Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvainspesifiset adenovirusvektoreita käsittävät hedelmällistä geenipohjaisten diagnostisen kuvantamisen ja terapia tutkimusalue varten pitkälle syöpä, mukaan lukien etäpesäkkeitä. Kuitenkin kliininen käännös virusvektoreita on kohdannut huomattavia esteitä, mikä johtuu suurelta osin isäntä immuunivaste virusta. Täällä, selvitimme hyödyntäminen hylkimistä rapamysiini, kiertää anti-adenovirus immuniteetin immunokompetenteilla hiiren eturauhassyövän malleja. Rapamysiini vähentynyt adenoviruksen aiheuttama akuutti immuunivastetta estämällä NF-KB: n aktivaation; se vähensi myös laajuuden ja viivästytti tulehduksellisten sytokiinien eritystä. Lisäksi huomasimme, että rapamysiini kumottu anti-adenovirus vasta-ainetuotanto ja hidasti toimintaa myelooisen ja lymfosyyteissä, jotka aktivoituivat kun viruksen annon pre-immunisoiduissa hosts. Siten samanaikainen rapamysiinin pitkittynyt ja parannettu adenovirus toimitettujen ilmentymistä

in vivo

, ja näin täydensi kuvantaminen kyky adenovirusvektoreiden sekä bioluminescent ja positroniemissiotomografia säännöt. Lisäksi olemme osoittaneet, että huolimatta erinomainen vaste syövän solujen sytotoksinen geeni terapeuttinen vektori

in vitro

, vain vähän terapeuttisia vaikutuksia havaittiin

in vivo

pre-immunisoiduissa hiirissä. Kuitenkin, kun yhdistimme geeniterapia ohimeneviä immunosuppressiota, täydellinen kasvaimen kasvun pysähtymistä saavutettiin. Kaiken ohimenevä immunosuppressio mukaan rapamysiini pystyi lisäämään diagnostiikka-apuohjelman ja terapeuttisia mahdollisuuksia adenovirusvektorien.

Citation: Jiang ZK, Johnson M, Moughon DL, Kuo J, Sato M, Wu L (2013) Rapamysiinin Parantaa Adenovirusvälitteinen Cancer Imaging and Therapy in Pre immunisoimattomilla Hiiren palvelimet. PLoS ONE 8 (9): e73650. doi: 10,1371 /journal.pone.0073650

Editor: Maria G Castro, University of Michigan School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 31, 2013; Hyväksytty: 19 heinäkuu 2013; Julkaistu: 02 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Jiang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukevat National Cancer Institute myöntää RO1CA101904 ja LW. ZKJ tukevat University of California Los Angeles (UCLA) JCCC predoctoral toveruuden ja UCLA Väitöskirja Year yhteyteen. DLM tukivat DOD Munasarjojen Cancer Research Program; MJ ja DLM tuettiin Kasvain solubiologian Training apurahan (T32-CA009056). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

adenovirusvektoreilla (mainokset) käytetään laajasti

in vivo

geenikuljettimia aineita prekliinisissä ja kliinisissä, sekä syövän diagnostisia ja terapeuttisia tarkoituksia varten [1,2]. Äskettäin ryhmämme on osoittanut kykyä mainokset spesifisesti tunnistamaan syövän etäpesäkkeiden seuraavat imusuonten suunnatulla tai systeemiset virus- hallinto [2,3]. Hyvistä tuloksista huolimatta eläinmalleissa, useita esteitä on voitettava ennen täytäntöönpanoa mainokset kliinisissä sovelluksissa, pelottavampiakin este on isännän immuunivaste Ad (katsaus [4]). Aikaisemmat tutkimukset jyrsijöillä ja muilla kädellisillä ovat osoittaneet, että systeemisesti injektoitu Ad (serotyyppi 5) pääasiassa lokalisoitu maksaan ja tartunnan Kupfferin solut, endoteelisolujen ja maksasoluissa [5-7]. Ad-infektio näiden solujen ja pernan dendriittisoluja (DC) aloittaa vyöry tulehdusta edistävien sytokiinien ja kemokiinien tunnusomaista varhainen induktion interleukiini (IL) -1 ja tuumorinekroositekijä (TNF) -α [8,9], jota seuraa IL-2 , IL-6, makrofaagi-inflammatorinen -proteiini 2 (IL-8), säädellään ja normaalin T-solun ilmentää ja erittää (RANTES), IL-12 ja interferoni (IFN-γ) [10-15]. Nämä tekijät puolestaan ​​voivat rekrytoida ja aktivoida efektorisolujen lukien neutrofiilit, monosyytit, polymorphonucleocytes ja V

α14 invariantti (NK) solut, jotka voivat johtaa kudoksen (pääasiassa maksan) vahingot, aseptinen shokki ja jopa kuolema [16-18 ].

Vaikka Ad aiheutuu tulehduksellinen solvauksia kun isännät laukaisemalla synnynnäisen immuniteetin reaktiot [5,7,19], adaptiivinen immuunijärjestelmä voi myös tyhjentää viruksen ja viruksen transdusoidut solut, tehoa heikentävä vaikutus Ad-pohjainen kuvantamis- ja hoitomenetelmät [18,20,21]. Lisäksi suurin osa ihmisen väestöstä hallussaan anti-Ad-vasta-aineiden takia kaikkialla altistumista tämän taudinaiheuttajan; näin ollen toistuvan annon Ad vektorit prime laajentamista Ad-erityisiä plasma solujen, joka johtaa voimakasta sekundäärisen vasta-aineen eritystä ja myöhemmät viruspuhdistuma, vähentää vektori hyötyosuus ja tehostava isäntä myrkyllisyys [12,20]. Lisäksi, siirtogeenin-ilmentävät solut kohtaavat soluvälitteisen immuunivasteen puhdistuma [22-24]. Erityisesti tällainen poistaminen ei rajoitu Ad suunnattu vapautusta mutta voidaan myös liittyy käyttöön ulkomaisten siirtogeeni jos geenituote on immunogeeninen [19]. Koska useimmat kuvantaminen ja terapeuttiset geenit ovat eksogeenisia isännälle, tämän immunogeenisuuden asia on merkittävä haaste saavuttaa onnistuneeseen lopputulokseen Ad-pohjainen diagnoosi ja geeniterapiaan.

Tässä tutkimuksessa hyväksyimme FDA-hyväksytty immunosuppressiivinen, rapamysiini (RAPA), arvioida arvon ohimenevä immunosuppression sovittamalla nämä ristiriidat Ad ja isännän immuunijärjestelmän. RAPA sitoutuu FKBP12 (FK sitova proteiini 12) ja inhiboi mTOR kinaasikompleksi 1, entsyymi monimutkainen välttämätöntä monenlaisia ​​solun toimintoja tarvitaan nopeasti lisääntyviä soluja [25,26]. RAPA estää solusyklin etenemisen (G1 /S), proliferaation, aktivaation ja erilaistumisen T- ja B-lymfosyyttien esiin vasteena erilaisiin stimulantteja sekä vaste DC: iden ja muiden luontaisen immuunijärjestelmän solujen tulehduksellinen vihjeitä [27-30]. Lisäksi RAPA osoittaa tuntuvia angiogeneesiä ja syövän ominaisuuksia [20,31]. Tässä tutkimuksessa, me raportoimme että rapamysiini onnistuneesti vähentynyt Ad-liittyvä synnynnäisen ja adaptiivisen immuunivasteen immunokompetenteilla isännät käyttäen kahta ennalta immunisoitu hiirilajilla. Strategia otettu täällä voisi toimia alustana parantamiseksi turvallisuusprofiili ja transgeeniekspressiota tehokkuutta Ad välittämä molekyylikuvantaminen ja hoitoja.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely, adenovirus ja huumeet

Hiiren eturauhassyövän solulinjoissa RM-9 (ystävällinen lahjoitus tri Timothy C. Thompson, Baylor College of Medicine [32]) ja MycCaP (ystävällinen lahjoitus tri Charles Sawyersilta [33]) viljeltiin DMEM joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini /streptomysiiniä. Vatsaonteloon (i.p.) annos rapamysiiniä (LC Laboratories, Woburn, MA) liuotettiin steriiliin DMSO: hon ja käytettiin ilmoitetuilla pitoisuuksilla. Oraalisesti annettu Rapamune ostettiin Wyeth Pharmaceuticals Inc, Philadelphia, PA. Gansikloviiri (GCV) (Cytovene-IV; Genentech, Roche ryhmä, South San Franscisco, CA) käyttövalmiiksi steriilillä vedellä, laimennettiin steriilillä suolaliuoksella ja käytettiin 50 mg /kg /vrk

in vivo

kokeita tai ilmoitettu annos

in vitro

kokeissa.

Ad-serotyypin 5-vektorit konstruoitiin perustuu modifioituun AdEasy järjestelmä – AdNUEZ järjestelmä, jossa siirtogeenien voidaan sijoittaa E3-alueelle, jonka monikloonauskohtia . Homologinen rekombinaatio pAdEZ ja pShuttle toteutettiin

E. Coli

BJ5183 kompetentteja soluja. Viral kloonit seulottiin, kasvatettiin, puhdistettiin ja titrattiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [3]. Kaikki mainokset tässä tutkimuksessa käytetyt ovat replikaatiovialliset. Tyhjät Ad sisältää E1- ja E3-poistettu viruksen rungon, ilman siirtogeenien. Tiitteri kaikki Ad vektorit määritettiin plakkikokeet, joten plakkia muodostavaa yksikköä (PFU).

GCV

in vitro

herkkyyden määritys, RM-9 ja MycCap solut tartunnan mainokset at infektiokertoimella (MOI) 100 ja käsitellään GCV päivästä 2 päivään 7 infektion jälkeen (pi). Solujen elinkelpoisuus mitattiin käyttämällä Cell Counting Kit-8 (CCK-8) mukaan valmistajan ohjeiden (Dojindo Laboratories, Japani).

Synnynnäinen immuunivastekokeisiin

Kaikki eläinkokeet suoritettiin mukaisesti UCLA Institutional Animal Care ja käyttö komitea, joka tunnetaan kanslerin Animal tutkimuskomitea (ARC), ohjeet (ARC # 2002-049-33; hyväksytty kautta 20.3.2014). 4-5 viikon ikäiset BALB /c-hiiret (Taconic Farms, Germantown, NY) annettiin päivittäin suun kautta Rapamune (30 mg /kg, Wyeth, Madison, NJ) 3 päivää ennen laskimonsisäistä (i.v.) viruksen injektio. Seeruminäytteet hiiristä kerättiin ja sytokiini-ELISA suoritettiin valmistajan ohjeiden (Mouse sytokiini-ELISA Kit, BD Biosciences). Hiiret maksakudoksissa hajotettiin ja alistettiin western blot. Kanin anti-IkB-α (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-β-aktiini (Sigma, St. Louis, MO), piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-kani-anti-hiiri-vasta-aineita (Santa Cruz) käytettiin .

SCID ja immunokompetenttien eläinten vertailu koe

5-6 viikon ikäisiä uros- SCID ja BALB /C129 hiiret (Taconic Farms) hoidettiin päivittäin suun Rapamunea 3 päivää ja sitten intraprostatically ruiskutetaan 2 x 10

8 PFU Firefly lusiferaasin (FL) ilmentävä Ad. Lusiferaasiekspressiota seurattiin käyttämällä IVIS jäähdytettiin CCD-kamera (Xenogen, Alameda, CA). Kuvat analysoitiin IGOR-PRO LivingImage Software (Xenogen).

PET kuvauskokeessa

RM-9-soluja istutettiin ihonalaisesti oikeaan olkapäähän C57BL /6-hiiret (Taconic Farms), joka 7 päivä myöhemmin, sai suolaliuosta oraalisesti tai Rapamune hoito 4 päivää. 5 x 10

8 PFU sr39tk ilmentävien Ad sitten tuumorinsisäisesti ruiskutettiin ja 6 päivää myöhemmin hiiret altistettiin PET kuvantamisen

18F-FHBG kuten aikaisemmin on kuvattu [3]. 10 minuutin CAT kuvaustilanteeseen seurasi rakenteellisen tietoja.

Imaging kokeiluja valmiiksi immunisoiduissa mallit

4- 5 viikon ikäiset C57BL /6 ja FVB hiiret (Taconic Farms) istutettiin RM-9 tai MycCaP kasvaimia, vastaavasti. Molemmissa malleissa eläimet esialtistettu Ad i.p. injektio 1 x 10

8 PFU tyhjän virus. Kolmen viikon kuluttua ensisijainen viruksen altistuminen, 2,5 x 10

5 RM-9 solua tai 3 x 10

6 MycCaP jälkeen solut istutettiin ihonalaisesti päälle oikeaan kylkeen eläinten Matrigel (1: 1 v /v; BD Biosciences). Indikoitu annos (for C57BL /6) tai 5 mg /kg (for FVB) päivittäin i.p. RAPA tai laimentimien käsittely alkoi, kun kasvain oli käsin kosketeltava (~ (5mm)

3) ja 3 päivää myöhemmin, eläimet saivat kasvaimeen injektiona 1 x 10

8 PFU (for C57BL /6) tai 5,42 x 10

8 PFU (for FVB) FL-ilmentävien mainokset. Eläimet saivat jatketaan päivittäin RAPA tai laimentimien hoitoa loppuun saakka tutkimuksen. Bioluminescent kuvantaminen suoritettiin ilmoitettuina ajankohtina, kuten edellä on kuvattu.

immunofluoresenssivärjäyksellä

Ihon alle kasvaimet leikeltiin ja kiinnitettiin histologia kasetti 3% paraformaldehydillä 4

° C: ssa yön yli. Parafiiniin tuumorisektioiden (5 pm) tehtiin patologian laboratorioon UCLA. Anti-F4 /80 (1: 500, Serotec, Raleigh, NC) ja anti-CD31 (1: 300, BD Biosciences, Bedford, MA), vasta-aineita käytettiin värjäämään tuumorin kohdat. Kuvat otettiin käyttäen Eclipse 90i mikroskooppia Nikon.

Virtaussytometria kasvainten

ihonalainen kasvaimet leikeltiin ja hajotettiin fyysisesti paloittelu ja kollagenaasikäsittelyn (Invitrogen, Carlsbad, CA, 80 yksikköä /ml DMEM, joka sisälsi 10% FBS), 37

° C: ssa 1,5 tunnin ajan. Myeloidisolujen määritellään CD11 ja CSF1R värjäys, kun taas lymfosyytit ovat määritelty CD11b- CD4 + tai CD11b- CD8 +. Jotta ”stimulaatiota” medium käytetään T-solujen reaktiivisuus kokeilu, 7,6 x 10

6 MycCaP solut infektoitiin 3,8 x 10

7 PFU FL ilmentävien Ad; 36 tuntia myöhemmin, solut kerättiin 200 ui passiivista hajotuspuskuria (Promega, Madison, WI), suoritettiin kolme kierrosta jäädytys-ja-sulatus ja sentrifugoitiin. Stimulaatio alusta sisälsi 120 ug /ml solulysaatista ja 3 x 10

7 PFU /ml tyhjä virus. Solususpensioita dissosioituneista kasvaimista inkuboitiin sitten plain tai tämän stimulaation väliaineessa 37

° C: ssa 3,5 tuntia. Kaikki virtaussytometrillä vasta-aineet hankittiin BD Biosciences.

Tutkimuksiin

4- 5 viikon ikäisille uros FVB hiiriä (Taconic Farms) esi-altistettiin Ad jota i.p. injektio 1 x 10

8 PFU tyhjän virus. 3 viikon kuluttua, 3 x 10

6 MycCap soluja istutettiin ihonalaisesti päälle oikeaan kylkeen eläimiä 1: 1 v /v sekoitus steriiliä PBS ja matrigeelin (BD Biosciences). Kasvaimet tuli kouraantuntuva (~ (5mm)

3) viisi päivää myöhemmin ja päivittäin i.p. RAPA tai laimentimen käsittely aloitettiin neljän peräkkäisen päivän ajan. Eläimet sitten sai kasvaimensisäistä injektiona 6 x 10

8 PFU ohjaus (FL-ilmentävät) tai terapeuttisia mainoksia. RAPA tai laimentimen hoitoa jatkettiin sitten 7 päivää. 50 mg /kg /vrk GCV annettiin terapeuttista ikäluokat alkavat päivä 1 viesti viruksen injektion. Kasvaimet mitattiin mittaharpilla kahdesti viikossa loppuun tutkimuksen. Eläimet lopetettiin 30 päivän kuluttua kasvaimen implantaation.

Anti-adenovirus-aineiden määritys

Hiiren seerumi on saatu ennen viruksen antoa ja lopussa pisteen tutkimuksesta silmäkuopan seurasi sentrifugointi pöydässä sentrifugoi 8000 kierrosta minuutissa 10 minuutin ajan. 96-kuoppaisia ​​levyjä päällystettiin 1,5 x 10

7 PFU /kuoppa adenovirus 100 ul natriumkarbonaattia (0,1 mol /l, pH 8,8) ja inkuboitiin 4

° C: ssa yön yli. Aikaan määrityksen, viruksen liuos poistettiin ja levyä inkuboitiin 6% esto-reagenssia (Roche, Indianapolis, IN), 0,05% PBS-Tween 37

° C: ssa 1 tunnin ajan. Sarjalaimennoksia hiiren seerumia tehtiin kahtena kappaleena, ja inkuboitiin 37 ° C

° C: ssa 2 tuntia, minkä jälkeen 5 kertaa pesun 0,5% PBS-Tween. Biotinyloitu vuohen anti-hiiri-IgM: n ja IgG: tä (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA), vasta-aineita käytettiin inkuboidaan levyssä huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan ja sen jälkeen 5 kertaa pesun. Streptavidiini-HRP: tä (PerkinElmer, Boston, MA) käytettiin sitten inkuboidaan levyssä huoneenlämpötilassa 30 minuuttia, minkä jälkeen pesut ja kehityksen TMB-substraatilla (Thermo tieteellinen, Rockford, IL). Optinen tiheys Sitten levy luettiin 450 nm: n aallonpituudella. Anti-adenovirus-vasta-ainetiitteri määritettiin korkein laimennos, jossa post-virus seerumi on lukema 0,05 ylittää vastaavan ennalta virus seerumin.

Tilastollinen

Tilastolliset analyysit olivat suoritettiin käyttäen paritonta tai pariksi kaksitahoiset

t

testiä. Kaikissa analyyseissä, P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Rapamysiini vähentynyt Ad-esiin synnynnäisen immuunivasteen

riippuen kohdesolutyyppiin ja solujen pääsyn mekanismi, Ad-infektio voi laukaista erilaisia ​​ohjelmiston signalointimolekyylien, mukaan lukien lipidikinaasiaktiivisuutta PI3K,-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK), fokaalisen adheesion kinaasi-ERK1 /2, ja JAK-STAT reittejä [4,5,8,11]. Nuclear factor (NF) -κB on yhteinen alavirtavaikuttajainhibiittorit aktivoimiseksi useiden signalointireittien [8]. Ensin kysyttiin, kyselemällä hajoaminen sen estäjä IKB-, jos RAPA voisi vähentää Ad aiheuttama NF-KB: n aktivoitumisen. Me pistetään suolaliuosta tai 1 x 10

9 PFU Ad suonensisäisesti (i.v.) osaksi laimennusainevertailunäytteenä tai RAPA-käsitellyistä BALB /c-hiiristä, korjattu maksakudosta ilmoitetuilla ajankohtina ja heidät asetettiin western blot. Kuten kuviossa 1A on esitetty, Ad aiheuttama voimakas IKB hajoamista (ja näin ollen NF-KB: n aktivoitumista), 6 ja 12 tuntia injektoinnin jälkeen (p.i.); RAPA kumotaan tämä vaikutus.

(A) BALB /c-hiirille annettiin päivittäin suun kautta rapamysiini (30 mg /kg) tai suolaliuosta hoito 3 päivää ennen i.v. injektio 1 x 10

9 PFU Ad-CMV-FL tai suolaliuosta. Maksakudoksissa näistä hiiristä kerättiin ilmoitettuina ajankohtina, hajotettiin ja suoritettiin Western blot tutkia IκBα hajoamista. β-aktiini käytettiin lastaus ohjaus. m1, m2 ja m3: hiiri 1, 2 ja 3 kunkin ryhmän kussakin aikapisteessä. (B) Näiden hiirten seerumi kerättiin 1, 6 tai 12 tuntia ja sytokiinien tasot määritettiin ELISA: lla. Virhepalkit: keskiarvo + SEM (n = 3). ns, ei merkittävää; *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001 kaksisuuntaisella

t

testi verrattuna Ad ainoa ryhmä.

Koska NF-KB-aktiivisuus liittyy transkription monien tulehduksellisten tekijöiden tulokset kuviossa 1A esitetty, että RAPA voitaisiin tehokkaasti lieventää Ad-aikaansaama sytokiini myrsky eläimissä. Seurata tätä asiaa tarkemmin, tarkastelimme seerumin paneelin sytokiinien ja kemokiinien näistä hiiristä. IL-1 ja TNF-α ensimmäisten joukossa sytokiinit, jotka aktivoidaan Ad; ne johtavat ilmaisun muiden loppupään tekijöitä ja myös välittää signaaleja hankittu immuniteetti [24]. IL-6 ja IL-8 pelata olennaisia ​​rooleja rekrytointi efektorisolujen, kuten neutrofiilit, maksan ja liittyvät suoraan Ad liittyviä maksan vammoja; IL-10 on avainsäätelijä kehittämisessä humoraalisen immuniteetin [10,11,13,34]. Kuten kuviossa 1B on esitetty, Ad lisääntyi merkittävästi TNF-α, IL-6, MKC (hiiren Keratinosyyttien johdettu sytokiini, on analoginen ihmisen IL-8), IL-10 ja IL-12p70 eritystä 1 ja 6 tuntia ja IL -1β taso 6 tuntia pi; RAPA merkittävästi estänyt induktion näiden sytokiinien. Lisäksi, puhkeamista IFN-γ tuotanto viivästyi RAPA 6-12 tuntia pi. Näin ollen, nämä tulokset viittaavat siihen, että RAPA hoito voi vähentää suuruutta tai viivästyttää komponenttien Ad aiheuttama sytokiini myrsky.

Rapamysiini voimistua Ad-toimitetaan ilmentymistä

Kestävä ja pysyviä ilmentymistä on olennaisen tärkeää varmistaa diagnostinen ja terapeuttinen teho Mainosten. Siksi ryhdyimme vaikutusten arvioimiseksi isännän immuunijärjestelmän Ad välittämän ilmentymistä. Me pistetään tulikärpäsen lusiferaasi (FL) ilmentävä Ad eturauhaseen immunokompetenttien BalbC /129 tai sekamuotoinen immuunipuutos (SCID) hiiriä ja käyttää

in vivo

bioluminesoiviin kuvantamiseen seurata FL ilmaisun 5 viikon aikana. Kuten kuviossa 2A on esitetty, sekä kesto ja voimakkuus transgeeniekspression oli erittäin heikko BalbC /129 hiirillä, hallussaan ehjä immuunitoimintoja verrattuna SCID-hiiriin. Seuraavaksi kysyimme RAPA voisi lieventää tällaisia ​​estävät vaikutukset esittämä isännän hankittu immuniteetti. Koska perimmäisenä tavoitteena tässä tutkimuksessa on helpottaa kliinistä käännös mainokset, tutkimme jos RAPA voisi lisätä Ad välittämän syövän kuvantaminen käyttäen positroniemissiotomografia (PET), kliinisesti tärkeiden kuvantamismodaliteetin. Kuvantamisen reportterigeeniä käytettiin tässä kokeessa on HSV1-sr39tk, parannettu variantti herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasigeeniä, ja koetin tämän geenin on sen substraatin

18F-FHBG [35]. RM-9 eturauhasen kasvaimet istutettiin syngeenisissä, immunokompetenteilla C57BL /6-hiiristä ja tuumoreita kantavaa hiirtä sai vehikkeliä tai RAPA ennen kasvaimensisäisenä Ad-CMV-sr39tk injektio. PET analyysi kuuden päivän kuluttua viruksen injektion paljasti selvästi kohonnut sr39tk erityisiä

18F-FHBG kasvaimen signaali kaikissa neljässä hiiressä RAPA saaneilla kohortti; sitä vastoin, vain yksi hiiri kontrolliryhmässä esillä heikko signaali (kuvio 2B). Nämä tulokset osoittivat, että RAPA voi voimistaa Ad välittämää ilmentymistä immunokompetenteilla isännät, Boding hyvin hyödyllisyyttä yhdistämällä tämä muoto ohimeneviä immunosuppressio Ad diagnostisen kuvantamisen lähestymistapoja kliinisessä yhteydessä.

(A) 2 x 10

8 PFU prostataspesifisen FL ilmentävien Ad oli ortotooppisesti ruiskutetaan eturauhanen immunokompetenttien BalbC /129 tai immuunivajaisiin SCID hiirillä. FL kuvantaminen suoritettiin ilmoitettuina ajankohtina lähettää viruksen annon. Väri bar: fotonien /toinen /cm

2 /sr. (B) C57BL /6-hiirissä, joissa ihon alle RM9 kasvainten annettiin suolaliuosta tai rapamysiini hoito 4 päivää alkaen 7 päivää post kasvaimen istutuksen. Sitten 5 x 10

8 PFU sr39tk ilmentävien Ad oli injektoitiin kasvaimen. PET kuvantaminen suoritettiin 6 päivää myöhemmin

18F-FHBG. Ihonalainen kasvaimia merkitty punaiset nuolet.

Arvioidaan tarkemmin tämän yhdistetyn lääkkeen ja molekyylikuvantaminen lähestymistapa kliinisesti merkittäviä skenaarioissa, kysyimme tehostajavaikutuksen RAPA voidaan laajentaa eläimiin, joilla on ennestään anti -Ad koskemattomuus. Meillä työskentelee kaksi kantaa immunokompetenttien hiirten, C57BL /6 ja FVB, ja immunisoitu ne intraperitoneaalisesti (i.p.) annoksena 1 x 10

8 PFU tyhjä Ad (kokeellinen aikajana kuvassa 3A). Tämä virus immunisointikaavio johti vahvojen anti-Ad humoraalisen immuunivasteen hiirissä (kuva S1 File S1). Syngeeninen eturauhasen kasvaimia (RM-9 tai MycCaP [36]) on sitten perustettiin ihonalaisesti kolme viikkoa sen jälkeen, kun ensisijaisen viruksen immunisaatio. Ihonalainen malli valittiin yli potilaalle tehdä yksi tätä ensimmäistä proof-of-pääasiallisen tutkimuksen takia on käytännössä toteutettavissa kasvaimensisäisiä viruksen annon, kasvaimen koko arviointi sekä vaimennus bioluminescent signaalien syvempää eturauhasen kasvaimia. Kun kasvaimet tuli kouraantuntuva (4-5 päivää RM9, 5-7 päivää varten MycCaP), päivittäin i.p. injektio RAPA tai laimentimen annettiin. 3 päivää myöhemmin eläimet saivat toisen kasvaimensisäistä injektio FL ilmentävien Ad (1 x 10

8 PFU varten RM9; 5 x 10

8 PFU varten MycCaP). Bioluminescent kuvantaminen suoritettiin seurata FL ilmentymisen. RM-9 tuumorin malli, korkea (5 mg /kg), väliainetta (1,5 mg /kg) ja matala (0,5 mg /kg) annoksina RAPA testattiin; kaikki annokset parannettu FL ilme päivänä 4 suhteessa hiirillä, jotka saivat laimennusaine (kontrolli). Transgeeniekspressio katosi päivänä 7 hallinnassa hiirillä, mutta oli silti havaittavissa RAPA käsitelty ikäluokat (kuvio 3B). Vuonna FVB yhteensopiva MycCaP tuumorin malli, vain 5 mg /kg RAPA testattiin; hiiret seurasi kuvantaminen 21 päivää. Kuten kuviossa 3C-D, RAPA lisääntynyt FL ekspressiotaso päivänä 4, ja huomattavasti laajennettu siirtogeeni pysyvyys vähintään 21 päivää, mikä oli viimeinen ajankohta testattu. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että jopa haaste ennestään immuniteetti, RAPA voi lisätä ilmentymisen Ad toimitettujen kuvantamisen reportterigeenin ja pitkittää diagnostinen ikkuna. Nämä tiedot tukevat myös, että helpotetaan vaikutukset RAPA eivät kasvain malli- tai hiiren kannan suhteen spesifisiä.

(A) aikajana varten ennalta immuniteetin malleja. Eläimet esikäsiteltiin intraperitoneaalisella annoksella 1 x 10

8 PFU tyhjä Ad ja 3 viikkoa myöhemmin, ihonalainen kasvaimet istutettiin. RM9 kasvaimia tuli kouraantuntuva 4-5 päivää post istutuksen; MycCaP kasvaimia tuli kouraantuntuva 5-7 päivää implantaation. Tässä vaiheessa, rapamysiini tai kontrollikäsittely aloitettu ja kasvaimensisäisenä Ad kuvantamisen vektorit annettiin neljä päivää myöhemmin. Päivittäinen rapamysiini hoitoa jatkettiin loppuun asti tutkimuksen. FL bioluminoivat kuvantaminen suoritettiin ajankohdilla B ja C (B) FL bioluminescent kuvantaminen RM-9, joissa C57BL /6-hiiriin päivänä 4 ja 7. korkea: 5 mg /kg /päivä rapamysiini; Medium: 1,5 mg /kg /vrk; Low: 0,5 mg /kg /päivä. n = 3. (C) FL bioluminescent kuvantaminen MycCaP joissa FVB-hiiriä (n = 3 tai 4) osoitettuina ajankohtina. (D) kvantifiointi kuvantamisen signaalin C. Väripalkki bioluminesoivista kuvantamisen: fotoni count. Virhepalkit: keskiarvo ± SEM (n = 4 Ad vain; n = 3 Ad + RAPA). * P 0,05, ** P 0,01 kaksisuuntaisella

t

testiä.

Rapamysiini tukahdutettu anti-Ad adaptiivisen immuunivasteen

Jotta voitaisiin edelleen tutkia mekanismi taustalla RAPA n edistävät vaikutukset Ad ilmentymistä pre-immunisoiduissa isännät, ensin tutkinut tiitterin anti-Ad-vasta-aineita hiirissä seerumeista lopussa edellisen tutkimuksissa. RM-9 malli, sekä keski- ja korkea RAPA annoksina, mutta ei alhaisen RAPA annos, esti toissijainen tuotanto anti-Ad IgG valmiiksi immunisoitujen C57BL /6-hiirten (kuvio S2 File S1). Kokeilu suurempia kohortin koko paljasti, että suuri annos RAPA pienentää IgG tiitteri 1,36 ± 0,33 x 10

5-9,88 ± 2,02 x 10

3 (P = 0,0021, kaksisuuntainen

t

testi ; n = 8) (kuvio 4A). Samoin RAPA vähensi loppupiste IgG-tiitteri lähes 3-kertaiseksi valmiiksi immunisoiduissa FVB hiiret (P = 0,0368, kaksisuuntainen pariksi

t

testi; n = 3-4) (kuvio 4A). Nämä tiedot ovat yhtäpitäviä aikaisempien tutkimusten osoittavat RAPA n estoa Ad-herättänyt B-solujen aktivaation ja IgG tuotanto [20]. Huomattavaa on, että olemme keskittyneet tiitterit IgG yli IgM koska IgM eritystä edeltäneen IgG ja ollut yhtä suuruusluokkaa näissä pre-immunisoiduissa eläimissä. Lisäksi toissijainen viruksen altistuminen voisi aiheuttaa isotyypin vaihtumiseen IgG [37]. Kuitenkin, Xu et ai. raportoivat äskettäin estäviä vaikutuksia luonnon IgM-vasta Ad transduktio [38]; valossa nämä tulokset, osoitimme, että RAPA myös näytteillä estävää vaikutusta tasoon IgM, jotka voivat sitoutua Ad (kuva S3 File S1).

(A) FVB ja C57BL /6-hiiriä käsiteltiin mukaisesti protokollan kuvassa 3A. Hiiren seerumi kerättiin lopussa tutkimuksen ja altistettiin ELISA anti-Ad-aineiden määritys (FVB tarkoitetaan 3 itsenäisestä tutkimuksista; *, P = 0,0368 kaksisuuntaisella pariksi

t

testi. C57BL /6: edustavat tiedot 2 itsenäistä tutkimuksissa (n = 10); **, P = 0,0021 kaksisuuntaisella

t

testi). Virhepalkit: keskiarvo + SEM. (B) edustaja immunofluoresenssivärjäyksellä ohuiden osien välillä RM-9 kasvaimista osoitetulla hoitoon. Pink, makrofagimarkkeri F4 /80; vihreä, verisuoni merkki CD31; sininen: DAPI. Asteikko bar = 200 pm. (C) RM-9 kasvaimen esitetty hoitoryhmän hajotettiin ja suoritettiin virtaussytometria-analyysi myelooisen ja T-solujen populaatioita. Myeloidisolun sukuperää määriteltiin CD11b värjäystä. Virhepalkit: keskiarvo ± SEM (n = 5). ns, ei merkittävää; **, P 0,01; ***, P 0,001 verrattuna Ad ainoa ryhmä kaksisuuntaisella parittoman

t

testiä. (D) MycCaP kasvainten ohjaus- tai rapamysiini-käsiteltyjen eläinten (n = 3), kerättiin 1,5 cm halkaisijaltaan, erottaa, ja sitten niitä inkuboitiin pelkällä media tai väliaineessa, joka sisältää adenoviruksen, ja Ad-infektoitujen MycCaP solulysaatista 3,5 tuntia 37 ° C: ssa , värjättiin solunsisäisen IFN-γ-vasta-aineita, ja suoritettiin virtaussytometrialla. IFN-γ-ilmentymisen stimulaatio oli sitten normalisoidaan vastaavat ei-Ärsykekontrollin (asetettu 100%). T-solujen alaryhmiä rajattiin CD4 ja CD8 värjäystä. Virhepalkit: keskiarvo + SEM (n = 3). *, P = 0,0431 kaksisuuntaisella parittoman

t

testiä.

Seuraavaksi tutkimme RAPA rooli moduloimiseksi solussa-pohjainen anti-Ad immuniteetti [26,28]. Erityisesti meidän arvioidaan sekä infiltraatiota ja aktivaatiota immuunisolujen Ad-ruiskutetaan kasvaimia. RM-9 malli, immunofluoresenssivärjäyksellä paljastui suurempi soluttautuminen F4 /80 positiivinen makrofagien laukaisi Ad injektiona. Kuitenkin makrofagien infiltraatiota merkittävästi tukahdutti RAPA (kuvio 4B). Sitten käytimme virtaussytometrialla saavuttaa parempia kvantifiointia kasvaimensisäisenä myelooisen solupopulaatioiden (CD11 + /CSF1R +). Yhdenmukainen immunofluoresenssivärjäyksellä tuloksia, RAPA hoito merkittävästi vähentynyt myelooinen tunkeutuminen kasvaimissa (kuvio 4C, ensimmäinen paneeli). Erityisesti solut, jotka ilmentävät pesäkkeitä stimuloiva tekijä-1-reseptorin (CSF1R), keskeinen molekyyli erilaistumista makrofagien, DC, ja muut myelooinen monosyyteissä [39], olivat lähes täysin eliminoitu RAPA (kuvio 4C, toinen paneeli) näissä kasvain soluttautua myeloidisoluissa. Lisäksi sekä kypsää (CD69 +) ja vihreät (CD62L +) fenotyypit CD4 + T-solujen (CD11b- /CD4 +) pieneni RAPA (kuvio 4C, kolmas paneeli), mikä tarkoittaa, että sekä rekrytointi ja aktivaatio CD4 + T-solut estyy. CD8 + sytotoksiset T-solut (CD11b- /CD8 +) näytti myös vähennettävä RAPA (kuvio 4C, viimeinen paneeli) vaikka CD8 + sisältöä RM-9 kasvaimia oli erittäin alhainen, ja siten vaikea mitata tarkasti. Mielenkiintoista, sopusoinnussa muiden raporttien [20], RAPA vähentynyt tuumoriangiogeneesi, mitä heijastaa vähentynyt värjäys verisuoniston CD31 markkeri (kuvio 4B), jotka tarjoavat toinen mahdollinen mekanismi taustalla RAPA n esto immuunisolujen infiltraatio ja aktivoinnin havaittu tässä mallissa.

Seuraavaksi pyrittiin määrittämään jos RAPA voisi vaikuttaa reaktiivisuus tuumoreihin tunkeutuvia immuunisolujen kohti Ad ja Ad-tartunnan, siirtogeenin ilmentäviä syöpäsoluja. IFN-γ, keskeinen sääntely sytokiini T-solujen kehityksen ja aktivointia, valittiin lukema immuunisolupopulaatio toiminnallisuutta. MycCaP kasvaimia, perustettiin vuonna hiirillä ennalta immuniteetin Ad, kuten edellä kuviossa 3A ja C, otettiin talteen 1,5 cm halkaisijaltaan ja hajotettiin yhden soluihin. Dissosioidut soluja inkuboitiin sitten väliaineen kanssa tai ”stimulaatio” cocktail koostuu adenoviruksen hiukkaset ja solulysaattia MycCaP infektoitujen solujen FL-ilmentävien virus. IFN-γ tuotannon T-solujen stimulaation vaikutuksesta arvioitiin sitten solunsisäinen värjäys ja virtaussytometrialla. Kuten kuviossa 4D, kohortin ilman RAPA hoitoa (-, kontrolli), Ad-välitteistä stimulaatiota johti 35%: n lisäys IFN-γ ilmaisun CD4 + T-soluja ei-stimuloitu (plain media) perustaso; kuitenkin, T-solut RAPA käsitellyt tuumorit eivät reagoi näihin ärsykkeisiin. Reaktiivisuus harvinainen CD8 + T-solujen MycCaP kasvaimissa näytti olevan muuttamattomana RAPA. Yhdessä lisääminen RAPA Ad-välitteistä kasvaimen geeninsiirto protokolla vähensi soluttautumista myelooisen ja T immuunisolujen kasvaimen ympäristössä; se myös pyöristettyjä T-solujen reaktiivisuus virus liittyviä ärsykkeitä.

Rapamysiini voimistua Ad-sr39tk /GCV geeniterapia valmiiksi immunisoiduissa hiirissä

Seuraavaksi testasimme kykyä rapamysiinin laajentaa Ad-välitteisen itsemurhan geeniterapian kautta parantaa herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasin (HSV-tk) geeni, sr39tk, ja sen aihiolääke gansikloviirin (GCV) [40]. Valita sopiva malli tutkia sr39tk /GCV-pohjainen terapia, herkkyys RM9 ja MycCap solut arvioitiin. Molemmat solulinjat olivat saaneet sr39tk-ilmentävien mainokset on infektiokertoimella (MOI) 100 ja käsiteltiin osoitetulla annoksella GCV päivästä 2 päivään 7 pi. Elinkelpoisuus RM9 soluja ei ole muutettu ilmaus sr39tk tai läsnä GCV, kun taas MycCap solut olivat herkkiä tähän hoitoon (kuvio 5A). Siksi MycCap malli on valittu; lisäksi, että julkisyhteisöt-TSTA [3] eturauhasen-promoottori osoitti vahvaa transkriptionaalista aktiivisuutta MycCap soluissa (kuvio 5A ja S4 File S1), ja näin ollen sitä käytetään terapeuttisessa kokeissa.

(A ) MycCap ja RM9 solut infektoitiin Ad-julkisyhteisöt-TSTA-sr39tk, Ad-CMV-sr39tk tai ei-viruksen MOI = 100: lla ja osoitetut pitoisuudet GCV päivästä 2 päivään 7 pi. solujen elinkelpoisuus mitattiin CCK- 8 määritys päivänä 7 ja normalisoidaan ei-virus, nolla GCV ehto (katkoviiva).