Krooninen sairaus

tiivistelmä

tunnustetaan yhä yleisemmin, että kasvain microenvironment on keskeisessä asemassa aloittamisen ja etenemisen keuhkosyöpään. Erityisesti vuorovaikutus syöpäsolujen, makrofagit, ja tulehdusreaktion kasvaimen mikroympäristössä on osoitettu helpottavan syöpäsolujen invaasiota ja etäpesäkkeiden. Erityinen molekyyli solukuolemaan että immunoedit kasvaimen kasvu ei ole määritelty. Liipaisu reseptori ilmentyy ydinsoluissa 1 (TREM-1) on jäsen Super immunoglobuliini perhe ilmaistaan ​​valitse ryhmä myeloidisolujen pääasiassa monosyytti /makrofageja. Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että ilmentyminen TREM-1 kasvaimissa voi ennustaa syövän aggressiivisuuteen ja sairauksien seurauksia, maksassa ja keuhkosyövän kuitenkin mekanismi TREM-1 ilmentymisen asettamista syöpä ei ole määritelty. Tässä tutkimuksessa osoitetaan, että kasvain kudosta joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä osoittavat lisääntynyttä ilmentymistä TREM-1 ja PGE

2. Immunohistokemia ja immunofluoresenssilla vahvisti, että ilmaus TREM-1 valikoivasti nähtävissä CD68 positiivinen makrofageissa. Käyttävät

in vitro

mallissa vahvistimme, että ilmentyminen TREM-1 on lisääntynyt makrofagien, jotka ovat viljeltiin yhdessä ihmisen keuhko- syöpäsoluja. Tutkimukset COX-2-estäjät ja siCOX-2 osoitti, että ilmentyminen TREM-1 makrofageissa kasvaimen mikroympäristössä riippuu COX-2 signalointi. Nämä tutkimukset ensimmäistä kertaa määritellä yhteys kasvaimen COX-2 induktio, PGE

2 tuotantoa ja ilmentymistä TREM-1 makrofageissa kasvaimen mikroympäristössä ja viittaavat siihen, että TREM-1 saattaa olla uusi kohde kasvainten immunomodulaatiossa.

Citation: Yuan Z, Mehta HJ, Mohammed K, Nasreen N, Roman R, Brantly M, et al. (2014) TREM-1 indusoituu Kasvain Associated makrofagien Syklo-oksigenaasi Pathway in Human ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 9 (5): e94241. doi: 10,1371 /journal.pone.0094241

Editor: Fabrizio Mattei, Instituto Superiore di Sanità, Italia

vastaanotettu: 04 syyskuu 2013; Hyväksytty: 14 maaliskuu 2014; Julkaistu: 19. toukokuuta 2014

Copyright: © 2014 Yuan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat veteraaniviraston (MR RTS). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi tappavimmista syövistä maailmanlaajuisesti. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) osuus on yli 80% kaikista keuhkosyövässä. Keskimäärin 5 vuoden eloonjäämisaste NSCLC on noin 15% [1]. Vaikka merkittävää edistystä on tehty hoitomuotojen, alhainen eloonjäämisaste ja huonon ennusteen potilailla keuhkosyöpä osoittaa tarvetta kehittää uusia hoitovaihtoehtoja tämän tuhoisan sairauden [2]. Tuloksena on jatkunut pyrkimys määritellä mahdollisia polkuja, jotka ajavat tumorgenesis keuhkosyövässä kanssa toivoa kehittää vaihtoehtoisia ja /tai lisähoitoihin keuhkosyöpä.

tunnustetaan yhä yleisemmin, että kasvain microenvironment keskeisessä asemassa taudin alkamisen ja etenemisen keuhkosyöpään. Kasvain kehitys riippuu tekijöistä mikroympäristössä; vuorovaikutukset pahanlaatuisten solujen, stroomasolut, solunulkoinen matriisi komponentteja, erilaisia ​​tulehdussolujen, ja erilaisia ​​liukoisten välittäjäaineiden edistää kasvaimen kehittymisen ja etenemisen [3] [4] [5] [6]. Makrofaagien kasvaimet ovat yleensä kutsutaan kasvaimeen liittyviä makrofagit (TAM) ja niiden läsnäolo voi olla huomattava (60% tuumorin strooman). Tunnusmerkki makrofagien on heidän plastisuus, kykyä joko tuen tai taistella kasvaimia riippuen kasvaimen ympäristö, joka on antanut heille maineen kaksiteräinen miekka tuumoribiologiassa [7] [8] [9] [10] [ ,,,0],11] [12]. On kertynyt todisteita siitä, että syöpäsolut voivat rekrytoida ja horjuttaa makrofagien toimia aktiivisena yhteistyökumppaneita niiden neoplastisten ohjelmassa. Jatkuva makrofagien aktivoituminen aiheuttaa paikallisia krooninen tulehdus, sytokiinien ja kemokiinien, joka edistää tuumorigeneesiä [3] [4] [6] [9] [13] [14]. Kuitenkin molekyylitason mekanismeja, joiden kasvaimet aktivoivat makrofageja edistää kasvaimen kasvua ei ole määritelty.

TREM proteiineja (Liipaisu reseptorit ilmentyvät myeloidisoluissa) on perhe immunoglobuliinin solun pinnan reseptoreihin ilmaistuna myeloidisoluissa [15]. TREM perhe proteiinin reseptorien koostuu TREM-1, TREM-2, TREM-3 (hiiri), TREM kaltainen transkripti (TLT) -1, ja TLT-2. TREM geeniklusteri sijaitsee ihmisen kromosomissa 6p21 ja hiiren kromosomissa 17C3 [16] [17]. TREM-1 oli ensimmäinen TREM tunnistettu ja alkuvaiheen tutkimukset perustettu TREM-1 vahvistimena systeemisen tulehdusreaktio-oireyhtymä ja sepsis [18] [19] [17] [20]. Tarkka ligandi TREM-1 on tuntematon mutta me ja muut ovat osoittaneet, että bakteerien ja virusten tuotteita [21] [19] indusoi TREM-1. Lisäksi olemme osoittaneet, että MyD88 riippuvaisten ja riippumattomien reittien aktivoida TREM-1 vastauksena tiettyyn TLR ligandeja [21]. Toiminnalliset seuraukset hiljentäminen TREM-1-geenin makrofageissa ovat muuttunut saatavuus avaimen signaloinnin (CD14, IκBα, MyD88) ja efektorimolekyylien (MCP-1, IL-1β, IL-6, IL-23) alavirtaan TLR aktivointi [22]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat myös osoittaneet, että lipidejä välittäjäaineiden, kuten prostaglandiinien ekspression modu- TREM-1. Erityisesti PGE

2 indusoi taas PGD

2 ja PGJ

2 ilmentymisen inhiboimiseksi TREM-1 [23] [24]. Yhdessä nämä tutkimukset ovat osoittaneet keskeinen rooli TREM-1 monistamiseen TLR indusoi vasteita. Kuitenkin rooli TREM-1 in kasvaimeen liittyvä tulehdus ja mikroympäristölle ei ole osoitettu.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että TREM-1 ilmentyy voimakkaasti paksusuolessa, hepatosellulaarinen ja keuhkosyöpä kudosten [25] [26] [27] [5]. Lisäksi TREM-1 ilmentymisen potilailla, joilla on NSCLC on liittynyt syövän uusiutumiseen ja huono potilaiden selviytymiseen viittaa siihen, että TREM-1 voi olla tärkeä rooli syövän etenemisessä [27]. Kuitenkin mekanismi, jolla TREM-1 indusoituu kasvainkudoksessa ei ole määritelty.

Teimme tämän tutkimuksen määrittää solun erityinen ilmaisu TREM-1 ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kudosten ja määritellä mekanismi, jonka kasvainsolujen indusoi TREM-1. Oletimme, että TREM-1-aktivaation kasvaimeen liittyvät makrofagit voivat indusoida PGE

2 syntyy syklo-oksigenaasi-2: n syöpäsoluja. Tutkimme hypoteesia käyttäen rinnakkaisviljelmätilanteessa järjestelmä ihmisen syöpäsoluja ihmisen monosyyttien /makrofagien

in vitro

.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Ihmisen normaali keuhko ja NSCLC saatiin sekä pakastettuina ja Aikasolujen kliinisestä ja translationaalisen tutkimuslaitos (CTSI) at University of Florida, joka tarjoaa kudospankkia tutkimustarkoituksiin. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta, joiden kudokset on kallistuskulma. Kirjalliset hyväksynnät tehdyksi kaikille tutkimukseen osallistuneista. Tutkimuksen hyväksyi eettinen komitea ja Institutional Review Board University of Florida. Hyväksynnän numero (# IRB201200392).

Reagenssit

naudan sikiön seerumia (FBS) (10%) saatiin AmericanType Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). RPMI-1640-väliaine saatiin Gibco (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). forboli-12-myristaatti-13-asetaatti (PMA), NS398 saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). EP1, EP2, EP4, reseptoriantagonistit (GW848687, AH6809, AH 23848) ja yhdistelmä PGE2 ja PGD2 hankittiin Cayman kemikaaleja. EP1 antagonisti (L-798-106) hankittiin Tocris Bioscience. cAMP agaonist (forskoliini) ostettiin Sigma-Aldrich. COX-2 ja aktiini vasta, ei-kohdistaminen siRNA allas (NS siRNA) ja siRNA kohdentaminen COX-2 saatiin Santa Cruz Biotekniikka (Santa Cruz, CA).

Soluviljely ja Co-kulttuuri Kokeet

Ihmisen monosyyttistä U937, keuhkosyövän solulinjassa A549, H23 tai H838 hankittiin ATCC: stä, ja ylläpidettiin RPMI-1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. A549, H23 tai H838-solut maljattiin kuuden kuopan astioihin (1,5-2 x 10

6 solua per kuoppa) elatusaineet. U937-soluja käsiteltiin PMA: lla (10 ng /ml) 48 h erottamaan niitä makrofageihin. U937-solut (2–2,5 x 10

6 solua insert), ihmisen makrofageissa (10

6 solua insertti) maljattiin suoraan transwell insertit (0,4 gm, BD Biosciences) viljelyväliaineessa. Ennen yhteisviljelmä, keuhkosyöpä solut ja makrofagit pestiin RPMI, joka sisälsi 0,1% naudan seerumin albumiinia (ruselatusaineeseen). Viimeisen pesun jälkeen, sopiva ruselatusaineeseen lisättiin keuhkosyövän soluja ja insertit sisältävät makrofagit pantiin kuhunkin kaivoon.

valmistaminen Ihmisen makrofagien perifeerisen veren monosyyttien

Ihmisen ääreisveren monosyyttejä (PBMC) eristettiin buffy coats normaalien luovuttajien Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare) kaltevuus. PBMC: t eriytetään makrofagien viljelemällä RPMI-1640 täydennettynä 10% FBS (Gibco) tiheydellä 10

6 /ml seitsemän päivää. Kypsymisen ihmisen makrofagien, 50 ng /ml ihmisen M-CSF: ää (R 90% CD14

+).

immunohistokemia Analyysi

Keuhkosyöpä näytteet ja normaalin kudoksen para kohdunkaulan alueella saatiin kolme potilailla, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. Parafiinisektioista (4 pm) värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla histologista arviointia. Immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin käyttäen modifioitua avidiini-biotiini-peroksidaasi-kompleksin menetelmä. 4 um: n osia formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kudokset kiinnitettiin poly-L-lysiinillä päällystettyihin objektilaseille ja sitten parafiini. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin 3% vetyperoksidia 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen, kun antigeeni hakuja HIER (pH 6,0) 4 minuutin ajan, leikkeitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa anti-TREM-1-vasta-aine (HPA005563, Sigma-Aldrich), tai isotyypin yhteen sovitetun kontrollivasta-aineen laimennus 1:500, sitten havaita käyttämällä EnVision ™ System-HRP (DAB) (Dako). Spesifisyys Immunohistokemian varmistettiin käyttämällä vasta-ainetta isotyyppikontrolli korvaamalla primäärisen antiseerumin identtinen pitoisuus immunisoimattomista hiiren tai kanin seerumia. Osiot seulottiin x 100 suurennus tunnistaa alueille suurimman määrän TREM-1-positiivisten solujen. Immunovärjäystä TREM-1 analysoitiin sokkona kaksi hallituksen sertifioitu patologia. Solut laskettiin tiheys × 400 suurennus vähintään kolme aluetta, joilla on eniten määrä TREM-1-positiivisia soluja.

epäsuoralla immunofluoresenssilla

Palasia formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut keuhkosyöpä kudoksia ja kasvaimen viereiseen normaaliin kudokseen poistettiin parafiini, blokattiin sitten 2% hevosen seerumia PBST-puskurissa 1 tunti huoneenlämpötilassa. Blokkauksen jälkeen, laseja inkuboitiin anti-TREM-1-vasta-aine (HPA005563, Sigma) laimennus 1:500 yön yli 4 ° C: ssa, sen jälkeen pestiin kolme kertaa kylmässä PBS: ssä, niitä blotattiin sekundaarista vasta-ainetta (Alexa Fluor 594 aasin anti-kani- IgG, 1:500; Molecular Probes) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Dual värjäys, objektilasit pestiin jälleen, blokkausliuoksella, ja inkuboitiin anti-ihmisen CD68-vasta-ainetta (klooni KP1, 1:100, Abcam) ja toinen fluori-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Alexa Fluor 488 aasin anti-hiiri-IgG, 1: 500; Molecular Probes). DAPI sisältävää kiinnitysväliaine (Molecular Probes) käytettiin tumavärjäystä. Kuvia yhden solun tasolla havaittiin ja valokuvattiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia varustettu Charge Pari Device kamera (Leica SP5, Saksa).

RNA Interference

Solut transfektoitiin siRNA: lla oligonukleotidien kohdistaminen ihmisen COX-2: n mRNA, ja ei-liittyvä ohjaus siRNA (Santa Cruz) erityisillä LONZA transfektioreagenssit (LONZA) mukaan valmistajan ohjeiden. Soluja inkuboitiin siRNA komplekseja 24 h-72 h ennen määritystä.

virtaussytometria

Ihmisen makrofagien ja U937-eriytetty makrofagit tutkittiin reseptorin ekspressiotasoja käyttämällä FACS anti-humaani-CD14-APC /Cy7 (eBioscience) ja anti-ihmisen TREM-1 (R 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

TREM-1 on yliaktiivista Kasvain Associated Makrofageilla Human ei-pienisoluinen keuhkosyöpä

On selvää, että TREM -1 esiintyminen lisääntyy infektion ja tulehduskudoksissa. Koska krooninen tulehdus liittyy läheisesti syöpään kysyimme jos TREM-1 ilmentyy NSCLC kudoksessa. Ensin suoritettiin RT-PCR ja RT-qPCR päässä keuhkokudoksesta potilaiden NSCLC. Pystyimme tunnistamaan lisääntymiseen TREM-1 viesti ihmisen keuhkoadenokarsinooma kudosta taas ilmentymistä ei havaittu normaalissa keuhkokudoksessa (kuvio 1A ja B). Koska ilmaus TREM-1 rajoittuu ydinsoluissa kysyimme joka solutyypit ekspressoivat TREM-1 in keuhkosyöpää kudosta. Jotta voitaisiin määrittää erityisiä solutyyppejä, jotka ilmentävät TREM-1 kasvaimen mikroympäristössä teimme immunohistokemiallinen analyysi (käyttämällä muunnettua avidiini-biotiini-peroksidaasi-kompleksin menetelmä, primaarinen vasta-aine anti-TREM-1-vasta-aineen ja isotyypin kontrollivasta-ainetta) ihmisen keuhkosyövän näytteitä potilaista, joilla keuhkojen adenokarsinooma. Immunohistokemia ja immunoflorescent värjäys päässä keuhkotuumoreiden osoittivat, että TREM-1-positiiviset solut ovat kasvaimeen liittyvät makrofagit (kuvio 1 C). TREM-1 positiivisten solujen ovat makrofagit varmistettiin käyttämällä CD68 värjäämällä erityistä makrofagimarkkeri jotka osoittivat, että solut ovat tosiaan makrofagit (kuvio 1 D). Lisäksi meillä on myös määritetty, jos keuhkosyövän soluja (A549-solut) express TREM-1-proteiinia. Emme pystyneet havaitsemaan ilmentymisen TREM-1 viesti tai proteiinin kasvainsoluissa yksinään (tuloksia ei ole esitetty). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että TREM-1 ilmentymisen taso nousee kasvaimeen liittyvät makrofagit ei-pienisoluinen ihmisen keuhkosyöpä.

A) RNA: ta ihmisen keuhkosyövän näytteet osoittivat kasvua TREM-1 viesti. B) Reaaliaikainen RT-PCR vahvisti kasvu TREM-1 viesti (n = 3, * p 0,05). C) edustaja immunohistokemiallisesti kuva osoittavat lisääntynyttä ilmentymistä TREM-1-proteiinin makrofagien kasvaimen strooman D) Konfokaalimikroskopia kanssa CD68 tietyn makrofagimarkkeri ja TREM-1 vahvisti, että solut, jotka ilmentävät TREM ovat TAM.

TREM-1 on indusoitu in Human makrofagit viljeltiin yhdessä Lung adenokarsinoomasoluja

Koska meidän tiedot osoittavat, että TREM-1 ilmentyy kasvaimeen liittyvät makrofagit ihmisen keuhkojen adenokarsinooma kehitimme

in vitro

co-kulttuuri malli määrittää, onko ilmentymisen TREM-1 TAM kasvaimen liittyy erityisesti kasvainsoluihin. Co-kulttuuri kokeet suoritettiin käyttämällä ihmisen makrofageissa (ihmisen monosyyteistä verestä maturoitiin makrofagien menetelmissä kuvatulla tavalla) ja A549, H23 ja H838 ihmisen keuhkojen syöpäsoluja. Näitä kokeita varten tuumorisolujen tai normaali epiteelisolut (NL-20, ATCC) olivat viljeltiin yhdessä kypsytetty ihmisen makrofagien 48 tuntia. Expression of TREM-1 määritettiin FACS-analyysillä. Co-kulttuuri kasvainsolujen makrofageihin johti induktio TREM-1 määritettynä FACS-analyysi (kuvio 2A). Toisaalta makrofagit, jotka olivat viljeltiin yhdessä normaalin epiteelisolujen ei osoittavat kasvua ekspression TREM-1-proteiinia (kuvio 2A ja B), mikä viittaa siihen, että ekspression TREM-1 TAM on vaikutusta kasvaimen solujen makrofageissa. Olemme myös suorittaa muita kokeita vahvistaa lisääntyneen ekspression TREM-1 viesti. Normaali epiteelisolujen, ja syöpäsolut A549, H23 ja H838-soluja viljeltiin yhdessä ihmisen makrofagien 48 tunnin ajan, jonka jälkeen RNA uutettiin makrofageissa. TREM-1 viestiä havaittiin RT-PCR: llä. Kanssa myös tietoja TREM-1-proteiinin ilmentymisen makrofagien, jotka olivat viljeltiin yhdessä syöpäsolujen osoitti kasvua TREM-1 viesti, joka ei havaittu makrofageja, jotka oli viljelty normaaleissa epiteelisoluissa (kuvio 2C). Yhdessä nämä tulokset vahvistavat, että kasvainsolut voivat aiheuttaa ekspressiota TREM-1 viesti ja proteiinia makrofageissa.

A) makrofagit olivat viljeltiin yhdessä NL-20 (normaali epiteelisolut) tai keuhkosyövän soluja (A549, H23 tai H838) 48 tuntia. TREM-1 ekspressio lisääntyi makrofagit, jotka olivat viljeltiin yhdessä syöpäsolujen FACS-analyysillä osoitettiin B) solujen prosenttiosuus, jotka värjäytyivät positiiviseksi TREM-1, n = 3-4, * p 0,05) C) edustaja RT- PCR: llä makrofagi viljeltiin yhdessä kasvainsolujen osoittivat osoittivat lisääntyneen ekspression TREM-1 viesti.

induktio TREM-1 in Tumor Associated Makrofagit on riippuvainen COX-2

halusimme seuraavaksi tutkia mekanismia, jolla kasvainsolujen indusoida TREM-1 makrofageissa. Kohonnut cyclooygenase-2 (COX-2) ilmentyminen on usein havaittu ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [10], [29]. Me ja muut ovat osoittaneet, että prostaglandiinit ilmentymisen moduloimiseksi TREM-1 vastauksena LPS, erityisesti PGE2 aiheuttaa taas PGD

2 ja PGJ

2 ilmentymisen inhiboimiseksi TREM-1 [23] [24]. Siksi arveltu, että ilmentyminen TREM-1 in tams saattavat indusoida PGE

2 tuotanto kasvainsoluista kautta syklo-oksigenaasi-reitin. Ensin vahvistettiin, että kasvaimen kudokset ja solut ilmentävät COX-2 (tuloksia ei ole esitetty). Tasot PGE

2 nostettiin keuhkojen kasvainkudoksessa (kuvio 3A). Seuraavaksi käsitellään luuytimestä peräisin makrofageihin villityypin hiiristä yhdistelmä-PGE

2 ja PGD

2 (10 pmol) ja suoritettiin RT-qPCR määrittämiseksi ilmentymistä TREM-1 viesti. Hoito PGE

2 johti ilmaus PGE

2 taas solut, joita käsiteltiin ajoneuvon ja PGD

2 ei osoittanut induktio TREM-1 (kuvio 3B).

A) PGE

2 tasoa mitataan ihmisen keuhkojen kasvain kudos osoitti kasvua PGE

2 viestin syöpäkudoksessa ilman merkittäviä havaitseminen normaalissa keuhkoissa (n = 3, p 0,05). B) Luuytimen johdettu makrofagit villityypin hiiriä käsiteltiin yhdistelmä-PGE

2 tai PGD

2 (10 umol) 12 tuntia ja TREM-1-ekspressiota havaittiin. BMDM käsitelty PGE

2 osoitti kasvua TREM-1 viesti vastauksena PGE

2 hoitoa (n = 3-4, p 0,05) mutta TREM-1 viestiä ei havaittu soluissa, jotka oli käsitelty PGD ​​

2.

jotta voitaisiin vahvistaa roolia COX-2 in induktio TREM-1 suoritimme kokeita, joissa me yhteistyötä viljellyt keuhkosyöpä solut monosyyttien /makrofagien 48 tuntia kun läsnä on COX-2-estäjien tai ajoneuvon hoitoon. Ohjaus makrofagit olivat viljeltiin yhdessä normaalin epiteelisolujen NL-20. Expression of TREM-1 määritettiin FACS-analyysillä. Kuten on esitetty kuviossa 4A monosyyteissä (U937-solut), jotka olivat viljeltiin yhdessä syöpäsolujen (A549-solut) osoittivat lisääntyneen ekspression TREM-1-proteiinin, jota ei havaita, kun U937-soluja viljeltiin yhdessä NL-20 normaalin epiteelisolujen. Käsittely COX-2-estäjä (NS-398, 100 umol) kanssa johti kumoamista induktioon TREM-1 (kuvio 4A ja 4B). Jotta lopullisesti määritellä roolin COX-2 induktio TREM-1 me pudotettiin COX-2: n ilmentymisen makrofageissa käyttämällä siCOX-2. Makrofagit transfektoitiin siCOX-2 tai ohjaus siRNA 48 tuntia ennen viljellään yhdessä syöpäsolujen kanssa tai normaali epiteelisolut (NL20) ja ilmentyminen TREM-1-proteiinin havaittiin FACS-analyysillä. Ensin vahvisti, että ilmentyminen COX-2: ta vaimennetaan COX-2-pudotus-soluissa määritettynä Western blot-analyysi COX-2 (kuvio 5A). Kuten kuviossa 5B ja C TREM-1-proteiini on yliaktiivista makrofageissa ilmentävät ohjaus siRNA, joka oli viljeltiin yhdessä keuhkosyövän soluja (A549, H23 ja H838-solut), mutta ei makrofageissa, jotka viljeltiin normaalin epiteelisolujen. Kuitenkin ekspressio TREM-1-proteiinin kumottiin makrofageissa, jotka on transfektoitu COX-2 siRNA, joka oli viljeltiin yhdessä syöpäsolujen (A549, H23 tai H838-solut) (kuvio 5B, 5C). Expression of TREM-1 viesti myös kumottiin makrofagit, joita oli käsitelty siCOX-2 ja viljeltiin yhdessä kasvainsolujen (kuvio 5D). Yhdessä nämä tiedot lopullisesti osoittavat, että ilmentyminen TREM-1 on COX-2-riippuvaista ja välittyy tuotantoon PGE

2.

A) edustaja kuva FACS-U937 monosyyttejä yhteistyössä ultured kanssa NL-20 tai A549-solut, kun läsnä on ilman NS-398 (100 umol) (spesifinen COX-2-estäjä). Ekspressio TREM-1 lisättiin U937-soluissa viljeltiin yhdessä A549-solut. Hoito NS-398 inhiboi tätä voimakkaammin ilmentävät B) Prosentuaalinen soluissa, jotka värjäytyivät positiiviseksi TREM-1 (n = 4-5, p 0,5).

A) Western blot-analyysi ihmisen makrofaagien COX-2 siRNA vahvisti kaataa COX-2-proteiinin solujen siCOX-2 verrattuna mock (kontrolli) siRNA. B) FACS-kuvia, jotka osoittavat TREM-1 ilmentymisen ihmisen makrofagien ilmentävät ohjaus siRNA: n tai COX-2 siRNA viljeltiin yhdessä NL-20-soluja tai syöpäsoluja (A549, H23 tai H 838-solut). Ekspressio TREM-1 on lisääntynyt makrofagien ilmentävät ohjaus siRNA viljeltiin yhdessä syövän soluissa, kun taas makrofagien siCOX-2 osoitti heikennetty ilmentymistä TREM-1. C) Prosenttiosuus soluissa, jotka värjäytyivät positiiviseksi TREM-1 värjäystä n = 3, p 0,05). D) Edustavia RT-PCR: llä makrofagien siCOX-2 esittävät vähentynyt TREM-1 viesti verrattuna makrofagien ohjaus siRNA.

halusimme seuraavaksi määritellä mekanismi, jonka PGE

2 sovittelee ilmentymistä TREM-1 in kasvaimeen liittyvän makrofageissa. PGE

2 vaikuttaa solun käyttäytymistä ligaatio sen neljästä eri G-proteiiniin kytkettyjen E-prostanoidireseptoreihin, numeroitu EP1-4 [30], [31]. Sen määrittämiseksi reseptorit, joiden kautta PGE

2 muuttaa ilmaus TREM-1 suoritimme kokeita EP1- kautta EP4 antagonisteja. Makrofagit käsiteltiin kunkin antagonistin (10, 50 umol) ennen yhteistyössä viljely A549-solut. EP1 (GW848687) ja EP3-antagonistit (L-978-106) ei ollut merkittävää vaikutusta ekspression TREM-1 (tuloksia ei ole esitetty), mutta soluissa, jotka oli käsitelty EP2 (AH6809) ja EP4 (AH23848) antagonisti oli alennettu ilmentyminen TREM-1-proteiinin, kuten FACS-analyysillä määritettynä (kuvio 6A ja B). EP2 ja EP4-reseptoreita ovat voimakkaita immunoregulatooristen molekyylejä, jotka jakavat kapasiteetti lisätä solunsisäisiä pitoisuuksia syklinen adenosiinimonofosfaatti (cAMP) kuluessa sekunneista minuutteihin PGE

2 sitovia. Niinpä halusimme selvittää, onko nämä vaikutukset välittyvät nousu cAMP tasoja. Siksi suoritettiin kokeita cAMP-agonistin forskoliinin (10 umol) ja yhteisymmärryksessä meidän tietoja EP2 saarron löysimme merkittävä kasvu ilmentymisen TREM-1 vastauksena forskoliinille (kuvio 6A ja 6B). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että ilmentyminen TREM-1 in kasvaimeen liittyvät makrofagit joita aiheuttaa PGE

2 välittyy EP2 ja EP4-reseptoreihin ja ohjaa nousu cAMP-tasoa.

) FACS kuvat osoittavat, että TREM-1 ekspressio vaimenee makrofageissa, jotka ovat viljeltiin yhdessä kasvainsolujen läsnä ollessa EP2 ja EP4-antagonistin (AH6809 ja AH23848), kun taas se on kasvanut, kun läsnä on forskoliinin. B) Prosentuaalinen soluissa, jotka värjäytyivät positiiviseksi TREM-1 (n = 4-5, * p 0,05).

Keskustelu

Tutkimuksemme vakuuttavasti osoittaa, että TREM-1 ilmentyy ihmisen NSCLC kudosten ja että ilmaisu selektiivisesti nähdään kasvaimeen liittyvä makrofagien syövän strooman. Emme pystyneet havaitsemaan ilmentymisen TREM-1 normaalissa keuhkokudoksessa tai eristetyissä kasvainsoluissa. Lisäksi osoitamme, että kasvainkudoksessa on lisääntynyt ilmentyminen COX-2 PGE

2-tuottamista ja makrofagit, jotka on käsitelty PGE

2 osoittavat lisääntyneen ekspression TREM-1. Lisäksi hoito COX-2-estäjiä ja knockdown COX-2 makrofageissa vaimennettu ilmentymistä TREM-1 in co-kulttuuri malli keuhkosyöpään solujen makrofageihin. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että TREM-1 voi olla kriittinen lenkki kasvaimen mikroympäristössä välillä kasvaimeen liittyvien makrofagiaktivaatiota, tulehdusreaktio, ja syövän etenemistä.

Syöpä liittyvä tulehdus on nyt tunnustettu tuntomerkki kasvaimia ja välinen yhteys keuhkojen syövän synnyn ja kroonisen immuuniaktivaatiota on vakiintunut [32] [33] [34] [35] [36]. Tulehdus esiintyy kasvaimen mikroympäristössä on tunnusomaista leukosyyttien infiltraatiota, joka sisältää kasvaimeen liittyvät makrofagit syöttösolut, dendriittisolut, luonnollisten tappajasolujen, neutrofiilit, eosinofiilit ja lymfosyytit [37] [38] [32]. On myös yhä tunnustettu, että vuorovaikutus syöpäsolujen, makrofagit, ja tulehduksellinen vaste kasvaimen mikroympäristössä voi helpottaa syövän invaasio ja metastaasi [39] [40] [41] [42] [43] [44]. Aikaisemmin olemme osoittaneet, että asukas keuhkojen makrofagit ovat ratkaisevia efektoreita alttiutta metastaattisen keuhkosyövän kasvua [45]. Useat hiiren ja ihmisen tutkimukset ovat osoittaneet, että korkea TAM tiheys on useimmiten liittyy huono prognoosi potilaalle ja kestävyys hoitoja eri syöpiä, kuten ei-pienisoluisen keuhkosyövän [46] [47] [40] [41] [42] [ ,,,0],48], [44] [49]. Lisäksi monosyytti /makrofagi ehtyminen koeasetelmia on onnistunut rajoittamisessa kasvaimen kasvua ja metastaaseja ja saavuttamaan parempia vastauksia perinteisiin kemoterapiaa ja antiangiogeenisten hoito [50] [13]. Vaikka TAM edistää merkittävästi tuotannon VEGF, IL-1β: n, TNF-α, IL-6, IL-23, IL-8, MMP joilla on angiogeneesiä ja kasvua ominaisuudet, erityisiä molekyyli solukuolemaan, että immunoedit kasvaimen kasvu ei ole hyvin määritelty [37]. Löydettiin runsaasti makrofagit stroomaan kasvainkudoksen, jotka osoittivat sekä TREM-1 ja CD68 ilmaisuja. CD68 on makrofagimarkkeri varten kasvaimeen liittyvä makrofagi, joka on tärkeä rooli angiogeneesissä ja etäpesäkkeiden. Lisääntyminen CD68 positiivinen makrofageissa tutkimuksessamme tukee oletusta, että tulehduksellinen makrofagit ilmentävät TREM-1 voi edistää edelleen tuotannon välittäjäaineiden, jotka voivat edistää kasvaimen kasvua.

Liipaisu reseptoria ilmentyy ydinsoluissa 1 (TREM-1) on jäsen Super immunoglobuliini perhe ilmaistaan ​​valitse ryhmä myeloidisolujen pääasiassa monosyytti /makrofageja. Expression of TREM-1 on liitetty immuunivasteen tulehdusvastetta. Tulehdus edistää useita tunnusmerkkejä syövän, kuten jatkuva proliferatiivinen signalointi, vastustuskyvyn solukuolemaa ja angiogeneesin induktio [51] [35] [36]. Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että ilmentyminen TREM-1 kasvaimissa voi ennustaa syövän aggressiivisuuteen ja sairauksien seurauksia, maksassa ja keuhkosyöpää epäilynalaisiksi että ilmentyminen TREM-1 makrofageissa voi olla kasvaimen kasvuun liittyvien ja etenemiseen [25] [26] [27] . Olemme osoittaneet, että toiminnalliset seuraukset vaientaa TREM-1-geenin makrofageissa ovat muuttunut saatavuus avaimen signaloinnin (CD14, IκBα, MyD88) ja efektorimolekyylien (MCP-1, IL-1β, IL-6, IL-23) alavirtaan TLR aktivointi [22] [21] [19]. Erityisesti IL-6 ja IL-23 on liioiteltu TREM-1 aktivointi [22], [52]. IL-6 ja IL-23 on osoitettu olevan osallisena immunologiseen editointia karsinooma mikroympäristöihin ja liittyy huonoon ennusteeseen [53] [54] [55] [56]. Vaikka spekulatiivinen liioiteltu tuotanto näiden sovittelijan TREM-1 voi olla mekanismi, jolla TREM-1 ilmentymisen tams voi edistää kasvaimen kasvua ja etenemistä. Käynnissä ja tulevissa tutkimuksissa perustaa roolia TREM-1 kasvaimen kasvua ja määritellä mekanismit, joilla TREM-1 moduloi kasvaimen kasvua [27] [56].

Tässä tutkimuksessa tutkimme myös mekanismi, jonka TREM-1 ilmentyy TAMeja. Koska ilmaus TREM-1 moduloi lipidivälittäjäaineita erityisesti prostaglandiini tutkimme roolia syklo-oksigenaasi-reitin. Osoitamme, että COX-2 johti vaimennus ilmentymisen TREM-1 makrofageissa. Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus, joka osoittaa, että ilmentyminen TREM-1in tams kasvaimen mikroympäristössä riippuu COX-2 signalointireitin. Samalla osoitetaan, että keuhkojen kasvain kudosta on lisääntynyt tuotanto PGE

2, joka todennäköisesti edistää ilmentymistä TREM-1 TAMeja. Lisäksi tutkimuksemme EP-reseptoriantagonisteilla, että vaikutukset PGE2 kasvaimen mikro-ympäristössä välittyvät EP2 ja EP4-reseptorin ja ovat seurausta kasvusta cAMP.