvaimen siirron jälkeen. Therapies aloitettiin välittömästi kasvaimensisäisiä sovellusten 50 ui vastaavat ratkaisut ja jatkettiin joka toinen päivä 10 päivän ajan (yhteensä 6 annosta). Sen jälkeen hoito oli aloitettu, hiiriä pidettiin yksittäin. Kasvaimet mitattiin joka toinen päivä 14 päivän ajan ja niiden tilavuus laskettiin. (A) Anchored laminariinin (laminariinin-BAM). 5 hiiren ryhmiä saatiin 0,2 mM laminariinin-BAM PBS: ssä, LPS: ää (0,5 mg /ml PBS: ssä), seosta 0,2 mM laminariinin-BAM ja LPS: ää (0,5 mg /ml) PBS: ssä, ja pelkkää PBS: ää. (B) Anchored mannoosia. Ryhmät 6-hiirten saadaan 3 mM mannose- (G)

5) – (K)

10-STE PBS: ssä, LPS: ää (0,5 mg /ml PBS: ssä), seosta 3 mM mannose- (G)

5- (K)

10-STE ja LPS: ää (0,5 mg /ml) PBS: ssä, ja pelkkää PBS: ää. (C) Anchored mannaania. 5 hiiren ryhmiä saatiin 0,2 mM mannan-BAM PBS: ssä, LPS: ää (0,5 mg /ml PBS: ssä), seosta 0,2 mM mannaania BAM ja LPS: ää (0,5 mg /ml) PBS: ssä, ja pelkkää PBS: ää. (D) ankkuroituna formylpeptide reseptorin agonistin oligolysin. Ryhmät 6-hiiriin injektoitiin 3 mM f-MLF- (G)

5- (K)

12 PBS: ssä, LPS: ää (0,5 mg /ml PBS: ssä), seosta 3 mM f-MLF- (G )

5- (K)

12 ja LPS: ää (0,5 mg /ml) PBS: ssä, ja pelkkää PBS: ää. (E) ankkuroituna formylpeptide reseptorin agonistin steariinihappoa. Sama järjestelmä kuin (D), 3 mM f-MLF- (G)

5- (K)

10-STE sijasta 3 mM f-MLF- (G)

5- ( K)

12. * P≤0.05, ** P≤0.01, *** P≤0.005, **** P≤0.001 verrattuna kontrolliin ■ P≤0.05, ■■ P≤0.01, ■■■ P≤0.005 verrattuna LPS oP≤ 0,05, ooP≤0.01, oooP≤0.005 verrattuna ligandiin.

Synergy laminariinin-BAM LPS, eri järjestelmille soveltamista.

sarja kokeita samanlainen kuin edellä mainittu yksi tehtiin. Optimointi huumeiden hakemuksen ajoitus tutkittiin. Seosta, jossa oli 0,2 mM laminariinin-BAM ja LPS: ää (0,5 mg /ml) PBS: ssä käytettiin. Tulokset on esitetty taulukossa 1, jossa korostetaan olennaista merkitystä lyhytaikaisen mutta riittävän tehokasta hoitoa.

Muiden tila Laminariinin sitoutumisen solun pintaan.

Direct kovalenttinen

in vivo

sitoutumisen laminariinin-SMCC soluihin (etukäteen vähentäminen kystiinejä by TCEP) levitettiin. Laminariini-SMCC (0,2 mM) annettiin yhdessä LPS: ää (0,5 mg /ml). Tämä hoito aiheutti voimakkaampia väheneminen kasvaimen kasvua kuin laminariinin-BAM /LPS, kuitenkin tämä ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä (tuloksia ei ole esitetty). Vähentäminen (TCEP) ja SMCC sitova ei vaikuttanut kasvaimen kasvuun.

Vertailukokeet.

kuvaavat, miten välttämätöntä Laminariinin ankkurointi syöpäsoluja, vapaa laminariini sijasta Laminariinin-BAM. Laminariini- ei pienennä kasvaimen kasvua ja sen seos LPS ei osoittanut merkkejä additiivisuuteen tai synergia. Kasvaimen kasvu vähentää aktiivisuutta tätä seosta vastasi aktiivisuutta LPS yksinään (tuloksia ei ole esitetty). Ankkuri yksin (lysiini-BAM) ei havaittu antituumorivaikutus ja sen seos LPS ei osoittanut merkkejä additiivisuuteen tai synergiaa samoin.

vaikutus molekyylien terminaalin mannoosia syövän hoidossa

merkitys mannoosin ankkurointi, vaikutus LPS.

3 mm liuosta mannoosia PBS ei pienennä kasvaimen kasvua, kun sitä käytetään joka toinen päivä, kuusi injektiot kokonaan. LPS: n lisäämistä (0,5 mg /ml) ei aiheuttanut mitään additiivisuutta tai synergiaa, seos vähensi kasvainten kasvua jopa vähemmän kuin pelkästään LPS: llä. Kasvainsolut merkittävästi negatiivisesti varautuneita, joten tutkimme niiden vuorovaikutusta positiivisesti varautuneita mannoosi-K

10, joka sisältää kymmenen lysiinitähteitä ketju. Mannoosia K

10 3 mM pitoisuus ei vaikuttanut kasvaimen kasvua ja LPS lisäystä (0,5 mg /ml) ei aiheuttanut additiivisuutta tai synergia. Alhainen vaikutus (32,7% keskimääräinen vähennys kasvaimen kasvua verrattuna kontrolliryhmään) todettiin käyttäen 3 mM liuosta mannose- (G)

5) – (K)

12) PBS eli yhdiste 5 glysiini jäännös spacer välillä ligandin ja ankkuroiva osa molekyyliä. Tämä vähennys oli tilastollisesti merkitsevä (kontrolliin verrattuna) vain päivänä 6 hoidon (tietoja ei esitetty).

lisääminen lipofiilisen ankkurin (mannose- (G)

5- (K)

10) -STE) johti edelleen vähentää kasvaimen kasvua. Liuosta, jossa oli tätä yhdistettä PBS: ssä (3 mM) aiheutti tilastollisesti merkittävä väheneminen kasvaimen kasvua (kuvio 1 B). Keskimääräinen väheneminen kasvaimen kasvu oli 75,6%. LPS lisäystä (0,5 mg /ml) ei aiheuttanut mitään additiivisuutta tai synergiaa, päinvastoin, keskimääräinen alenema kasvaimen kasvun laski 71,2%. Vaikutus LPS yksin jäi vahvin. Hiiret tapettiin 14 päivää sen jälkeen, kun hoidon alussa. Ratkaisu mannose- (G)

5- (K)

10-STE täysin tukahdutetaan ulkonäkö etäpesäkkeitä. Ilmaantuvuutta ja voimakkuutta etäpesäkkeitä on koottu taulukkoon 2.

Vaikutus ankkuroitu mannan (mannan-BAM) kasvaimen kasvua ja sen synergia LPS.

Hiiriä käsiteltiin mannaanisulfaatti -BAM, LPS ja näiden kahden seos (kuvio 1 C). Mannaania BAM aiheuttama heikko (50,5%), mutta tilastollisesti merkitsevä väheneminen kasvaimen kasvua. Vaikutus LPS oli hieman suurempi (keskimääräinen väheneminen kasvaimen kasvu oli 63,2%). Yhdistelmä molemmat yhdisteet aiheutti voimakkaan synergistisen väheneminen kasvaimen kasvua (88,6% kontrolliin verrattuna) ja kasvainten ajallisesti katosi 80% hiiristä. Pieneneminen kasvaimen kasvun aiheuttaman mannan-BAM /LPS seos oli aluksi tilastollisesti merkitsevä verrattuna sekä verrokki- että molemmat yksittäiset komponentit seoksen, myöhemmin vain ohjaus. Jatkaminen hiiri selviytymisen aiheuttama hoidon seoksella mannaania BAM /LPS, ei ollut tilastollisesti merkitsevä.

Synergy mannaania-BAM LPS, eri järjestelmien sovelluksen.

optimaalinen järjestelmä on parhaiten saavuttaa pulssi kasvaimeen soveltamista 50 ui 0,2 mM mannaania BAM ja LPS: ää (0,5 mg /ml) seosta päivinä 0, 1, 2. 8, 9, 10,16, 17, 18,24, 25, 26 . Tämä järjestelmä aiheutti paitsi vähentää merkittävästi kasvaimen kasvua (94,7%), mutta tilastollisesti merkitsevä elinajan pitenemiseen (P≤0.005), katso kuva 2. 80% eloonjäämisaste 100 päivää havaittu.

seos 0,2-BAM ja LPS (0,5 mg /ml) PBS: ssä sovellettiin se pulssi järjestelmää (päivää 0,1,2. 8,9,10.16,17,18.24,25,26). Sekä koe- ja kontrolliryhmässä sisälsivät 5 hiirtä kussakin. *** Osoittaa, P≤0.005 kontrolliin verrattuna.

Muiden tila mannaania sitoutumisen solun pintaan.

suora kovalenttinen

in vivo

sitoutumiseen 0,2 mM mannan-SMCC soluihin (ensisijaisesti pienentää TCEP) testattiin. Mannaania SMCC annettiin yhdessä LPS: ää (0,5 mg /ml). Kuten taulukossa 3 on esitetty, suuri väheneminen kasvaimen kasvun ja korkea suhde hiirien väliaikaisen katoaa kasvaimia ei havaittu. Käyttö neljä terapeuttisten pulssien mannan-SMCC /LPS seos aiheutti lähes tilastollisesti merkitsevä elinajan pitenemiseen. Vain tässä tapauksessa, selviytyminen pidempi kuin 100 päivää ei havaittu.

Vertailukokeet.

Kuten edellä mainittiin, vapaa mannoosi ei pienennä kasvaimen kasvua. Sen seos LPS myös ei osoittanut merkkejä additiivisuuteen tai synergiaa, kaikki kasvain vähentää seoksen aktiivisuus vastasi vaikutusta LPS yksin. Samat tulokset saatiin vapaa mannaaniin (tuloksia ei ole esitetty). Testata uusia ankkurointia periaatteiden (sähköstaattiset vuorovaikutukset, solu vähennys TCEP ja SMCC sitova) ei paljastanut mitään antituumorivaikutus ja yhdessä LPS ei osoittanut merkkejä additiivisuuteen tai synergiaa samoin. BAM ankkurointi ei paljastunut syövän vastaista aktiivisuutta kuten on jo kuvattu. Mitä tulee (G)

5- (K)

10-STE, kuten alla on kuvattu, ei ole syövänvastainen aktiivisuus liittyy tämän tyyppinen ankkurointi samoin.

vaikutus formylpeptide reseptoriagonisteja syöpä terapia

merkitys ankkuroiminen formylpeptide reseptoriagonistien.

vaikutus LPS. Ensimmäisessä kokeessa, agonistit formylpeptide reseptorien oli liitetty kasvainsolun pinnalla perusteella maksu vuorovaikutuksen kuten edellä jo mainittiin. f-MLF- (K)

12 käytettiin agonistina. Jopa 3 mM konsentraatio, se ei vähentänyt kasvua melanooma. Agonisti vaikutus tehostaa käyttämällä välilevy (5 glysiinitähde ketju), joka mahdollistaa korkeammat joustavuus terminaalin f-MLF ryhmä. Rakenne edellä mainittu yhdiste oli f-MLF- (G)

5- (K)

12. Kuten kuviossa 1D, f-MLF- (G)

5- (K)

12 Liuokseen, aiheuttama heikko, mutta silti tilastollisesti merkittävä väheneminen kasvaimen kasvu (keskimääräinen alenema kasvaimen kasvu oli 59,7%), joka on merkittävästi parannettu lisäämällä LPS: 78,3% keskimääräinen vähennys kasvaimen kasvua. F-MLF- (G)

5- (K)

12 /LPS vuorovaikutusta tulisi pitää hieman lisäainetta, koska niiden seos osoitti vain hieman suurempi vaikutus kuin tehokkaampi komponentin seoksen.

molekyyli formylpeptide agonistin modifioitiin edelleen. Charge vuorovaikutukset kytkettiin ankkurointi alifaattisten ketjun lipidien kerros solukalvoon. Rakenne Tämän yhdisteen oli f-MLF- (G)

5- (K)

10 STE. Kuten on osoitettu kuviossa 1E, f-MLF- (G)

5- (K)

10-STE toimii vertailukelpoisella (55,0% keskimääräinen alenema kasvaimen kasvu), kun yhdistettä ilman steariinihappoa, käytetty edellisissä kokeessa ( 59,7%). Yhdistelmä f-MLF- (G)

5- (K)

10-STE LPS johti voimakas synergistinen vaikutus, joka osoittaa merkitty hidastanut kasvaimen kasvua (98,7%). Tämä vähennys oli tilastollisesti merkitsevä verrattuna molemmat osat seoksen. Kasvaimet viidessä kuusi hiirtä (83,3%) tilapäisesti katosi. Kasvu elossapysymisaikojen tässä ryhmässä oli tilastollisesti merkitsevä (P≤0.05).

Muiden liikennemuotojen sitoutumisen f-MLF solun pintaan.

sarja kokeita paljastui että ankkuroitu 0,5 mM f-MLF motiivi seoksena LPS: ää (0,5 mg /ml) on riittävä voimakas väheneminen kasvaimen kasvua. Käyttämällä näitä pitoisuuksia ja eri tapoja ankkurointiin ja ajoituksen suoritimme kokeita, jonka tavoitteena on löytää parhaat edellytykset vahvin antituumorivaikutuksen.

Tulokset esitetään yhteenvetona taulukossa 4. Kokeet vahvistivat olennainen merkitys lyhyt mutta riittävän tehokas alustava hoito, jossa seos 0,5 mM f-MLFKK-DOPE ja LPS: ää (0,5 mg /ml) osoittautui parhaaksi. 60% hiirissä, joita hoidettiin tällä tavalla selvisi 100 päivää, elävät edelleen ilman patologisia oireita.

Vertailukokeet.

Vapaa 3 mM f-MLF ei osoittanut mitään väheneminen kasvaimen kasvun ja vähentäminen aktiivisuus sen seos LPS vastasi aktiivisuutta pelkästään LPS: llä. Tietoja ei ole esitetty. Ankkurit (DOPE lysiininä-DOPE, (G)

5- (K)

10-STE immunologisesti inertti MLF- (G)

5- (K)

10-STE) ei näytä mitään antituumorivaikutus ja yhdistelmä, jossa LPS ei osoittanut merkkejä additiivisuuteen tai synergian.

analyysi solun tunkeutumaan kasvaimissa virtaussytometriaa käyttämällä. Sytokiinimäärityksiä

kolme kokeissa saman suunnittelun tehtiin kolmella eri phagocytic reseptorin ligandeja: laminariini-BAM, mannaani-BAM ja f-MLFKK-BAM yksin tai yhdessä LPS: n kanssa.

kaikissa kokeissa 3 hiirtä kustakin ryhmästä (ks legenda kuvioihin 3, 4, 5, 6) tapettiin 12, 24 ja 48 tunnin välein (+3 valvonta hiiret tapettiin ajankohtana 0). Solujen virtaussytometria ja supernatantit ELISA valmistettiin ja analysoitiin.

ryhmät 9 hiiret saivat yhden annoksen 0,2-BAM PBS: ssä, LPS: ää (0,5 mg /ml PBS: ssä), seosta 0,2 mM Laminariinin-BAM ja LPS: ää (0,5 mg /ml) PBS: ssä, ja pelkkää PBS: ää 50 ul: se 3 hiirtä kustakin ryhmästä tapettiin 12, 24 ja 48 tunnin välein, solut irrotettiin kasvaimia valmistettiin entsymaattisella käsittelyllä (Liberase DL ja DNaasi I) ja analysoitiin virtaussytometrialla. Jyvässolu havaitseminen anti-hiiri-Ly-6G (Gr-1) Alexa Fluor 700 on käytetty.

ryhmät 9 hiiret saivat yhden annoksen 0,2-BAM PBS: ssä, LPS: ää (0,5 mg /ml PBS), seos 0,2 mM mannaania BAM ja LPS: ää (0,5 mg /ml) PBS: ssä, ja pelkkää PBS: ää 50 ul: se 3 hiirtä kustakin ryhmästä tapettiin 12, 24 ja 48 tunnin välein, solut irrotettiin kasvaimia valmistettiin entsymaattisella käsittelyllä (Liberase DL ja DNaasi I) ja analysoitiin virtaussytometrialla. Seuraavat leimattuja vasta-aineita käytettiin: (A) anti-hiiri-Ly-6G (Gr-1) Alexa Fluor 700 granulosyyttien havaitseminen, (B) ja anti-hiiri-CD19 APC havaitsemiseksi B-lymfosyyttien ja (C) ja anti-hiiri-NK1. 1 PE NK-soluja.

ryhmät 9 hiiret saivat yhden annoksen 0,5-MLFKK-BAM, LPS: ää (0,5 mg /ml), seos 0,5 mM f-MLFKK-BAM ja LPS: ää ( 0,5 mg /ml), ja pelkkää PBS: ää 50 ul: se Valmistaminen solususpensiota ja granulosyytti värjäys suoritettiin kuten kuviossa 3.

ryhmät 9 hiiret saivat yhden annoksen 0,5-MLFKK-BAM, LPS: ää (0,5 mg /ml), seokseen, jossa oli 0,5 mM f-MLFKK-BAM ja LPS: ää (0,5 mg /ml), ja pelkkää PBS: ää 50 ul: se 3 hiirtä kustakin ryhmästä tapettiin 12, 24 ja 48 tunnin välein. Valmistuksen jälkeen solut irrotettiin kasvaimista, jotka vastaavat supernatantteja käytettiin IL-1-beeta määrittämiseksi. IL-1-beeta tasot on ilmaistu pg IL-1-beeta /mm

3 kasvainkudoksesta.

Therapy käyttöön perustuvat Laminariinin-BAM, LPS ja niiden seos.

muutokset granulosyyttiarvojen (GR1 +) vain havaittiin seurantajakson aikana. [24].