Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

Eturauhassyöpä (PCA) on ominaista vapautuneilla ilmentyminen useiden tuumorisuppressorin tai onkogeenisten miRNA. Tavoitteena oli tutkia tunnistaminen ja luonnehdinta miR-let-7c mahdollisena tuumorisuppressorin PCA.

Experimental Suunnittelu

Tasot ilmentymisen miR-let-7c tutkittiin ihmisen PCa solulinjoissa ja kudoksissa käyttäen qRT-PCR ja

in situ

hybridisaatio. Anna-7c yliekspressoitui tai tukahdutetaan arvioida vaikutuksia kasvuun ihmisen PCa solulinjoissa. Lentivirusvektorikonstruktit välittämä uudelleen ilmentäminen let-7c käytettiin arvioimaan vaikutuksia ihmisten PCa -ksenografteja.

Tulokset

tunnistettu miR-let-7c mahdollisena tuumorisuppressorin PCA. Expression of let-7c on vaimentua in kastraatio kestävä eturauhassyöpä (CRPC) soluja. Yli-ilmentymisen let-7c laski taas downregulation let-7c lisääntynyt solujen lisääntymistä, kyky muodostaa klooneja ja kiinnittymisestä riippumatonta kasvua Eturauhassyövän soluja

in vitro

. Suppressio let-7c ilme parantaa kykyä androgen-herkkien PCa solut kasvamaan androgeenista riistää olosuhteissa

in vitro

. Ennastus Let-7c by lentiviral välittämä kasvaimensisäisenä toimitus vähensi tuumoritaakka ksenografteissa ihmisen PCa soluja. Lisäksi let-7c ilmentyminen säädeltiin vähentävästi kliinisissä PCa yksilöitä verrattuna niiden Hyväksytty hyvänlaatuinen kudoksiin, kun taas ilmaus Lin28, Master säätelijä let-7 miRNA käsittely määrä lisääntyy kliinisissä PCa yksilöitä.

Johtopäätökset

Nämä tulokset osoittavat, että microRNA let-7c on vaimentua PCA ja toimii tuumorisuppressorin, ja on potentiaalinen terapeuttinen kohde PCa.

Citation: Nadiminty N, Tummala R, Lou W, Zhu Y, Shi XB, Zou JX, et al. (2012) MicroRNA let-7C vaimentua in Eturauhassyöpä ja vaimentaa Eturauhassyöpä Growth. PLoS ONE 7 (3): e32832. doi: 10,1371 /journal.pone.0032832

Toimittaja: Gokul M. Das, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 2. helmikuuta 2012 Julkaistu: 30 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Nadiminty et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain NIH CA140468, CA118887, CA109441, DOD PC080538 (AG) ja DOD PC100502, American Cancer Society-IRG (NN). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisimmin esiintyviä maligniteetti ja toiseksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolleisuus miehillä Yhdysvalloissa. Suurin osa potilaista on pitkälle edennyt PCa vastata aluksi androgeenideprivaatio hoito, mutta uusiutuminen kasvun takia kastraation resistenttien eturauhassyövän (CRPC) soluja. Merkittäviä ponnistuksia on keskitytty ymmärtämään mekanismeja kehittämiseen ja etenemiseen CRPC. MikroRNA (miRNA) ovat endogeenisiä pienet ei-koodaavat RNA: t, jotka voivat häiritä proteiinin ilmentyminen joko indusoimalla pilkkomalla niiden erityinen tavoite mRNA: iden tai estämällä niiden käännös. Kypsät miRNA ovat evoluutiossa konservoituneita ~22nt yksijuosteiset RNA: t johtuvat monivaiheinen käsittely suurempien prekursorimolekyylit kautta Drosha ja Dicer. Lopulta kypsä miRNA sisällytetään RISC kompleksin yhdessä niiden kohde t, jotka tunnustetaan sekvenssikomplementaarisuutta 3′-UTR [1]. Jokainen miRNA voi kohdistaa useita erilaisia ​​mRNA: iden ja kukin mRNA voidaan kohdistaa useita miRNA, tuottaa monimutkaisen verkoston geenien ilmentymisen sääntelyä. MiRNA on osoitettu säätelevän nopeasti kasvaviin monimutkaisia ​​biologisia prosesseja, mukaan lukien erilaistuminen, solusyklin, apoptoosin ja aineenvaihduntaa [2]. Valtavan määrän uusia todisteita viittaa rooliaan tuumorisuppressoreilla tai onkogeenien joka esittelee koko kirjon uusia diagnostisia ja terapeuttisia mahdollisuuksia [1], [3].

Anna-7 koodaa evoluutiossa konservoitunut perheen 13 homologisia miRNA sijaitsee genomisessa paikoissa usein poistetaan ihmisen syövissä [4]. Expression of let-7 keuhkosyövän solulinjoissa vähennettävä soluproliferaatiota [5], ja se esti kasvaimen kehittymisen rintasyövän solujen vähentää samalla etäpesäkkeitä [6]. Yliekspressio let-7 väheni myös keuhkosyöpä solun resistentiksi sädehoitoa [7]. Vähentynyt ilmentyminen let-7 ihmisen keuhkosyövästä on liittynyt lyhennetty leikkauksen jälkeinen eloonjääminen, mikä viittaa siihen, että let-7 voi olla tärkeä prognostinen markkeri keuhkosyövän [8]. Samoin 5-vuoden ilman taudin etenemistä korko todettiin olevan suurempi munasarjasyöpää sairastavilla potilailla, joilla on alhaisempi HMGA2 /let-7 suhdeluvut verrattuna niihin, joilla on korkeampi HMGA2 /let-7 suhdeluvut [9]. On selvä yhteys menetys let-7 ilmentymisen ja kehittäminen huonosti eriytetty ja aggressiivisia syöpiä [10]. Anna-7 ilmentyminen havaittiin vaimentua lokalisoitu PCa kudoksissa suhteessa hyvänlaatuinen kehävyöhyke kudoksen [11], [12]. Let-7 jäsentä on osoitettu säätelevän tasoilla onkogeenien kuten HMGA2 [5], RAS [13] ja Myc [14] sekä geenien solusyklin ja solunjakautumisen sääntelyä. Hoitostrategioita kehitetään kohdistamista anna-7, käyttäen joko lenti-tai adeno-virus-koodattu yli-ilmentymisen avulla, 7 tai lyhytaikaista transfektiota kaksijuosteisen esiasteita let-7 [15], [16]. Näin ollen anna-7 esittää lupaavat kuin molekulaarinen merkkiaine tietyissä syövissä ja potentiaaliseksi terapeuttiseksi syövän hoidossa.

Lin28, erittäin konservoitunut RNA-sitovan proteiinin ja Master säädin päästää 7 miRNA käsittely, on yli-ilmentyy ensisijaisesti ihmisen kasvaimissa [17], [18] ja oletetaan olevan yksi alkion kantasoluilla tekijöitä, jotka edistävät syövän synnyn ja leviämisen syöpäsolujen, jonka tukahduttamisen let-7 perheen tuumorisuppressoreilla [19]. Lin28 sitoutuu terminaalin silmukat esiasteita let-7 perheen miRNA ja estää sen jalostamista kypsä miRNA [20], [21]. Lin28 myös derepresses c-Myc by repressoivan let-7 ja C-Myc kopiointia aktivoi Lin28 [22], [23]. Tämä Lin28 /let-7 /c-Myc silmukka voi olla tärkeä rooli vapailla miRNA ilmaus allekirjoitus havaittu monissa syövissä [24].

Tässä tutkimuksessa osoitamme, että let-7c, yksi jäsenet let-7 perhe, tukahduttaa PCa kasvu

in vitro

ja

in vivo

. Yli-ilmentymisen let-7c johti eston kiinnittymisestä riippuvaisten sekä kiinnittymisestä riippumatonta kasvua Eturauhassyövän soluja. Reexpression let-7c ksenografteissa ihmisen PCa soluihin käyttämällä lentivirally koodattua let-7c esti kasvaimen kasvua merkittävästi. Lisäksi anna-7c ilmentyminen säädeltiin vähentävästi kliinisissä PCa yksilöitä. Tuloksemme tarkoita, että eturauhasen kasvaimen kasvua säätelee let-7c ja käyttökuntoon let-7 voi olla hyödyllisiä vaikutuksia PCA vähentämällä selviytymistä ja lisääntymistä syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjoja ja reagenssit

LNCaP, C4-2B, PC-346C ja DU145-solut saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). LNCaP, C4-2B ja PC346C solut ovat androgeenireseptorin (AR) positiivinen ja vastata androgeenireseptorin täydentämistä, kun taas DU145 solut ovat AR negatiivisia ja ovat androgen-tunteettomia. LNCaP-S17 ja LNCaP-IL6 + solulinjat tuotettiin laboratoriossamme vakaa transfektoimalla täyspitkän IL-6 cDNA LNCaP ja kroonisessa käsittelyssä LNCaP-solujen 5 ng /ml rekombinanttia IL-6 vastaavasti. Molemmat solulinjat osoittavat autokriinisen IL-6-signalointia. Vasta-aineet Actin ja Tubulin ostettiin Santa Cruz Biotekniikka (Santa Cruz, CA). Lin28 vasta-aineet on saatu Abcam (San Francisco, CA). SYBR Green iQ Supermixiä oli Bio-Rad. Lentivector-pohjainen let-7c-konstrukti saatiin System biotieteiden ja Lin28 ORF ja shRNA konstruktit saatiin Open Biosystems.

Western blot -analyysi

Solut hajotettiin korkean suolan puskurissa, joka sisälsi 50 mM Hepesiä pH 7,9, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM PMSF, 1 mM Na-Vanadate, 1 mM NaF ja proteaasiestäjäseostabletit (Roche), kuten aiemmin on kuvattu [25]. Proteiinin kokonaismäärän arvioitiin käyttäen Coomassie Protein Assay Reagent (Pierce, Rockford, IL). Yhtä suuret määrät proteiinia, ladattiin 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa PBST (1x PBS + 0,1% Tween-20) ja koetettiin primaaristen vasta-aineiden 1% BSA: ta. Signaali havaittiin ECL (GE Healthcare) kanssa inkuboinnin jälkeen sopivan HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita.

mittaus PSA

PSA-tasot mitattiin viljelmän supernatanteista ELISA (United Biotech Inc , Mountain View, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Real-Time Kvantitatiivinen RT-PCR

LNCaP-solut transfektoitiin ilmoitetuilla plasmidit tai oligonukleotidien ja koko RNA: ta uutettiin käyttäen Trizol reagenssia ( Invitrogen). cDNA: t valmistettiin digestion jälkeen RNaasittomalla RQ1 DNaasia (Promega). CDNA: t tehtiin reaaliaikaisen käänteistranskriptio-PCR (RT-PCR) käyttämällä SYBR Green iQ Supermix (Bio-Rad) mukaisesti valmistajan ohjeiden ja kuten aiemmin on kuvattu [26], [27]. Reaktiot suoritettiin 1 ui RT-PCR cDNA: n, 0,5 ui kutakin eteen- ja reverse-alukkeita (10 pmol /l), 10,5 ui kahteen kertaan tislattua vettä, ja 12,5 ui iQ SYBR Green SuperMix. Kukin reaktio normalisoitui coamplification aktiini. Triplikaatteina näytteitä ajettiin oletusasetukset Bio-Rad CFX-96 reaaliaikaista cycler. Alukkeita käytetään kvantifiointiin Lin28 olivat: Eteenpäin 5’GCCCCTTGGATATTCCAGTC-3 ’ja Reverse 5′-AATGTGAATTCCACTGGTTCTCCT-3’. miRNA qPCR suoritettiin käyttämällä miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR kit ja LNA-konjugoidun miRNA alukkeita (Exiqon) mukaan valmistajan ohjeiden.

Northern blotting

20 ug kutakin koko RNA: iden LNCaP, PC-3, DU145, LNCaP-S17 ja LNCaP-IL6 + soluja ajettiin 15% Urea-PAGE-geeleissä ja siirrettiin nylon kalvoja. Sen jälkeen kun UV-silloitus, membraanit hybridisoidaan koettimeen tunnustetaan kypsän sekvenssin anna-7c. U6 snRNA käytettiin latauskontrollina.

miRNA in situ

In situ

-hybridisaatio (ISH) suoritettiin määrittämiseksi malleja ilmentymisen let-7c ihmisen kliininen PCa kudos microarray sisältävän 160 ytimet kukin verraton hyvänlaatuinen ja syöpä prostates. ISH suoritettiin käyttäen lukittu nukleiinihappo (LNA) -konjugoitu let-7c-spesifinen koetin Exiqon mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

klonogeeninen määritykset

Anchorage riippuvainen klonogeenisten kyky määritykset suoritettiin, kuten on kuvattu aiemmin [28]. Lyhyesti, LNCaP-solut transfektoitiin joko tyhjällä vektorilla tai anna-7c ympättiin alhainen tiheys (400 solua /malja) 10 cm: n viljelylevyillä. Levyjä inkuboitiin 37 ° C

oC väliaineessa, joka sisälsi joko 10% FBS tai 10% hiilellä erotettua FBS: ää (CS-FBS), ja niitä seisotettiin 14 päivää. Lopussa kokeen, solut kiinnitettiin metanolilla, värjättiin kristallivioletilla ja pesäkkeiden lukumäärät laskettiin.

Soft-agar Colony Formation määritykset

Anchorage riippumaton pesäkkeiden muodostumisen määritykset olivat suoritettiin käyttäen C4-2B ja LNCaP-S17, jotka on transfektoitu ilmaistuilla plasmideilla. Transfektion jälkeen solut maljattiin 0,35% agaroosia päällä 1,2% agar-kerros. Solut syötettiin kahdesti viikossa täydellinen RPMI1640 ja inkuboitiin 37

0C 2 viikkoa. Lopussa kokeen, pesäkkeet värjättiin 0,005% Crystal Violet ja laskettiin.

Cell Growth määritykset

LNCaP, C4-2B, DU145, LNCaP-S17 ja LN-IL6 + soluja transfektoitu ilmentävien plasmidien let-7c ja elinkelpoisten solujen määrä määritettiin 0, 24 ja 48 h käyttäen Coulter solulaskuria.

A) kokonaismäärä RNA: iden LNCaP, PC-3, DU145, LNCaP-S17 ja LN -IL6 + solut analysoitiin qRT-PCR: llä. Tulokset esitetään suhteellinen kertainen muutos verrattuna ilmentymistasoihin LNCaP. Tietopisteet edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta näytteestä kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta. B) 20 ug kutakin edellä RNA: t analysoitiin myös Pohjois-blottauksella. U6 snRNA käytettiin lastaus ohjaus. C) qRT-PCR, joka esittää vähenemisen let-7c ilmentymisen LNCaP soluissa, jotka ilmentävät Lin28 verrattuna LNCaP-soluja, jotka on transfektoitu tyhjällä vektorilla (Con). Inset Western blot osoittaa ilmaus Lin28. D) qRT-PCR osoittaa kasvu let-7c ilmentyminen C4-2B transfektoiduissa soluissa shRNA vastaan ​​Lin28 verrattuna C4-2B soluihin transfektoitu ohjaus GFP shRNA. Inset Western blot osoittaa downregulation Lin28. Tietopisteet edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta näytteestä kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta. Virhe palkit merkitsevät ± SD (*

p

0,05). E) Western blot, joka osoittaa ekspression tasoja Lin28 PCA-soluissa. Aktiini käytetään latauskontrollina.

Apoptosis määritykset käyttämällä Cell Death Detection ELISA

DNA pirstoutuminen LNCaP, DU145, LNCaP-S17 ja LN-IL6 + transfektoitu plasmideilla kuten kuvissa oli arvioinut Solukuolemaan havaitseminen ELISA kit (Roche, Indianapolis, iN) mukaan valmistajan ohjeiden.

Generation Stabiilin solulinjojen

Stable solulinjoja LNCaP ja C4-2B ilmentävät let-7c tuotettiin transfektoimalla plasmideja, jotka sisältävät cDNA: t, ja kloonien valinta soveltamisen jälkeen selektiivisen paineen sopivat antibiootit.

A) Suhteellinen ekspressiotasot let-7c mitattiin qRT-PCR: llä kokonais-RNA: t uutetaan 10 pariksi hyvänlaatuinen ja kasvain ihmisen eturauhasessa. B) Anna-7c mitattiin käyttämällä

in situ

-hybridisaatiota TMA sisältävän 160 ytimet kukin verraton hyvänlaatuinen ja syöpä eturauhasen koepaloja. Kuvat ovat näkyvät hyvänlaatuinen ja syöpä sydämiä. Expression of let-7c oli suurempi hyvänlaatuinen prostates verrattuna syöpä prostates. C) Suhteellinen ekspressiotasojen Lin28 on 10 pariksi hyvänlaatuinen ja kasvain ihmisen eturauhasessa. Ekspressiotasot Lin28 korreloivat käänteisesti kuin let-7c. Virhe palkit merkitsevät ± SD (*

p

0,05).

LNCaP (A), C4-2B (B), DU145 (C), LN-IL6 + (D ) ja LNCaP-S17 (E) transfektoitiin let-7c tai tyhjän vektorin (Con) ja solumäärät määritettiin 24 ja 48 tuntia. Kasvu Eturauhassyövän soluja tukahdutettiin let-7c. Sisäkkeet osoittavat ekspressiotasoja let-7c plasmidi. F) Solukuolemaan analysoitiin LNCaP, DU145, LNCaP-S17 ja LN-IL6 + transfektoitujen solujen let-7c tai tyhjän vektorin (Con). Let-7c indusoiman apoptoottisen solukuoleman eturauhasen syöpäsoluja. G) LNCaP anti-sense oligoja vastaan ​​let-7c tai salattu oligot (Con) kasvatettiin FBS ja CS-FBS ja solujen määrä määritettiin. Inset esittää downregulation ilmentymisen let-7c anti-sense oligoja. LNCaP-solujen vaimentua ilmaus let-7c näytteillä nopeamman kasvun CS-FBS kontrolleihin verrattuna. Tietopisteet edustavat keskiarvoa ± SD kolmesta näytteestä kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta. Virhe palkit merkitsevät ± SD (*

p

0,05).

Eläimet

6-8 viikkoa vanhoja nude-hiiriä ylläpidettiin Animal Facility UC Davis Medical Center. Kaikki koetoimenpiteet käytetään eläimiä hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitean UC Davis. 1-2 x 10

6 solua /kylki injektoitiin s.c. osaksi molempiin kylkiin ja kasvainten annettiin kasvaa. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet 0,5 cm

3, 1×10

7 IFU (tarttuva yksikköä) lentivirusten sisälsi joko tyhjän vektorin GFP tai anna-7c esiaste injektoitiin kasvaimen. Lopussa kokeiden, hiiret tapettiin ja kasvaimet leikattiin irti. Seerumit kerättiin mittausta varten PSA.

Ihmisen PCa näytteet

Parilliset hyvänlaatuinen ja kasvaimen eturauhaskudoksiin valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [29]. Kirurgisista näytteistä käytettiin tässä tutkimuksessa olivat eturauhasen yksilöitä (yksi robotti leikkausta) kerätään Johns Hopkins University vuodesta 2002 vuoteen 2007. Näytteet valittiin jäädytetty eturauhassyövän pankin mikäli käytössä jäädytettyjen harkkojen rikastettiin histologisesti normaalin ja kasvaimen alueet olivat käytettävissä. Jäädytetyt lohkot olivat käsin lohkottu edelleen rikastuttaa histologiaa kiinnostava. Kryoleikkeet (7 um) valmistettiin kustakin lohkosta ennen RNA. Kasvain pitoisuus Tuumorinäytteet oli suurempi kuin 80%, kun taas normaalit näytteet oli vähintään 60% epiteelin sisällön ja mitään todisteita kasvaimen läsnä. Ensimmäinen ja viimeinen jakso kutakin lohkon oli H 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Anna-7c on ilmoitettuna PCa Solut

Aiemmat tutkimukset käyttäen miRNA mikrosiruja osoitti let -7c oli yleisimmin moduloitu miRNA PCA soluissa (julkaisematon data). Määrittää suhteelliset ekspressiotasot let-7c PCa-soluissa, olemme eristettiin kokonais-RNA: t alkaen LNCaP (androgeenistä riippuva, ​​AR-positiivinen), PC-3, DU145 (kastraatio kestävä, AR-negatiiviset solut) sekä LNCaP -S17 soluja, jotka ilmentävät IL-6 [30] ja LN-IL6 + solujen kroonisesti käsitelty IL-6 [31]. cDNA: t analysoitiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä käyttäen alukkeita monistamiseen kypsän muodon let-7c (Exiqon) erikseen. Tuloksemme osoittivat, että let-7c ilmennetään korkeilla tasoilla LNCaP-soluissa verrattuna hormonin tulenkestävä PC-3 ja DU145-soluissa (kuvio. 1A). Aiemmat raportit osoittivat, että IL-6 ja anna-7 näytteille vastavuoroinen sääntelyn ilmaisun. LNCaP-IL6 + ja LNCaP-S17-soluissa (autokriinisella IL-6 signalointi) osoitti vähenemistä let-7c, jotka olivat yhtäpitäviä raportissa, että IL-6 vähentää let-7 ilmentymisen PCA soluissa ja että let-7 säätelee IL-6 lauseke [ ,,,0],18]. Nämä tulokset vahvistettiin myös Pohjois-blottauksella käyttämällä koetinta vastaan ​​kypsän let-7c sekvenssi (Fig. 1 B), mikä viittaa siihen, että let-7c tasot vähenevät aggressiivisempia ja kastraatio kestävä PCa soluissa.

Viimeaikaiset raportit osoittivat, että ilmentyminen let-7 perheen miRNA säätelee Lin28, mestari säätelijä miRNA käsittely [18], [20]. Yhdenmukainen sen havainnon kanssa, huomasimme, että yli-ilmentyminen Lin28 johti vähenemiseen let-7c tasoja LNCaP (Fig. 1 C), kun taas downregulation Lin28 käyttäen Lin28 shRNA johti kasvuun let-7c tasoa (Kuva. 1 D) in C4-2B soluja, jotka ilmentävät endogeenistä Lin28 (Fig. 1 E). Downregulation tai yliekspressio Lin28 vahvistettiin Western-blottauksella (Inset Fig. 1 C 0,05).

Lisäksi testasimme downregulation let-7c parantaisi kykyä androgen-herkkien PCa solujen kasvavat androgeenin riistää olosuhteissa. Transfektoimme anti-sense oligoja vastaan ​​let-7c tai ohjaus salattu oligoja osaksi LNCaP lisätty joko FBS tai hiilellä erotettua FBS (CS-FBS) ja seurataan solujen kasvua. Tulokset osoittivat, että downregulation let-7c anti-sense edistää androgeeniriippuvaisissa LNCaP solujen kasvua olosuhteissa androgeenideprivaatioterapian (Fig. 3G). Downregulation let-7c anti-sense oligoja varmistettiin käyttämällä qRT-PCR (Kuva. 3G, upotus). Nämä havainnot ehdottivat, että kastraation kestävä kasvu PCa voidaan luonnehtia downregulation anna-7c ilmentymisen.

C4-2B (A), PC346C (B) ja DU145 (C) solua injektoitiin molempiin kylkiin nude-hiiriin ja kasvaimet sai yhden kasvaimeen injektion lentivirusten joka joko GFP (kontrolli) tai anna-7c. Kasvaimen kasvua seurattiin kahdesti viikossa 3 viikkoa. Tietopisteet edustavat keskiarvoa ± SD kasvaimen tilavuus (mm

3) Kaikkien hiirten osoitetuissa aikapisteissä. D) eritys PSA C4-2B ja PC346C ksenografteissa mitattiin hiiren seerumeissa ELISA. Ennastus let-7c kasvaimissa erityksen väheneminen PSA jonka ksenografteista. Lopussa kokeiden, kasvaimen kudokset leikattiin irti, yhteensä-RNA: t valmistettiin ja alistettiin qRT-PCR arvioida mRNA tasoja let-7c (E) ja Lin28 (F). Virhe palkit merkitsevät ± SD (*

p

0,05).

analysoitiin myös klonogeeniset kyky Eturauhassyövän soluja, jotka ilmentävät let-7c sekä kiinnittymisestä riippuvaisen ja kiinnittymisestä riippumaton olosuhteissa . LNCaP-S17 ja C4-2B-solut transfektoitiin let-7c tai tyhjän vektorin ja pesäkkeiden muodostumisen määritykset suoritettiin. Molemmat klonogeeniset (Fig. 4A) ja pehmeä agar siirtomaa (Fig. 4B) muodostuminen kyvyt LNCaP-S17 ja C4-2B solut tukahdutti yli-ilmentymisen let-7c. Pesäkkeiden lukumäärä, joka on muodostettu kasvualustoja, jonka LNCaP-S17-soluissa vähennettiin 142 ± 15-46 ± 10 ja pesäkkeiden lukumäärä muodostuu C4-2B solujen alennettiin 122 ± 10-34 ± 7 (Fig. 4A). Samoin muodostuneiden pesäkkeiden määrästä pehmeässä agarissa, jonka LNCaP-S17-soluissa vähennettiin 82 ± 4-15 ± 2 ja pesäkkeiden lukumäärä muodostuu C4-2B solujen alennettiin 61 ± 5-21 ± 5 (Fig. 4B ) yli-ilmentyminen let-7c. Lisäksi koko pesäkkeiden muodostettu valvonta-transfektoiduissa soluissa oli suurempi verrattuna pesäkkeiden muodostettu let-7c-transfektoiduissa soluissa (kuvio. 4C F). Nämä havainnot viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen let-7c estää eturauhassyövän kasvua, ja että käyttökuntoon let-7c tasot voivat esittää houkutteleva terapeuttinen strategia ihmisen PCa.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme havaitsi, että let-7c ilmentyminen säädeltiin vähentävästi in kastraatio kestävä PCa solujen ja kliinisissä näytteissä. Transfektio lentiviruksen-koodattuja let-7c esti kasvun ja kyky muodostaa klooneja PCa solujen samalla parantaa apoptoottisen solukuoleman. Kääntäen, downregulation let-7c anti-sense-oligonukleotideja koitui selviytymisen etu PCa solujen androgeenin-täynnä sekä androgeenin köyhdytettyä ympäristöissä. Kasvaimensisäistä injektio lentivirally koodatun let-7c esti PCa ksenografti kasvaimen kasvua, mikä osoittaa, että let-7c toimii tuumorisuppressori, joka estää eturauhassyövän kasvua. Nämä tulokset viittaavat siihen, että miRNA let-7c on tärkeä rooli PCA solujen lisääntymisen ja voidaan hyödyntää terapeuttisiin sovelluksiin.

mekanismit tukahduttaminen eturauhasen kasvaimen kasvua let-7c voivat olla suoria tai välillisiä ekspressiosäätelyä tasot onkogeenien kuten Myc ja Lin28. Tuoreessa raportissa, osoitimme, että let-7c kohdistuu ilmaus AR kautta kohdistaminen ilmentymisen Myc [32]. AR on keskeinen eloonjäämistekijä eturauhaskasvainsoluissa ja vähentää sen ilmentymisen on osoitettu tukahduttaa eturauhasen kasvaimen kasvua [33]. Vahvistukseksi Näiden havaintojen ilmentymisen PSA, yksi klassinen kohdegeenien AR, havaittiin tukahduttaa let-7c ksenografteissa ja C4-2B ja PC346C soluja tässä tutkimuksessa.

On hyvin dokumentoitu, että Lin28 on merkittävä rooli sääntelyssä let-7c ilmaisun [18], [21]. Tämä on sopusoinnussa meidän tutkimukset osoittavat, että Lin28 vaimentaa let-7c ilmentymistä PCA soluissa. Yliekspressio Lin28 esti let-7c ilmentyminen LNCaP, kun taas knockdovvn Lin28 ilmaisun kasvoi let-7c C4-2B soluissa. Lisäksi olemme osoittaneet, että yli-ilmentyminen antaa 7c vähensivät Lin28 ekspression kasvaimissa PCa ksenograftimalleissa (Fig. 5F), joka osoittaa, että negatiivinen takaisinkytkentäsilmukka välillä Lin28 ja anna-7c.

useat raportit ovat luoneet tärkeän roolin let-7, joka osoittaa, että jäsenet anna-7 perheen vaimentua vuonna keuhkosyövässä ja että downregulation korreloi huonon säilymisen [8]. Tuumorisuppressorina rooli on katsottu johtuvan let-7 perheen miRNA ja näyttää kiistaton paitsi harvoissa tapauksissa, kuten päästää 7a, joka on raportoitu kohdistaa kaspaasi-3 ihmisen syövissä [34], siten välttäen alttius syöpäsolujen kemoterapeuttisten solukuolema. Vuonna pahanlaatuinen mesoteliooma, anna-7b * havaittiin olevan erittäin ilmaistaan ​​[35] ja säätelyä anna-7b ja anna-7i liittyi korkealuokkaisesta transformaatio lymfooma [36]. Nämä ristiriitaiset tiedot vapautuminen anna-7 erilaisissa ihmisen syövissä osoittavat, että yksittäiset let-7 perheenjäsenet voivat olla erillisiä ja vaihtelevia toimintoja eri soluissa ja ei yksinkertaisesti näytteille tarpeeton toiminnot.

Eräässä aikaisemmassa tutkimuksessa Dong et al. [37] kertoi, että let-7a estää eturauhassyövän kasvua kohdentamalla E2F2 ja CCND2. Tutkimuksemme osoittavat, että let-7c estää eturauhassyövän kasvua useita reittejä, kuten sääntely IL-6, Myc, Lin28 ja AR [32]. Lisäksi suora käyttökuntoon let-7c ruiskuttamalla lentivirally koodatun let-7c osaksi perustettu ksenograftikasvaimissa on merkittävä askel kohti tulevien terapeuttisten strategioiden let-7c. Vaikka jäsenet let-7 perhe voi esiintyä joitakin tarpeettomia toimintoja, yksittäisten komponenttien saatetaan differentiaaligeometriaan ja kudosspesifisiä sääntelyä eri solutyyppejä.