Krooninen sairaus

tiivistelmä

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä on hyvin heterogeeninen sairaus ja edelleen kaikkein tappava gynekologinen maligniteetti länsimaissa. Hoitomenetelmiä tarvitse selittää potilaiden väliset ja sisäiset kasvaimia heterogeenisuus ja yksityiskohtainen karakterisointi

in vitro

malleissa edustavat eri histologisia ja molekyylitason munasarjasyövän alatyyppejä on kriittinen mahdollistaa luotettavan esikliinisiä tutkimuksia. On noin 100 julkisesti saatavilla munasarjasyövän solulinjoissa mutta niiden solu- ja molekyylitason ominaisuudet ovat pitkälti undescribed. Olemme tunnettu 39 munasarjasyövän solulinjoissa yhdenmukaisin kasvun edellytysten ominaisuuksien, mRNA /microRNA ilme, eksonin sekvensointi, lääkevaste kliinisesti tärkeiden terapeuttiset ja koonnut kaikki saatavilla olevat tiedot alkuperäisen kliinisiä piirteitä ja alkuperäisistä tiloista. Testasimme tilastollisia assosiaatioita solu- ja molekyylitason ominaisuudet linjat ja kliiniset piirteet. Niistä 39 munasarjasyövän solulinjoissa, 14 oli määrätty korkealaatuista vakavien, neljä vakavien-tyyppi, yksi matala-asteinen serous ja 20 ei-vakavasta tyyppiä. Kolme morfologiset alatyyppiä: epiteelikasvaimet (n = 21), Round (n = 7) ja Kara (n = 12) havaittiin, että osoitti selvästi biologiset ja molekyylitason ominaisuuksia, kuten yli-ilmentyminen solun liikkumista ja muuttoliikkeeseen liittyvät geenit Karan alatyyppi. Verrattuna alkuperäiseen kliiniset tiedot osoittivat yhdistys karamaisen kasvaimista etäpesäkkeiden pitkälle, optimaalinen debulking ja huonon ennusteen. Lisäksi ilmaus profiilit Karan, pyöreä ja epiteelikasvaimet morfologioita ryhmittyneet aiemmin kuvattu C1-strooman, C5-mesenkymaalisten ja C4 munasarjojen alatyyppi ekspressioprofiileja vastaavasti. Kattava profilointi 39 munasarjasyövän solulinjoissa valvotuissa yhdenmukaisella osoittaa kliinisesti merkittäviä solu- ja genomin ominaisuudet. Tämä data tarjoaa järkevän perustana valittaessa malleja kehittää erityisiä hoitotapaa histologista ja molekyylitason alatyyppien munasarjasyöpä.

Citation: Beaufort CM, Helmijr JCA, Piskorz AM, Hoogstraat M, Ruigrok-Ritstier K, Besselink N , et ai. (2014) munasarjasyöpä Cell Line Panel (OCCP): Kliininen merkitys

In vitro

morfologiset alatyyppejä. PLoS ONE 9 (9): e103988. doi: 10,1371 /journal.pone.0103988

Editor: Richard Pearson, Peter MacCallum Cancer Centre, Australia

vastaanotettu: 15 marraskuu 2013; Hyväksytty: 05 heinäkuu 2014; Julkaistu: 17 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Beaufort et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain Center for Henkilökohtainen Cancer Treatment (yhteistyönä UMC Utrecht, Erasmus MC Rotterdam ja Alankomaiden Cancer Institute Amsterdam), The KWF-Alpe (UU 2011-4977) ja European Organisation for Research and Treatment of Cancer (avustus nr. EORTC STrF 2008-03, JH). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä on tappavin gynekologinen maligniteetti länsimaissa ja edenneen taudin edelleen parantumaton useimpien potilaiden. Huolimatta testaus erilaisia ​​hoitostrategioita ja uusia sytostaattien, optimaalinen ensisijainen hoito ja eloonjäämisluvut eivät ole merkittävästi muuttuneet käyttöönoton platinan ja taksaanin käsittely [1] – [3].

Viimeaikaiset oivalluksia ovat osoittaneet, että munasarjasyöpä on yhteisnimitys invasiivisia lantion syöpiä, jotka ovat peräisin eri kudoksista erottuva histologisia ja epidemiologisia ominaisuuksia. Viisi suurta histiotypes on osoitettu olevan tiettyjä geneettisiä profiileja ja sitä tulisi käsitellä erillisinä sairauksia. Korkeatasoinen vakavien (HGS) karsinooma edustaa 80% munasarjojen syöpiä ja määritellään

TP53

mutaatio (96%), homologisen rekombinaation DNA korjaus vikoja (-50%),

CCNE1

vahvistus ja genomin epästabiilisuuden [4] – [6]. Sen sijaan, matala-asteista serous karsinoomat ovat

TP53

villityyppistä ja osoittavat usein aktivoivat RAS koulutusjakson mutaatioita [7], [8]. Loput histiotypes ovat mucinous, endomet- ja selkeä solujen [3]. Aktivointi RAS polku mutaatiot löytyvät -40%: n mucinous kasvainten taas endomet- ja selkeä kasvaimet ovat

PIK3CA

(PI3Kinase komponentti, 12%, 31%: lla), ja

ARID1A

mutaatioita ( 30%, 46%, vastaavasti) [4], [5], [9], [10].

Lisäksi suuret tutkimukset ovat tunnistaneet useita molekyyli- alatyyppejä HGS perustuu geenin ja microRNA ilmaisun [4] , [11]. Nämä alatyyppejä ehdottaa yhdistysten erityisiä biologisia prosesseja (kuten reaktiivinen strooman, mesenkymaalisten, immunoreaktiivisia ja lisääntymistä) ja huono ennuste, esimerkiksi C1 strooman-alatyypin tunnistaa Tothill et al. [4], [11]. Edelleen tutkitaan kliinisen ominaisuuksia Näiden biologisten eri alatyyppejä ja tunnistaa optimaalinen hoito voi tunnistaa uusia hoitostrategioita.

On välttämätöntä, että kokeellisesti taipuisa in vitro -malleja, kuten solulinjat, tarkasti edustavat eri histologisia ja molekyylitason alatyyppejä jotta voidaan testata uuden alatyypin erityiskäsittely strategioita. Maailmanlaajuisesti on olemassa noin 100 munasarjasyövän solulinjoissa syntyy, kuten kirjallisuudessa [12] – [17] ja noin 70 näistä ovat saatavilla ATCC, ECACC, RIKEN, DSMZ, JCRB tai Cancer Research Technology. Vuodesta 1990 keskimäärin noin 100 papereita /vuosi julkaistaan ​​joka luottaa munasarjasyövän solulinjoissa mallina. Merkittävä rajoitus näitä tutkimuksia varten on se, että useimpien munasarjojen solulinjojen niiden alkuperä huonosti määritelty ja puutteellisen luonnehdinta ei tiedetä mikä erillisiä histologista tai molekyylin alatyyppi on edustettuna.

selostavat laajan ja yhtenäinen luonnehdinta kokoelma 39 munasarjasyövän solulinjoissa käytetään yleisesti

in vitro

tutkimuksissa. Havaitsimme histologinen sekä morfologiset alatyyppejä, jotka liittävät kliinisiä patologisia ominaispiirteitä munasarjakarsinoomat sekä ennustetta. Lisäksi morfologiset alatyyppejä liittävät molekyyli- alatyyppejä tunnistaa Tothill et al. [11]. Yhteenvetona nämä tulokset voivat toimia oppaana valita sopiva solulinjoihin edustavat eri histologisia ja molekyylitason alatyypin munasarjasyöpään varten

in vitro

terapeuttisia tutkimuksia.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja viljelemällä

Solulinjat tutkittavalla CaOV3, CAOV4, ES-2, OV-90, OVCAR3, TOV-112D, TOV-21G, UWB1.289, UWB1.289 + BRCA1 (hankittu ATCC ), 59m, A2780, A2780CIS, A2780ADR, ”COLO720E”, COV318, COV362, COV362.4, COV413A, COV413B, COV504, COV644, OAW28, OAW42, OV56, OV7, OV17R, PEA1, PEA2, PEO1, PEO4, PEO14, PEO16, PEO23, SKOV3 (ostettu Euroopan kerääminen soluviljelmissä, ECACC kautta Sigma), 2774, A2780, HOC7, SKOV3, SKOV6 (kohteliaisuus Gunter Daxenbichler, Dept. Naistenklinikka, Innsbruckin yliopisto, Itävalta), IGROV1 (: Dr. Irene Hamelers, Institute of Biomembranes, Utrecht University, Alankomaat). Taulukossa S1 yhteenveto alkuperäisen lähteen solulinjoista. Solulinjat A2780 ja SKOV3 molemmat saatu akateemisen laboratorio- ja myös ostetaan ECACC, ja on kuvattu täällä ”A2780 ECACC” ja ”SKOV3 ECACC”. Kolmekymmentä yhdeksän 40 solulinjoja kasvatettiin yksittäiskerroksina, lukuun ottamatta osittain kiinnittyvä solulinja ”COLO720E”, josta kelluva ja kiinnittyneet solut jatkettiin. Liitteenä solut täysin eriteltynä trypsinoimalla välillä kohtia. Solulinjat pidettiin 37 ° C: ssa inkubaattorissa, jossa kostutettu ilma 5% CO2.

Kaikki solulinjat olivat aluksi viljeltiin käyttäen alusta ja täydentää suositusten mukaisesti toimittajat. Päinvastoin kuin muissa tutkimuksissa, me viljellä kaikki solulinjat samoissa viljelyolosuhteissa välttää harhojen vuoksi vaihtelevia pitoisuuksia täydentää sisällä eri medioiden (esimerkiksi kasvutekijöitä) tai erilaisia ​​prosenttiosuuksia seerumin. Kaikkia solulinjoja viljeltiin RPMI-1640 glutamax, Gibco /Invitrogen, jota oli täydennetty 10% FCS: ää (Lonza, lähde: Brasilian, Lot nr 1SB002), 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, 50 ug /ml gentamysiiniä. Kaikki kokeet ja nukleiinihapon eristäminen tehtiin sen jälkeen viljelemällä solulinjoja vähintään kuukauden käyttämällä näitä yleisiä.

UWB1.289 on BRCA1-null solulinja nainen ituradan

BRCA1

2594delC mutaatio. UWB1.289 + BRCA1 on transfektoitu stabiilisti pcDNA3-plasmidi, joka sisältää

BRCA1

lisätä ja pidettiin 200 ug /ml genetisiiniä (G418) ylläpitää valinta transfektoitujen solujen. A2780ADR ja A2780CIS altistettiin kerran kuukaudessa 100 nM doksorubisiinin ja 1 uM sisplatiinia vastaavasti.

Short Tandem uusintaa

PowerPlex 16 System (Promega) käytettiin mukaisesti valmistajan protokollan käyttämällä ABI PRISM 3100 tuottamaan STR (Short tandem-toisto) sormenjälki kunkin solulinjan määrittää ainutlaatuisen identiteetin ja /tai puute yhteistyön kulttuuri saastuminen. Lisäksi STR profiilin tarkistettiin ennen ja sen aikana Solujen viljely, jotta ristikontaminaatiota tai virheellinen korvaaminen ei tapahtunut.

kasvukäyrät ja huumeiden herkkyyden määritys

MTT kolorimetristä määritystä , joka mittaa metabolista aktiivisuutta elävien solujen, käytettiin tuottamaan kasvukäyrät ja määrittää kemosensitiivisyys solulinjoista.

Ensinnäkin, kasvukäyrät muodostettiin kahtena, joka määrittelee optimaalisen solujen määrä käyttää lääkkeen herkkyys määrityksessä. Tämä tehtiin, jotta vältetään kasvun esto johtuu kylvö ole tarpeeksi soluja tai ehtyminen väliaineen jälkeen kylvö liikaa soluja. Eniten solujen osoittavat jatkuvia eksponentiaalinen kasvu viiden päivän jälkeen valittiin lääkevaste MTT määrityksiä (taulukko S1, File S1).

Response dikäyrät varten karboplatiini, sisplatiini, Oksaliplatiini, doksorubisiini ja 5-fluorourasiilia (suonensisäinen ratkaisuja, Pharmachemie, Hollanti), Paclitaxel (suonensisäinen ratkaisu, Ebewe Pharma, Itävalta), Doketakseli (liuotettuna DMSO, Sigma), ja GEMSITABIINI (suonensisäiseen käyttöön, liuotetaan PBS, Sun Pharmaceutical Industries Europe BV, Alankomaat) . Solujen elinkelpoisuus arvioitiin neljänä käyttäen MTT-määritystä jälkeen viiden päivän altistumisen 18 yhdisteen konsentraatioilla. Phoenix WinNonlin 1.1 ohjelmisto (Pharsight) käytettiin sopivaksi annosvastekäyrä ja laskea 50%: kasvun esto arvot (GI 50), jossa virhe ja 95%: n luottamusväli (katso myös File S1).

DNA ja kokonais- RNA: n eristys

NucleoSpin kit (Machery-Nagel) käytettiin mukaisesti valmistajan protokollan DNA: n eristämiseksi soluista talteen trypsiinillä ja pestiin PBS: llä.

eristämistä varten kokonais-RNA (mukaan lukien MikroRNA), eksponentiaalisesti kasvavat solut suoraan hajotettiin dosviljelypulloihin RNA-Bee välttää muutoksia ilmaisun takia sadonkorjuuta tai pesemällä. Kokonais-RNA eristettiin lysaateista kuten aiemmin on kuvattu [18]. Kolme riippumatonta isolaatit RNA: ta kustakin linja yhdistettiin mRNA ja microRNA ilmentymisanalyysiä laskevan Puolueellisuuden päässä outlier arvoista.

microRNA ja geeniekspressioanalyysiä

microRNA ilmentymisanalyysiä, TaqMan Array Human MicroRNA fluidivoimaan kortit v2.0 (Applied Biosystems), joka sisälsi qRT-PCR-määrityksissä määrittää 381 ainutlaatuinen MikroRNA käytettiin mukaisesti valmistajan protokollaa. Ilmaisu data normalisoitiin käyttämällä mediaani Ct kaikkien mitattujen MikroRNA kuten ovat kuvanneet Vandesompele et al. [19] (katso myös File S1). Normalisoidut lauseke tiedot kaikista 384 MikroRNA on esitetty taulukossa S2.

Geenien ilmentyminen mitattiin käyttämällä GeneChip- Human eksoni 1.0 ST Array (Affymetrix) mukaan valmistajan protokollan (katso myös File S1). Hankittu ekspressiotietojen oli esikäsitellyt käyttäen Robust Multichip Analysis (RMA) algoritmin sisällä Affymetrix Expression Console ohjelmisto, joka suorittaa taustakorjausta, normalisointi ja koetinsarjaa yhteenvetoa per transkriptio mikä yhdessä ilmaisun -arvo geenin. Geeniekspression data on talletettu Gene Expression Omnibus (GSE53418).

SNaPshot mutaation analyysi

SNaPshot-analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [20] – [22] käyttäen Applied Biosystems SNaPshot Multiplex Kit. Nukleotidi- ja vastaava aminohapposekvenssi muutoksia arvioitiin olivat PIK3CA, BRAF, HRAS, sääntelyviranomaisten ja KRAS on lueteltu täydentää menetelmillä (

Tiedoston S1

).

mutaatio ja vahvistus analyysit kiinteällä eksonin sekvensointi

käsittely näytteiden sekvensointia annetun SOLiD5500 sekvensointialustamme (Life Technologies) suoritettiin Sciclone NGS nesteenkäsittelyn robotti (Perkin Elmer), joka perustuu protokolla käsin kirjasto valmisteluun [23]. Sure-Select rikastumista varten kiinnostavia geenejä suoritettiin multipleksoidun muoti enintään 16 näytettä per reaktiota (perustuen Nijman et al. [24]) käyttäen räätälöityä rikastamiseen kit.

Aineisto kartoitettu viite genomin (GRCh37 /hg19) käyttämällä BWA ja SNP ja Indel calling tehtiin käyttäen mukautettua analyysiä putki. Perustuen COSMIC-tietokannan [9] ja tarkastelun Berns et ai. [5], 53 geenejä, jotka ovat usein mutatoitunut tai monistettu munasarjasyövän valittiin analyysejä (katso täydentää menetelmiä File S1 luettelo geenien).

analysointia geenimonistuman, vankka Z-score laskettiin per eksonin, kuten ovat kuvanneet Iglewicz ja HOAGLIN [25]. Geeni monistetaan Z-score on suurempi kuin 2 ja erittäin monistettiin jos se on yli 3.

Kiinteä eksoni sekvensointi on talletettu Euroopan Nucleotide Archive (PRJEB5114).

Mutaatio analyysi by Tagged-amplikoni syvä sekvensointi (Tam-Seq) B

koodaussekvenssit TP53, BRCA1, BRCA2, PTEN, PIK3CA, EGFR ja APC geenit monistettiin ja sekvensoitiin käyttämällä Tam-Seq menetelmää ja Fluidigm Access Array 48,48 (Fluidigm CA, USA) valmistajan protokollan mukaisesti, kuten aiemmin on kuvattu [26]. Sekvenssianalyysillä ja variantin tarkastusta suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [26], [27]. Alukesekvenssejä ovat saatavilla pyynnöstä. TAM-Seq data on talletettu Euroopan Nucleotide Archive (PRJEB5183).

mikrosatelliittien epävakaus

mikrosatelliittien epävakautta määritettiin käyttäen MSI Analysis System Version 1.2 (Promega) mukaan valmistajan protokollan ja kun suoritetaan rutiininomaisesti Elektroforeesin käyttäen ABI PRISM 3100 MSI määräytyy viisi mononukleotidi toista markkereita (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 ja MONO-27).

FACS-analyysit

solut kerättiin ja värjättiin asianmukaisesti titrattiin fluorokromiin konjugoituja monoklonaalisia vasta-aineita (kuten edellä on kuvattu [28]). Lyhyesti, solut värjättiin vasta-aineiden luminaaliseen sytokeratiini: n (CK) konjugoituna PE (seos sytokeratiini- 8, 18 -clone C11 ja sytokeratiini 19 -clone A53-B /A2-, Veridex LCC, Raritan, NJ), CD24- FITC: n (klooni SN3, eBiosciences, San Diego, CA), CD44-PeCy7 (klooni IM7, eBiosciences) ja EpCAM-FITC: n (klooni EBA-1, BD Biosciences, San Jose). CK värjäys edelsi tallennuksesta ja läpäiseväksi vaiheessa käytetään FIX PERM reagenssit (An Der Grub Bio Research GmbH, Itävalta). Proteiinin ilmentyminen mitattiin FACSCanto virtaussytometrillä (BD Biosciences). Signaali-kohina-suhde (S /N) laskettiin (ts geometrinen keskiarvo fluoresenssin intensiteetti (MFI) on värjättyä väestö jaettuna MFI unstained väestöstä) korjaamaan auto fluoresenssi.

Tilastot ja visualisointi

Tilastolliset analyysit tehtiin 33 solulinjat, jotka oli tuotettu ainutlaatuinen munasarjasyöpä potilaan materiaalia. Kopiot (SKOV3 ja A2780),

in vitro

johdannaiset (A2780ADR, A2780CIS, COV362.4 ja UWB1.289 + BRCA1) ja mahdollisesti saastunut solulinja ”COLO720E” jätettiin pois näistä analyysejä. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen epäparametrisia menetelmiä sisällä STATA tilastopaketista, vapauta 12,0 (STATA Corp., College Station, TX). P-arvot olivat kaksipuolisia ja P 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

BRB array työkalut (v4.3.1) käytettiin valita geenien ja MikroRNA ilmentyvät differentiaalisesti näiden kolmen morfologiset alatyyppiä. Ensinnäkin MikroRNA kanssa 80% puuttuvat arvot oli suodatettu pois. Sitten puuttuvat arvot, joita ei merkitty takia huonolaatuisia korvattiin pienin arvo kaikkien MikroRNA ja näytteet seurasi 2log normalisointi. Sisällä BRB, 50% eniten muuttuva MikroRNA ja mRNA: t valittiin ja luokan vertailun algoritmin avulla laskettiin permutaatio p-arvo jälkeen 10.000 yhdistelmää. P 0,05 pidettiin merkittävänä. Hierarkkinen klusterointi tehtiin mediaani keskitetty mRNA ja microRNA ilmaisun dataa Eisen Gene klusterin 3.0. Sillä GSE9891 datajoukon useita koettimia per geeni otettiin keskiarvo, joka vastaa lähimmin kyseistä lähestymistapaa eksoni paneelit (eli koetinsarjaa yhteenvetoa sisällä Affymetrix Expression Console -ohjelmaa). Seuraavaksi solulinja geenin ilmentymisen tietojen ja GSE9891 tiedot (lukuun ottamatta LMP näytteet) olivat mediaani keskitetty erikseen korjaamaan erot alustoja käytetään, ja sen jälkeen yhdistetään ennen hierarkkinen ryhmittely. Tunnistaminen biologisen funktion morfologian liittyvien geenien suoritettiin käyttäen IPA (v16542223, kekseliäisyyttä Systems).

Tulokset

Kuvassa 1 on yhteenveto koesuunnitelma myös viljelemällä kaikki solulinjat, joilla on sama viljelyolosuhteet välttää harhojen vuoksi vaihtelevia pitoisuuksia täydentää sisällä eri tavalla (esimerkiksi kasvutekijöitä) tai seerumin.

STR lyhyt tandem-toisto, MSI mikrosatelliittien epävakaus, PFS ilman taudin etenemistä

.

Short tandem-toisto (STR) analyysi

mitattu toistojen lukumäärä kullekin 16 STR loci sekä mainitaan STR profiileja julkisista tietopankeista ja kirjallisuudesta on esitetty taulukossa S3.

välistä yhdenmukaisuutta huiput vertailuprofiilit ja profiileja syntyy tässä tutkimuksessa oli 100% 22 solulinjojen, 90-99% kymmenen solulinjojen ja 79-89% neljälle solulinjoja. Kolmen solulinjoja, ei ole viittauksia saatavilla (taulukko S3).

Yksi solulinja, ”COLO720E”, osoitti vain 4% yhteensopivuutta STR profiilien julkaisema Korch et al. [29]. COLO720E on kuvattu olevan seos, COLO684 ja COLO685 solulinjoja, jotka ovat molemmat peräisin kohdun adenokarsinooma [30]. ”COLO720E” oli kaksi TP53 kuvattujen mutaatioiden (c.1118del1, c.C413T), joka tukee mahdollisuutta kahden solupopulaatioiden. Nämä kaksi TP53 mutaatiot äskettäin raportoineet Anglesio et al. vaikka niiden COLO720E solulinja ei vastaa julkisesti saatavilla STR viite [31]. Koska ”COLO720E ’on hiljattain vedetty pois ECACC solulinjasta arkistoon, voimme sulkea sitä edelleen tietojen analyyseissä.

Alkuperäinen

kirjallisuutta tietoa alkuperästä 39 solulinjojen on yhteenveto kuvassa 2 (lisätietoja taulukossa S1) [32] – [53]. Kolmekymmentä kolme solulinjat muodostettiin ainutlaatuinen potilaan materiaalista, joka ei sisällä päällekkäisiä lähteistä (SKOV3, A2780), in vitro johdannaiset (A2780ADR, A2780CIS, COV362.4, UWB1.289 + BRCA1) ja mahdollisesti saastunut solulinja ”COLO720E” . Histologia kuvattiin 30/33 solulinjojen ja osoitti samanlaista frekvenssijakaumaa verrattuna munasarjakarsinoomat pääosan ollessa vakavien (21/33) (kuva 2).

Morfologia

: E epiteelikasvaimet R Round, S Karan,

Histologia Otaksuttu Histologia

: S vakavien, HGS laadukkaat vakavien, LGS heikompilaatuisen vakavien, E endomet-, C selkeä solu, Mx sekoitettu, M mucinous.

Alkuperä

A askites, T kasvainkudoksen, TM kudosta etäpesäke, munasarjojen kasvain kudos, P pleuraeffuusio.

Aika

: P ensisijainen sairaus, R uusiutunut tauti, CR kliinisillä vastus.

Platinum käsitelty

: U käsittelemätön, P platinapohjaisen hoidon O muihin kemoterapia, R sädehoitoa.

proteiinimarkkereita

: kirkkaanpunainen no lauseke (signaali to-noise ratio 5), vaaleanpunainen pieni lauseke (signaali to-noise ratio 5-20), vaaleanvihreä lauseke (signaali to-noise suhde 20-200), kirkkaan vihreä korkea lauseke (signaali to-noise ratio 200), harmaa ei määritetty.

Therapy vastaus

: vihreästä punaiseksi mittakaavassa herkkä resistenttien.

Doubling aika

: vihreä alle yhden päivän, keltainen 1-2 päivää, oranssi 2 päivää.

MSI

microsatellite epävakautta.

Geenimutaatiot

: tummansininen tunnistaa ainakin kahdella tavalla, vaaleansininen tunnistaa yhdellä menetelmällä, vaaleanpunainen tunnistetaan yksi menetelmä, mutta ei toinen menetelmä.

Geenimonistus

: orange monistetaan (2-3x SD yläpuolella mediaani), punainen erittäin monistetaan ( 3x SD yläpuolella mediaani). Wnt /bCatenin reitin (WNT /bCAT) ja homologinen rekombinaatio korjaus (HRR) sarakkeet esittävät määrä mutatoituja geenejä näillä reittejä.

alkuperä (askites, kasvain kudos tai pleuraeffuusio), aika (ensisijainen sairaus, toistuminen, kliinisillä vastus) ja onko potilas saanut platinapohjaisen kemoterapian ennen kulttuuri tunnettiin 32, 21 ja 25 solulinjoissa vastaavasti. Kudos-alkunsa solulinjat olivat enimmäkseen platinaa hoitamattomilla potilailla (7/8, 88%) ja ensisijaisen sairauden (6/7, 86%), kun taas askites-alkunsa solulinjat olivat useammin platina-käsitelty (9/15, 60%) ja viljeltiin uusiutunut tai kliinisen vastus (10/12, 83%).

mikrosatelliittien epävakaus

mikrosatelliittien epävakautta kaikkien viiden markkereita tutkittu havaittiin: 2774, molemmat SKOV3 lähteet, IGROV1, TOV21G ja ”COLO720E” (kuvio 2). A2780ADR ja A2780CIS osoitti epävakaus neljä viidestä markkereita (NR-21, BAT26, NR-24, MONO-27) ja oli bi-alleelinen viidennen merkki BAT25. Sen sijaan vanhempien A2780 ECACC solulinja (myös Euroopan soluviljelmästä kokoelma ECACC) osoitti vain mikrosatelliittien epävakautta yksi merkki (NR-21) ja oli myös bi-alleeliset varten BAT25. Toinen A2780 lähde akateemisen laboratorio ei osoittanut microsatellite epävakautta (vain pieni muutos NR-21), mutta oli myös bi-alleeliset varten BAT25. Tämä osoittaa, että eri kulttuureissa saman solulinjan voi kehittyä tai valita geneettisiä eroja kuten aikaisemmin on kuvattu eri A2780 solulinjoilla [54].

Vaikka luvut ovat hyvin pieniä, neljä MSI solulinjat osoittivat merkitsevästi vähemmän konkordanssin niiden STR profiilin viite STR profiilin (U-testi, p 0,0013) ja enemmän mutaatioita kuin 29 ei-MSI solulinjoissa (mediaani 13 vs. 2 mutaatiot kohti solulinjaa, U-testi p 0,001 ).

morfologiset alatyyppejä

kolme morfologisia fenotyypit erottuivat perustuu kahteen riippumattomia havaintoja morfologisten ja kasvuominaisuudet aikana viljelemällä matalan tiheyden jopa 70 ta /80% konfluenssiin eli solu muoto, solu koko ja kasvu kuvio viljelyn aikana sekä leviämisen korko. Kuvio S1 esitetään edustavat kuvat kuusi esimerkkejä kunkin kolmen morfologiset alatyyppien havainnollistaa eroja solun muoto, koko ja kasvun mallin välillä morfologiset alatyyppejä. The ’Epiteelin ”morfologinen alatyypin leimasi litistetty epiteelin kaltaisia ​​soluja, jotka kasvoivat arkkia säännöllinen tai epäsäännöllinen klustereiden (n = 21). Vuonna ”Round” alatyyppi (n = 7), solukoko oli pienempi pyöreä muoto ja korkea lisääntymisnopeus. Solut kasvoivat erikseen tai epäsäännöllinen klustereita, noudatetaan väljästi kudosviljelylautasiin ja usein kasvoivat päällekkäin. Solut ”Karan” alatyyppi (n = 12), venytettiin ja karan muotoisia ja kasvoi erillisinä soluja tai epäsäännöllinen klustereita.

Oli assosiaation morfologian ja alkuperä 33 ainutlaatuinen solulinjat, 74 % epiteelisolujen linjojen peräisin askites (14/19), kaikki neljä Round solulinjoja kulttuurin kudoksesta, kun taas Kara solulinjat peräisin yhtä askites, kudoksesta tai pleuraeffuusio (kaikki 3/9, 33%) (Fisherin tarkka p = 0,002). Vaikka ei ole merkittävä, epiteelisolujen linjat olivat usein vakavien alkuperää (83%) verrattuna Round (33%) ja Kara (56%) solulinjat (Fisherin tarkka, p = 0,095).

Mielenkiintoista, morfologiset alatyyppi oli merkitsevästi yhteydessä ennen platinapohjaisen kemoterapian (10/14 epiteelikasvaimet oli aiemmin saanut platinaa perustuvaa hoitoa vs. 4/4 kierroksen ja 7/7 Kara käsittelemättömän linjat; Fisherin testiä, p 0,002).

Protein markkereita

ilmentymisen CD44, CD24, EpCAM ja luminaalinen sytokeratiinia: n on esitetty kuviossa 2.

kantasolujen markkeri CD44 ilmentyi 31/33 solulinjoista ja liittyi morfologiaa (Kruskal-Wallis p = 0,0037). Mielenkiintoista, 6/9 Karan solulinjat osoittivat korkeaa CD44 ilme yhdistettynä poissa CD24 ilme, jota on ehdotettu ominaisuus kantasolukkoa. Sitä vastoin CD44

korkea /CD24

– ilmaisu ei havaittu neljän kierroksen solulinjoissa että ainoastaan ​​6/20 epiteelisolujen linjat.

Epiteelin markkereita EpCAM ja luminal sytokeratiinivasta n ilmaistiin useimmissa epiteelisolujen linjat (19/20 ja 18/20 vastaavasti), mutta vain yhdellä Round solulinjassa (1/4). Kaikki Karan solulinjat osoittivat poissa tai hyvin alhainen ilmentyminen EpCAM mutta 5/9 ei ilmaista luminaaliselle sytokeratiinivasta n. EpCAM ja luminaali sytokeratiinivasta n ilmentyminen liittyi morfologia (Kruskal-Wallis, p 0,001 ja p 0,024 vastaavasti) sekä vakavien vs. ei-vakavien histologia (Mann-Whitney, p = 0,004 ja p = 0,108 vastaavasti).

geenimutaatio ja vahvistusta

mutaatio asema 53 geenien määritettiin kolme tekniikkaa: snapshot, kiinteitä ja /tai Tam-sekvenssi eksonin sekvensointi. Ristiriitainen tietoja näiden kolmen tekniikkaa tarkastettiin manuaalisesti raaka järjestyksessä tiedot. Taulukko S4 luetellaan kaikki mutaatio data josta on yhteenveto kuvassa 2. Kaikkiaan Havaitsimme 178 mutaatioita 45 geenien kaikissa 39 solulinjoissa. Yleisimmin mutatoitunut geeni oli TP53, mutatoituneet 27/33 solulinjojen 7/8 korkealaatuista vakavien, 9/10 serous ja odottamatta 3/3 heikompilaatuisen vakavasta.

Selvitimme monistuminen CCNE1, MYC, TPX2 ja erbB2 vertaamalla jaksotusta kattavuutta kunkin eksonin keskiviivan yleistä kattavuutta [55]. Monistaminen havaittiin CCNE1 (n = 5), MYC (n = 3), TPX2 (n = 3) ja erbB2-(n = 2) (kuvio 2, kuvio S2A-C). Kun verrataan genomivahvistuksen kunkin geenin mRNA: n ekspression, MYC ja TPX2 olivat erittäin ilmaistaan ​​suurin osa solulinjojen linjat, jotka osoittivat, vahvistus (tuloksia ei ole esitetty). Solulinjat osoittavat

erbB2:

tai

CCNE1

vahvistus oli suurinta näiden geenien ilmentymistä. Sillä

CCNE1

tämä yhdistys oli merkittävä (Mann-Whitney p 0,001, kuva S2D).

Response to kemoterapeuttisia

Kaikille huumeet, pitoisuus joka aiheuttaa 50% kasvun eston (GI 50-arvot) osoitti kahden kertaluvun välillä herkkiä ja resistenttejä solulinjoja (kuva 3). Erityisesti mediaani GI 50-arvot (nM) osoittivat selvästi eroja lääkkeiden kanssa yleisimmin erotetaan yhdisteitä, Doketakseli ja karboplatiini, jolla on 10000-kertainen ero (kuva 3).

Viikset ulottuvat 1,5 kertaa korkeus laatikko (eli 25

persentiili on mediaani ja mediaani 75

persentiili) tai, jos ei ole arvoa sillä alueella, minimiin tai maksimiarvot

.

ituradan mutaatioita

BRCA1

ja

BRCA2

on liittynyt vastauksena platina huumeita. Kuitenkin, ei ollut selvää yhteyttä välillä vastauksena platinan ja mutaatio asema tai ilmaus

BRCA1

ja

BRCA2

meidän kokeita (tietoja ei esitetty). Noin 50% BRCA mutaatioiden havaittu ei tiedetä olevan kliinisesti merkittäviä (taulukko S4), ja siksi ehkä ole vaikutusta BRCA toimintoa. Kuitenkin kaksi solulinjoja, joiden tiedetään ituradan mutaatioita BRCA1 (UWB1.289) ja BRCA2 (PEO1) olivat melko herkkiä Cisplatin.

vaste kaikkien huumeiden oli merkitsevä positiivinen korrelaatio proliferaationopeus solulinjat, eli kahdentumisaika (taulukko 1).

taulukossa 1 on esitetty yhdistyksen välillä lääke vasteen ja proteiinin ilmentymisen merkkiaineet CD44, CD24, EpCAM ja Luminal sytokeratiinia n. Mielenkiintoista, solulinjat, joilla on korkea CD44 ilme olivat herkempiä taksaaneja. Sitä vastoin solulinjat osoittavat korkea ilmaus luminal sytokeratiinia n olivat suhteellisen resistenttejä kolmelle platina huumeiden testattu, ja doksorubisiinin. Korkea ekspressio EpCAM korreloi myös suhteellisen resistenssin sisplatiinia. Luminaalisen sytokeratiinia ja EpCAM korreloivat voimakkaasti ja poissa ilmentymistä sekä merkkiaineiden oli yleisimmin nähty Round solulinjoja, jotka olivat yleisesti ottaen hyvin herkkä eniten terapeuttisia. Jos neljän kierroksen solulinjat ulkopuolelle, ainoa merkittävä assosiaatio havaittu oli välillä Oksaliplatiini vasteen ja ilmaus luminal sytokeratiini- n, mikä osoittaa, että tämä pieni ryhmä solulinjojen pääasiassa aiheuttaa muiden yhdistysten.

vieressä käyttäneet Spearmanin korrelaatio testata korrelaatiota GI50-arvot ja ilmaisu kunkin mRNA: n tai microRNA, jotta voidaan tunnistaa geenejä ja MikroRNA liittyy hoitovaste. Määrä mRNA liittyy vastauksena kahdeksan terapeuttisia testattu vaihtelivat 22-310 geeneistä (p 0,001) ja 1-10 MikroRNA (p 0,01). Kuvio 4 esittää kullekin mRNA ja microRNA korrelaatio ja merkityksen välillä sen ilmaisun ja vastaus sisplatiinia ja paklitakselia.

X-akseleiden spearman korrelaatio, Y-akselien -Log p-arvo.

Oletetut histologisia alatyyppejä

nimetty solulinjoja otaksuttu HGS tai endomet- /kirkas cell linjat, jotka perustuvat neljä kriteeriä. Perusteet otaksuttu HGS alkuperä olivat: 1) HGS alkuperää TP53 mutaatio eikä MSI, tai 2) vakavien alkuperää TP53 mutaatio ja monistaminen CCNE1, MYC tai TPX2. Kriteerit luulotellun endomet- /kirkas soluista olivat: 1) endomet- ja /tai kirkas solujen alkuperä, tai 2) ARID1A mutaatio.

Käyttämällä näitä kriteerejä, voimme päätellä oletetun histologinen alatyyppi varten 39 solulinjoja 20 non -serous (kuvio 2, viimeinen sarake ryhmä 1 2) ja 19 serous solulinjoja, jotka sisältyvät 14 korkealaatuisesta serous ja yksi matala-asteista vakavien linja (kuva 2, viimeinen sarake ryhmä 3-5).

ei-vakavien solulinjoissa, ryhmä 1 (katso myös kuvio 2), sisältää kymmenen solulinjat, jotka on kuvattu olevan ei-vakavien ja ainoastaan ​​COV362 ja 59 M, MYC vahvistusta ristiriidassa tämän. [11]. [11].