Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

Kyky ennustaa vastauksia kemoterapiaa serous epiteelin munasarjasyöpä (EOC ) olisi arvokasta, koska luontaisesti solunsalpaajaresistentti EOC potilasta (jatkuva tai uusiutuva sairaus 6 kuukauden kuluessa) saavat vähän hyötyä tavanomaisen kemoterapian. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia seuloa ja tunnistaa erottuva biomarkkereita vesivatsanes- on vakavien EOC liittyy luontainen chemoresistance.

Methods

Proteiininäytteet Vesivatsanesteestä 12 chemosensitive ja 7 luonnostaan ​​solunsalpaajaresistentti serous EOC potilaat olivat analysoitiin käyttämällä kaksiulotteista fluoresenssin ero geelielektroforeesi (2-D DIGE) yhdistettynä matriisi laserdesorptio /ionisaatio-lentoaika-massaspektrometrialla (MALDI-TOF /TOF MS). Lisäksi tunnistetut proteiinit validoitu ELISA vesivatsanes- näytteissä 19 chemosensitive ja 9 luonnostaan ​​solunsalpaajaresistentti EOC potilailla.

Tulokset

määrä paikkoja havaittiin kaikissa 2-D DIGE geelit vaihtelivat 1523 -1711 käyttäen DeCyder ohjelma-analyysillä. Kolmekymmentä neljä täplät ilmentyvät eri perusteiden on keskimääräinen suhde yli 1,5 ja opiskelija t-testi

P

arvo 0,05. Sen jälkeen MALDI-TOF /TOF MS-analyysia 11 ilmentyvät eri proteiineja, mukaan lukien 3 säädelty ja 8 alassäädetty proteiineja, vesivatsanes- on solunsalpaajaresistentti kasvainten onnistuneesti tunnistettu. Neljästä valittu proteiineista (ceruloplasmin, apolipoproteiini A-IV, transtyretiini ja haptoglobiini) in askites testattiin ELISA: lla, vain keruloplasmiini oli läsnä merkittävästi eri tasojen solunsalpaajaresistentti ja chemosensitive askites näytteitä keskimääräiset pitoisuudet 192,2 mikrog /ml ja 157,5 mikrog /ml, vastaavasti (

P

= 0,001).

Johtopäätös

merkittävästi ajan säänneltyä tasoa ceruloplasmin että askitesnesteessä luontaisten solunsalpaajaresistentti vakavien EOC potilaiden ehdottaa potentiaaliaan ennustetyövälineenä biomarkkeri vastauksia kemoterapiaa. Tämä havainto kysyy lisätutkimuksia suuremmalla tutkimuksen voidakseen varmistaa kliininen hyöty ceruloplasmin.

Citation: Huang H, Li Y, Liu J, Zheng M, Feng Y, Hu K, et al. (2012) seulonta ja identifiointi biomarkkerit vesivatsanes- liittyvät luonnostaan ​​Chemoresistance of seroosit munasarjan epiteelin syövät. PLoS ONE 7 (12): e51256. doi: 10,1371 /journal.pone.0051256

Editor: Alexander James Roy Bishop, University of Texas Health Science Center at San Antonio, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 30 lokakuu 2012; Julkaistu: 10 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Huang et al. Tämä on open-yhteys artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä Lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Natural Science Foundation of Guangdong, Kiina (nro 7001535). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Platinum-pohjainen yhdistelmä kemoterapia on standardi ensilinjan hoitoon pitkälle munasarjan epiteelin karsinooma (EOC). Kasvaimet pidetään ”platina herkkä”, jos kliininen etenemisvapaan väli on yli 6 kuukautta, mutta noin 20%: sta 30%: lla potilaista edistymisen tai niiden kasvaimet nopeasti tullut vastustuskykyisiä tähän hoitoon [1]. Näillä potilailla, joilla luontainen chemoresistance joilla uudestaan ​​6 kuukauden sisällä saada vähän hyötyä tavanomaista hoitoa. On myös näyttöä siitä, että pidempi väli kunnes toistuminen, sitä parempi vaste myöhemmin kemoterapiaa [2]. Siksi chemoresistance munasarjojen syöpiä voi esiintyä alussa hoidon (luontainen resistenssi) tai voi kehittyä hoidon aikana (hankittu resistenssi).

Tällä hetkellä chemoresistance on EOC voidaan määrittää vasta jälkikäteen, kun potilaat ovat saaneet taakka ja myrkyllisyyttä tehoton hoito. Siksi tunnistaminen ominainen molekyyli biomarkkereiden liittyviä luontaisia ​​chemoresistance vuonna EOC voi johtaa yksilöllisesti terapeuttisia ja parantaminen tulosten jälkeen tavanomaisen kemoterapian ne saavat hyvin vähän hyötyä.

Useat viimeaikaiset tutkimukset ovat käyttäneet geeni microarray tunnistamaan erillisten geeniekspression in luontainen solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpä potilasta eri alustoilla, kuten nylon cDNA paneelit, Affymetrix sirut ja Agilent oligonukleotidigeenisirumenetelmää [3], [4]. Näissä tutkimuksissa on tunnistettu eri prognostisten ja ennustaja geenejä, jotka voivat erottaa varhain myöhään uusiutunut tai taudin etenemistä. Kuitenkin, transkription kohdegeenin kasvain voi olla hyvä ennustaja lääkeresistenssin ja ennusteeseen munasarjasyöpä. Esimerkiksi mRNA runsaus ei ehkä korreloi vastaavan proteiinin ilmentymistä ja toimintaa. Lisäksi joidenkin ensisijainen tai toistuvia munasarjasyöpä potilaille, kudosnäytteet eivät ole aina käytettävissä geenin profilointiin.

Toisin kuin muiden lantion /vatsan pahanlaatuinen etäpesäke, massiivinen askites ovat erottuva kliiniset oireet pitkälle EOC, joissa on enemmän kuin 80%: lla näistä potilaista, joilla on laajaa metastaasin herakalvopinnat ja niihin liittyvät vatsakalvon ja /tai Pleuraeffuusiot [5]. Kehon nesteet on osoitettu olevan erinomainen median biomarkkereiden löytö syövän, ja askitesneste sisältää pahanlaatuiset epiteelisolut ja aktivoitu mesoteelisolujen, joka voi tuottaa sytokiinejä, kasvutekijöitä ja invaasio edistävät liittyvät komponentit ja metastaasit [6]. Tämä neste on sen vuoksi secretome munasarjasyöpä solujen ja heijastaa muut microenvironmental tekijät maligniteetti.

Näin ollen, soveltamalla yhä edistää tekniikan proteomiikka analyysiin askites voi helpottaa löytö uusien biomarkkereiden, jotka ovat herkempiä ja yksityiskohtaisempia kuin tällä hetkellä saatavilla. Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää seuloa ja tunnistaa erottuva biomarkkereita vesivatsanes- munasarjasyövän liittyy luontainen chemoresistance kaksiulotteisella fluoresenssi ero geelielektroforeesilla (2D-DIGE) tekniikka, joka auttaisi tunnistamaan näiden potilaiden huonon ennusteen ja parantaa kliinistä tulos vaihtoehtoisiin hoitoihin.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimus hyväksyi eettinen komitea Sun Yat-sen University Cancer Center Institutional Review Board. Kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan.

Potilaille ja näytteiden valmistus

Kaikkiaan 19 askites näytteitä 2D-DIGE ja 28 tapausta askitesta ELISA validointi kerättiin aikana helmikuu . 1, 2009 31 joulukuu 2010 alkaen ehjä serous EOC potilailla, joille tehtiin tyydyttävä sytoreduktiivisen leikkausta. Naiset, joilla on aiemmin syövän historia ja saavien neoadjuvanttikemoterapian suljettiin pois. Sytoreduktiivisen Leikkaus suoritettiin kautta vatsan keskiviivan viilto. Näytteitä 5 ml askites saatiin ja säilytettiin 80 ° C: ssa nestemäisessä typessä ennen koko kohdunpoisto, kahdenväliset salpingo munasarjan poisto, omentectomy ja resektio kaikki näkyvä ja konkreettista tilaa vieviä kasvain ja imusolmukkeiden, mukaan National Kattava Cancer Network (NCCN) ohjeet . Tietoa hoidon ja vaste saatiin potilaan kaavio tarkastelu.

Kun debulking potilaat saivat kuusi sykliä platinapohjaisen yhdistelmä kemoterapiaa. Kemoterapia huumeita mukana paklitakseli (135-175 mg /m

2), karboplatiini (pinta-ala käyrän [AUC] 5-6), doxepaclitaxel (70 mg /m

2) ja sisplatiinia (65-75 mg /m

2). Perustuen NCCN suuntaviivoja, luonnostaan ​​solunsalpaajaresistentti kasvaimet määriteltiin ne, joilla jatkuva tai uusiutuva sairaus 6 kuukauden kuluttua aloittamisesta ensilinjan platinapohjaisen yhdistelmä kemoterapiaa. Chemosensitive kasvaimet luokitellaan ne, joilla on täydellinen vaste kemoterapiaa ja platina-vapaa väli 6 kuukautta.

Askites sentrifugoitiin 2000 rpm: llä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa erottaa neste solukomponenttien . Suspensio sonikoitiin, ja roskat sentrifugoitiin 14000 rpm: ssä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti suspendoitiin uudelleen ja pestiin kolme kertaa jääkylmässä Tris-puskuroitua sakkaroosiliuosta (10 mM Tris, 250 mM sakkaroosi, pH 7,0), ja sitten kaavitaan ja hajotettiin jääkylmässä lyysipuskuria (30 mM Tris-HCI: a, 7 M ureaa , 2 M tioureaa, 4% paino /tilavuus CHAPS, pH 8,5).

Askites näytteitä käsiteltiin käyttäen ProteoPrep Blue albumiini väheneminen Kit (Sigma, St. Louis, MO, USA), joka poistaa selektiivisesti albumiini ja IgG mukaan valmistajan ohjeiden. Proteiinin puhdistamiseksi uuttamalla ja ratkaisee lopullisen proteiinipitoisuus, 2-D Clean-up Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) ja 2-D Quant Kit (GE Healthcare) käytettiin peräkkäin.

Tutkimuksen suunnittelu ja Protein Sample leimaaminen CyDye

Kaksitoista chemosensitve näytteet jaetaan tasan kahteen alaryhmään kuusi näytettä kutakin, ja seitsemän chemoresistance näytteet samoin jaettu kahteen alaryhmään neljällä tai kolmen näytteen kukin. Yhtä suuret määrät proteiinia näytteiden samassa alaryhmässä sekoitettiin ja jaettu neljään yhtä suureen (50 ug kutakin). Kaksi chemosensitive proteiinin näyte-erien leimattiin Cy3: lla, ja kaksi solunsalpaajaresistentti näytealikvoottien leimattiin Cy5: llä. Loput kaksi chemosensitive Sitten näytteet leimattu Cy5: llä ja kahden muun solunsalpaajaresistentti näytteitä Cy3. Näyte, joka koostuu yhtä suuret määrät kaikista näytteistä käytettiin yhdistetään sisäisen standardin (50 ug) ja leimattiin 200 pmol Cy2. Siksi yksi chemosensitive potilas allas (Cy3 tai Cy5), yksi solunsalpaajaresistentti potilas allas (Cy5 tai Cy3) ja yksi sisäinen standardi (Cy 2) ajettiin kussakin geeli, neljä geelit yhteensä perustuu meidän suunnittelu. Tämä väriaine vaihtamalla strategia hyväksyttiin välttää väriaine bias ja mahdollisti tasaisen jakautumisen Cy väriaineiden molemmissa potilasryhmissä.

Proteiini merkintöjä suoritettiin CyDye DIGE fluoresoivia (GE Healthcare) kuvatun Ettan DIGE käyttöopas. Lyhyesti, sen jälkeen, kun inkubointi jäällä 30 min ajan pimeässä, 1 ml 10 mM lysiiniä lisättiin reaktion pysäyttämiseksi. Kunkin geelin, Cy2-, Cy3- ja Cy5-leimatut proteiinit (50 ug kutakin) sekoitettiin ja säädettiin 450 ul: ksi nesteytys-puskuria [7 M urea, 2 M tioureaa, 4% (w /v) CHAPS, 40 mM DTT , 1% IPG-puskuria (pH 4-7), 0,002% (w /v) bromifenolisinistä].

2D-DIGE

. Uudelleenhydratoinnin jälkeen, leimatun proteiinin seoksen kunkin geelin levitetty Immobiline DryStrip (24 cm, pH 4-7, GE Healthcare). Isoelektrinen fokusointi (IEF) suoritettiin jossa Ettan IPGphor II laite (GE Healthcare) seuraavasti: 30 V 12 tuntia, 500 V 1 tunti, 1000 V 1 tunti ja 10000 V jopa yhteensä 85000 voltin tuntia . Jälkeen IEF, proteiinit vähennetään ja alkyloitu peräkkäisten 15 min hoitoja tasapainotuspuskurilla, joka sisältää 2% (w /v) DTT, ja sen jälkeen 2,5% (w /v) jodiasetamidia. Sitten proteiinit ratkaistiin 12,5% SDS-PAGE-geeleillä käyttäen Ettan DALTsix väline (GE Healthcare). Helpottaakseen MS-analyysia leimaamatonta allas proteiininäytteestä (500 ug) ajettiin rinnakkain preparatiivisessa geelillä ja värjättiin Deep Purple Total Protein Stain (GE Healthcare) mukaan valmistajan ohjeiden.

Gel Image hankinta ja analyysi

Gel kuvat hankittiin Typhoon 9400 skanneri (Amersham Biosciences) ja analysoitiin käyttäen DeCyder Software (V6.0, GE Healthcare) kuten aiemmin on kuvattu [7]. Cy2, Cy3 ja Cy5 signaalit erikseen kuvattiin heräte /emissioaallonpituuksilla 488/520, 532/580 ja 633/670 nm. Preparatiivinen geelit (Deep Purple Total Protein Stain) skannattiin eksitaatio /emissio aallonpituuksilla 532/560 nm mukaan käyttäjän käsikirja. Proteiinit chemosensitive askites näytteitä verrattiin in solunsalpaajaresistentti niistä. Nousut ja laskut ovat proteiinin runsaasti yli 1,5-kertaisesti (t-testi ja ANOVA,

P

0,01) katsottiin merkittäviä muutoksia. Vastaavat proteiinitäplien valittiin värjätty preparatiivisessa geeli spot poiminta.

Protein Spot Handling

Valittu proteiini paikoista preparatiivisessa geelit automaattisesti poimittiin ja käsiteltävän Ettan Spot Handling Workstation ( GE Healthcare). Valitun proteiinin täplät pestiin 15 mM ammoniumbikarbonaattia ja 50% metanolia, ja sitten hajotettiin 0,02 ug /ml sekvenssointilaatua trypsiini-liuosta (Promega, Madison, WI, USA) 37 ° C: ssa 2 tuntia. Trypsiinikartta peptidit uutettiin 50% (v /v) asetonitriiliä (ACN), ja 0,5% (v /v) trifluorietikkahappoa (TFA), liuotettiin 5 mg /ml R-syaani-4-hydroksikanelihappo (Amersham Bioscience) in 50% (v /v) ACN ja 0,1% (v /v) TFA ja sitten laikullinen MS näytelevyn.

Matrix laserdesorptio /ionisaatio Time-of-lennon spektrometria (MALDI-TOF /TOF MS) analyysi

proteiini tunnistus suoritettiin ABI 4800 proteomiikka MALDI-TOF /TOF Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) positiivisionisella heijastin tilassa. Monoisotooppinen huippu massat ostettiin eri 900-4,000 Da joiden signaali-kohinasuhde (S /N) 200. Trypsiini autolyyttistä peptidien massojen 842,5 ja 2211,1 käytettiin sisäisinä standardeina. Viisi voimakkain ioni signaalit valitaan automaattisesti esiasteita MS /MS hankinta ilman trypsiiniä autolyysin huiput ja matriisi ioni signaaleja. Peptidi massa sormenjälki (PMF) yhdistetty MS /MS-spektrit etsittiin vastaan ​​NCBInr tietokannan avulla GPS Explorer ™ -ohjelmistoa (versio 3.6, Applied Biosystems) ja MASCOT versio 2.1 (Matrix Science). Haku parametrit asetetaan seuraavasti:

Homo sapiens

, trypsiinipilkkomiskohdan (yksi jäi pilkkominen sallittu), carbamidomethylation kiinteiksi muutos, metioniinin hapetus muuttuvina muutos, peptidi massa toleranssi säädetty 75 ppm ja fragmentti toleranssi asetettu 0.2 da. Merkittävästi korkeat MASCOT pisteet, joka johti luottavainen väli (CI) on suurempi kuin 95% varten PMF tai MS /MS-tiedot paikalla pidettiin uskottavasti tunnistettu proteiini. Muut kriteerit sisältyi vähintään neljä peptidien osumia PMF data-pohjainen tunnistaminen ja ainakin kaksi peptidejä, joissa erillistä tunnistetun MS /MS-analyysi.

ELISA Validation

Askites näytettä (5 ml ) sentrifugoitiin 2000 rpm: llä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa erottaa nesteen solu- komponenteista. Suspensio sonikoitiin, ja roskat sentrifugoitiin 14000 rpm: ssä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti suspendoitiin uudelleen ja varastoitiin -80 ° C: ssa.

ELISA-määritys sarjoja kunkin analyyttien valittiin lisäanalyysiin hankittiin Abcam. Nämä analyyttien olivat seuraavat: apolipoproteiini A-IV (Apo-AIV), keruloplasmiini, transtyretiini ja haptoglobiini. Määritykset suoritettiin ohjeiden mukaisesti sarjasta. Lyhyesti, värin muutos johtuu entsyymi-substraatti-reaktio kuhunkin kuoppaan mikrotiitterilevyllä mitattiin spektrofotometrisesti aallonpituudella 450 nm. Pitoisuus Kunkin testatun proteiinin näytteessä määritettiin sitten vertaamalla optinen tiheys (OD) kuin standardikäyrän.

Studentin t-testi suoritettiin vertaamaan eroja seerumin proteiinin arvoja. SPSS 16.0 ohjelmistopaketti (SPSS, Chicago, IL, USA) käytettiin johtamaan tilastollisten analyysien ja kaksisuuntaista

P

arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

tulokset

Kliininen Potilastiedot

Yhdeksäntoista askites näytteitä vakavien EOC potilaista analysoitiin 2D-DIGE seuloa mahdollisten biomarkkerit liittyy ero vastauksia kemoterapiaa. Näytteitä erillisestä kohortin 28 potilasta, joilla vakavien EOC käytettiin validointi 2D-DIGE tuloksia ELISA. Kaikki potilaat olivat saaneet tyydyttävää sytoreduktiivisen leikkausta. Ei ollut merkittäviä eroja ikä diagnoosin, kasvaimen erilaistumiseen ja International Federation of Gynecology and Obstetrics (FIGO) pysähdyspaikan välillä potilaista chemosensitive ja solunsalpaajaresistentti ryhmiä. Demografiset ja kliiniset piirteet tapauksista on esitetty taulukossa 1.

Lisäksi eloonjäämisluvut että 28 potilasta testattiin ELISA: lla verrattiin mukaan erilaiset vastaukset kemoterapiaa. Maaliskuuhun 2012 neljä yhdeksästä potilaasta (44,4%) vuonna solunsalpaajaresistentti ryhmässä ja kolme yhdeksäntoista potilasta (15,8%) oli kuollut kemosensitiivisyys ryhmässä. Keskimääräinen elinaika oli yhdeksän solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpä potilasta tutkimuksessamme oli 18,9 kuukautta. Kuitenkin pidempi seurannan tarvittiin määrittämään tarkan mediaanielossaolosta chemosensitive potilaiden, mikä oli enemmän kuin 18,9 kuukautta. Perustuen Tarkastelujakso tässä tutkimuksessa, ero selviytymisen ryhmien välillä havaittuna käyttämällä Kaplan-Meier oli merkitsevä (

P

= 0,007), jolla suositaan niitä, joilla parempia vastauksia kemoterapiaa (Fig. 1) .

merkittävä ero (

P

= 0,007) havaittiin eloonjäämisen, joka suosi potilaille, joilla chemosensitive kasvaimia.

2D-DIGE analyysi ja MS /MS Tunnistaminen

Saamiemme koesuunnitelma on kuvattu Materiaalit ja menetelmät, neljä 2D-DIGE geelit yhteensä oli perustettu Proteomiikan analyysi solunsalpaajaresistentti versus solunsalpaajaresistentti potilaan askites. Jokaista geeli sulautuneen kuva muodostettiin kolme kuvia chemosensitive, solunsalpaajaresistentti ja sisäisen standardin näytteitä. Edustava DIGE geelistä, jossa päällekkäin on Cy2, Cy3 ja Cy5 leimattu kuvia on esitetty kuviossa 2.

Edustaja 2D-DIGE kuva (yhdistetyn kuvan), jotka osoittavat proteiinin profiilia Askites of chemosensitive ja solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpä potilaat leimattu Cy5: llä (punaiset täplät) ja Cy3 (vihreä täplät), tässä järjestyksessä, jossa sisäistä standardia merkitty Cy 2. IPG nauhat (24 cm, pH 4-7) käytettiin IEF ennen standardi SDS-PAGE (12,5% polyakryyliamidi) toisen ulottuvuuden. Moolimassa-alueen pysty- mitta on noin 150-10 kD. Proteiinit tunnistettiin ilmentyvät eri on merkitty keltaisella nuolia määritetty numeroita DeCyder analyysiin. Numerot kuvassa vastaavat esitetään taulukossa 2; (Alhaalla) MALDI-TOF-MS massaspektri spot 1543 tunnistettu ceruloplasmin mukaan sovitettuun huiput.

Yhteensä 1523-1711 täplät havaittiin eri Differential In-geeli Analysis (DIA) työtilat kaikissa geelit käyttävät DeCyder ohjelmistoa. Vuonna biologinen vaihtelu Analysis (BVA) moduuli, Cy3 kuva geelistä numero neljä valittiin päällikön geeli, koska sillä oli maksimimäärä paikkoja. Kolmekymmentä Neljälle havaittiin ekspressoitua eri perusteiden ja jonka keskimääräinen suhde on yli 1,5 tai alle -1.5 ja opiskelija t-testi

P

arvo 0,05. Niistä 14 täplät todettiin alas säännellä solunsalpaajaresistentti askites, ja 27 oli säädelty verrattuna chemosensitive potilaille.

Jotkut ero paikoista havaita DeCyder ohjelmistoa ei voitu visualisoida preparatiivinen geeli värjättiin kolloidisella Coomassie johtuu todennäköisesti vähäistä. Sen jälkeen visuaalinen tarkastelu, 20 proteiinitäplien osoittaa korkea runsautta ja merkittävästi muuttunut ilmentyminen solunsalpaajaresistentti versus chemosensitive potilasta valittiin MALDI-TOF /TOF MS-analyysi. Kaikkiaan 11 eri tavoin ilmaistuna proteiineja, mukaan lukien 3 säädelty ja 8 alassäädetty proteiineja, vesivatsanes- on solunsalpaajaresistentti kasvainten verrattuna chemosensitive kasvaimia onnistuneesti tunnistettu. Peptidi lasken tunnistetuista proteiineista vaihdellut 4 33. kertamuutoksia tasoja 11 tunnistettu proteiineja kahteen ryhmään yhdessä yksityiskohtaisen Mascot hakutulokset annetaan taulukossa 2.

Useita proteiineja havaittiin useita paikkoja. Esimerkiksi huomasi 1421, 1593, ja 1598 ovat kukin tunnistettu transtyretiini-proteiini, joka on kuljetus- ja akuutin vaiheen proteiini, tai sen variantteja. Samoin täplät 1614 ja 1626 tunnistettiin haptoglobiini, kun taas täplät 1536 ja 1543 määritettiin olevan ceruloplasmin ja sen proteolyyttinen fragmentti. Tunnistetut proteiinit ovat osallisena neljässä eri osa solujen toimintaa ja liittyvät kasvaimen etenemiseen ja etäpesäkkeiden (yksi tukirangan proteiini, kolme energia /rasva-aineenvaihdunnan proteiineja, kolme kantajaproteiinit ja neljän akuutin vaiheen proteiineja).

ELISA validointi Apo-AIV, keruloplasmiini, transtyretiini ja haptoglobiini

validoimiseksi tulosten Proteomiikan analyysissa määritetään tasot neljän proteiinien kuten Apo-AIV, keruloplasmiini, transtyretiini ja haptoglobiini vesivatsanes- näytteissä 19 chemosensitive ja 9 luonnostaan ​​solunsalpaajaresistentti EOC potilaita ELISA. Perustuen edelliseen proteomic profiilit ja harkitsee meidän tarkoitus seulonnan ainutlaatuinen biomarkkereiden että askites, tukirangan proteiini (ACTB) jätettiin pois analyysin.

ELISA Tulokset vahvistivat meidän MALDI-TOF /TOF MS havainnot siitä, että taso of ceruloplasmin oli huomattavasti korkeampi solunsalpaajaresistentti kuin chemosensitive askites. Keskimääräinen pitoisuus ceruloplasmin oli 157,5 mikrog /ml chemosensitive ryhmässä ja 192,2 ug /ml solunsalpaajaresistentti ryhmässä (

P

= 0,001), kun taas tasot Apo-AIV, transtyretiini ja haptoglobiini eivät olleet merkittävästi erilaiset näiden kahden ryhmän välillä. Nämä tulokset on esitetty yhteenvetona taulukossa 3.

Keskustelu

ennustetta munasarjasyöpä tiedetään olevan voimakkaasti yhteydessä pituus platinaa väliajan ensisijaisesta ensilinjan platina-pohjainen yhdistelmä kemoterapiaa taudin uusiutumiseen. Mitä pidempi väli kestää, sitä parempi vaste myöhemmin kemoterapiaa [8]. Siten tavanomaisen kemoterapian on suurelta osin ei-hyödyllistä luonnostaan ​​solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpä potilaille (joilla on jatkuva tai uusiutuva sairaus 6 kuukauden kuluessa). Kyky ennustaa vastaus tavanomaisen kemoterapian näillä potilailla olisi erittäin arvokas mahdollistaa varhaista käyttöä yksilöllisten terapeuttisten auttaa pidentää elinaikaa ja välttämään tarpeetonta sivuvaikutuksia tehottomia hoitoja.

Olemme todenneet, että monet pitkälle munasarjasyöpä potilailla esiintyy nopea kasvu vatsaonteloon kasvainten yhdessä vatsan turvotus seurauksena kertyminen askitesneste vatsaontelossa. Mekanistisesti, askites muodostuminen tapahtuu pahanlaatuiset solut erittävät proteiineja, kasvutekijöiden ja sytokiinien, jotka aiheuttavat uudissuonittumista, angiogeneesi, lisääntynyt nesteen suodatus- ja /tai imunestejärjestelmän tukos, jolloin kertyminen seerumia, kuten nesteen sisällä vatsan [9], [10]. Rikas väliaine tukee pahanlaatuisten solujen proliferaatiota ja edelleen etäispesäkkeitä puuttumisesta huolimatta matriisin kasvualustojen, jolloin nämä solut voittaa apoptoosiin liittyy menetys kiinnitys. Tämä tarkoittaa, että pahanlaatuisia soluja ja mesoteelisolujen vesivatsanes- säätää ylös eloonjääntisignaaleja jotta sinnikkäästi hypoksinen mutta muuten rikas neste miljöö [11]. Siten Askites on erinomainen säiliö tunnistamiseksi hyödyllisiä syövän biomarkkereita, erityisesti EOC potilailla [12].

Eräässä tutkimuksessa Kislinger ryhmä, askites erotettiin solujen ja neste jakeet, jota seuraa massaspektrometria analyysi kunkin fraktion [13]. Vaikka yli 2500 proteiinien askites havaittiin vain 229 proteiinit löydettiin nestefraktio. Sen jälkeen integroitu laskennallinen analyysi askites proteomiin yhdistettynä proteomic tietoja ihmisen plasmasta ja virtsasta microarray tietomääriä ja proteiini-proteiini vuorovaikutus Database I2D, 80 ehdokasta serologinen munasarjasyöpä biomarkkereita valittiin lisävalidointia. Kuk ja työtovereiden myös suorittaa proteomiikka analyysi askitesnesteen perustuu useisiin erottaminen ja fraktiointitekniikalla [14]. Kaikkiaan 52 proteiinien valittiin 445 ainutlaatuista proteiineja askitesnesteessä kuin hyviä ehdokkaita munasarjasyövän biomarkkereita tulevaisuudessa tutkimuksiin. Nämä kirjoittajat kaikki löydetyt proteomiikka-analyysi on merkittävä resurssi munasarjasyöpä tutkimus- ja puitteet biomarkkereiden löytö.

Tietääksemme proteomic tutkimukset munasarjasyövän Askites ovat rajalliset, ja vertailevan tutkimuksen luontainen solunsalpaajaresistentti ja chemosensitive munasarjasyövän Vesivatsanesteestä DIGE tekniikka ei ole aikaisemmin raportoitu. Havainnot Tutkimuksemme voi auttaa ennustaminen terapeuttisen vaikutuksen ja taudin ennusteen munasarjasyöpä potilaille. Ensimmäinen tavoite oli löytää ainutlaatuinen biomarkkereiden juuri askitesnesteestä eikä solussa sekoitus kuin Kislinger tutkimuksessa [13]. Niinpä erotti nestefraktioon solun komponentteja 2D-DIGE sentrifugoimalla. Biomarkkereina voivat olla läsnä pieninä pitoisuuksina kehon nesteiden kuten seerumin ja askites, yksi suuri haaste suorittamaan perusteellisen analyysin proteomeja massaspektrometrialla on läsnäolo erittäin runsaasti proteiineja, kuten albumiini ja immunoglobuliinit, jotka muodostavat 65-97% seerumiproteiinien [15]. Nämä runsas proteiineja rajoittaa ionisaatio tehokkuus aikana MS-analyysia estää tunnistamisen vähäisessä määrin proteiineihin. Siksi heikentävien erittäin runsas proteiineja käyttämällä 2D-siivota kit oli välttämätöntä ennen analyysimme toteamiseksi nöyrä runsas biomarkkereita.

Tutkimuksessamme yhteensä 11 eri tavoin proteiinien tunnistettiin välillä chemosensitive ja solunsalpaajaresistentti munasarjasyöpä askites. Se ei ollut odottamatonta, että jotkut proteiinit havaittiin useita paikkoja, koska monet proteiinit Askites tiedetään esiintyvän isoformeina. Esimerkiksi haptoglobiini ja transtyretiini edustivat kaksi ja kolme sijaa, vastaavasti, ja molemmissa tapauksissa, yksittäiset täplät samalla alassäädetty. Lisäksi samaa proteiinia on läsnä useissa eri paikoissa olisi voinut olla biologisesti relevantteja muutoksia tai proteolyyttisiä fragmentteja (esim keruloplasmiini).

muutos pitoisuus seerumissa ceruloplasmin, monien muiden akuutin vaiheen proteiinit tunnistettu keskuudessa differentiaalisesti ilmennettyjen proteiinien, sekaantunut läsnäolo immuuni- ja inflammatoristen vasteiden aiheutti kasvaimen. Tulokset eivät olleet odottamattomia, koska eri tulehduksen välittäjäaineita, jotka pelata erilaisia ​​rooleja, kuten angiogeneesin, invaasio, autokriinisen kasvun silmukoita ja kestävyys apoptoosin, ovat koholla munasarjasyöpäpotilailla [16]. Monet akuutin vaiheen proteiineja, kuten haptoglobiini ja transtyretiini on myös viime aikoina luonnehdittu munasarjasyövän biomarkkereita varhaista havaitsemista [17]. Lisäksi aikaisemmassa geeni profilointi tutkimuksessa Bachvarov ja työtovereiden totesi, että alassäädetty geenien chemosensitive serous EOC kasvaimia sisältyy lukuisia geenien rasva-aineenvaihduntaan ja liikenne, tulehdus sekä geenien tiedetään lisäävän taudin etenemiseen ja invaasio [18]. Nämä havainnot sekaantunut akuutin vaiheen proteiineja ehdokkaaksi biomarkkereita kohteisiin lisätutkimuksia varten.

keruloplasmiini, plasma glykoproteiini, joka kuljettaa kupari koko kehon, oli ainoa proteiinin varmistettiin ELISA nykyisessä tutkimuksessa on differentiaalisesti ilmaistava askites välillä solunsalpaajaresistentti ja chemosensitive tutkimuspotilaat. Mielenkiintoista on, että korkea seerumin ceruloplasmin on osoitettu erilaisissa syövissä, kuten kilpirauhasen, eturauhas- ja paksusuolen syöpä [19], ja mikrosiruanalyysillä on liitetty tämän geenin kasvaimen invaasion ja metastaasin rintasyövän [20]. Altered seerumin ceruloplasmin tasot hoidon jälkeen (kemoterapiaa tai sädehoitoa) on havaittu monilla potilailla, joilla on maligniteetti, kuten kurkunpään, kohdunkaulan ja rintasyöpiä. Ilmeisesti, merkittävämpi lasku seerumin ceruloplasmin tasoa käsittelyn jälkeen liittyy parempi hoitovaste, koska nämä muutokset voivat vaikuttaa sairauden lopputulokseen [21], [22]. Nämä aiemmat havainnot tukevat päätelmää, että pitoisuus ceruloplasmin oli merkitsevästi pienempi askitekseen nesteissä chemosensitive munasarjasyöpä potilaille.

teht ceruloplasmin on ehdotettu syöpään liittyvien prosessien, kuten angiogeneesi ja uudissuonittuminen. Proteiini toimii myös surrogaattimarkkerina koko kehon kuparia. Siksi alemman seerumin ceruloplasmin tasolla meidän tutkimus saattaa olla toissijaista puute kokonaispuhdistumassa kuparin liittyvät tuumorisuppressiogeeneksi. Eräässä tutkimuksessa Cox et al., Tetrathiomolybdate (TM), kupari kelaattorin käytettiin vähentää kehon myymälöissä kuparin hiirimallissa pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (SCC) perustetun käyttäen erittäin aggressiivista SCC VII /SF solulinja [23]. Tutkijat havaitsivat, että kun koko kehon kuparin väheni TM, seerumin keruloplasmiini taso pienentää vastaavasti, jossa lähtötasoon laskemassa by28%. Kuten suppressoi merkittävästi tasoilla sekä kasvua SCC ja kasvaimen verisuonitus havaittiin, niiden tulokset viittaavat siihen, mahdollisen tehon TM syöpien kautta vaikutuksia angiogeneesiin ja uudissuonittumiseen. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin faasin II tutkimuksessa edenneen munuaissyövän syöpäpotilaiden jossa anti-kasvain vaikutuksia TM (vähentynyt verisuonitus ja syöpäkasvain) liittyi pienempi seerumin kuparin ja ceruloplasmin tasolla [24].

Näin muutos seerumipitoisuus ceruloplasmin voi osoittaa, että se on akuutin vaiheen proteiini erittyy vasteena oksidatiivisen stressin tulehdus liittyy kasvaimen ja /tai että se on toissijainen puute koko kehon kuparia. Meidän analyysi perustuu ensisijaisesti serous EOC tuumoreihin sekoitettu histotypes ovariokasvainten tai toistuva ja etäpesäkkeitä. Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportoitu proteomiikka-analyysi 2D-DIGE analyysi askites potilaista, joilla on luontainen solunsalpaajaresistenttiä ja chemosensitive munasarjasyöpä. Lisäksi tulokset voivat auttaa ennustamaan terapeuttisen vaikutuksen ja antaa sairauden ennustetta sekä uusia vihjeitä osaksi mekanismia chemoresistance munasarjasyövän hoitoon. On kuitenkin olemassa mahdollisia harhat tutkimuksessamme. Kuten edellä mainittiin, ilmaus ceruloplasmin voi liittyä syövän etenemiseen. Siksi korkean keruloplasmiini tason vesivatsanes- tutkimuksessamme voi johtua suhteellisen pitkällä tuumorietäpesäke liittyy huonompi ennuste. Lisäksi harhat voivat johtua seerumin komponenttien askitesnesteessä tai jopa meidän syrjäytyminen askites näytteiden sekoitettu verta johtuen kasvaimen verenvuoto.

Tutkimuksessamme potilaiden määrä rajoitti pituutta