Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

polymorfismi koodaavien geenien lääkettä metaboloivia entsyymejä tiedetään olevan tärkeä rooli lisääntynyt alttius paksusuolen syövän. UGT1A geenilokuksessa on ehdotettu määritellä kudosspesifisiä glukuronidaatiota aktiivisuutta. Vähentynyt kapasiteetti Glukuronidaation korreloi kehittämiseen peräsuolen syöpä. Siksi pyrimme tutkimaan polymorfismi UGTlA geenin paksu- ja peräsuolisyövän.

Methods

syöpä ja terveiden kudosten saatiin selectedpatients. Verinäytteet kerättiin ja UGTlA mRNA transkriptiota analysoitiin. Genominen DNA valmistettiin ja UGTlA8 eksoni-1-sekvenssit monistettiin, visualisoitiin ja puhdistettiin. Uutettu DNA subkloonattiin ja sekvensoitiin. Kaksisuuntainen Fisherin testiä, Odds suhteet (syrjäisimmillä alueilla), luottamusväli (CI) ja logistiikka regressioanalyysi käytettiin tilastolliseen analyysiin.

Tulokset

UGTlA mRNA ilmentyminen väheni syöpäkudokset verrattuna terveisiin kudoksiin samasta potilaasta. UGTlA mRNA ilmaisu tervettä kudosta tutkimuksessa potilailla oli pienempi kuin kontrolli. MRNA ilmentyminen syöpäkudoksen oli säädellä vähentävästi UGTlAl, 1A3, 1A4, LA6, 1A9 ja säädellään ylöspäin UGTlA8 ja UGTlAl0 UGT1A5 ja UGT1A7 ei ilmaistu koolonkudoksessa joko ryhmän. Alleeli taajuus WT UGTlA8 * 1 oli suurempi (p = 0,000), taajuus UGTlA8 * 3 alennettiin vuonna kontrolliryhmässä (p = 0,000). Ilmaisu Homotsygoottisen UGTlA8 * 1 oli suurempi kontrolliryhmässä (p = 0,000). Tiheämmin Molempien heterotsygoottisten UGTlA8 * 1 /* 3 ja UGTlA8 * 2 /* 3 havaittiin tutkimuksessa (p = 0,000; p = 0,000). Esiintyminen paksusuolen syövän pääasiassa liittyy todettu polymorfisten UGTlA8 * 3-alleelit (p = 0,000).

Johtopäätös

asetus ihmisen UGT1A geenien on kudosspesifinen. Yksilöllistä vaihtelua Monimuotoinen ilmauksia UGTlA geenilokuksesta todettiin kaikentyyppisissä koolonkudoksessa testattu, kun taas maksan kudos ilme oli yhtenäinen. Yleisyys UGTlA8 polymorfismin olemassa peräsuolen syöpäpotilailla. UGTlA8 * 1 alleeli toimii suojaavana tekijänä ja UGTlA8 * 3 alleeli on riskitekijä.

Citation: Wang M, Sun D-F, Wang S, Qing Y, Chen S, Wu D, et al. (2013) polymorfinen ilmentäminen UDP-glukuronosyylitransferaasin UGTlA Gene Human peräsuolen syövän. PLoS ONE 8 (2): e57045. doi: 10,1371 /journal.pone.0057045

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japani

vastaanotettu: 16 joulukuu 2012; Hyväksytty: 16 tammikuu 2013; Julkaistu: 27 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia tieteen ja teknologian keskeinen hanke Shandongin maakunnassa (No.2006GG3202050), Science bonusrahat nuorten tutkijoiden Shandongin maakunnassa (NO.2007BS03017, ei URL-linkki), ja Natural Science Foundation Shandongin maakunnassa (No.Y2008C115, no URL-linkki). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on yksi yleisimmistä syöpien maailmanlaajuisesti. Perustuu tietoihin International Agency for Research Cancer (IARC), peräsuolen syöpä vastaa 9,4% kaikista

de novo

syöpien diagnoosin 2007.Compare lukuihin vuonna 2000, äskettäin diagnosoitu kolorektaalisyöpä vuonna 2007 oli kasvanut 27%, ja kuolleisuus oli noussut 28%; jonka osuus vuotuinen kasvu 3,9% ja 4,0%, vastaavasti [1].

Vaikka etiologiaa peräsuolen syöpä ei ole täysin ymmärretty, polymorfismi koodaavien geenien lääkettä metaboloivia entsyymejä tiedetään olevan tärkeä rooli lisääntyneeseen alttiuteen paksusuolisyövän [2]. Lukemattomia entsyymit osallistuvat faasin I ja faasin II metaboliareitteihin, jäsenet mukaan lukien sytokromi P450 (P450) ja UDP-(UGT) superperheistä. UGT katalysoivat glukuronidaation reaktio, joka on tärkeä xenobiotic aineenvaihduntaa. Glukuronidaatio mahdollistaa käytön tiettyjen ravintoaineiden sekä vieroitus ja erittymistä potentiaalisesti haitallisten yhdisteiden ja aineenvaihduntatuotteiden, kuten steroidit, bilirubiinit, ulkoiset huumeita, myrkyllisiä kemikaaleja ja perimää vaurioittavia aineita [3]. Yli 50 eri UGT oli havaittu monissa elimissä ja kudoksissa sekä eläinten että ihmisten, kuten maksan, suolen limakalvolla, keuhkot, aivot, istukka ja kohtu [4] – [8]. Ihmisen UGT on jaettu UGT1, 2, 3 ja 8 multigeeniryhmiä perustuu evoluution eroavuus [4]. Tähän mennessä 21 eri UGT [9] on havaittu ihmisillä. Ihmisen UGT1A geenilokuksesta sijaitsee kromosomissa II. Se koostuu kolmestatoista eri ensimmäisen eksonien 5′-päähän liitetty, vaihtoehtoisen silmukoinnin, neljälle eri yhteistä eksonit 3′-päässä. UGT1A geenilokuksen koodaa vähintään yhdeksän funktionaalisia proteiineja (UGT1A1-, UGT1A3-UGT1A10) ja neljä pseudogeenejä (UGT1A2, UGT1A11-UGT1A13) [10].

Kudosspesifinen ilmentyminen UGT1A geenilokuksen on ollut hyvin tunnettu. Geeni oli ehdotettu määritellä kudosspesifisiä glukuronidaatio vaikutus ihmisen ruoansulatuskanavan. Maksan UGT1A proteiineja (UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6 ja UGT1A9) on tutkittu ja havaittu yksityiskohtaisesti. Tutkimuksissa ruoansulatuskanava ovat johtaneet tunnistamiseen kolmen ekstrahepaattisen UGT1A selostukset: UGT1A7, UGT1A8 ja UGT1A10 [11], [12]. Käyttämällä RT-PCR (RT-PCR), alempi-geenin ilmentyminen UGT1A8 todettiin ruokatorven [13]. Laajempi tutkimus ei osoittanut mitään havaittavaa UGT1A8 RNA ohutsuolessa, mutta runsaita tasoja UGT1A8 mRNA paksusuolessa [12]. Tällä hetkellä tiedot ilmaus UGT1A8 maksassa tai muuta ihmisen kudos on ollut niukkaa. Valikoiva ilmentyminen UGT1A8 paksusuolen voisi osoittaa, että UGT1A8 on tärkeä rooli solujen homeostaasin ja disposition endogeenisen ja eksogeenisen yhdisteitä. On raportoitu, että ihmisen UGT1A8 proteiini katalysoivat glukuronidaatiota kumariinit, fenoliset yhdisteet, antrakinonit, flavonoideja ja useita steroideja, on transfektoitu ihmisen alkion munuaisen 293 (HEK293-solut) [14]. Harkita sitä, että paksusuolen sisältää huomattavan määrän UGT1A proteiinien [12], alennettua kapasiteetti glucuronidating tiettyjen aineiden voisi olla haittaa homeostaattiseen tasapaino paksusuolessa.

Viime vuosina, genotyypityksen ja sekvensoinnin tiedot oli johti havaintoon, yli 100 varianttien sisällä promoottorialueet ja koodaavan sekvenssin UGT1A geenejä. Erityisesti monet variantit osoittavat alleelifrekvenssien jopa 40-50% koko väestössä, joka on todettu olevan kytkentäepätasapainossa. Mutta muutamat vaihtoehdot ovat riittävän taajuuden väestössä luokiteltava polymorfismien [15], [16]. Polymorfismi parhaiten edustaa UGT1A1- geeni, jonka tiedetään sisältävän 113 muunnos alleeli genotyyppien UGT1A1- (UGT1A1- * 1-UGT1A1- * 113). Monet UGT1A1- geenien osoittavat suurta alleelifrekvenssit [17], [18]. Geneettinen polymorfismi oli myös todettu UGT1A3 [19], [20], UGT1A4 [21], [22], UGT1A6 [23], [24], UGT1A7 [16], [25], [26], UGT1A8 [12 ], [14], [21], [27], [28], ja UGT1A9 [29]. Polymorfismi johtaa eriasteisia transkription sekä toiminnallisia muutoksia, mikä saattaa vähentää UGT aktiivisuutta ja johtaa patologian sairastuneilla yksilöillä. Analyysi tapauskohtaisesti kontrolloitu tutkimus paljasti lisääntynyt riski sairastua peräsuolen syöpä (CRC) yksilöillä kuljettavat UGT1A1 * 6 ja UGT1A7 * 3 vaihtoehtoja [30]. Analyysi geneettisten polymorfismien UGT1A3 geenien (UGT1A3 * 2, UGT1A3 * 3) osoitti, että ei ainoastaan ​​aktiivisuustaso ilmaistuna UGT1A3 proteiini oli muuttunut, mutta spesifisyys erilaisia ​​alustoja vaikutti sekä [20]. Laajat tutkimukset oli tehty UGT1A7 geenivarianttien. Sen alhainen karsinogeeni metabolizing aktiivisuus, UGT1A7 geeni on riskitekijä maksasolusyövän (HCC) kehitys, Kiina (OR = 3,06) [31], Ranskan (OR = 3,4) [32], Japani (OR = 2,33) [33 ], ja korealaiset (OR = 1,45) [34]. Lisäksi UGT1A4 * 2 ja UGT1A4 * 3 pidettiin myös riskitekijä HCC käytettäessä alleeliyhteys tutkimuksen [21].

katalyyttinen tehokkuus UGT1A8 * 3 (C277Y) ja UGT1A9 * 3 (M33T ) allozyme kohti mykofenolihapolle rajusti vähentynyt [29]. Alleeli vaihtelua yksi monista UGT loci voi johtaa merkittäviin biokemiallisia muutoksia lääkkeitä metaboloivia potentiaalia. Ne UGT entsyymejä tiedetään hajottavan karsinogeeneja; puute toiminta saattaa olla tärkeä rooli etiologiassa karsinogeenisesta episodi kuten kolorektaalisyöpä.

Jotta ymmärrettäisiin paremmin roolin UGT1A ruoansulatuskanavassa, nykyinen tutkimus oli keskittynyt UGT1A8 vuonna ruoansulatuskanavassa. Perustuu aiemmat raportit [35], me tunnustettu muutokset ilmentymistä ja toimintaa UGT1A8 saattaa olla riskitekijä paksusuolisyövän. Tässä tutkimuksessa, polymorfinen ilmentyminen UGT1A geenien tutkittiin. Testasimme genotyypin UGTlA8 potilailla, joilla peräsuolen syöpä ja tutkitaan suhde polymorfismi UGTlA8 geenien ja peräsuolen syövän.

Materiaalit ja menetelmät

2.1 Kliiniset materiaali

(1) peräsuolen syöpä ryhmä, 150 potilasta (90 naista ja 60 miestä, keski-ikä 56,8 ± 11,3 vuotta) seulottiin meidän General Surgery osasto, Qilu sairaala, Shandongin yliopistossa, Shandongin maakunnassa, Kiinassa. Nämä potilaat valittiin standardin Amsterdamin II [36], on esteenä perinnöllinen polypoottinen peräsuolen syöpä (HNPCC) ja familiaalinen adenomatoottisen polypoosin (FAP). Kelpoisuus määritettiin jos ensisijainen diagnoosi tapahtui jopa kuusi kuukautta ennen tutkimukseen osallistumista, jossa lopullinen diagnoosi vahvisti kautta Patologian laitos.

Kukaan potilaista sai kemoterapiaa, sädehoitoa tai biotherapy ennen näytteiden keräämistä. 120 normaalihenkilöihin (48 naista ja 72 miestä, keski-ikä 57,2 ± 11,9 vuotta) seulottiin Department interventioradiologian Gastroenterology Qilu sairaalan, Shandong University. 72 normaali maksan kudosnäytteitä vapaaehtoisilla (30 naista ja 42 miestä, keski-ikä 56,5 ± 10,2 vuotta) on saatu osasto General Surgery, Qilu sairaalan Shandong University. Serial markkereita seerumin hepatiittiviruksen olivat negatiivisia näissä 72 aiheista. Kymmenen aiheita alistettu maksan verisuonikasvaimeen ja neljätoista alistettu maksan kysta. Katsaus potilastiedot kaikissa edellä mainituista aineista ei ollut osoitettavissa kroonisten huumeiden ottaen käyttäytymistä sekä puuttuminen tupakoinnin ja alkoholin väärinkäyttöä. Lisänäyte normalisointi toimenpiteet toteutettiin, kuten tupakoinnin lopettaminen 6 kuukautta ennen kudosnäyte keräämistä, ja paasto vähintään 12 tuntia ennen kirurgisia toimenpiteitä ja kudoksen keräys.

(2) 327 potilasta (123 naista ja 204 miestä , keski-ikä 56,4 ± 11,0 vuotta) ja peräsuolen syövän seulottiin osasto General Surgery ja Department of Gastroenterology, Qilu sairaala, Shandong University. Nämä potilaat valittiin perustuu standardeihin Amsterdamin II kriteerit ennen [36]. Kontrolliryhmässä oli 327 sukupuolijakauman vapaaehtoisilla (keski-ikä 54,2 ± 10,3 vuotta). Keskimäärin vapaaehtoiset kaksi vuotta nuorempi kuin peräsuolen syöpäpotilailla (p 0,05). Kaikki koehenkilöt olivat Han ihmiset tulevat yhteisen alueen Shandongin maakunnassa Kiinassa, ilman consanguinous suhdetta. Kyselylomakkeita annettiin erikoiskoulutettu sairaanhoitajien opiskella aiheita henkilökohtaista. Kysely kerättiin tietoa elämäntapaan liittyvien tekijöiden kuten liikunnan alkoholin ja tupakan käyttö; lääketieteen, perhe, ja työhistoria; ja käyttö over-the-counter lääkitys. Lisäksi säilyttämiseksi epidemiologisten arkistoista ja arvioida yksittäisten altistumista ravinnon syöpää aiheuttaville, yksityiskohtainen kyselylomake käytettiin mittaamaan keskimääräistä ravinnon saanti vuotta ennen diagnoosia peräsuolen syöpä, tai vuosi ennen valinnan valvontaa. Ei ollut muita merkittäviä eroja (esim. Iän, suvussa paksusuolen syövän, tupakoinnista, yhteensä lihan saanti, koulutustaso tai tulot) yksilöiden välillä jotka antoivat verinäytteen ja väestössä. Tietoon perustuva suostumus saatiin ja hyväksyi tutkimuksen eettinen komitea Shandongin yliopistossa.

2.2 kudosnäytteitä ja reagenssien

(1) kolorektaalisyövän ryhmässä, 150 paria näytettä (1 cm × 1 cm x 1 cm) kerättiin toimivat kirurgien 150 potilasta, joilla peräsuolen syöpä aikana osittainen kolektomian. Sitten näytteitä jäähdytettiin 0 ° C suolaliuosta. Jokainen paria otos koostui pahanlaatuista kudosta ja ympäröivä terve kudos. Tervettä kudosta kerättiin etäisyydellä yli 5 cm resektio marginaali paksusuolisyövän. 120 terveen paksusuolen limakalvon näytteitä kontrolliryhmän kerättiin sähköjohtoja enteroscope. Makroskooppinen tutkimus terveiden limakalvoa tutkimusryhmän ja verrokeilla ei näkynyt merkkejä vaurioista, kuten kuolion. Mikroskooppinen tutkimus valolla mikroskoopilla dokumentoitu normaali histologia. Kudokset olivat vapaita kasvaimen ja mitään havaittavissa samanaikainen sairaus, kuten koliitti, dysplasia. Paksusuolen limakalvon leikeltiin ja saada kudosnäytteiden free paksusuolen muscularis ja useimmat submukoosasta. Tämä mahdollisti suoran vertailun maksan epiteeli minimoimalla läsnä nonepithelial solutyyppejä. 72 maksan kudosnäytteet vapaaehtoisia saatiin läpi laparoscope etäisyydellä yli 5 cm reunasta kirurgisten ablaation. Näytteet valittiin puuttuminen histologisesti ilmeistä taudin, kuten hepatiitti ja maksakirroosi minimoida näytteen bias. Oltuaan kapseloitu tina alumiinikääreessä ja merkitty, kaikki kudosnäytteet huuhdottiin kylmällä 0,9% NaCl, ja pakastettiin välittömästi nestemäisessä typessä 10 minuutin kuluessa kirurginen poisto ja olivat jatkuvasti säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes sitä tarvitaan.

Käänteistranskriptaasilla MMLV hankittiin Sigma Chemical Co. TaqDNA polymeraasi hankittiin Shanghai Shengong Co. reagenssit reaktiona järjestelmissä Reverse Transcription (RT) ja polymeraasiketjureaktio (PCR) toimitti Kasvain Immunityand Genetic Engineering Key Laboratories. UGTlA kit hankittiin Gentest Corp.

(2) 5 ml ääreislaskimoiden kokoverta näytteet kerättiin 327 paksusuolisyövän potilaiden ja 327 tapauksia terveitä aikuisia. Molemmat ryhmät olivat paastonneet vähintään 12 tuntia ennen näytteenottoa. Happositraattidekstroosiin (ACD) käytettiin estämään veren koaguloimiseksi analyysiin asti. Reagenssit punasolujen lysaattia, valkosolut lysaattia, proteiinisaostusta ja DNA nesteytys hankittiin Medical Genetics Institute of Medical College Shandongin yliopistossa. Reagenssit reaktiossa järjestelmissä RT-PCR ja TaqDNA endonukleaasi ostettiin Promega CO. PCR-tuotteet liivate hakuasennon pakki ostettiin BioTek CO. Kaikki muut reagenssit saatiin kaupallisista lähteistä ja analyyttistä laatua.

2.3 Detection ja UGTlA mRNA: n ilmentymisen eri kudoksissa

läsnäolo UGT1A transkriptien kudoksen kokonaispinta-RNA analysoitiin PCR-monistuksella, suoritettiin duplex RT-PCR-co-monistuksen β-aktiini-cDNA: ta kontrollina. RT-PCR-havaitseminen kaikki UGT1A transkriptien ennustaa ihmisen UGT1A lokuksen suoritettiin käyttäen eksonin 1 erityisiä sense-alukkeet ja antisense-alukkeita, jotka sijaitsevat eksonit 2-5 tai sisällä yhteisen osan 3′-pään ensimmäisen eksonien. Kaikki alukkeet biosynthesized päässä Shenggong CO., Shanghai, hakemisen jälkeen genomisessa laboratoriossa, kuten taulukossa S1.

RNA: n eristämistä valmistettiin guanidiini-isotiosyanaatti menetelmiä. Noin 200 mg jäädytettyä kudosta jauhettiin huhmareessa täytetty nestemäisellä typellä. Tissue jauhetta heti hajotettiin happamissa fenoli-guanidiini-isotiosyanaatti ratkaisu. UGT1A cDNA yhteistyössä synthesizd kanssa β-aktiini-cDNA Eppendorf-putkissa, jotka sisältävät 1 ug RNA: ta, 1 ui MMLV, 7 ui RT-PCR-järjestelmä, 1 μ1 alavirran alukkeet .UGT1A cDNA yhteistyössä monistettiin β-aktiini-cDNA lähtö- tilavuus 98 ui, joka sisälsi 20 ui käänteistranskriptiolle tuotteita, 19 ui PCR-järjestelmä, 1 ui vastavirtaan alukkeita, 58 ui ultra-puhdasta vettä. Kun oli inkuboitu 94 ° C: ssa 3 minuutin ajan, PCR-sykliä aloitettiin lisäämällä 2 ui TaqDNA polymeraasia ja sitä seuraavaa sentrifugoimalla. Kaikkiaan kolmekymmentäviisi sykliä suoritettiin. Kukin PCR-jakso koostuu monistusreaktioissa 94 ° C 1 min, 58 ° C 1 min, ja 72 ° C 1 min, jota seurasi pidentymisen reaktiot laajennettu venymä aika 7 min 72 ° C: ssa. Analyyttinen agaroosigeelielektroforeesilla suoritettiin tunnistamiseksi PCR-tuotteita. Kodak Gelatiini Analysis System käytettiin arvioimaan ilmentymisen intensiteetti UGT1A ja UGT1A isoformit seuraavalla kaavalla:

Kokeet suoritettiin useita tasoja valvonnan, mukaan lukien valvonta ilman cDNA, alukkeita tai termofiilinen polymeraasia. Spesifisyys Tämän määrityksen määritettiin PCR: llä käyttäen kaikkia alukepareja kullakin kloonattu malliin cDNA jättää ristireaktiivisuutta. Vahvista havaitsemiseen erityisten UGT1A cDNA käyttämällä tätä määritystä, PCR-tuotteet olivat sekvensoitiin osittain dokumentoida identiteetin näiden tiettyjen geenituotteiden.

2,4 DNA-eristys kokoverinäytteistä

300 ui verinäytteitä infusoitiin 1,5 ml: n Eppendorf-putkiin. 900 ui punasolujen lysaattia lisättiin näytteeseen. Digestion annettiin 10 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sitten näytettä sentrifugoitiin 12000 g: llä 20 sekunnin ajan ja kirkas supernatantit poistettiin. 50 ui erytrosyyttien lysaattia ja 300 ui leukosyyttilysaatissa lisättiin suspendoidaan pelletti, jota seurasi 30 minuutin digestio huoneenlämpötilassa. Proteiini saostettiin lisäämällä 100 ui proteiinin saostumisen ja näyte sentrifugoitiin sitten 12000 g: ssa 20 sekunnin ajan. Supernatantti siirrettiin uuteen 1,5 ml: n Eppendorf-putkeen, jonka jälkeen hidas tiputusta kaksinkertaisella-määrälle ennalta jäähdytetty kuivattu etanolilla. Näyte vacillated hieman kunnes DNA sademäärä. Sitten näytettä sentrifugoitiin 9000 g: ssä 1 minuutin ajan ja kirkas supernatantit poistettiin. 500 ui 75% etanolia lisättiin sakka, jota seurasi sentrifugointi 9000 x g 1 minuutin ajan, supernatantit poistettiin ja DNA-sakan annettiin kuivua ilmassa. DNA nesteytys lisättiin nesteyttää DNA ja laimennetaan DNA-liuos pitoisuuteen 20 mg /l jatkokäyttöä varten, kvantifioinnin jälkeen DNA: ta UV-spektrofotometrillä. DNA rehydratoitiin puhtaalla vedellä pitoisuuteen 20 mg /l. Pitoisuus on todennettu UV-spektrofotometrillä ennen edelleen käyttää.

2,5 monistaminen UGT1A8 eksoni-1: n PCR

eksoni-1, joka sijaitsee 5′-päässä ihmisen UGT1A8, esitetään yksittäisen vaihtelua sen sääntelyä. Alukkeet suunniteltiin perustuen joukko UGT1A geenilokuksen (hakunumero AF297093). Eteenpäin pohjamaali (prlA8F, bases34175-34198): 5′-TGG GGT CAG GTT TTG TGC CTG TAG-3 ’, käänteinen aluke (prlA8F, emäkset 35175-35208): 5’-GAA ATT GTC AAA TCA CAA TTC AGT AAG GAA TCT -3 ’. Reaktio ehto säädettiin 4 ui 5 x PCR-reaktion, 4 ui 5 x dNTP: tä, 0,5 ui forward-aluketta, 0,5 ui reverse-aluke, 5 ui Taq-DNA-endonukleaasi, 2 ui DNA-templaattia, ja täydentävän optinen tilavuus steriiliä kolmesti tislattua vettä, joka koostuu kokonaistilavuudessa 100 ui. 35 monistussykliä reaktio suoritettiin. Kukin sykli koostui denaturoinnista 95 ° C: ssa 30 sekuntia, pariutuminen reaktio 57 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, ja pidennys 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Koko sykli edelsi 3minutes inkuboimalla reaktioseosta 95 ° C: ssa ja tämän jälkeen 10 minuutin pidennys 72 ° ° C: ssa. Identity PCR-tuotteiden varmistettiin geelillä electrophrosis.

2,6 Purication ja sekvensointi PCR-tuotteet

PCR-tuotteet värjättiin etidiumbromidilla 15 minuutin ajan, ja eristetty 20 g /l agaroosigeelillä , jännitteen ollessa 120 V: ssa 1 tunnin ajan. Monistettu DNA hihnat leikattiin pois alla UV-lampulla 320 nm ja laitetaan 1,5 ml: n Eppendorf-putkiin. Nelinkertaiseksi tilavuus Binding Buffer lisättiin DNA hihnat. Inkubaation jälkeen vesihauteessa 65 ° C: ssa 7 min, minkä jälkeen seos siirrettiin sarakkeisiin ja sentrifugoitiin 12000 g: ssä 1 minuutin ajan. 300 ui Binding Buffer käytettiin kolonnin puhdistamiseen sen jälkeen, kun hylätään ratkaisu. Toinen 750 ui DNA Wash Buffer lisättiin näytteeseen ja sentrifugointi toistettiin 10000 g: ssa 1 minuutin ajan. Sekoitettu liuos sentrifugoitiin 12000 g: ssä 1 minuutin ajan ennen heitetään supernatantit. Poistamisen jälkeen supernatantti, näytteet siirrettiin 1,5 ml: n Eppendorf-putkiin sarakkeeseen. Sitten, 30 pl DNA: Vesi-puskuria lisättiin kolonniin, sen jälkeen seosta sentrifugoitiin 12000 g: ssä 1 minuutin ajan. Liuosta kerättiin määrällisesti ja tarkempaa analyysiä. Kerätty DNA-fragmentit eri genotyyppien siirrettiin TOPO TA plasmidi DNA-näytteet sekvensoitiin Medical Genetics Institute of lääketieteellisen tiedekunnan Shandongin yliopiston kanssa täysautomaattisen sekvensseri (Prism 377, ABI CO., USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Tässä tutkimuksessa käytettiin samoja laadunvalvontatoimenpiteet kuvanneet Lesley M. Butler, et al. [37]. Ensinnäkin, positiiviset ja negatiiviset kontrollit Jokaisessa PCR ja Taqman kokeilu. Homotsygoottinen villityypin, heterotsygootti, ja homotsygoottinen variantit kunkin UGT1A8 genotyypin genomisista DNA-näytteistä ja UGT1A8 genotyypin olivat mukana. Toiseksi, toistuvat määritykset toteutettiin kolmella satunnaisesti valittua näytettä kutakin koetta oli 100% sopimuksen. Kolmas, vielä kolme satunnaisesti valitut näytteet varmistettiin suoralla DNA-sekvensoinnilla. Lopuksi laboratorion henkilökunta sokaisi tapaukseen tilan näytteistä.

2.7 Tilastollinen

Software paketti SPSS11.0 käytettiin analysoimaan tietoja tässä tutkimuksessa. Määrälliset tulokset ilmaistaan ​​keskiarvoina ± keskihajonta (χ ± s). Vertailuja avulla kahden ryhmän näytteitä tehtiin Studentin

t

-testi, kun taas useita ryhmän avulla analysoitiin ANOVA. Tulokset tapausverrokkitutkimukset analysoitiin käyttäen kaksisuuntainen Fisherin testiä määrittää jakelun ero useiden alleelien tapausten ja kontrollien välillä. Oikaistu syrjäisimmillä alueilla ja 95% CI peräsuolen syövän laskettiin logistisen regression malleja. CI 95% käytettiin, ellei toisin mainita. Oikaistu Ors ja 95% CI käytettiin vaikutusten arvioimiseksi UGT1A8 alleelien, genotyyppi, ja sukupuolen herkkyydestä kolorektaalisyövässä. P-arvo on 0,05 tai vähemmän määriteltiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

3.1 vaihtelu ilmaisun UGT IA mRNA

Kaikki ihmisen UGT1A geenitranskriptien näyttää ainutlaatuinen 5 -päähän ominaisuus kunkin yksittäisen transferaasin ja yhteinen 3′-osa koodaa eksonit 2-5. 3 ’alue on sama kaikille jäsenille koodaama UGT1A rataa, ja voidaan siten hyödyntää analysoida yleistä UGT1A ilmaisua. Co-monistaminen 487 bp UGT1A ja 317 bp: n ihmisen β-aktiini-PCR-tuotteet, erotetaan 2% agaroosigeelissä ja värjättiin etidiumbromidilla, on osoitettu käyttäen syöpäkudoksiin, sen ympäröivän terveen kudoksen, on normaalia koolonin kudosten verrokeilla , ja maksan kudoksiin. Leveys ja intensiteetti β-aktiini (317 bp) paneeleissa olivat yhdenmukaisia ​​odotetusti. Laajuus ja intensiteetti UGT1A mRNA: iden (487 bp) olivat paljon vaihtelevampi. Kvantifiointi DRT-PCR-tuotteiden saavutettiin laskemalla suhteellinen kertoimella Kodak Liivate Analysis System. Kuitenkin määrällisen paljasti huomattavia eroja vakaassa tilassa tasot kolme ekstrahepaattisen lähde ja maksan kudoksiin.

kolorektaalisyövän potilailla, UGTlA mRNA ilmaisun vähensi merkittävästi sairaan kudoksen verrattuna ympäröiviin terveisiin kudoksiin korjataan yhdessä. UGT1A mRNA: n ekspression tervettä kudosta kerättiin kolorektaalisyövän potilailla oli merkittävästi pienempi kuin terveen paksusuolen kudosta korjattu normaalia ohjausta. Korkein UGT1A mRNA: n ekspression havaittiin maksan kudoksesta, joka oli huomattavasti korkeampi kuin normaalin paksusuolen kudoksiin terveiden verrokkien (P 0,01), (Table.1). Paksusuolen UGTlA geeniekspressioiden leimasi merkittäviä yksittäisiä vaihtelua, kun taas maksan UGTlA mRNA ilmaisut olivat tasaisempi.

3.2 Monimuotoinen ilmentymistä UGT1A isomuotojen eri kudoksissa

analyysi UGT1A geenin ilmentyminen oli suoritetaan mRNA-tasolla käyttämällä UGT1A eksoni 1-spesifinen DRT-PCR: llä. Kuten aikaisemmin on raportoitu, ihmisen maksan ja paksusuolen kudokset on tunnusomaista ainutlaatuinen ja kudosspesifisen ero ilmentymisen UGT1A lokuksen [11], [12]. Tuotteet eksonista 1-erityisiä DRT-PCR nimenomaan havaitsee selostukset kaikista tunnetuista UGT1A isoformeja. DNA hihnat erotettiin 2% agaroosi ja värjättiin etidiumbromidilla (kuvio 1). Ja UGT1A perheen isoformit analysoidaan, UGT1A5 ja 1A7-mRNA: ta ei havaittu kaikissa kudosnäytteistä, ja näytteiden lukumäärä ilmaistuna UGT1A isoformien oli erilainen eri kudoksissa. Analyysi 150 eri UGT1A selostukset syöpäkudoksen todettu: UGT1A1-, 1A8 ja 1A10 mRNA ilmaistiin 102 näytettä (kuva 1 A). UGTlAl, 1A3, 1A4, LA6, 1A8, 1A9 ja 1A10 mRNA ilmaistiin 54 näytettä (Fig.1.b). UGTlAl, 1A3, 1A6, 1A8 ja 1A10 mRNA ilmaistiin 66 näytettä (Fig.1.c). UGTlA3, 1A4, 1A8, 1A9 ja 1A10 mRNA ilmaistiin 108 näytettä (Fig.1.d). Polymorfisen ilmentyminen UGTlA isomuotojen eri kudoksissa nähtiin table.2 ja kuva 2. Toisin syöpäkudoksiin, UGTlA8 ja UGTlAl0 mRNA ei ilmenny 72 eri maksan kudosnäytteistä. Oli vähän vaihtelua runsaasti UGTlA isomuotojen transkriptien kun jokainen verrattiin β-aktiinin ekspressiotasot. UGTlAl, 1A3, 1A4, LA6 ja 1A9 mRNA-tasot olivat erilailla alas-säädellä syöpäkudokset verrattuna ympäröivään terveeseen limakalvo (P 0,01), mutta UGTlA8 ja UGTlAl0 mRNA-tasot olivat sääteli (P 0,01).

AT: Paksusuolen syöpä kudoksia; N: Ympäröivät terve limakalvo; M: Marker

A.PCR tuotteet UGTlA8 eksoni-1 (1 033 emäsparia). 1,2,3: PCR-tuotteiden UGTlA8; M: Marker. B.Sequenced tulokset uGTlA8 alleelien. a: UGTlA8 * 1 b: UGTlA8 * 2; c: UGTlA8 * 3.

Nämä tiedot osoittavat, että UGT1A lokus on ilmaistu ihmisen ruoansulatuskanavassa. Tiedot myös huomata Monimuotoinen sääntelyä ja yksittäisten vaihtelu UGTl geenin lokuksesta RNA-transkriptin. Lisäksi tunnistaminen kudosspesifisen ilmentymistä UGT1A8 merkitsee, että sääntelyn mekanismit voivat olla osoitus evoluution kehitystä ja biologinen perusta vahvistettaessa yksittäisiä vaihtelua syöpäriskiä.

3.3 tunnistaminen joukko DNA uutettu koko verinäytteitä

SeqMan of DNASTAR ohjelmisto Molecular Biology käytettiin analysoimaan sekvenssit PCR-tuotteiden. Havaitut sekvenssit verrattiin ennalta määritellyt yhtenäisten kriteerien mukaan Human Genome Project [HGP] määrittää sivustoja SNP ja taajuus alleelien, kun yhdistetty analyysi jaksotelluille tulosten ja eri poikkeusten haamu huiput ja virheelliset sektorit. Väestön jakautuminen alleelien met Hardy-Weinberg tasapainoa χ2 testi (vapausasteita = sellaisten alleelien-1). Pituus PCR-tuotteiden 1,033bp (Fig.2.A). Sekvensoitiin tulokset puhdistettiin PCR-tuotteiden osoitti, että oli kolme SNP: emäspariin 518 (CG), emäsparin 765 (AG), ja emäsparin 830 (GA) sisällä koodaava alue UGT1A8 eksoni-1 (Fig.2.B, Taulukko S2) kantavassa mutaatio nukleotidiin 518 johtaa missense-mutaatio kodonissa 173, sen seurauksena, alaniini on korvattu glysiinillä. Mutaatio nukleotidin 830 johtaa korvaaminen tyrosiinin kysteiinin koodaama kodonioptimoida 277. mutaatio nukleotidin 765 on hiljainen mutaatio. Toiminnalliset polymorfiat on esitetty taulukossa S2. Koska suurin osa näytteistä, joilla on heterotsygoottinen mutaatio vain yksi mutaatio oli läsnä, osoittaa, että kolme pistemutaatiot eivät ole yhteydessä (Taulukko S2, S3). Tarkkuuden parantamiseksi, kerätty DNA-fragmentit eri genotyyppien siirrettiin TOPO TA-kloonausvektoriin plasmideja. Useita klooneja kustakin DNA-näytteestä karakterisoitiin DNA-sekvenssianalyysillä. Kaikissa tapauksissa, mutaation kuviot vastasivat olevien alleelien identiteettiin, kuten esitetään taulukossa S2 ja Table.S3. Genotyyppi näytteet voidaan todentaa TOPO DNA- palasten kloonaamisen, tässä tapauksessa UGTlA8 * 2 ja UGTlA8 * 3-alleelit tunnistettiin käyttämällä TOPO kloonausta.

3.4 Analyysi taajuuden alleelien ja genotyyppi UGT1A8

kontrolliryhmässä, alleelin taajuus UGTlA8 * 1 (villityypin) ja UGTlA8 * 1a oli hallitseva (79%), jonka jälkeen 18,8% for UGTlA8 * 2. Identiteetti UGTlA8 * 3 oli todella harvinaista, vain 2,3% valvonnan havaittu kuljettaa tämän genotyypin (Table.3, Figure.3). UGTlA8 * la on hiljainen mutaatio ja koodaa UGTlA8 * l. Homotsygoottinen kuvio UGTlA8 * 1 (UGTlA8 * 1 /* 1, UGTlA8 * 1 /* 1 a, UGTIA8 * 1a /* 1 a) osuus noin 65,21% normaalista aikuisista (Table.4). Todettiin, että genotyyppi UGTlA8 * 1 /* 2 ja UGTlA8 * 1 a /* 2 on taajuudella 24,64%, genotyyppi UGTlA8 * 1 /* 3 ja UGTlA8 * 2 /* 3 on taajuudella 4,35%, UGTlA8 * 2 /* 2 oli taajuudella 5,8% valvontaa. Mielenkiintoista on, että ei ole homotsygoottisia UGTlA8 * 3. Mikäli potilaalla on kolorektaalisyövässä alleelin taajuus UGTlA8 * 1 ja UGTlA8 * 1a, UGTlA8 * 2, UGTlA8 * 3 muodosti noin 61,5%, 22,0%, ja 16,5% (Figure.3), tässä järjestyksessä. Heterotsygoottinen ilmentyminen UGTlA8 * 1 /UGTlA8 * 2, joka koostuu niistä, joiden genotyyppi on UGTlA8 * 1 /UGTlA8 * 2 ja UGTlA8 * 1 a /* 2, olivat: n taajuudella noin 18,84%. 28.98% yksilöiden kolorektaalisyöpä ilmaistaan ​​UGTlA8 * 1 /* 3 ja UGTlA8 * 2 /* 3. Homotsygoottisen genotyyppi UGT1A8 (UGTlA8 * 1 /UGTlA8 * 1, UGTlA8 * 2 /UGTlA8 * 2), joka koostuu 46,38%, 4,35% syöpä- tapauksista, vastaavasti. Yksi tapaus Homotsygoottisen UGT1A8 * 3 totesi myös (Table.3). Siellä olivat tilastollisesti merkitseviä eroja alleelin frekvenssi ja genotyyppien välillä valmisteluryhmän ja kontrolliryhmään. Villityypin alleeli (UGTlA8 * 1) taajuus oli alempi joukossa tutkimusryhmän kuin kontrolliryhmä [P = 0,000, OR = 0,45, CI (+0,28-+0,79)]. Sama merkitys voitaisiin pani genotyyppi UGTlA8 * 1 /* l [P = 0,000, OR = 0,28, CI (,19-0,41)] ja UGTlA8 * 2 /* 3 [P = 0,000, OR = 10,58, CI (4.48- 24.98)] (Table.4 ja kuvio 4). Vastakkainen Tulokset havaittiin alleelin UGTlA8 * 3 [P = 0,000, OR = 6,99, CI (3,39-14,42)] (Table.3 ja kuvio 4) ja genotyyppi UGTlA8 * 1 /* 3 [P = 0,000, OR =