Krooninen sairaus

tiivistelmä

yli-ilmentynyt CEACAM6 kasvainkudoksissa näyttelee tärkeä rooli invaasio, etäpesäkkeitä ja anoikis vastus erilaisissa ihmisen syövissä. Me raportoi äskettäin, että CEACAM6 ilmentyminen ylössäädellään mahasyövän (GC) kudoksiin ja edistettävä GC etäpesäke. Täällä me raportoimme että CEACAM6 edistää vatsakalvon etäpesäkkeitä

vivo

ja korreloi negatiivisesti E-kadheriinin ilmentymisen GC kudoksissa. Yli-ilmentynyt CEACAM6 aiheuttama epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) GC mitattuna korotukset EMT merkkiaineiden N-kadheriinin, vimentiinistä ja Slug taas E-kadheriinin ilmentyminen väheni CEACAM6-yliekspressoivassa GC soluissa; vastakkaiset tulokset havaittiin CEACAM6-vaiennetaan soluissa. Lisäksi E-kadheriinin ilmentyminen korreloi negatiivisesti syvyys kasvaimen invaasio, imusolmuke etäpesäke ja TNM vaiheessa GC kudoksissa. Lisäksi CEACAM6 kohonnut matriksimetalloproteinaasi-9 (MMP-9) aktiivisuus GC, ja anti-MMP-9-vasta voisi kääntää lisätä hyökkäyksen ja muuttoliikkeen aiheuttama CEACAM6. CEACAM6 myös nostivat fosforyloidun AKT, joka on mukana etenemistä erilaisissa ihmisen kasvaimissa. Olemme lisäksi havaittu, että LY294002, PI3K-estäjä, voi kääntyä CEACAM6 aiheuttama EMT kautta mesenkymaalisten-epiteelin siirtyminen. Nämä havainnot viittaavat siihen, että CEACAM6 parantaa hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden GC edistämällä EMT kautta PI3K /AKT signalointireitille.

Citation: Zang M, Zhang B, Zhang Y, Li J, Su L, Zhu Z, et al . (2014) CEACAM6 Edistää mahasyövän ja metastaasit indusoimalla epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon kautta PI3K /AKT signalointireitin. PLoS ONE 9 (11): e112908. doi: 10,1371 /journal.pone.0112908

Editor: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 07 elokuu 2014; Hyväksytty 16. lokakuuta 2014; Julkaistu: 14 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Zang et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (nro 81172324, No. 91229106, nro 81272749, ja nro 81372231), ja Key Project Shanghai koulutusvaliokunta (nro 12ZZ105 ja No.12ZZ102) ja Science and Technology komissio Shanghai kunta (nro 13ZR1425600). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

GC on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia ja merkittävä terveysongelma maailmanlaajuisesti, erityisesti Itä-Aasian maat, kuten Japani, Korea, Kiina, missä se on toiseksi syy syövän liittyvän kuoleman [1] – [3]. Karsinoembryonaalinen antigeeni liittyvät solun adheesiomolekyyli 6 (CEACAM6) on glykosyylifosfatidyyli-inositoli (GPI) linkatun immunoglobuliinien superperheen jäsen, joka on yli-ilmentynyt useissa eri ihmisen syövissä, erityisesti gastrointestinaalisten syöpien [4], ja toimii solujen välinen adheesiomolekyyli [4] – [6]. Vaikka CEACAM6 on GPI-ankkuroitu solun pinnan glykoproteiinin, se ei ole transmembraani- tai solunsisäisen domeenin, mutta pystyy vaikuttamaan solunsisäiseen signalointitapahtumia ja sillä on tärkeä rooli maha syövän etenemisessä [4], [6] – [8]. GPI-ankkuroitu molekyylit ovat usein samanaikaisesti paikallistettu pieniä kalvon mikrodomaineja solukalvon [9], mikä voi aktivoida alavirtaan signalointikaskadien kuten integriini-signalointireitin [10]. CEACAM6 toimii onkogeenin kasvaimia ja edistää syövän invaasio, etäpesäke, anoikis vastus ja chemoresistance, ja estää erilaistumista [7], [8], [11]. Me raportoi äskettäin, että CEACAM6 ilmaisua ylössäädellään ja liittyy imusolmuke etäpesäke GC kudoksissa [12]. Kuitenkin mekanismeista, joiden avulla CEACAM6 vaikutteita solunsisäistä viestintää GC jäävät vielä.

epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon (EMT) on paitsi fysiologinen prosessi alkionkehityksen aikana tai kudosten uudistumista, mutta myös patologinen elementti syövän etenemisessä, joissa kasvaimen etäpesäke, apoptoosin ja vanhenemista vastus [13] – [15]. EMT aina osoittaa huonon kliinisen ennusteen ihmisen syövissä. Useita mekanismeja, jotka liittyvät EMT aloittamista on dokumentoitu, mukaan lukien TGF-β, IL-6, PI3K /AKT, RAF /MAPK, ja SRC polkuja [15] – [18]. Aiemmissa tutkimuksessa havaitsimme CEACAM6 aiheuttama SRC aktivaation GC soluissa [12], ja havaittu lisääntynyt määrä kara-muotoinen CEACAM6 yli-ilmentäviä soluja verrattuna kontrolli soluihin. Siksi olimme hyvin kiinnostuneita määritettäessä suhdetta CEACAM6 ja EMT GC soluissa. Vaikka negatiivinen korrelaatio CEACAM6 ja EMT on kirjattu haiman karsinoomat [19], mekanismeja, joilla CEACAM6 säätelee EMT tunnetaan huonosti.

Tässä tutkimuksessa olemme tutki vielä vaikutukset ja mahdolliset reitit CEACAM6 GC invaasio ja metastaasi, ja tutkitaan sen korrelaatio EMT.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

kirjallinen suostumus tutkimukseen on saatu kaikille osallistujille. Tutkimuksen protokolla hyväksyi eettinen komitea on Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Eläinten menetelmät suoritettiin protokollan mukaisesti hyväksymän Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) Shanghai Jiao Tong-yliopiston, Shanghai, Kiina.

Solulinjat ja kudosnäytteiden

Ihmisen GC solulinjoja SGC-7901, MKN-45 ja MKN-28 hankittiin Shanghai Institutes for Biological Sciences, Kiinan tiedeakatemia. Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ja kosteustason RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia.

mahakasvaimen ja viereisen ei-kasvainkudoksessa saatiin 93 potilailla, joilla on GC jolle tehtiin parantava leikkaus Shanghai Jiaotong yliopiston School of Medicine Affiliated Ruijin sairaala vuodesta 2010 vuoteen 2013. potilaille koostui 69 miestä ja 24 naista, joiden keski-ikä oli 62,1 vuotta (vaihteluväli 30-85 vuotta). Yksikään potilaista ei ollut saanut sädehoitoa tai kemoterapiaa ennen leikkausta. Kliinis kerättiin ja patologisten tuumorin luokitus määritettiin mukaisesti UICC TNM luokittelu. Histologinen tyypitys suoritettiin vähintään kaksi asiantuntija patologian työskentelee itsenäisesti kaksinkertaisen sokkona. Tutkimus hyväksyi eettinen komitea Shanghai Ruijin sairaala, ja kaikki potilaat olivat täysin tietoisia koemenetelmien.

vector rakentaminen ja transfektio

Täyspitkä CEACAM6 cDNA saatiin RT PCR kokonais-RNA: uutettu GC näytteistä. Alukkeen sekvenssit olivat 5′-CCGGAATTCCCATGGGACCCCCCTCAGCCC-3 ’(eteenpäin) ja 5′-TCCCCCGGGGCTATATCAGAGCCACCCTGG-3’ (taaksepäin). Olemme koottu pIRES2-eGFP-CEACAM6 rakentaa liittämällä CEACAM6 cDNA pIRES2-eGFP vektori. Me seuraavaksi transfektoidut pIRES2-eGFP-CEACAM6 tai pIRES2-eGFP vektori SGC-7901 ja MKN-45-soluissa käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA) mukaisesti valmistajan protokollaa. Stabiileja klooneja valitaan jatkuva hoito G418: aa (1,2 mg /ml; Gibco, New York, USA).

Lentivirusvektori rakentaminen

perusteella ihmisen CEACAM6 geenin data, joka on oligonukleotidisekvenssiparin ja negatiivinen kontrolli sekvenssit suunniteltiin ja syntetisoitiin Shanghai Novobio Scientific Co., Ltd shRNA sekvenssit olivat seuraavat: CEACAM6, 5′-CACCGCCGGACAGTTCCATGTATACGAATATACATGGAACTGTCCGG-3 ’(eteenpäin) ja 5′-AAAACCGGACAGTTCCATGTATATTCGTATACATGGAACTGTCCGGC-3′ (taaksepäin); ohjaus, 5’-CACCGCTACACAAATCAGCGATTTCGAAAAATCGCTGATTTGTGTAG-3 ’(eteenpäin), ja 5′-AAAACTACACAAATCAGCGATTTTTCGAAATCGCTGATTTGTGTAGC-3’ (reverse). CEACAM6 shRNA subkloonattiin pL /shRNA /F lentivirusvektorilla saamiseksi pL /shRNA /SHR-CEACAM6 konstrukti. Sitten PL /shRNA /SHR-CEACAM6 tai ohjata lentivirusvektoreita transfektoitiin MKN-28 GC soluissa. Transfektoitu stabiilisti solut valittiin käsittelemällä 5 ug /ml blastisidiinia ja käytettiin tunnistamiseen ja jatkotutkimusta.

Western blotting

Solut kerättiin ja lyysattiin käyttäen RIPA-puskuria (Solarbio, Peking, Kiina ), joka sisälsi 1% PMSF proteaasi-inhibiittoreita. BCA-määritys (Pierce, Rockford, USA) käytettiin mittaamaan koko proteiinipitoisuus. Yhtä suuret määrät proteiinia erotettiin 10% SDS-PAGE, ja Erotetut proteiinit siirrettiin PVDF-membraaneille. Membraanit blokattiin kuoritun maidon 5% 2 h ja sitten inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa. Ensisijainen vasta-aineet olivat seuraavat: CEACAM6 (1:500; Abcam, USA), E-kadheriinin (1:500; Cell Signaling Technology (CST), USA), N-kadheriinin (1:500, CST, USA), vimentiinistä ( 1:1000, CST, USA), Slug (1:500, CST, USA), p-AKT (Ser473) (1:1000, CST, USA), yhteensä AKT (1:1000, CST, USA) ja GAPDH ( 1:10000; Abcam, USA). Sitten kalvoja inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen kanssa 2 tuntia huoneenlämpötilassa ja tehtiin näkyviksi käyttämällä tehostettua kemiluminesenssidetektiolla (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA) mukaisesti valmistajan protokollaa.

immunofluoresenssivärjäyksellä

Soluja viljeltiin peitinlaseilla 24 tuntia ja sitten kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 min ajan. Solut pestiin PBS: llä, sitten läpäiseviksi 0,5% Triton X-100: ssa 20 min ja pysäytettiin 5% BSA 30 min huoneenlämmössä. Me seuraavaksi värjättiin solut CEACAM6 vasta-aineella (1:50; Abcam) 37 ° C: ssa 2 h, jonka jälkeen inkuboitiin fluoresoivan sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Tumat värjättiin DAPI. Rodamiinifalloidiinia vasta-aine (1:150; Cytoskeleton) käytettiin visualisoimaan solun tukirangan GC soluja. Objektilasit analysoitiin ja kuvatuksi fluoresenssimikroskoopilla.

immunohistokemia

jaksot 4 pm paksu leikattiin parafinoidut kudosblokeista ja sitten parafiini ja nesteytyksestä. Immunohistokemiallisella värjäyksellä osien suoritettiin mukaisesti DAKO protokollan, käyttäen hiiren anti-CEACAM6 (1:100, Abcam) ja E-kadheriinin (1:100, CST), 4 ° C: ssa yön yli. Sitten aluslaseja inkuboitiin HRP-leimatun sekundaarisen vasta-aineen ja visualisoitiin diaminobentsidiinin. Kaksi patologia jotka sokaisi mihinkään potilastietoja arvioitu riippumattomasti ja teki kohdat. Immunohistokemia tahra pisteet = positiivinen solu pisteet + värjäys voimakkuus pisteet. Niiden positiivisten solujen pisteytettiin seuraavasti: 0 (10%), 1 (10-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) ja 4 ( 75%). Immunohistokemiallinen värjäys voimakkuus luokiteltiin seuraavasti: 0 (ei värjäystä), 1 (heikko värjäytyminen), 2 (ruskea värjäytyminen), ja 3 (tummanruskea värjäys). Yhteensä kymmeniä ≥3 määriteltiin positiivinen yksinkertaistaa tietojen analysointi. Analysoida korrelaatio CEACAM6 ja E-kadheriinin ilmentymisen, Image-Pro Plus versio 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA) käytettiin määrittämään ilmaus CEACAM6 ja E-kadheriinin 20 näytettä.

gelatiinitsymografialla

tutkimiseksi MMP-9 -aktiivisuuden, tsymografialla suoritettiin käyttäen 10% SDS-PAGE-geelejä, jotka sisältävät 1 mg /ml gelatiinia (Sigma). Lyhyesti, GC-soluja viljeltiin seerumivapaassa RPMI-1640-alustassa 24 tuntia ja otettiin sitten talteen supernatantti ja sentrifugoitiin 1000 rpm 5 minuutin ajan. Geelit pestiin kahdesti rena- (2,5% Triton X-100) 30 minuutin ajan joka kerta, kun SDS: n poistamiseksi elektroforeesin jälkeen ja sen jälkeen inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan reaktion puskuriin (50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 5 mM CaCl2, 150 mM NaCl). Me seuraavaksi värjättiin geelit 0,5% Coomassie brilliant blue R-250: ssa 2 tuntia, ja väri poistettiin geelit puskurissa (30% metanolia, 10% etikkahappoa). Kirkas läpinäkyvä bändejä taustalla sininen värjäys edusti gelatinaasimäärityksellä toimintaa.

Solun maahanmuutto- ja invaasion määritykset

solumigraatioon ja invaasio määrityksissä, yhteensä 1 x 10

5-soluja keskeytetään seerumittomassa RPMI-1640 kanssa tai ilman MMP-9-vasta-ainetta (Abcam, 2 ug /200 ui), ja maljattiin transwell kammioissa (8 um 24-kuoppalevylle, Corning Costar, NY, USA) kanssa tai ilman Matrigel ( BD Bioscience, CA, USA) valmistajan protokollien. Sekä määrityksiä, joka sisälsi 10% FBS: ää lisättiin alempaan kammioon kemoattraktantti. 24 tunnin kuluttua kulttuurin, solut kiinnitettiin 10% formaliinilla ja värjättiin 0,5% kristalliviolettia. Lopuksi solut alemmassa kammiossa valokuvattiin ja laskettiin ylösalaisin mikroskoopilla.

Nude hiiren ksenograftimallissa

neljä viikkoa vanhoja BALB /c-nude-hiiriin (Institute of Zoology, Kiina Academy of Sciences) käytettiin arvioimaan roolia CEACAM6 vatsakalvon levitys

vivo

. Nude Hiiriä pidettiin tietyllä patogeenittomassa ympäristön Animal Laboratory yksikkö, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Kiina. Hiiret saivat inhimillinen hoito ja tutkimus protokollat ​​tehtiin protokollan mukaisesti hyväksymän Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) Shanghai Jiao Tong-yliopiston, Shanghai, Kiina. Yhteensä 2 x 10

6 SGC-7901-CEACAM6 tai SGC-7901-NC-soluja injektoitiin viisi hiirtä vatsaonteloon kunkin ryhmän (satunnaistaminen). Hiiret lopetettiin 30. päivänä injektion jälkeen ja vatsan massat oli kuvattu ja valokuvattiin. Kaikki kokeet suoritettiin mukaisesti virallisten suositusten Kiinan eläimen yhteisöä.

Tilastot

Opiskelijan

t

-testi käytettiin tutkimaan tilastollisia eroja ryhmien välillä . Korrelaatioita E-kadheriinin ilmentymisen GC kudosten ja kliinis parametrit ja CEACAM6 ilmaisun analysoitiin chi-neliö tai Fisherin testejä tai Pearsonin korrelaatiokerrointa analyysi. Data näytetään keskimääräisenä ± SD.

P

0,05 ja

P

0,01 pidettiin tilastollisesti merkitsevä ja erittäin merkittävä, vastaavasti.

Tulokset

CEACAM6 vaikuttaa solujen morfologia ja solun tukirangan

aikaisemmat tulokset ymmärtää, että MKN-28 GC soluissa luonnostaan ​​ilmentävät korkeita CEACAM6, kun taas SGC-7901 ja MKN-45 GC-solut ilmentävät alhaisella tasolla [12]. N yli-ilmentyminen CEACAM6 in SGC-7901 ja MKN-45 GC solujen ja vaimennus CEACAM6 ilmentymisen MKN-28 GC solujen PL /shRNA /SHR-CEACAM6 lentivirusvektoreita vahvistettiin proteiinitasolla Western blot analyysi (Fig. 1A). Immunofluoresenssimääritykset aina osoitti, että SGC-7901-CEACAM6 solut ilmensivät enemmän CEACAM6 proteiinia kuin SGC-7901-NC-soluissa (kuvio. 1 B).

(A) Vakaa yliekspressio ja tukahduttaminen CEACAM6 GC soluissa. (B) CEACAM6 ilmentyminen analysoitiin immunofluoresenssilla, ja CEACAM6 ekspressiota havaittiin CEACAM6 yli-ilmentäviä soluja kuin kontrollisoluissa (200 x). Sininen: DAPI; punainen: CEACAM6. (C) yli-ilmentyminen CEACAM6 in SGC-7901 ja MKN-45-soluissa indusoi mesenkymaaliset morfologia, kun taas knockdovvn CEACAM6 in MKN-28 soluihin indusoi epiteelin morfologian (200 x). (D) immunovärjäys F-aktiini in CEACAM6 yli-ilmentäviä soluja ja kontrollisoluja (400 x). Red: F-aktiini; sininen: DAPI.

Mielenkiintoista, solumorfologiaan muutettiin seuraavat CEACAM6 vaimennus ja yli-ilmentymisen. Kontrolliin verrattuna soluihin, SGC-7901-CEACAM6 ja MKN-45-CEACAM6 solut ilmensivät enemmän mesenkymaaliset kaltainen morfologia, ja ne olivat spindle- ja fusiform-muotoinen (Fig. 1 C). Sitä vastoin tyypillinen siirtyminen mesenkymaalisten epiteeli- morfologia havaittiin MKN-28-sh soluissa verrattuna MKN-28-nc-soluissa (kuvio. 1 C). Kuitenkin oli epäselvää, jos CEACAM6 yli-ilmentyminen vaikutti solun tukirangan, mikä immunofluoresenssivärjäyksellä F-aktiini värjäys suoritettiin. Mielenkiintoista on, että isompia fusiform-muotoisten solujen havaittiin MKN-45-CEACAM6 ja SGC-7901-CEACAM6 linjat kontrolliin verrattuna soluihin (Fig. 1 D).

CEACAM6 on negatiivisesti liittyy E-kadheriinin in GC kudosten

immunohistokemiallinen analyysi käytettiin määrittämään tasojen E-kadheriinin ilmentymisen syöpäkudoksissa ja pariksi viereisen ei-tuumori- kudoksiin. Immunohistokemiallinen värjäys osoitti E-kadheriinin ilmentyminen oli matalampi kasvainkudoksissa kuin viereisillä kuin syöpäkudoksissa, ja paljasti, että E-kadheriinin pääasiassa sijaitsee cytomembrane epiteelisolujen (Fig. 2D, E, F). Seuraavaksi tutkimme suhdetta E-kadheriinin ilmentymisen ja kliinis-GC, ja totesi, että vaimentua E-kadheriinin liittyi syvyys invaasio (

P

= 0,046), imusolmuke etäpesäke (

P

= 0,013), ja TNM-luokitus (

P

= 0,035), mutta ei muiden kliinis tekijät kuten sukupuoli, ikä tai erilaistumiseen (taulukko 1). Lisäksi CEACAM6 negatiivisesti korreloi EMT haiman karsinoomat [19] ja CEACAM6 tukahduttaminen voi lisätä E-kadheriinipromoottorin aktiivisuutta kolorektaalisyövässä [20].

(A) Negatiivinen CEACAM6 ilmentyminen ei ollut kasvainta mahalaukun limakalvon. (B, C) Positiivinen tai negatiivinen CEACAM6 ilmaisun GC näytteissä. (D) Vahva positiivinen E-kadheriinin ilmentymisen kuin tumorous mahalaukun limakalvon. (E, F) Negatiivinen tai positiivinen E-kadheriinin ilmentymisen GC näytteissä. (G) Negatiivinen korrelaatio CEACAM6 ja E-kadheriinin ilmentyminen havaittiin GC kudoksissa (R = -0,636,

P

0,01) (200 x).

Lisäksi olemme tutkineet korrelaatio E-kadheriinin ja CEACAM6 ilmaisun GC järjestysnumeroa § immunohistokemiallinen (20 näytettä). CEACAM6 ekspressio kasvaimen kudoksissa oli korkeampi kuin täsmäsi ei-tuumori- kudoksiin (Fig. 2A, B, C), mikä on yhdenmukaista aiempien tulosten [12]. Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että CEACAM6 ilmentyminen korreloi negatiivisesti E-kadheriinin ilmentymisen GC kudoksissa Pearson korrelaatiokerroin analyysi (

P

0,01; Fig. 2G).

CEACAM6 indusoi EMT vuonna GC-solut

EMT-sukuiset proteiinit GC-solut arvioitiin western blot -analyysillä. Havaitsimme, että N-kadheriinin, vimentiinistä ja Slug-proteiinin tasot nousivat, kun taas E-kadheriinin aleni CEACAM6 yli-ilmentäviä soluja verrattuna niiden ohjaus solut (Fig. 3A, B). Converse tulokset saatiin, kun CEACAM6 pudotettiin vuonna MKN-28-soluissa (kuvio. 3C, D). Nämä tulokset viittaavat toiminnallinen rooli CEACAM6 säätelyssä EMT GC soluissa. Lisäksi nämä havainnot GC soluissa olivat samankaltaiset havaintojen GC kudoksessa.

(A, C) proteiini tasot EMT markkereita analysoitiin western blot analyysi GC solujen CEACAM6 yli-ilmentymisen tai knockdown. (B, D) Suhteellinen EMT merkki ilmentymistä CEACAM6-yliekspressoivassa ja -silenced GC solut laskettiin harmaasävyjen suhde. Tulokset ovat kolmen riippumattoman kokeiluja Pylväiden. *

P

0,05, **

P

0,01.

CEACAM6 nostaa MMP-9 GC soluissa

on hyvin tunnettua, että tarttuvuus, hajoaminen ja maahanmuutto ovat merkittäviä kysymyksiä syövän etäpesäkkeiden. Gelatiinitsymografialla suoritettiin vaikutusten tutkimiseksi CEACAM6 on MMP-9, joka on tärkeä ECM hajoamista. MMP-9: n aktiivisuutta SGC-7901-CEACAM6 ja MKN-45-CEACAM6 solujen lisääntynyt verrattuna niiden kontrolliryhmiin (Fig. 4A, B). Me tutkimme seuraavaksi, onko kasvatettu MMP-9 indusoi CEACAM6 GC-soluissa johti todellinen lisäys määrän tunkeutuvat ja vaeltavat solut. Meillä on siis tutkinut Aktiivisten anti-MMP-9-vasta-ainetta tai PBS: CEACAM6-yliekspressoivassa GC soluissa. Kuten odotettua, oli merkittäviä eroja määrän tunkeutuvat ja vaeltavat solut vasta-aineella käsiteltyjä soluja verrattuna PBS-käsitellyt solut (

P

0,01; Fig. 4C, D, E, F).

(A) supernatantti GC solujen kerättiin 24 tunnin kuluttua. Sitten MMP-9 aktiivisuutta tutkittiin gelatiinitsymografialla. (B) Suhteellinen MMP-9 ilmaisun GC soluissa. (C, E) Transwell määrityksessä. Kuvat osoittavat, soluja, jotka olivat matkanneet läpi mikrohuokoisen kalvon kanssa tai ilman matrigeelin (200 x). (D, F) histogrammit osoittivat numerot vaeltavien solujen ja tunkeutuvat soluihin. Tulokset ovat kolmen riippumattoman kokeiluja Pylväiden. *

P

0,05, **

P

0,01.

CEACAM6 ylössäätelee fosforyloidun AKT GC soluissa

aiemmin havaittu että SRC aktiivisuus indusoitiin CEACAM6 in SGC-7901 GC soluissa. AKT on alavirtaan proteiini SRC ja dramaattisesti liittyy EMT, invaasio ja etäpesäkkeiden syövän etenemiseen. Siksi arvioitiin AKT-vaikutusta CEACAM6-yliekspressoivassa GC soluissa. Western blotting osoitti, että AKT fosforylaatio seriinillä 473 oli merkittävästi lisääntynyt CEACAM6 yli-ilmentyvä GC-soluja verrattuna kontrolliryhmiin (Fig. 5A, B). Sen tutkimiseksi, onko EMT muutoksia indusoitiin CEACAM6 kautta PI3K /AKT-reitin, SGC-7901-CEACAM6 ja MKN-45-CEACAM6 soluja käsiteltiin 100 nM LY294002 24 tuntia. Mielenkiintoista on, että E-kadheriinin lisättiin ja N-kadheriinin pienennettiin LY294002-käsitelty CEACAM6 yli-ilmentäviä soluja kontrolleihin verrattuna, mitattuna Western blot-analyysillä (kuvio. 5C, D).

(A) Western blot-analyysi osoitti, että yli-ilmentyminen CEACAM6 lisääntyi p-AKT (Ser473) fosforylaatio. GAPDH ja koko AKT käytettiin lastaus valvontaa. (B) Kun määritellään p-AKT (Ser473) ilmentyminen GC soluissa. (C) E-kadheriinin ekspressio lisääntyi, kun taas N-kadheriinin ilmentyminen väheni CEACAM6-yliekspressoivassa GC soluja käsiteltiin LY294002, PI3K-estäjä. (D) Suhteellinen E-kadheriinin ja N-kadheriinin ilmentymisen CEACAM6-yliekspressoivassa ja LY294002 käsiteltyjen GC solut laskettiin harmaasävyjen suhde. Tulokset ovat kolmen riippumattoman kokeiluja Pylväiden. *

P

0,05.

CEACAM6 edistää vatsakalvon leviää in vivo

Lopuksi tutkimme vaikutuksia CEACAM6 ilmentymisen vaikutus vatsakalvon levittää ja etäpesäkkeiden

vivo

. Me pistetään SGC-7901-CEACAM6 ja SGC-7901-NC solujen vatsat nude-hiirten. Laaja vatsakalvon leviäminen havaittiin SGC-7901-CEACAM6 ryhmässä verrattuna SGC-7901-NC ryhmä (Fig. 6A). Oli huomattavasti enemmän näkyviä vatsakalvon kyhmyjä SGC-7901-CEACAM6 ryhmässä kuin kontrolliryhmässä (5,400 ± 0,510

vs.

1,400 ± 0,245,

P

0,01; Fig. 6B ). Lisäksi yli-ilmentyminen CEACAM6 parantaa etäpesäkkeiden

vivo

on myös raportoitu haimasyövän [19].

(A) Lisääntynyt määrä etäpesäkenystyröiden havaittiin SGC-7901-CEACAM6 ryhmässä kuin kontrolliryhmässä, kuten on osoitettu mustat nuolet. (B) keskimääräinen lukumäärä vatsakalvon kyhmyjä kahteen ryhmään. Enemmän kyhmyt tapahtui SGC-7901-CEACAM6 ryhmä kuin SGC-7901-NC ryhmä.

Keskustelu

GC on toinen syy syövän liittyvän kuoleman maailmanlaajuisesti [1] . Lisääntyvä näyttö osoittaa, että CEACAM6 tärkeä rooli mahasyövän etenemisen [7], [20] – [22], ja CEACAM6 on levinnyt laajemmalle kuin CEA (CEACAM5) normaaleissa kudoksissa, joilla on merkittäviä ilmaistaan ​​useissa epiteeli [4]. CEACAM6 vaikutteita solunsisäinen signalointi tapahtumien kautta homofiilisiä ja heterofiilisten tarttuvuus muihin CEACAMs tai integriinien [23], [24]. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia panosta GPI-ankkuroitu proteiini CEACAM6 GC etenemiseen.

Mielenkiintoista, havaitsimme että solujen morfologia ja solun tukirangan rakennetta muutettiin vakaa säätelyä ja downregulation CEACAM6 GC soluissa. CEACAM6-yli-ilmentävät solut olivat mesenkymaalisten kaltaisia ​​ja niillä karan ja fusiform muoto, ja aktiinin rasitukseen liittyviä säikeitä havaittiin verrattuna kontrolliryhmiin, prosessissa määritelty EMT. Mesenkymaaliset fenotyyppi hankkii solujen useamman muuttavan ja invasiivisia ominaisuuksia [15]. Tämä havainto oli yhdenmukainen

vivo

tulokset jolloin CEACAM6 aiheuttama laaja vatsakalvon leviää nude-hiirissä. MET havaittiin seuraavia vaiennettu CEACAM6 GC soluissa. Nämä havainnot osoittivat, että CEACAM6 saattaa osallistua asiakkuutta EMT GC. Olemme ensi tutkinut korrelaatio CEACAM6 ja E-kadheriinin, merkkiaine EMT, GC kudoksissa immunohistokemiallisella värjäyksellä. Kuten odotettua, merkittäviä kielteisiä korrelaatiota ei havaittu CEACAM6 ja E-kadheriinin ja E-kadheriinin ilmentyminen liittyi syvyys kasvaimen invaasio, imusolmuke etäpesäke ja TNM vaiheessa GC kudoksissa. Lisäksi CEACAM6 edistänyt imusolmuke etäpesäke (

P

= 0,001) 98 GC kudoksissa edellisessä tutkimuksessa [12]. Edelliset tulokset osoittivat, että CEACAM6 vaimennus lisääntynyt E-kadheriinipromoottorin aktiivisuutta kolorektaalisyövässä [20]. Edellä mainittujen havaintojen me olettaisi, että CEACAM6 edistetään GC invaasiota ja etäpesäkkeiden indusoimalla EMT ja voi toimia mesenkymaalisten merkki.

Etäpesäke on johtava syy syöpään liittyvien kuolemaan mutta on ollut vaikea tutkia, koska se liittyy sarja harvinaisia, stokastinen tapahtumia. Useita mahdollisia signalointireittien syöpään liittyvää etäpesäkkeiden on kuvattu, mukaan lukien PI3K /AKT, MAPK /ERK, FAK-SRC, JAK /STAT, NF-kβ, ja MMP polkuja [25] – [27]. Tässä tutkimuksessa, yliekspressio CEACAM6 kohonnut MMP-9 -aktiivisuuden, ja anti-MMP-9-vasta-aine voi kääntää lisäämällä invasiivisia ja muuttavien ominaisuuksien aiheuttama CEACAM6. EMT aloittamista merkittävästi korreloi syövän etäpesäkkeitä, ja indusoi kantasolujen ominaisuuksia, ehkäisee apoptoosia ja vanhenemista, ja edistää immunosuppression syövän etenemisessä [15]. EMT voidaan indusoida aktivaation kautta PI3K /AKT-signalointireitin [28], [29]. CEACAM6 toimii solujen välinen adheesiomolekyyli ja ne voivat muodostaa suurempia lipidilauttojen vuorovaikutuksessa itsensä tai muiden CEACAMs, mikä aktivoi alavirran signalointikaskadien, kuten integriini ja PI3K /AKT reitit [10], [30]. Siksi tutkimme vaikutuksia CEACAM6 ilmentymisen vaikutus tasot AKT fosforylaation GC soluissa. Fosforyloidun AKT kohoamiseen vuonna CEACAM6 yli-ilmentäviä soluja, yhdenmukaisia ​​aiempien tulosten todettiin haiman karsinoomat [8], [11]. Näiden havaintojen, ehdotamme hypoteesia, jonka mukaan CEACAM6 aiheuttama EMT tapahtuu aktivoimalla PI3K /AKT signalointiryöpyn GC. Lisäksi CEACAM6 yli-ilmentäviä soluja käsiteltiin LY294002, PI3K estäjä, tehtiin käänteinen EMT kautta MET. Täten voimme päätellä, että CEACAM6 indusoi EMT aktivoimalla PI3K /AKT-signalointireitin GC ja voi toimia mahdollisena kohteena kasvaimen hoidossa.

Yhteenvetona olemme osoittaneet, että CEACAM6 toimii onkogeenin edistämällä EMT kautta PI3K /AKT aktivaation GC. Lisäksi E-kadheriinin on merkittävästi vaimentua GC kudoksissa kuin pariksi viereisen ei-syöpäkudoksissa. CEACAM6 edistää invaasio ja etäpesäkkeiden

vitro

ja

vivo

, ja voi olla mahdollinen uusi ja ennustavia merkki ja uusi kohde GC terapia.

tukeminen Information

tarkistuslista S1.

ARRIVE suuntaviivoja. Kaikki in vivo kokeissa meidän käsikirjoitus vietiin mukaisesti ARRIVE ohjeita.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0112908.s001

(DOC) B

Kiitokset

kiittää Xuehua Chen ja Jianian Zhang teknistä apua, jotta Beiqin Yu hänen aineellista tukea.