Krooninen sairaus

tiivistelmä

Breaking tasapaino lisääntymisen ja erilaistumisen eläinsoluissa voi aiheuttaa syöpää, mutta mekanismit säilyttää tämän tasapainon pysyvät suurelta osin määrittämätön. Kalsium aktivoitu kloridikanava A1 (CLCA1) kuuluu kalsiumherkkää kloridin johtokyky perheen proteiinien ja saadaan pääasiassa paksusuolessa, ohutsuolessa ja liite. Osoitamme, että CLCA1 lla on funktionaalinen rooli erilaistumista ja lisääntymistä Caco-2-solut ja suoliston kudos. Caco-2-solut spontaanisti erilaistuvat joko konfluenteissa kulttuuriin tai käsitelty butyraatti, molekyylin läsnä luonnostaan ​​ruokavaliossa. Täällä vertasimme CLCA1 ilmaisullisella tasojen potilaiden kanssa ja ilman peräsuolen syöpä (CRC) ja määritetään funktionaalinen rooli CLCA1 erilaistumisen ja proliferaation Caco-2-solut. Osoitimme, että: 1) CLCA1 ja CLCA4 ilmentyminen alassäädetty merkittävästi CRC potilaille; 2) CLCA1 ilmentyminen säädellään ylöspäin Caco-2-solut indusoidaan erilaistumaan konfluentteja kulttuurin tai käsittelemällä natriumbutyraatti (NaBT); 3) knockdovvn CLCA1 siRNA esti merkitsevästi solujen erilaistumista ja edistetään soluproliferaatiota in Caco-2 konfluentteja viljelmiä, ja 4) Caco-2 3D kulttuuri, tukahduttaminen CLCA1 huomattavasti lisääntynyt solujen lisääntymistä ja vaarantaa NaBT inhiboivan vaikutuksen lisääntymistä. Lopuksi CLCA1 voi edistää spontaanin erilaistumisen ja vähentää leviämisen Caco-2-solut ja se voi olla kohteena NaBT inhiboivan vaikutuksen lisääntymistä ja siksi mahdollinen diagnostinen markkeri CRC ennustetta.

Citation: Yang B Cao L, Liu B, McCaig CD, Pu J (2013) siirtyminen leviämisen ja eriytyminen peräsuolen syövän säätelee kalsium Aktivoidut Chloride Channel A1. PLoS ONE 8 (4): e60861. doi: 10,1371 /journal.pone.0060861

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japani

vastaanotettu: 14 joulukuu 2012; Hyväksytty: 03 maaliskuu 2013; Julkaistu: 12 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat NHS Endowment Fund (12/50) ja LC, JP ja CDM, ja ystävät Anchor JP ja CDM. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

nisäkkäiden suolistossa enterosyytteihin uudistetaan jatkuvasti välein 4-8 päivää. Tämä tapahtuu koordinoidun useita tapahtumia, joihin liittyy proliferaatiota, erilaistumista, ja siirtyminen suoliston crypts ylöspäin kohti ontelon [1]. Häiriöt tasapainoa solujen jakautumista ja erilaistumista voi johtaa tautitilojen kuten syövän [2]. Korjauksilla tiukasti säänneltyä tasapaino erittäin proliferatiivisen /vähemmän eriytetty enterosyytit ja ei-proliferatiivinen /suuria eroja valtion saattaa johtaa liikakasvuun, hyvänlaatuinen (polyypit) tai pahanlaatuinen kasvain [3]. Wnt signalointireitin on ensisijainen mekanismi valvoa leviämisen enterosyyteistä suoliston kryptissa [4].

Ionikanavat edistää kasvainten säätelemällä perus solun prosesseja proliferaatiota, erilaistumista ja apoptoosia [5]. Esimerkiksi KCNK9 (kaliumkanavan subfamily K jäsen 9) on yli-ilmentynyt ja vaikuttavan kasvainten kehittymiseen edistämällä syöpäsolu selviytymistä rintasyövän [6]. GIRK1 (G-proteiini sisäänpäin korjaamisesta kaliumkanavan 1) ilmaus kasvoi 50/72 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä potilaita ja esiintyminen mRNA liittyi merkittävästi vähentää viiden vuoden eloonjäämisluvut [7]. Lisäksi TRPM8 kanava proteiinin (ohimenevä reseptorin potentiaalia kationi kanava subfamily M jäsen 8) eturauhasspesifinen markkeri oli säädelty kasvainkudoksessa [8]. Tutkimukset esiintymistä kuvaava yksittäisten ionikanavien kasvainsoluissa ja niiden toiminnalliset vaikutukset kasvuun, muuttoliikettä tai invaasio kasvaa [9].

paksusuolen kloridikanavia (CLCs) muodostavat suuren toiminnallisen perheen kanssa rakenteellisesti monipuolinen jäsenet, joilla on tärkeä rooli sääntelyn epiteelin neste- ja elektrolyyttitasapainon liikenne [10]. Aktivointi kloridi nykyisen läpi erikoistuneiden tilavuus säädelty anioni kanavaa (VRACs) vastauksena solun turvotusta (I

Cl, turvota) on yksi tärkeimmistä mekanismeista, joiden solut palauttaa niiden tilavuus seuraavat hypo-osmoottisen stressin (RVD) [ ,,,0],11]. Tämä on tärkeää, koska on olemassa suora yhteys apoptoottinen vastus siirrettävä jonka antiapoptoottisten Bcl-2-proteiinin ja vahvistaminen RVD kyky johtuu säätely ylöspäin I

Cl, turvota [12]. Lisäksi Chloride kanava 3 (CLC3) proteiini on yksi prostataspesifisen VRACs ja on säädelty androgeeni-riippumaton eturauhassyöpä soluihin [13]. Kalsiumin aktivoimien kloridikanavia (CLCAs) myös ilmaistaan ​​naudan [14], hiiren [15] ja ihmisen [16] enterosyyteissä, ja on olemassa käänteinen korrelaatio tasojen kloridi kanavan (CLCA1 ja CLCA2) ilmaisun ja tuumorigeenisyyden, mikä osoittaa, että ne toimivat suppressors rinta- ja kolorektaalisyövän [17], [18], [19]. Kuitenkin yksityiskohtaiset biologisen toiminnan CLCAs on vielä määrittämättä. Siksi me tutkimme, CLCA1 myötävaikuttaa kasvaimien syntyyn säätelemällä tasapainon lisääntymistä ja erilaistumista enterosyyttien.

Ihmisen suoliston syöpä solulinja Caco-2 on vakiintunut malli järjestelmä tutkia solujen erilaistumista ihmisen enterosyyteissä vuodesta se erottelee spontaanisti polarisoituneet solujen morfologiset ja biokemialliset ominaisuudet ohutsuolen enterosyyteistä [20]. Lisäksi, Caco-2-solut myös erilaistuvat, kun se altistetaan fysiologisesti asiaan lyhytketjuisten rasvahappojen, butyraatti [19]. Lyhytketjuisten rasvahappojen (SCFA), pääasiassa butyraatti, propionaatti ja asetaatti, tuotetaan suoliston läpi käymisen kuitua, jonka koolonin mikrobiston [21]. Butyraatti erityisesti on edullinen energianlähde soluja paksusuolen limakalvon ja saa aikaan erilaisia ​​biologisia vaikutuksia viljellyissä nisäkässoluissa, kuten soluproliferaation inhibointi, apoptoosin ja erilaistumisen induktion [22], [23]. Tämän vuoksi, sen terapeuttista potentiaalia paksusuolen syöpä on ehdotettu [23]. Caco-2-soluihin, kun kasvanut yksisolukerroksena tai alttiina natriumbutyraatti (NaBT) käsittely, eriyttää jäljittelemään fenotyypiltään ja toiminnallisesti kypsä paksusuolen epiteelin ja ovat käyttökelpoinen malli tutkimiseksi molekyylimekanismeihin erilaistumista CRC. Tässä osoitamme, että CLCA1 (kalsium-aktivoitujen kloridikanava perheenjäsen 1) näyttelee toiminnallista roolia säätelyssä erilaistumista ja lisääntymistä Caco-2-soluilla.

Tulokset

Down-regulation of CLCA1 ekspressio ja peräsuolen syöpä (CRC) Potilaat

Ensinnäkin, tutkimme ekspressiotaso ihmisissä kloridikanavia normaaleissa ja tuumorikudoksissa käyttäen microarray tietokanta NCBI (http: //www.ncbi.nlm.nih. gov /geo /). Ilmentymistasojen CLCN2, CLCN3, CLCA1, CLCA4 ja CFTR alussa CRC potilaalla oli merkittävästi vähentynyt 31%, 59%, 74%, 41% ja 58% vastaavasti verrattuna normaaliin paksusuolen limakalvon (Fig. 1A). Edelleen varmistamiseksi alas-säätely CLCA1 CRC potilailla, käytimme immunofluoresenssivärjäyksellä havaitsemaan CLCA1 ilmaisua sekä CRC ja suoliston normaalin kudosten ja löysi ilmentymä CLCA1 vähensi merkittävästi CRC suolistossa (Fig. 1 B). Yksi ominaisuuksia kasvainten synnyssä on korkea leviämisen /alhainen erilaistumisen määrä soluja. Ehkä CLCA1 myötävaikuttaa kasvaimien syntyyn säätelemällä tasapainon lisääntymistä ja erilaistumista enterosyyttien.

. Normalisoitu raaka ilmaus arvoja kloridikanava perheenjäsenten analysoitiin ihmisen paksusuolen limakalvolla ja varhainen CRC kudoksia Gene Expression Omnibus (viite-sarja on GSE4017). CLCA1, CLCA4, CLCN2, CLCN3 ja CFTR olivat alassäädetty merkittävästi alussa CRC potilailla. Arvot ovat keskiarvo ± SEM, *

p

0,01. B. Analyysi immunofluoresenssilla osoitti, että ilmentyminen CLCA1 väheni CRC kudoksissa, toisin kuin on normaalia koolonin limakalvoa. Bar = 50 pm.

Up-regulation of CLCA1 indusoima Natriumbutyraattia Caco-2 solut

Pro-eriyttämällä vaikutus natriumbutyraatin (NaBT) on tutkittu laajasti eri pahanlaatuisten solulinjojen [24], [25]. Analysoimme Ca

2 +: sta riippuvaisen kloridi kanavaekspression kuvioita Caco-2-soluihin käyttämällä kvantitatiivista RT-PCR (qPCR). Huomasimme, että ekspressiotasot CLCA1 ja CLCA3 oli voimistunut 35-kertaiseksi ja yli 100-kertaiseksi jälkeen 2 mM NaBT hoitoa 24 tuntia (Fig. 2A). Western blotit lisäksi osoitti, että CLCA1 proteiini lisäys oli ajasta riippuva. Kun Caco-2-soluja käsiteltiin NaBT 24 tuntia, CLCA1 ilmentyminen säädeltiin merkittävästi verrattuna ei hoitoryhmässä (Fig. 2B). Kuitenkin oli vain vähän tai ei ilmentymistä CLCA1 seuraava lyhyempi altistuksen (8 ja 12 tuntia hoitoja, Fig. 2B). Expression of CLCA1 yksikerrosviljelmiin ei ole käsitelty NaBT näytetään myös merkittävän kasvun 24 tuntia (verrattuna 8 ja 12 tunnin viljelmät) johtuen spontaanin erilaistumisen Caco-2-solujen konfluentteja viljelmiä (Fig. 2B). NaBT myös kohonnut ilmentyminen suolen alkalista fosfataasia (ALPI) ja β-kateniinin Caco-2-solut (Fig. 2C). Molemmat ovat merkkiaineita suoliston erilaistumisen ja yläreguloituja erilaistuneita soluja. Tuloksemme viittaavat siihen, että CLCA1 saattaa välittää solujen erilaistumisen aiheuttama konfluentteja kulttuurin ja NaBT in Caco-2-soluilla.

. MRNA: n ilmentyminen CLCA1, A2, A3 ja A4 mitattiin käyttämällä kvantitatiivista RT-PCR: llä. CLCA1 ja CLCA3 oli säädelty vastaavasti Caco-2-soluissa, sen jälkeen käsiteltiin 2 mM NaBT 24 tuntia. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta, *

p

0,01. B. Caco-2 yksikerroksista viljeltiin eri ajanjaksoilta /ilman 2 mM NaBT hoitoa. Expression of CLCA1 havaittiin Western blot. 8 ja 12 tuntia konfluentteja kulttuuri, ei valvontaa eikä NaBT lisäsi ilmaisun CLCA1. Kun Caco-2 monolayers viljeltiin 24 tunnin ajan, sekä valvonta- ja NaBT sääteli CLCA1 ilmentymistä, mutta NaBT parannettu CLCA1 ilmentymistä paljon enemmän kuin havaittiin kontrolleissa. C. NaBT koholla ALPI ja β-kateniinin lauseke (Differentiaatiomarkkerien) konfluenteissa viljelmät Caco-2-solut. Histogrammit B ja C esittävät suhteellinen intensiteetti CLCA1 90 KD, ALPI ja β-kateniinin ilmaistiin suhteena suhteessa GAPDH kontrolli. Kaikki tulokset olivat kolmen erillisen kokeen.

CLCA1 ylössäädellään varhaisessa vaiheessa aikana spontaani erilaistuminen Caco-2 solut Confluent Culture

Culture konfluenssiin indusoi spontaanin erilaistumisen Caco -2-soluja [19], [24], [25], [26]. Mallin, kysyimme CLCA1 osaltaan erilaistumista Caco-2-solut. Ensinnäkin, havaitsimme ilmaus CLCA1 ja kaksi Differentiaatiomarkkerien ALPI ja sakkaroosi-isomaltaasin (SI) konfluenteissa kulttuuriin. Olemme havainneet, että ilmentyminen CLCA1 (mukaan lukien kaksi erilaista solun pintaan liittyvä alayksiköt 38 KD: n ja 90 KD [16]), havaittiin hyvin vähäistä alussa viljelmästä. Koska kulttuureissa tuli konfluentteja, CLCA1 ilme alkoi kasvaa ajassa riippuvaisella tavalla. Tämä ilmentymisen lisääntyminen oli havaittavissa 1 päivä (Fig. 3A, 3B). Expression of ALPI ja SI osoitti myös merkittävää aikariippuvainen ylössäätöä, mutta tämä tapahtui vasta päivänä 4, myöhemmin kuin CLCA1 lauseke (Fig. 3C, 3D). Lisäksi olemme havainneet myös ilmaus β-kateniinin eri päivinä Caco-2 cell konfluentteja kulttuuriin. Huomasimme, että β-kateniinin kasvoi hieman Caco-2 yksisolukerroksena (Fig. 3E). Subsellulaarifraktiointikokeet tutkimukset osoittivat, että kasvu β-kateniinin johtui kasvusta kalvon osa β-kateniinin, kun taas sytosolin pysyi vakaana (Fig. 4B) [27]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että ilmaus CLCA1 voi myötävaikuttaa spontaanin erilaistumisen Caco-2-soluilla.

A ja B. Expression of CLCA1 alayksiköstä (38 KD: n ja 90 KD) oli säädelty jälkeen 24 tunnin konfluentteja kulttuuri ja saavutti huippunsa 10 päivän kulttuuria. C. ALPI markkerina Caco-2-solujen erilaistumista oli säädelty merkittävästi 4 päivän kuluttua confluent kulttuurin. D. ilmentäminen sakkaroosi-isomaltaasin (SI), toisen solun differentiaatiomarkkeri, myös nostettiin huomattavasti 4 päivän kuluttua confluent kulttuurin. E. Expression of β-kateniinin tehostui hieman ajan viljelmässä. Histogrammit A-E osoittavat suhteellinen intensiteetti CLCA1, ALPI, SI ja β-kateniinin ilmaistiin suhteena suhteessa GAPDH kontrolli. Kaikki tulokset analysoitiin kolmen erillisen kokeen.

. Caco-2-soluja transfektoitiin ohimenevästi 0, 50, 100, 150 ja 200 nM siRNA

clca1 ja blotattiin varten CLCA1. siRNA

clca1 100 nM tai yli tehokkaasti esti CLCA1 ja vaimentua ilmaus ALPI ja β-kateniinin. B. Immunofluoresoivat värjäys osoitti ekspressiota β-kateniinin konfluentteja viljelmiä Caco-2-soluja. β-kateniinin sijaitsi pääasiassa ytimen solujen alkuvaiheessa kulttuurin (2 päivää). Sen jälkeen, kun 10 päivää kulttuuri, β-kateniinin oli kulkeutua solukalvoon. Knockdovvn CLCA1 pienentää jakelun β-kateniinin kalvolla. C. Caco-2-soluja käsiteltiin joko siRNA negatiivisena kontrollina tai siRNA

clca1 ja sitten viljeltiin 72 tuntia. Solulysaatit kerättiin havaitsemiseksi ALP aktiivisuus käyttämällä alkalisella fosfataasilla Detection Kit tai ALP ilmentymisen Western blot. Tulos osoittaa, että sekä ALP aktiivisuutta ja ilmaisun vähenivät merkittävästi CLCA1 pudotus soluissa. Histogrammit A osoitti suhteellinen intensiteetti CLCA1 38 KD, 90 KD, ALPI ja β-kateniinin ilmaistiin suhteena suhteessa GAPDH kontrolli. Kaikki tulokset olivat kolmen erillisen kokeen. **

p

0,01.

CLCA1 tarvitaan spontaani erilaistuminen Caco-2 solut

määrittämiseksi toiminnallista roolia CLCA1 in Caco-2 solujen erilaistumiseen, käytimme stealth lyhyen häiritsevä RNA (siRNA

clca1) ja knock-alas ilmentymistä cLCA1 in Caco-2-solut. Sen jälkeen, kun 72 tunnin transfektion jälkeen solut testattiin ilmentymisen CLCA1, ALPI ja β-kateniinin Western blot (kuvio. 4A). Tuloksemme osoittivat, että CLCA1 ilmentyminen säädeltiin annoksesta riippuvaisella tavalla vastauksena yhä transfektion pitoisuuksia siRNA

clca1. Välttämiseksi off-tavoite vaikutuksia suurempaa siRNA, valitsimme 100 nM siRNA

clca1 optimaalisena pitoisuuden myöhemmissä kokeissa.

ALPI ja β-kateniinin ilmentyminen vähenivät huomattavasti, kun CLCA1 knockdown. Lisäksi confocal imaging oli alentunut solukalvon värjäytymisen β-kateniinin siRNA

clca1 knockdown-soluja (Fig. 4B). Edelleen vahvistaa pro-eriyttäminen rooli CLCA1 Caco-2-soluissa, olemme havainneet ALP, jossa käytetään solujen erilaistumiseen havaitseminen sarja Caco-2-soluissa. Tuloksemme osoittivat, että ALP aktiivisuus estyi merkittävästi CLCA1 pudotus soluissa (Kuva. 4C). Nämä tulokset osoittivat, että CLCA1 avainasemassa säätelyssä spontaanin erilaistumisen Caco-2-soluilla.

CLCA1 Toistaa antiproliferatiivinen Rooli Caco-2 solut

antiproliferatiivista vaikutusta NaBT on tutkittu laajasti eri pahanlaatuisten solulinjojen [25]. Voit tarkistaa, onko CLCA1 esitteli antiproliferatiivinen vaikutus Caco-2-solut, me viljellä soluja 3D Matrigel 5 päivää muodostamaan pesäkkeitä. Huomasimme, että keskimääräinen pesäkkeen koko in Caco-2 CLCA1KD solujen lisääntynyt merkittävästi verrattuna villityypin solujen (p 0,01, n = 50 kussakin). Kun soluja käsiteltiin 2 mM NaBT, pesäkkeen koko estyi merkittävästi Caco-2-soluja, mutta CLCA1KD solujen hoitoon NaBT pesäkkeen koko ei vähentynyt merkittävästi (

p

0,05, n = 50 kutakin) (Fig. 5A). Nämä tulokset osoittavat, että lisääntymistä estävä vaikutus NaBT voitaisiin välittämää CLCA1. Edelleen vahvistaa vaikutuksen CLCA1 jakautumiseen, arvioimme tätä kautta ethynyldeoxyuridine (EDU) sisällyttämistä Caco-2-solut. Huomasimme, että leviäminen Caco-2-solujen väheni 3 päivää konfluentteja viljelmiä. Kuitenkin leviämisen Caco-2-solujen edistettiin merkittävästi siRNA

clca1 käsitellyissä soluissa verrattuna on siRNA negatiivisen kontrollin soluissa (

p

0,01, n = 100 kpl) (Fig. 5B). Yhdessä 3D kulttuuriin, nämä tulokset osoittavat, että ilmentyminen CLCA1 edistää sääntelyn proliferaation Caco-2-soluilla.

. Caco-2-solut joko käsiteltiin siRNA negatiivinen kontrolli, tai CLCA1 siRNA yksin, tai lisättyä NaBT ympättiin 25% Matrigel ja pidettiin 5% CO

2 ja 37 ° C: ssa 5 päivää. Halkaisija kystat mitattiin ja analysoitiin käyttämällä Metamoph ohjelmistoa. Keskimääräinen pesäkkeiden koko Caco-2 CLCA1 pudotus soluja kasvoi merkittävästi verrattuna kontrolli soluihin. NaBT esti merkittävästi pesäkkeen koko, vaan knockdovvn CLCA1 vaarannu NaBT aiheuttama vähentäminen pesäkkeen koko. Suurennus tavoite on 10 x. 50 kystat mitattiin kussakin ryhmässä yhdessä kokeessa. B. Caco-2-soluja käsiteltiin negatiivisena kontrollina tai CLCA1 siRNA ja viljeltiin ilmoitettuina päivinä. Solujen lisääntyminen havaittiin edu sisällyttäminen määrityksessä. Edu visualisoitiin käyttämällä Alexa Fluor 594 (punainen) ja DNA DAPI (sininen). Histogrammi esittää EDU positiiviset% soluista eri ryhmiin ja osoittaa, että knockdovvn CLCA1 lisännyt merkittävästi solujen lisääntymistä.

P

arvot näkyvät histogrammissa. N = 100 kussakin ryhmässä yhdessä kokeessa. Asteikko bar = 100 pm A, 50 pm B. Tulokset esitetään keskiarvona ± sem kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Keskustelu

Leviämisen erilaistumiseen siirtyminen (PDT ) on kriittinen vaihe jatkuvaa uusimista normaalin suoliepiteeliin [1] ja paksusuolen epiteelisolut ovat alansa-tutkittu malleja tumorigeneesin koska niiden jatkuva uusiminen vaatii läheistä sääntely PDT [3], [28]. Monet geneettiset vauriot, kuten mutaatio APC ja p53, tuottaa neoplastisen transformaation paksusuolen suoliston. Lisäksi organogeneesin aikana, kantasolut suorita hiljentäminen leviämisen geenien ja aktivoitumisen erilaistumista geenien askelittaisella ajallinen tavalla. Tärkeitä oivalluksia molekyylit, jotka voivat toimia kohteina hoito olisi saatu täyttä ymmärrystä molekyylitason mekanismeja näiden prosessien. Täällä, huomasimme, että kalsium aktivoitu kloridikanava CLCA1 on keskeinen rooli ja kunnossapito PDT paksusuolen suoliston, koska menetys CLCA1 johti solujen palaaminen matalan eriytetty asema.

CLCA1 Säätelee PDT suolen epiteelisolujen

PDT yhden kantasolujen on tiukasti säännelty morfogeeneille, kasvutekijät ja hormonit [29] ja molekyylitason muutoksia yksittäisiä komponentteja signalointireittien käytetään näiden eri luokkiin molekyylin ovat tärkeitä aikana syövän kehittymiseen [30]. Näiden muutosten, säätelyä CDK-inhibiittorit (CKI) p21

CIP1 /WAF1 ja p27

Kip1 monissa terminaalisesti erottamaan soluja [31], Wnt /β-kateniinin signalointi asiakkuutta lihaksen solujen erilaistumista [32], SOX9 riippuva PKC-a tukahduttaminen suosivat lisääntymistä ja estämällä erilaistumisen [33] on raportoitu. Aikaisemmat tutkimus on osoittanut, että CLC-2, CLC-4 (kloridi kanava 2 ja 4) ja CFTR (kystisen fibroosin transmembraanisen säädin, kloridikanavan) ilmaistiin merkittävästi korkeammalla tasolla vasta eristetyssä ihmisen sarveiskalvon kudoksia kuin viljellyissä epiteelisolujen ( primääriviljelmässä tai solulinja) [34]. Kuten määrä solun kerrosta lisää, geeni-ilmentymisen tasoa ja proteiinin värjäys voimakkuus CLCA2 (kalsium-aktivoitujen kloridi kanavan jäsen 2) on lisääntynyt merkittävästi [35]. Tämä osoittaa, että CLCs (kloridikanavia) voi myötävaikuttaa sääntelyn eriyttäminen kehittämisessä epiteelikudosten. Lisäksi aktiivisuus Cl

– kanavia vaihtelee solusyklin ja kalsiumin aktivoimien kloridikanavia olisi saatiin merkittävä kasvu etu kasvainsolujen [14], [15], [35], [36], [37]. CRC, CLCA1 ja CLCA2 säädeltiin vähentävästi merkittävästi noin 80%: lla potilaista [19]. Menetys ilmentymisen sekä mCLCA1 ja mCLCA2 aikana tuumorigeneesin ehdotti, että voimakas aktivaatio joko voisi estää eloonjäämistä kasvainsolujen [16]. CLCA2 tarvitaan epiteelin erilaistumista, ja sen menetys aikana kasvaimen etenemisen edistää etäpesäkkeiden [38]. Lisääntyvän Caco-2-soluja spontaanisti aloittaa erilaistumisprosessia kun solut ovat saavuttaneet konfluenssin. Tämä solujen erilaistumista ohjelma aloitetaan, kun solu-solu yhteyttä ja siirtyminen lisääntymistä ja erilaistumista voidaan käynnistää tietyn biokemiallisen tapahtumia kuten E-kadheriinivälitteistä solu-soluadheesion [20]. Kloridikanavia ovat kalvon proteiinin ja voi olla tärkeä rooli solu-solu viestintä jälkeen solu-soluadheesion. Yhdessä tämä merkitsee sitä, että CLCAs saattaisi olla toiminnallinen rooli tuumorigeneesissä läpi ohjaamalla proliferaatiota ja erilaistumista tasapaino.

CLCA1 esiaste on noin 900 aminohappoa pitkä, jossa yksi proteolyyttisen seuraavat aminoterminaalisen signaalisekvenssin. Lopulta kaksi tuotetta on 90 kDa ja 30-40 kDa pelata toiminnallisten roolien [15], [16], [36], [37]. CLCA1 läheisesti korreloi transkriptio c-

myc,

proto-onkogeenin, jonka tuote on läheisesti osallisena solujen jakautumisen ja apoptoosin [39]. Tässä tutkimuksessa löydettiin käyttäen mikrosirulla että ilmaus CLC2, CLC3, CLCA1, CLCA4 ja CFTR olivat alassäädetty merkittävästi alussa CRC potilaiden ja alennettu ilmentyminen CLCA1 varmistettiin immunofluoresenssivärjäyksellä kudosta CRC potilaista (Fig. 1 ). Lisäksi

in vitro

osoitimme että CLCA1 oli mukana säätelevät erilaistumista ja lisääntymistä Caco-2-solut. Kun CLCA1 in Caco-2-solujen inhiboitui siRNA

clca1, sekä NaBT aiheuttama ja spontaanin erilaistumisen väheni merkittävästi (Fig. 4), kun taas lisääntymistä kasvoi merkittävästi (Fig. 5). Nämä tiedot viittaavat siihen, että aktivointi CLCA1 voi olla ratkaiseva säilyttää tasapaino erilaistumista ja lisääntymistä enterosyyttien.

Lisäksi korkea kudosspesifisyys transkription noin CLCs [40], aluksi ehdotti, että havaitseminen niiden mRNA tietyissä kudoksissa voi olla käyttökelpoinen varhaisen diagnoosin, molekyyli lavastus, ja leikkauksen jälkeinen seuranta [19]. Tärkeää on, meidän tiedot osoittavat, että sopimaton transkriptio kloridikanavia paitsi sisälly CLCA1, mutta myös CLC2, CLC3, CLCA4 ja CFTR, mikä osoittaa, että viat kloridi kuljetuksen tai kloridi virta voi olla keskeinen rooli CRC. Aktivointi kloridi nykyisten erikoistuneiden tilavuus säädelty anioni kanavaa (VRACs) on yksi tärkeimmistä mekanismeista, joiden solut palauttaa niiden tilavuus seuraavat hypo-osmoottisen stressin (RVD) [11], kun taas epiteelin kuljetusta kloridi edistää myös epiteelin potentiaali erotus (TEP) suolistossa [41]. TEP on luontainen ominaisuus kuljettamisesta epiteelin ja syntyy kaltevuudet ionien kuljetetaan suunnatusti kaikkialla epiteelisolujen kerrokset. Across ihmisen suolistossa, on TEP -25 ± 7 mV, valovirran negatiivinen. On mielenkiintoista testata uusia käsitystä, että TEP voi olla sääntelyn rooleja valvontaan PDT ja tumourgenesis suolistossa.

β-kateniinin on mukana CLCA1 rakentuvassa Cell lisääntymistä ja erilaistumista

Wnt polku on erittäin hyvin säilynyt eläimen koko maailmassa [4]. β-kateniinin on keskeinen molekyyli kanoninen Wnt joka säätelee suoliston epiteelin erilaistuminen [4], [42], [43]. Lisäksi β-kateniinin /TCF (T-solu-tekijä) reitti säätelee myös koolonin epiteelisolujen proliferaatiota [33]. Hiiren myoblastisoluja C2C12, Wnt signalointia kautta β-kateniinin voi toimia molekyyli kytkin, joka säätelee siirtymistä solujen lisääntymisen ja myogenic erilaistumista [44]. Lisäksi useimmat tapauksia CRC syntyy inaktivoivat mutaatiot adenomatoottisen polypoosin coli (

APC

) geenin, joka ohjaa β-kateniinin hajoamiseen [28], [45], [46]. Yhdessä tämä viittaa siihen, että β-kateniinin reitin avainasemassa PDT. In Caco-2 konfluentteja viljelmiä, koska ne erilaistuvat, β-kateniinin osoitti ajasta riippuvaisia ​​lisäystä solukalvon (Fig. 3) [27] ja kun CLCA1 pudotettiin, β-kateniinin oli alassäädetty dramaattisesti solukalvolla (Fig. 4). Tuloksemme viittaa siihen, että β-kateniinin osallistuu lukuisiin johtavien tapahtumien erilaistumista ja tämä ohjaa CLCA1 aktivaation Caco-2-soluilla.

CLCA1 tavoitteeksi asetettiin Butyraatilla Pro-erilaistumista ja Anti-leviämisen

Butyraatilla on yksi runsaimmin lyhytketjuisia rasvahappoja (SCFAs) ja sillä on keskeinen rooli paksusuolen epiteelin homeostaasin. Se hapetetaan asetyylisyklosporiini CoA mitokondrioissa ja se edustaa pääasiallinen polttoaine normaalin enterosyyttien [47], [48], sekä paksusuolen syövän soluja [49]. Ihmisen paksusuolen syöpäsoluja, butyraatti estää solujen kasvua [49], [50], [51] ja edistää solujen erilaistumista [52]. Lisäksi, butyraatti aiheuttama PC12-solujen erilaistuminen ja kromafiinisoluissa liittyy tiukka soluadheesiota ja induktio solunulkoisen soluadheesion proteiinit [53]. Antikarsinogeenista vaikutukset butyraatti on havaittu käyttäen sinoomasolulinjoja

in vitro

. Näissä malleissa, butyraatti johtaa proliferaation inhibitio, apoptoosi tai erilaistumisen kasvainsolujen [54], [55], [56], [57]. Lisäksi monet mekanismit butyraatti: n syöpää vaikutuksia on raportoitu, esimerkiksi se on histonideasetylaasi-inhibiittori [58], [59], [60], [61], lisää p21 (

WAF1

) geenien ilmentyminen ja indusoi G1 solukierron pysähtymisen [62]. Butyraatti myös alas-säätelee avain apoptoottisten ja angiogeneesiä säädin neuropi–1 (NRP-1) ja estää kasvaimen solujen vaeltamiseen ja eloonjäämisen paksusuolen syöpä [63]. Lisäksi, butryrate dysregulates Bcl2 proteiinit [64], [65], indusoi GPR109A ilmaisun ja reseptorin aktivaation aiheuttamaan kasvainsolun-specific apoptoosin [66], ja moduloi kanoninen Wnt signalointia [67]. Butyraatti lisää myös erilaistumista ihmisen LIM2537 paksusuolen syöpäsoluja, vähentää GSK-3β aktiivisuutta ja lisää tasoja sekä kalvoon sitoutuneen ja Apc /ak- siini /GSK-3β monimutkainen liittyvä altaat β-kateniinin [39]. Butyraatti on tunnustettu sen mahdollisuuksia toimia toissijaisista kemopreventiossa [68]. Tuloksemme osoittavat, että CLCA1 tavoitteeksi Butyraatin, tehokkaasti säädellä pro-erilaistumista ja anti-proliferaation Caco-2-solut (Fig. 2 ja 5).

Yhteenvetona paljastaa tuntematon mekanismi CLCA1 säätelee Wnt /β-kateniinin ajettu spontaani ja butyraatti aiheuttama eriyttäminen enterosyyttien. Tämä osoittaa, että CLCA1 voi ohjata PDT suoliston ja siten toimia tuumorisuppressori peräsuolen kasvaimien syntyyn. Menetys CLCA1 ilmaisun estää suoliston eriyttäminen ja voi johtaa paksusuolen syövän kehittymisen. Siten ymmärtää paremmin CLCA1 fenotyypin paksusuolen epiteelin ja mekanismeista menetys ilmaisun karsinoomien voivat tarjota keinon hoitotoimenpiteitä kautta kääntämistä etenemisen paksu- ja syövän synnyn.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

paksusuolen ja peräsuolen kudosten saatiin kirurgian potilaiden laitoksella General Surgery, The 309th sairaalan PLA, Peking, Kiina. Eettinen hyväksyntä Tutkimuksen myönsi 309th sairaalan PLA eettisen komitean. Tietoon kirjallinen suostumus saatiin kaikki osallistujat mukana tutkimuksessa.

Cell Culture

Caco-2-solut (ATCC HTB-37) viljeltiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM) (Invitrogen , UK), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 2 mM L-glutamiinia, ei-välttämättömiä aminohappoja, 50 U /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä 37 ° C: ssa 5% CO 2-inkubaattorissa. Natriumbutyraattia ostettiin Sigma-Aldrich, UK.

knockdovvn CLCA1 siRNA

knockdovvn CLCA1 suoritettiin käyttämällä BLOCK-it ™ RNAi Express hakukoneen (Invitrogen, UK). Stealth RNAi ™ siRNA duplex sense-juosteen sekvenssit 5’CAAUGCUACCCUGCCUCCAAUUACA-3 ’toimitettiin BLAST-haussa ihmisen EST kirjastoja, jotta muut ihmisen geenejä ei ole kohdistettu. Lyhyesti, soluja viljeltiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FBS: ää ilman antibiootteja yksi päivä ennen transfektiota. Caco-2-solut sitten transfektoitiin CLCA1 erityisiä siRNA lipofektamiinia 2000 laimennettu Opti-MEM I mukainen kasvatusalusta valmistajan protokollan (Invitrogen, UK), jossa on lopullinen siRNA konsentraatio 50-200 nM optimointi siRNA transfektion. Non-kohdistaminen negatiivinen kontrolli siRNA käytettiin ei-sekvenssi-konkreettisia vaikutuksia näiden molekyylien. Sillä 10 päivää yksikerrosviljelmiä, 5 x 10

4 solut maljattiin kollageeni I pre-pinnoite peitelasit tai 12-kuoppaisilla levyillä. 100 nM siRNA duplex transfektoitiin on 2

nd ja 6

päivänä kulttuurin. Kun 10 päivän viljelyn soluja Pääliliuskat kiinteät ja solut 12-kuoppalevyllä lysoitiin western blot analyysiä.

kvantitatiivinen PCR

Caco-2-soluja viljeltiin DMEM /ilman 2 mM NaBT hoitoa 24 tuntia 37 ° C: ssa 5% CO

2. Kokonais-RNA eristettiin käyttäen TRIzol® reagenssia (Invitrogen, UK). cDNA syntetisoitiin SuperScript ™ III Solujen suora cDNA Synthesis System (Invitrogen, UK). Ilmentymistaso CLCA1, CLCA2, CLCA3 ja CLCA4 mRNA määritettiin käyttämällä kvantitatiivista reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qPCR). PCR-alukkeet suunniteltiin käyttämällä Primer3 verkossa [34]. Ihmisen CLCA1, CLCA2, CLCA3 ja CLCA4 mRNA-sekvenssit ladattu National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank. Alueet, jotka vastasivat konsensussekvenssiä CLCA1, CLCA2, CLCA3 ja CLCA4 valittiin PCR-alukkeita (taulukko 1). Alukkeet valittiin 20 emäsparin pituinen, joiden GC-pitoisuus 55% ja ilman pitkiä toistoa yhden emäksen. 01:05 laimennettu cDNA pyöritti qPCR (SYBR vihreä, Roche, Sveitsi) on LightCycler®

480

System.