Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Suurin osa (70%) epiteelin munasarjojen syöpien (EOCs) diagnosoidaan myöhään. Ei-invasiivisia biomarkkerit, jotka helpottavat taudin havaitsemista ja ennustaa tuloksen tarvitaan. MikroRNA (miRNA) ovat uusi luokka biomarkkereita. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa ja vahvistaa plasma miRNA biomarkkereina vuonna EOC.

Menetelmät /Principal Havainnot

arvioitiin plasmanäytteet 360 EOC potilaiden ja 200 tervettä verrokkia kahdesta laitosten. Kaikki näytteet ryhmiteltiin seulonta, koulutus ja validointi sarjoiksi. Me skannattu kiertävästä plasman miRNA by TaqMan low density array seulonta asettaa ja tunnistaa /validoitu miRNA markkereita reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio määritys koulutuksessa asetettu. Vastaanotin toimii ominaisuus ja logistinen regressioanalyyseissä perustettu diagnostinen miRNA paneeli, joka vahvistettiin validointi sarjoiksi. Löysimme suuremmat plasman miR-205 ja alemman anna-7f ilmentymistä tapauksissa kuin kontrolleilla. MiR-205 ja anna 7F yhteen tarjotaan korkea diagnostinen tarkkuus EOC, erityisesti potilailla, joilla on vaiheen I tauti. Näiden kahden miRNA ja hiilihydraattiantigeeniä-125 (CA-125) edelleen parantaa tarkkuutta havaitseminen. MiR-483-5p ilmentymistä koholla vaiheiden III ja IV verrataan vaiheittain I ja II, joka oli yhdenmukainen sen ilmentämiskuviota tuumorikudoksissa. Lisäksi alhaisempi let-7f olivat ennustavia huonon ennusteen EOC potilailla.

Johtopäätökset /merkitys

havainnot osoittavat, että plasman miR-205 ja anna-7f ovat biomarkkereita munasarjasyöpä havaitsemiseen että täydennys CA-125; let-7f voi ennustaa munasarjasyöpä ennustetta.

Citation: Zheng H, Zhang L, Zhao Y, Yang D, Song F, Wen Y, et al. (2013) Plasma miRNA kuin Diagnostic ja Prognostiset biomarkkereita munasarjasyöpä. PLoS ONE 8 (11): e77853. doi: 10,1371 /journal.pone.0077853

Editor: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Saksa

vastaanotettu: 21 kesäkuu 2013 Hyväksytty: 02 syyskuu 2013; Julkaistu: 01 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Zheng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat osittain National Natural Science Foundation of China (Grants 81072363), ohjelma Changjiang Tutkijat ja Innovative Research Team yliopistossa Kiinassa (Grant IRT1076), National Key tieteellistä ja teknologista Project (Grant 2011ZX09307-001-04) ja Tianjin tieteen ja teknologian säätiö (Grant 09ZCZDSF04700). Kudospankin on yhdessä tukevat Tianjin Center ja Yhdysvaltain National Foundation for Cancer Research. D. Y. on Odyssey Fellow MD Anderson Cancer Center, ja tukee Diane Denson Tobola Fellowship Munasarjojen Cancer Research apurahan ja The Harold C. ja Mary L. Daily Endowment Fund. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munasarjasyöpä on viidenneksi suurin syy syövän naisten yleisin kuolinsyy maailmanlaajuisesti, ja epiteelin munasarjasyöpä (EOC) on kaikkein vaarallisin gynecologic kasvain [1]. Koska EOC on yleensä oireeton ja harvat seulontatestit ovat käytettävissä, lähes 70% naisista esiintyy myöhäisvaiheen (vaihe III tai IV) sairaus, jossa 5-vuoden eloonjäämisluvut alle 30% [2]. Sitä vastoin potilailla, jotka ovat diagnosoitu vaiheen I tauti on 5 vuoden pysyvyys on jopa 90%, ja potilaille, joilla on vaiheen II tauti on 5 vuoden pysyvyys on enintään 70% [3]. Siksi varhainen havaitseminen EOC voi merkittävästi parantaa kliinisiä tuloksia. Herkät, ei-invasiivisia biomarkkerit, jotka voivat helpottaa sairauden havaitsemista ja lavastus ja ennustaa hoitotulokseen tarvitaan parantamaan eloonjäämisluvuissa ja määrittää optimaalisen hoitoja.

Hiilihydraattien antigeeni-125 (CA-125) on yleisimmin käytetty biomarkkeri munasarjasyöpä havaitseminen [4], mutta se on vain koholla noin 50% vaiheen I EOCs ja 70% -90% kehittyneiden tapauksista [5]. Näin ollen, on olemassa kriittinen tarve uusien biomarkkereiden, jotka ovat herkempiä ja spesifisiä havaitsemiseksi EOC kun niitä käytetään yksin tai yhdessä CA-125. Äskettäin MikroRNA (miRNA), perheen pieniä sääntelyn RNA: iden, syntyi mahdollisimman plasma merkkiaineita ihmisen sairauksia, kuten syöpää, koska niiden suhteellisen vakauden verenkierrossa [6].

miRNA ovat pieniä, ei- proteiini-koodaus RNA: iden transkription jälkeen säädellä geeniekspressiota tukahduttamalla erityiseksi kohde-mRNA: [7], [8]. Tiettyjen kiertävien miRNA on liitetty eri kasvaimen tyypit, mukaan lukien keuhkosyöpä, [9], [10], paksusuolen syöpä [11], [12], eturauhassyöpä [13], munasarjasyöpä [14], [15], ja haiman syöpä [16], [17]. Taylor

et al.

[14] verrattiin miRNA profiilit kasvain- eksosomeiksi, joka oli eristetty seerumista munasarjasyöpä potilailla, joilla on näiden välille sovitettu kasvainkudoksista peräisin samoista potilaista. Nämä tutkimukset olivat rajalliset saamalla pieni näyte koot ja arvioidaan muutamia kliiniset tekijät. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa ja vahvistaa kiertävä miRNA ihmisen plasmassa käytettäväksi ja ennustavia biomarkkereita munasarjasyöpää sairastavilla. Olemme pyrkineet vertailua identifid plasma miRNA kanssa CA-125, erityisesti lisätä herkkyyttä EOC havaitsemisen potilailla, joilla on normaali CA-125 seerumissa.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimusasetelma ja Population

Suunnittelimme monivaiheinen, retrospektiivinen, sisäkkäisiä tapauskontrollitutkimuksessa onko seerumin miRNA profiileja voidaan käyttää ennustamaan EOC kehitystä. Kaikki näytteet ryhmiteltiin seulonta, koulutus, ja validointi sarjaa (Fig. 1). Kaikkiaan 560 plasmanäytteistä (360 tapausta ja 200 valvonta) saatiin Tianjin Medical University Cancer Institute ja sairaalan (TCIH) ja Cancer Center Nanjing Medical University heinäkuun 2007 ja kesäkuun 2010 tapausten ja verrokit hyvin yhteen iän keskuudessa koulutus ja validointi sarjoiksi. Kaikki EOC potilaat olivat histopatologisesti diagnosoitu primaarinen munasarjasyöpä. Kaikki potilaat rekrytoitu Tutkimuksen eivät olleet saaneet kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen veren tasapeliä. Ja kaikki verinäytteet otettiin ennen leikkausta. International Federation of Naistenklinikka ja synnytysten (FIGO) lavastus järjestelmää käytettiin vaiheessa tapauksiin. Kaikkien potilaiden ja verrokkien olivat geneettisesti liity, etninen Han Kiinan naiset, jotka olivat pysyvästi asuvat kaupunkialueella Tianjin ja Nanjing. Controls, joilla on sydän-, hengitys-, ruoansulatus, virtsan, lisääntymis- ja hormonaaliset sairaudet jätettiin pois.

erotteli näytteet kolmesta: seulonta, koulutus, ja validointi. Validointi sisälsi kaksi vaihetta vahvistaa paras paneeli.

Tutkimus pöytäkirjat hyväksynyt Tianjin ja Nanjing Centerin tarkistamiskomitea. Tietoon perustuva suostumus saatiin, ja kaikki osallistujat olivat henkilökohtaisesti haastateltiin koulutettu haastattelijat käyttämällä esitestattuja kyselyn saada tietoa väestötiedot, kuukautiskierron ja lisääntymiseen historia, elämäntapa, ympäristötekijät, ja suvussa syöpää. Haastattelun jälkeen 5 ml laskimoverta otettiin verinäyte. Näistä tapauksista, 44 vastaavat munasarjakasvain kudosnäytteitä saatiin Tianjin keskus tässä tutkimuksessa. EOC kasvain kudosnäytteitä ja kudosten RNA saatiin Tissue Bank Facility TCIH, joka kerää kaikki kiinteä kasvain kudokset leikkauspotilaiden kun se on mahdollista.

CA-125 plasman näytteitä hankittiin sähköisten potilaskertomus kahden keskuksen. Potilaiden seuranta-havainnot tehtiin, ja eloonjääminen kesto laskettiin alkaen diagnoosi kuolinpäivästä tai Viimeisimmässä seurannassa maaliskuussa 2012.

Seulonta Aseta

havaitsemiseksi yleistettävissä miRNA allekirjoitukset, me Yhdistettyjä seeruminäytteitä 10 alkuvaiheen tapaukset (vaihe I), 10 myöhäisvaiheen tapauksissa (vaihe IIIc-IV), ja 10 tervettä verrokkia, vastaavasti, ja analysoidaan näiden kolmen altaan näytteitä TaqMan alhaisen tiheyden array (TLDA set 2.0, Applied Biosystems) siru seulonta löytö vaiheessa. TLDA versio 2.0 (Sanger miRBase V14 ihmisen) sisältyy 667 ihmisen miRNA. Microarray data on talletettu National Center for Biotechnology Informationin (NCBI: n) Gene Expression Omnibus (NCBIGEO GSE50472).

harjoitussetti

miRNA yksilöidyt seulonnassa asetetaan validoitiin käyttäen kvantitatiivista päinvastaisessa transcription- polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) yksittäisten plasmanäytteet 76 EOC potilaista ja 30 normaalia valvontaa.

Validation Set

validointi setti koostui kaksivaiheisesti. Lupaavia järjestöt seulonta ja koulutus asetettu arvioitiin validointivaiheessa asetin, joka käsittää 134 tapausta ja 70 valvonta Tianjin keskus. Vastaanotin toimii (ROC) käyrä-pohjainen riskinarviointi Sitten toteutettiin analyysi määrittämiseksi erotteleva vaikutus ehdokas plasman miRNA. Validointi vaiheen joukko sisältyy näytteitä 77 EOC tapauksista ja 50 normaalit kontrollit olivat Tianjin Center ja 73 EOC tapauksissa ja 50 normaalit kontrollit olivat Nanjing Centerin.

RNA: n eristäminen

Verta kerättiin EDTA-putkiin (BD Biosciences) ja käsitellään eristää plasman. Veri sentrifugoitiin 1200 g: llä ympäröivässä lämpötilassa 10 minuutin ajan, ja supernatantti plasma siirrettiin uuteen putkeen ja säilytetään -80 ° C: ssa.

RNA eristettiin plasmanäytteistä terveiden luovuttajien ja munasarjasyöpä potilaiden . Lyhyesti, 250 ui plasmaa sulatettiin jäällä ja sentrifugoitiin 14000 g: llä 4 ° C: ssa 10 minuuttia poistamiseksi lymfosyyttejä. Sitten hajotettiin 200 pl supernatanttia yhtä suurella määrällä QIAzol hajotusreagenssi (Qiagen, Shanghai, Kiina). Sillä plasmapoolien käytettiin seulomaan ihmisen munasarjasyöpä biomarkkereiden ehdokkaita, loimme altaan näyte yhdistämällä 110 pl kutakin 10 näytettä. Allas oli sekoittaa kääntämällä ja pyöritettiin 14000 g 10 minuuttia; 1 ml supernatanttia siirretään uuteen putkeen ja RNA: n eristämistä. Normalisointia, 5 ui 25 fmol synteettisen

Caenorhabditis elegans

miRNA cel-miR-39 lisättiin kuhunkin denaturoituun näytteen. Pieniä RNA eristettiin käyttäen miRNeasy Mini (Qiagen) seuraten valmistajan protokollaa, paitsi että RNA eluoitiin 30 ul: aan esilämmitettyä nukleaasitonta vettä. Eristää kokonais-RNA: munasarjakasvain kudoksia, pakastetut näytteet ensin homogenisoitiin TRIzol reagenssia (Invitrogen, San Diego, CA) käyttäen Omni-Mixer Homogenisaattori (Omni International, Kennesaw, GA). Kokonais-RNA eristettiin käyttäen standardi TRIZOL-menetelmää (Invitrogen), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Laatu kokonais-RNA varmistettiin kanssa Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies).

Mirna Profilointi

miRNA ilmaus altaan näyte profiloitu käyttäen TLDA. Lyhyesti, RNA käänteiskopioitiin käyttäen TaqMan miRNA käänteistranskriptio kit, ja TaqMan miRNA multiplex RT määritykset, Human allas Set. Sellainen määrä 9,16 ui plasmaa RNA liuosta transkriboidaan 15 ui RT seoksen. Putkia inkuboitiin 16 ° C: ssa 30 minuuttia, minkä jälkeen 42 ° C: ssa 30 minuuttia ja 85 ° C: ssa 5 minuutin ajan. Taqman Esivahvistustaso master mix Kit (Applied Biosystems) on tarkoitus lisätä määrää cDNA analysoitaviksi ennen käyttöä TLDA. 25 ui reaktioseosta käsitti 2,5 ui laimentamatonta cDNA yhdistettiin 12,5 ui TaqMan Esivahvistustaso master mix, 2,5 ui Megaplex Esivahvistustaso alukkeita, ja 7,5 ui nukleaasitonta vettä. Pre-monistus vaiheessa suoritettiin valmistajan protokollan. Tuote laimennettiin lisäämällä 75 ui nukleaasitonta vettä ja 9 ui laimennettua seosta yhdistettiin 450 ul: TaqMan Universal PCR Master Mix, ja 441 ui nukleaasitonta vettä. Lataamisen jälkeen 100 ui kutakin multiplex allas seos, array (TaqMan Human MicroRNA Array Set v2.0) sentrifugoitiin ja sinetöity. Monistus suoritettiin Applied Biosystems 7900 HT-lämpösyklilaitteessa (Applied Biosystems) käyttäen valmistajan suosittelemaa sykliolosuhteita. Aineisto analysoitiin RQ Manager ohjelmiston versio 1.2 ja 7900 Sequence Detection System 2.4 (Applied Biosystems).

Mirna kvantifiointi reaaliaikaisella qRT-PCR

määrittämiseksi miRNA plasmassa näytteissä, me käytetyt ABI Mirt-PCR-järjestelmä, jossa seuraavat ehdot: 2,5 ui rikastettua pieniä RNA: iden plasmanäytteistä tai 10 ng kokonais-RNA: kudosnäytteet käänteistranskriptio käyttäen TaqMan miRNA käänteistranskriptio kit (Applied Biosystems) 7,5 ui reaktion puskuri, jossa kohde-spesifisiä alukkeita. Putkia inkuboitiin 16 ° C: ssa 30 minuuttia, minkä jälkeen 42 ° C: ssa 30 minuuttia ja 85 ° C: ssa 5 minuutin ajan. Alustuksen jälkeen, laimennetaan 1:20 käytettiin templaattina PCR-vaiheessa käyttäen TaqMan 2 x Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) ABI Prism 7900. Olemme mitattiin kolmena rinnakkaisena käyttäen 15 ui Lopullinen reaktiotilavuus ja seuraavia sykliolosuhteita: 10 minuuttia 95 ° C: ssa, jota seurasi 50 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C: ssa 1 minuutti. 7900 Sequence Detection System 2.4 -ohjelmassa oletusarvo käytettiin laskea suhteellista muutosta ilmentymisen 2

-ΔΔCt menetelmällä 95%: n luottamusväli.

Tilastollinen analyysi

suhteellinen taso miRNA kvantifioitiin käyttäen 2

-ΔΔCt menetelmällä, ja tiedot analysoitiin log

10 suhteellisen määrän kohde miRNA. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin käyttäen Wilcoxonin rank tai

t

-testin välillä potilaiden ja verrokkien. ROC dikäyrät arvioida diagnostinen tarkkuus kunkin ehdokkaan miRNA, ja herkkyys ja spesifisyys optimaalisen rajakohta määriteltiin ne arvot, jotka maksimoitu pinta-ala ROC-käyrän (AUC). Vaiheittainen logistinen regressiomalli käytetään valitsemaan diagnostiset miRNA markkereita perusteella harjoitustietosivut asetettu. Korrelaatio selviytyminen (eloonjäämiseen [OS] ja ilman taudin etenemistä [PFS]) ja plasman miRNA analysoitiin käyttämällä Kaplan-Meier menetelmä ja log-rank-testi. Coxin suhteellisen vaarat regressioanalyysiä käytettiin määrittämään, onko plasman miRNA oli itsenäinen ennustetekijä varten EOC.

Käytimme tilastollinen ohjelmistopaketteja SAS versio 9.0 (SAS Institute, Cary, NC) ja MedCalc (Mariakerke, Belgia ). Kuvaajat muodostettiin kanssa GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolisia, ja

P

arvo 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Potilastiedot

Keräsimme 560 plasmanäytteet (360 tapausta ja 200 tarkastukset) ja siihen liittyvät kliiniset ja demografiset tiedot tätä tutkimusta; tapauksissa mukana 179 vakavasta kasvaimia (49,7%), 86 endomet- kasvaimet (23,9%), 33 mucinous kasvaimet (9,2%), 15 kirkas solu kasvaimia (4,2%), ja 47 adenokarsinoomat, ei ole muutoin täsmennetty (NOS) (13,0%) . Osallistujien ominaisuudet on esitetty taulukossa 1 ja taulukossa S1. Jakaumia eniten riskitekijöistä oli yleensä samanlainen potilaiden ja verrokkien (taulukko S1). Potilailla ei ollut merkittävää eroa jakelussa FIGO vaiheissa, histologinen tai CA-125 tasojen koulutus ja validointi ryhmien (taulukko 1).

Mirna Screening

TLDA siru, me seulotaan 667 ihmisen miRNA löytää merkittävästi eri miRNA ekspressiotasot tapausten ja kontrollien välillä. Seulomiseksi tehokkaasti useita miRNA biomarkkereiden ehdokkaita, ensin syntyy kolme plasmapoolin erillä, jotka oli johdettu varhaisen ja myöhäisen vaiheen EOC potilaiden ja terveiden verrokkien. Kontrolliin verrattuna allas oli 43 ja 50 miRNA jotka ilmentyvät differentiaalisesti alkuvaiheen ja loppuvaiheen tapauksessa allas, vastaavasti. Näistä merkittävä miRNA oli 30 miRNA ristissä. Kolmekymmentä ilmentyvät eri plasma miRNA tunnistettiin välillä EOC potilaiden ja terveiden verrokkien (Fig. 2A ja taulukko S2).

(A) TLDA seulonta paljasti 30 merkittäviä plasman miRNA muutoksia tapausten ja kontrollien välillä. (B) Kun training set havaitsimme 30 merkittävää miRNA käyttäen qRT-PCR ja havaitsi, että 11 ehdokasta miRNA oli ilmennetty eri tulivuoren juoni. -log

10

P

arvot (y-akseli) piirretään log

2 kertaluokkamuutos tapausten ja kontrollien välillä (x-akseli). Jokainen symboli on värikoodattu keskiarvo ilmentymisen koettimen yli kaksi ryhmää. Katkoviivat rajaavat cut-off merkittävästi vaimentua (vasemmalla) tai voimistunut (oikealla) miRNA tapauksissa. Lämpöä kartta 11 merkittävän miRNA näkyy oikealla. (C, D) In ​​validointivaihetta I, vain miR-205 (C, vasen) ja anna-7f (D, vasemmalla) oli eriasteisesti. ROC-analyysi osoitti, että AUC-arvot miR-205 ja anna-7f erottamiselle tapauksissa ja valvonta olivat 0,609 (95% CI: 0,538-0,677) ja 0,780 (95% CI: ,717-+0,835), tässä järjestyksessä.

Plasma miRNA tasot Potilaat vs. kontrollit Training Set

training set käytimme qRT-PCR havaita edellä mainitun 30 merkittävää miRNA on tapauskontrollitutkimuksessa joka sisälsi 76 EOC tapauksissa ja 30 tervettä verrokkia. Yhdeksän miRNA (miR-205, miR-200a, miR-184, miR-34a *, miR-141, miR-483-5p, miR-193B *, anna-7e *, ja miR-363 *) havaittiin suuremmilla tasot tapauksissa kuin verrokeilla, kun taas miR-98 ja anna-7f havaittiin alemmilla tasoilla (havainnollistettu tulivuoren juoni ja lämpö kartta, kuvio. 2B).

Plasma miRNA tasot Potilaat vs. kontrollit, että Validation faasi I Set

validointivaihetta asetin, ilmaus profiilit 11 ehdokkaan miRNA arvioitiin edelleen käyttäen qRT-PCR menetelmä 134 EOC tapauksissa ja 70 valvontaa. MiR-205 ja anna-7f oli erilaiset ekspressiotasot tapausten ja kontrollien välillä. Verrattuna kontrolleissa, plasma miR-205-tasot olivat merkittävästi korkeammat (

P

= 0,012) (Kuva. 2C, vasen paneeli) ja anna-7f tasot olivat merkittävästi alhaisemmat (

P

= 1,97 × 10

-10) in EOC potilailla (Fig. 2D, vasen paneeli).

ROC-analyysiä käytettiin arvioimaan herkkyys ja spesifisyys kahden ehdokkaan plasma miRNA markkereita. AUC miR-205 ja anna-7f olivat 0,609 (95% CI, +0,538-,677; herkkyys = 30,1%, spesifisyys = 94,2%) (Fig. 2C, oikea paneeli) ja 0,780 (95% CI, ,717-0,835; herkkyys = 66,9%, spesifisyys = 84,2%), vastaavasti (Fig. 2D, oikea paneeli).

Yhdistelmä miR-205 ja Anna-7f varten EOC Diagnosis

vaiheittainen logistiikkaregressiomallin käytettiin arvioida yhteinen voima miR-205 ja anna-7f ennustamaan riski EOC vuonna validointivaiheessa Asetin. MiR-205 ja anna-7f olivat tehokkaita erotteleva tapausten valvonta [Fig. S1A; logit (P = EOC) = -0,610-3,075 × let-7f + 1,532 × miR-205 käytettiin rakentaa ROC käyrä]. AUC miRNA paneelin (anna-7f ja miR-205) oli 0,831 (95% CI, +0,772-,880; herkkyys = 62,4%, spesifisyys = 92,9%) (Fig. 3A), joka oli huomattavasti korkeampi kuin AUC-arvot miR-205 (

P

0,001) ja anna-7f (

P

= 0,008) yksinään (Fig. S1B).

Olemme perustettu miR-205 ja let-7f paneeliin validointivaihe I ja vahvisti sen itsenäistä näytteistä vaiheessa II. Vaiheessa I, (A) AUC oli 0,831 (95% CI, +0,772-+0,880; herkkyys = 62,4%, spesifisyys = 92,9%) tapauksista; (B) 0,895 (95% CI, +0,822-+0,967; herkkyys = 77,8%, spesifisyys = 90,0%) alkuvaiheen tapaukset vastaan ​​kontrollit; ja (C) 0,814 (95% CI, 0,700-0,929; herkkyys = 68,4%, spesifisyys = 92,9%) ja alhainen CA-125 ( 35 U /ml) tapauksessa vastaan ​​kontrollit. Vaiheessa II, (D) AUC oli 0,813 (95% CI, +0,759-,860; herkkyys = 71,3%, spesifisyys = 82,0%) tapauksista vastaan ​​kontrollit; (E) 0,783 (95% CI, 0,699-0,853; herkkyys = 70,0%, spesifisyys = 82,0%) alkuvaiheen tapaukset vastaan ​​kontrollit; ja (F) 0,726 (95% CI, 0,634-0,805; herkkyys = 64,3%, spesifisyys = 72,0%) ja alhainen CA-125 ( 35 U /ml) tapauksessa vastaan ​​kontrollit.

kahden miRNA paneeli myös eron alkuvaiheen tapaukset (vaihe I) ja valvontaa, AUC on 0,895 (95% CI, +0,822-+0,967; herkkyys = 77,8%, spesifisyys = 90,0%, Fig. 3B). Vuonna validointivaiheen Asetin, noin 89,3% ja EOC potilaista oli CA-125 korkeus, toinen potilaita ei havaita CA-125. Diagnostinen tarkkuus miRNA paneelin arvioitiin mukaan CA-125 tasolla. Matalan CA-125 ( 35 U /ml) (n = 14, 10,7% kaikista tapauksista, taulukko 1) mukaan validointivaiheessa asetin, AUC miRNA paneelin oli 0,814 (95% CI, 0.700 on 0,929; herkkyys = 68,4%, spesifisyys = 92,9%, Fig. 3C).

Tarkistetaan mirna Panel validointivaiheessa II Set

kahden miRNA paneeli edelleen arvioitiin validointivaihetta II sarja 250 plasmanäytteistä (150 EOC potilasta ja 100 tervettä verrokkia). AUC miRNA paneelin oli 0,813 (95% CI, +0,759-0,860; herkkyys = 71,3%, spesifisyys = 82,0%, Fig. 3d) kaikissa validointivaihe II näytteitä. AUC oli 0,783 (95% CI, 0,699-0,853; herkkyys = 70,0%, spesifisyys = 82,0%, Fig. 3E) alkuvaiheen tapaukset (vaihe I) ja valvontaa, vastaavasti. Diagnostinen tarkkuus miRNA paneelin arvioitiin sitten mukaan CA-125 tasolla. Matalan CA-125 ( 35 U /ml) (n = 14, 9,3% tapauksista, taulukko 1) ja validointivaiheeseen II, AUC miRNA paneelin oli 0,726 (95% CI, +0,634-+0,805; herkkyys = 64,3%, spesifisyys = 72,0%, Fig. 3F).

plasma miRNA tasot ja Survival

edelleen selvittää plasma let-7f ja miR-205 tasot ennustavat ennusteen, suoritimme analyysin käyttöjärjestelmän ja PFS kaikille potilaille koulutuksesta ja validointi sarjoiksi. Kaplan-Meierin eloonjäämiskäyrien analyysi ei paljastanut yhdistyksen välillä let-7f tai miR-205 tasoilla ja OS (Fig. S2). Kuitenkin plasmassa pienempiä let-7f ilmentyminen korreloi merkitsevästi huono PFS kaikilla potilailla (

P

= 0,006, log-rank-testi) (Fig. 4A), erityisesti vaiheessa III ja IV tapauksissa (

P

= 0,002, log-rank-testi). Monimuuttujafunktiokehitettiin Coxin regressioanalyysi osoitti, että plasma let-7f oli merkittävä prognostinen indikaattori EOC PFS (HR = 2,07, 95% CI = 1,27-3,37) (taulukko 2).

(A) PFS analyysi kaikilla potilailla (n = 360) paljasti, että alhaisemmat plasmatasot let-7f liittyi huonoon ennusteeseen (

P

= 0,006). Stage-specific Kaplan-Meierin eloonjäämiskäyristä paljasti, että

P

arvoja log-rank-testi olivat 0,576 ja 0,002 vaiheissa I ja II (B) ja III ja IV (C), tässä järjestyksessä. Eloonjääntitulokset verrattiin käyttäen log-rank-testi, ja anna-7f ekspressiotasot potilailla määriteltiin korkea tai matala suhteessa mediaani. NP, ei etenemistä; P, eteneminen.

Mirna ilmentäminen EOC Tissue

määrittää, onko ilmaus miRNA plasmassa eri vaiheissa korreloi että matching tuumorikudoksissa. Tutkimme 11 merkittävää miRNA (miR-205, miR-200a, miR-184, miR-34a *, miR-141, miR-483-5p, miR-193B *, anna-7e *, miR-363 *, asennuspalveli- 98 ja anna-7 f) koulutuksen asetettu Hyväksytty kasvain kudosnäytteistä. Vertaileva analyysi paljasti, että kasvain ilmentymistä miR-483-5p, mutta ei anna-7f, oli vahvasti korreloi plasman lauseke (r = 0,541,

P

= 1,52 x 10

-4) (Fig. S3A). Olemme myös havainneet, että miR-483-5p ilmentyi suuremmilla tasoilla vaiheen III ja IV kasvain kudosten kuin vaiheessa I ja II (

P

= 0,048) (Kuva. S3B), sopusoinnussa plasmassa (

P

= 0,043) (Kuva. S3C). MiR-483-5p ilmentyi suuremmilla plasmassa edennyt pitkälle (vaihe III ja IV) kuin alkuvaiheessa (vaihe I ja II) (Fig. S3C). Mikään muu miRNA plasmassa korreloivat tasoilla kasvainkudoksissa.

Keskustelu

EOC Näistä suurin munasarjojen syöpäsairauksia. Koska löytö CA-125 vuonna 1981, lukuisat tutkimukset ovat dokumentoineet rooliaan diagnostinen ja toistuminen välineenä EOC potilailla [18], [19]. Noin 80% EOC potilaista on CA-125 korkeus. CA-125 on hyödyllinen seurannassa taudin arvioidaan terapian vasteen, ja havaitaan uusiutumisen [20], [21]. Kuitenkin se toimii huonosti havaitsemisessa alkuvaiheessa munasarjasyöpä kehityksen [22]. Diagnostisia markkereita munasarjasyövän tarvitaan seulontaa. Tällä hetkellä useat kiertävä miRNA on tunnistettu käytettäväksi eri syöpätyyppejä [13], [23], [24], [25]. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että let-7f ja miR-205 ovat erittäin lupaavia diagnostisina ja progressiivinen biologisten merkkiaineiden EOC.

Käyttämällä tiukkaa validointiprosessien ja logistinen regressiomalli, osoitimme, että let-7f- miR-205 miRNA paneeli oli erittäin tarkasti EOC diagnoosi, erityisesti potilailla, joilla on vaiheen I tauti. Tärkeää on, tämä levy voidaan käyttää alhaisen CA-125 potilasta tunnistamaan varhaisvaiheen EOC.

let-7 /miR-98 perhe yksi ensimmäisistä nisäkkäiden miRNA voidaan tunnistaa [26]. Anna-7 alunperin havaittiin sukkulamato

C. elegans

[27], ja ekspressiotasot monien let-7-perheen jäseniä on löydetty vähennettävä erilaisten syöpien [28], [29], [30], [31], [32]. Anna-7f on mukana fysiologisia ja patologisia prosesseja, mukaan lukien syövän syntymistä [33]. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että se toimii tuumorisuppressori moniin syöpiin, mukaan lukien munuaissolukarsinooma [34], papillaarinen kilpirauhassyövän [35], ja mahasyövän [36]. Let-7 miRNA perhe on selektiivisesti erittyy solunulkoiseen ympäristöön eksosomeiksi, mikä voi olla tärkeää syövän valvontaan. Väheneminen Let-7 solunulkoisessa ympäristössä, kuten plasmassa, voi siten luoda syöpää ja etäpesäkkeiden ympäristö. Tutkimuksessamme havaitsimme, että plasma let-7f voidaan käyttää EOC havaitseminen ja ennusteen biomarkkereiden. Verrattuna terveisiin kontrolleihin, munasarjasyöpä potilaat ovat pienemmät plasman let-7f. Vuonna EOC potilaille, nämä alemmat tasot olivat ennustaneet huonoon ennusteeseen.

MiR-205 on erittäin konservoitunut miRNA eri lajien, mukaan lukien ihmiset. MIR-200 perhe (miR-200a miR-200b, miR-200c, miR-141, ja miR-429) ja miR-205 usein vaimentua pitkälle syöpä [37]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että kohdistamalla transkriptiorepresso- E-kadheriinin, ZEB1 ja ZEB2, Mir-200 perhe on osallisena epiteelisolujen-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) ja kasvaimen invaasio [38]. Lisääntynyt ilmentyminen miR-205 on havaittu myös kohdun limakalvon adenokarsinooma [39], pään ja kaulan okasolusyöpä solulinjat [40], levyepiteelisyöpä keuhkosyöpä [41], ja munasarjasyöpä [37]. Sitä vastoin vähentää ilmentymistä miR-205 on raportoitu melanooma [42] ja syövät, ruokatorven [43], munuaisen [44], virtsarakon [45], [46], rintojen [47], ja eturauhasen [48] . MiR-205 voi toimia onkogeenin tai kasvainsuppressorigeenin, riippuen solujen yhteydessä. Tutkimuksessamme plasma miR-205 ilmentyi korkeammalla tasolla EOC potilailla kuin terveillä verrokeilla. Kuitenkin, ei ollut eroa miR-205 ilmentymisen välillä EOC kasvainkudoksissa ja viereisten terveiden kudosten.

häviäminen let-7 syövän tulokset taaksepäin alkionkehityksen ja erilaistamattomuuden [49], ja miR-205 on tunnistettu voimakas säätelijänä EMT [50]. Viimeaikaiset havainnot ovat kytketty let-7 kanssa kantasolujen ylläpitoon ja ehdottaa yhteys EMT ja kantasolujen muodostumista. Konversio epiteelin solun mesenkyymisolun avainasemassa sekä alkion kehitykseen syövän eteneminen ja metastaasit. Solut, joille EMT menettävät epiteelin morfologisiin ominaisuuksiin, järjestämään uudelleen solun tukirangan ja hankkia liikkuvia fenotyyppi läpi ylä- ja alas-säätely useita molekyylejä, kuten tiukka ja tarttuu liitoksen proteiineja ja mesenkymaalisten markkereita. Munasarjasyövän EMT, anna-7f ja miR-205 osallistuvat EMT prosessiin säätelemällä niiden kohdegeenien [49]. Verenkierrossa let-7f ja miR-205 voi olla heijastusta EMT prosessia; Näin ollen, on tärkeää tutkia niiden säätelijänä solunulkoiseen ympäristöön.

Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että kiertävän miRNA verinäytteistä peräisin kasvainkudoksista [14], tulehduksellinen pesäkkeitä [51], endoteelisolujen vauriot [52 ], ja normaali perifeerisen veren mononukleaarisia soluja ja verihiutaleita [53]. Tässä tutkimuksessa kartoitettiin munasarjasyöpä kudosten ja havaitsi, että miR-483-5p ilmentyminen korreloi plasmassa. Tämä tulos viittaa siihen, että tuumorista peräisin eksosomeiksi voi selittää pienen osan alkuperää plasman miRNA. Lisäksi korkeammat miR-483-5p ekspressio havaittiin pitkälle EOC kuin alussa EOC, sekä kasvainkudoksessa ja plasma. Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus todeta, että miR-483-5p voi liittyä munasarjojen syövän etenemisessä. Äskettäin seerumi miR-483-5p todettiin mahdollisena biomarkkerina havaitsemaan maksasyövän [54].

Yhteenvetona tunnistimme plasma let-7f ja miR-205 mahdollisina biomarkkereita munasarjasyöpä diagnosointiin, etenkin varhaiseksi havaitsemiseksi EOC. Anna-7f voi myös olla ennustetyövälineenä merkkiaine munasarjasyöpä. Kiertävä miRNA on todettu olevan vakaa, erityinen ja herkkä biomarkkerit. Perusteella tietomme, ehdotamme, että tiettyjä miRNA, jotka liittyvät verenkierrossa eksosomeiksi ovat varhainen markkereita munasarjasyöpä ja voidaan käyttää määrittämään vaiheessa ennusteen ja hoidon vasteen.

tukeminen Information

Kuva S1.

Diagnostic suorituskykyä miRNA. (EN) miRNA rakennettiin käyttäen logistinen regressiomalli. (B) tulokset ROC-analyysi osoitti, että miR-205 ja anna-7f paneeli syrjinyt tapausten ja kontrollien välillä. AUC-ROCS Mir-205, let-7, ja miRNA paneeli (miR-205 ja anna-7 f) erottamiselle tapauksissa ja valvonta olivat 0,780, 0,609 ja 0,831, tässä järjestyksessä. Paneeli oli AUC = 0,831 (95% CI: ,772-,880), joka parani merkittävästi verrattuna kahteen miRNA yksin (miR-205 [

P

0,001] ja anna-7f [

P

= 0,008]).

doi: 10,1371 /journal.pone.0077853.s001

(TIF) B Kuva S2.

PFS ja OS kaikkien potilaiden let-7f tai miR-205 tasolla. Kaplan-Meier selviytymisen käyrät paljasti, että matalan let-7f ilmentyminen liittyi PFS (

P

= 0,006, Kuva. A) mutta ei OS (

P

= 0,589, Kuva. B) . Ei ollut eroja miR-205 tason ja PFS (

P

= 0,969, C) tai OS (

P

= 0,576, D). Eloonjääntitulokset verrattiin käyttäen log-rank-testi, ja anna-7f tai miR-205 ekspressiotasot määriteltiin korkea tai matala suhteessa mediaani. NP, ei etenemistä;