Krooninen sairaus

tiivistelmä

Novel strategiat ovat tarpeen parantaa kemoterapia vasteen kehittynyt ja toistuvia kohdun limakalvon syöpä. Tässä osoitamme, että terpenoids läsnä höyrytislataan Ote Ginger (SDGE) ovat voimakkaita estäjiä leviämisen kohdun limakalvon syövän soluja. SDGE eristetty kuudesta eri erien inkivääri juurakot, johdonmukaisesti esti leviämisen endometriumin syövän solulinjoissa Ishikawa ja ECC-1 IC

50 1,25 ug /ml. SDGE paransi myös anti-proliferatiivista vaikutusta säteilyn ja sisplatiinia. Vähentynyt lisääntyminen Ishikawa ja ECC-1-soluissa suoraa seurausta SDGE aiheuttaman apoptoosin osoituksena FITC-anneksiini V värjäys ja ilmaus pilkotun kaspaasi 3. GC /MS-analyysi havaintojen mukaan yhteensä 22 eri terpenoidiyhdisteitä in SDGE, jossa isomeerit neral ja geraniaali muodostavat 30-40%. Sitraali, seos neraali ja geraniaali inhiboivat Ishikawa ja ECC-1-solujen IC

50 10 uM (2,3 ug /ml). Fenoliset yhdisteet, kuten gingerol ja shogaol ei ole havaittu SDGE ja 6-gingerol oli heikompi inhibiittori leviämisen endometriumin syöpäsoluja. SDGE oli tehokkaampi asiakkuutta syöpäsolun kuoleman kuin Sitraali, mikä viittaa siihen, että muut terpeenit läsnä SDGE myös edistää kohdun limakalvon syöpä solukuolemaa. SDGE hoito johti nopeaan ja voimakkaaseen kasvuun solunsisäisen kalsiumin ja 20-40%: n lasku mitokondrion kalvon potentiaalia. Ser-15 p53 fosforyloitiin 15 min kuluttua hoidon syöpäsolujen kanssa SDGE. Tämä lisäys p53 liittyi 90%: n lasku Bcl2 taas mitään vaikutusta ei havaittu Bax. Estäjä p53, pifithrin-α, heikennetty syövän vaikutukset SDGE ja apoptoosin myös ei havaittu p53

neg SKOV-3-soluja. Tutkimuksemme osoittavat, että terpenoids peräisin SDGE välittäjänä apoptoosin aktivoimalla p53 ja olisi sen vuoksi tutkitaan aineina kohdun limakalvon syövän.

Citation: Liu Y, Whelan RJ, Pattnaik BR, Ludwig K, Subudhi E, Rowland H, et al. (2012) terpenoids alkaen

Zingiber officinale

(Ginger) apoptoosin in Endometrial Syöpäsolut kautta aktivointi p53. PLoS ONE 7 (12): e53178. doi: 10,1371 /journal.pone.0053178

Editor: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital Research Center, Saudi-Arabia

vastaanotettu: 10 elokuu 2012; Hyväksytty: 26 marraskuu 2012; Julkaistu: 31 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitusta tutkimuksen tarjosi avustusta osasto Naistenklinikka AK ja MSP, lahjoitus Jean McKenzie ja tutkimus avustusta Wisconsin munasarjasyöpä Alliance MSP ja Rebecca Meyer Brown professuuria UW-Eye Research Institute (Retina Research Foundation) BRP. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

vuonna 2011 noin 8010 naista kuoli johtuu kohdun limakalvon syöpä ja lähes 47130 potilasta vasta diagnosoitu tämä syöpä [1]. Noin 70% naisista, joilla on diagnosoitu kohdun limakalvon syöpä, tauti löydetään lokalisoitu kohdun corpus ja viisi vuoden pysyvyys on peräti 85% [2]. Advanced ja toistuvia kohdun limakalvon syöpä potilaita, kirjoilla useita gynekologisia Oncology Group (GOG) tutkimuksissa aineet, mukaan lukien platina, taksaanit ja antrasykliinit, harvoin täydellinen vaste terapiaan [3] – [9]. Yhdistelmähoitoihin osoittavat korkeampia hoitovaste, mutta ilman taudin etenemistä ajan näiden hoitojen on suhteellisen alhainen (5-7 kk), joilla on korkeampi sairastuvuus ja jatkuva puute parannuskeinoa [10]. Nämä tilastot korostavat tarvetta kehittää uusia ja tehokkaita kemopreventiivisiä ja kemoterapeuttisten aineiden endometriumsyöpään.

Luonnollinen ravinnon komponentteja saada merkittävä bioaktiivisia yhdisteitä, jotka voivat toimia sekä chemopreventive sekä kemoterapia-aineiden vasten kohdun limakalvon ja muut syöpätyypit [11]. Meidän lab tutkii parhaillaan syövän ominaisuuksia yhdisteiden läsnä inkiväärin juurakot (

Zingiber officinale

). Nämä tutkimukset tukevat aiemmissa tutkimuksissa, jotka osoittavat, että kuiva inkivääri jauhetta tai liuotinuutoksista inkivääri juuret aiheuttaa solukierron pysähtymisen ja apoptoosin iho, rinta-, eturauhas-, paksusuoli-, ja munasarjasyövän solujen [12] – [17]. Ajankohtainen soveltaminen Etanolisuodos uutteen inkivääri laski esiintyvyys, koko ja lukumäärä DMBA /TPA tuumoreita SENČAR hiirissä [18].

Suurin osa aiemmat tutkimukset ovat päätellä, että bioaktiiviset komponentit kuiva-aine ja liuotin uutteesta inkivääri juurakot vastuussa syövän toimet ovat fenoliset yhdisteet, 4-, 6-, 8- ja 10-gingerols, paradol, ja shogaol, tuote muodostuu kuivauksen jälkeen tai lämmityksen juuret [19] , [20]. Nämä fenoliset yhdisteet, ja erityisesti gingerols omaavat antiproliferatiivisia ja antiangiogeenisiä ominaisuuksia osoituksena

in vitro

ja

in vivo

tutkimukset eri syövän mallit [13], [14], [16], [21] – [25]. Paksu- ja peräsuolisyövän soluja käsiteltiin 6-gingerol esti soluproliferaatiota indusoimalla G1 solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin [26]. Gingerols esiintyy näitä syöpälääkkeen vaikutuksia kautta useita mekanismeja, jotka sisältävät proteiinien hajoaminen sekä β-kateniinin, PKC delta, ja GSK3 beta reittejä [26]. Studies in the munasarjasyöpä malli ovat osoittaneet, että 6-shogaol inhiboi VEGF syöpäsolut [16]. 6-gingerol indusoi apoptoosin eturauhassyövän LnCaP lisäämällä p53: n ja Bax ja samalla vähentää ilmentymistä Bcl-2 [16], [17], [21].

Lisäksi jauhetut inkivääri ja liuotinuutto, bioaktiivisten yhdisteiden voidaan myös eristää höyrytislauksella tämän juurakot [27], [28]. Parhaan tietomme mukaan vain rajoitettu tutkimukset on tehty osoittaa syövän ominaisuuksia on höyrytislataan otteet inkivääri. Kemiallinen analyysi höyrytislataan ote inkivääri osoittaa, että aiemmin tunnistettu bioaktiiviset fenoliyhdisteitä ovat läsnä hyvin pieni pitoisuus höyrytislataan otteet inkivääri [27]. Nykyisessä tutkimuksessa osoitamme, että höyrytislataan uutteet inkivääri ovat voimakkaita välittäjiä apoptoosin kohdun limakalvon syövän soluissa. Meidän tutkimukset viittaavat siihen, että yksi tärkeimmistä bioaktiivisten komponenttien höyrytislataan uutteen inkivääri on sitraali (seos kahdesta terpenoidien isomeerien, neraali ja geraniaali). Osoitamme, että käsittely endometriumin syöpäsolujen kanssa höyrytislataan ote inkivääri johtaa merkittävään kasvuun solunsisäisen kalsiumin, vähenee mitokondrion kalvon potentiaalia, kasvaa ilmentymistä kaspaasi 3, fosforylaatiota P53, ja merkittävä lasku ilmaisua Bcl-2. Havainnot hahmoteltu meidän tutkimukset osoittavat, että höyrytislataan ote inkivääri ja sen bioaktiiviset komponentit potentiaalia kehitetään kemopreventiivisiä ja kemoterapeuttisten aineiden endometriumsyöpään.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit ja Solulinjat

Pifithrin-α ostettiin Sigma Life Science. DMEM (Dulbeccon modifioituun Eaglen Medium), RPMI-1640, Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), ja Dulbeccon fosfaattipuskuroitu suolaliuos (DPBS) olivat Cellgro (Manassas, VA). DiOC6, Ionomycin ja Indo 1-AM ostettiin Life Technologies (Grand Island, NY). SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate RIPA puskuriin ja proteaasiestäjäseostabletit olivat ThermoFisher Scientific (Waltham, MA). Ensisijainen kaspaasi-3-Rabbit-vasta-aine, Bcl-2-Rabbit-vasta-aine, Bax Rabbit vasta-aine, Phospho-P53 hiiri-vasta-aineen ja β-aktiini hiiri-vasta-aine hankittiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Peroksidaasikonjugoitua AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG vasta-ainetta ja peroksidaasilla konjugoitu AffiniPure Goat anti-hiiri-IgG-vasta-olivat Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA). FITC-anneksiini V Apoptosis Detection Kit hankittiin BD Pharmingen (San Diego, CA). ECC-1 [29], [30] ja Ishikawa [31] soluja lahja Drs. Elaine Alarid ja David Olive (Madison, WI), tässä järjestyksessä. SKOV-3-soluja hankittiin ATCC: ltä (Manasas, VA).

Cell Culture

Ishikawa-soluja kasvatettiin DMEM: ssä ja ECC-1 ja SKOV-3-soluja kasvatettiin RPMI-elatusaineeseen, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% penisilliini /streptomysiiniä antibioottien 5% CO

2-inkubaattorissa.

Steam tislaus Ginger juurakot

Ginger juurakot saatiin paikallisilta toimittajilta , puhdistettu tislattua vettä ja leikataan 0,5 cm palasiksi. Noin 250-300 g leikatun inkivääripaloista siirrettiin 1000 ml: n pyörökolviin ja Clevenger höyrytislauslaitteeseen. Inkivääri juuret upotettiin 500 ml: aan deionisoitua vettä (18 MOhm-cm) ja höyryä tislaus suoritettiin 4-6 tuntia kuumentamalla pulloa. Öljy erottaa vuonna Clevenger laitetta on vettä kevyempää ja erotettiin ajoittain valuttamalla neste kertyminen erotusputkesta yksikön. Öljy heti alikvooteiksi mikrofugiputkissa ja jäädytetään kunnes käyttää määrityksissä. Tiheys öljy laskettiin olevan 0,87 g /ml, ja tämä mittaus käytetään laskettaessa pitoisuus uutetta, jota käytetään johtamaan biologisia määrityksiä.

soluproliferaatiomääritykset

Effect höyryn tislattu inkivääri uutteet, sitraali, ja 6-gingerol proliferaatioon syövän solulinjojen määritettiin 3- (4,5-dimethythiazol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) oton menetelmällä [32 ], [33]. Lyhyesti, syövän solut maljattiin 96-kuoppaiselle levylle tiheydellä 5000 solua /kuoppa niiden väliaineessa. Solut käsiteltiin sitten eri pitoisuuksilla inkivääriuute (0,025 ug, 0,25 ug, 2,5 ug, 6,25 ug ja 12,50 ug /ml) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ympäristössä 24 tuntia, 48 h ja 72 h. Jälkeen määritetyn ajan kuluessa, 20 ui 3- (4,5-dimethythiazol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi, lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa vielä 3 tuntia. Formatsaanikitei- muodostuneet kiteet kuopissa liuotettiin 100 ui DMSO: ta. Absorbanssi mitattiin 570 nm: ssä käyttäen Spectra MAX 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Yhdistetty hoito syöpäsolujen kanssa SDGE ja säteily tai kemoterapiaa

MTT testit suoritettiin määrittämään jos SDGE parannettu anti-leviämisen säteilyn vaikutusta tai kemoterapiaa kohdun limakalvon syövän solut. Ishikawa tai ECC-1-solut maljataan useille 96 kuoppalevyillä (5 x 10

3 solua /kuoppa) päivänä 1 kokeen. Sen jälkeen, kun solut vakauttamiseksi, media tai SDGE lisättiin kuoppiin, jotka sisältävät endometriumin syövän solut päivänä 2. Solut joissakin kuopat myös sisplatiinia (5 uM), kun taas toiset säteilytettiin kerta-annoksen 4 Gy käyttäen Cesium-137 jäähdytin. Näiden hoitojen, soluja viljeltiin 72 h ajan 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ympäristössä. Hoidon proliferaatioon ja kohdun limakalvon syövän solut määritettiin suorittamalla MTT määrityksissä kuten edellä on kuvattu.

Gas Chromatography-Mass Spectrometry of SDGE

erottaminen ja tunnistaminen yhdisteiden SDGE käytettyjen näytteiden Shimadzu GC-17A kaasukromatografin varustettu QP-5000 kvadrupolimassa- analysaattori (Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD). Ennen analysointia, 20 ui juuri sulatettua SDGE liuotettiin 1000 ul: aan pentaania. 1 ui tätä liuenneen uutteen injektoitiin manuaalisesti kaasukromatografiin käyttäen 01:50 sisääntulon jakosuhteen ja heliumia kantajakaasuna kaasun virtausnopeudella 1,4 ml /min. Kaasukromatografin sisälsi ei-polaarisella RTX-5MS sarakkeen (30 m pitkä, 0,25 mm ID, 0,25 um kalvon paksuus; Restek, Bellefonte, PA.) Pylvään lämpötila oli aluksi 70 ° C, minkä jälkeen ramppi 4 ° C /min 180 ° C. Electron ionisaatiodetektiota oli täydessä-scan, positiivinen ioni tila yli massa-ja varauksen suhde (m /z) välillä 41 300. Yhdisteet alustavasti määrittänyt etsimällä NIST kirjasto ja vertaamalla aritmeettinen säilyttäminen indeksien arvoihin raportoitu Adams [34].

mittaus Apoptoosi virtaussytometria

Apoptoosi mitattiin käyttäen FITC-anneksiini V: Apoptosis Detection kit (BD Pharmingen, San Diego, CA). Lyhyesti, 2 x 10

6-soluja käsiteltiin 0,25 ug /ml inkivääriuute kanssa tai ilman 100 uM Pifithrin-α. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 0-16 tuntia, solut pestiin kaksi kertaa kylmällä PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen 1 x sitomispuskurissa (10 mM HEPES /NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl

2) pitoisuutena 1 x 10

6 solua /ml. Sitten 1 x 10

5 solua 100 ul: ssa sitomispuskurissa, siirrettiin 5 ml: n putkiin ja värjättiin 5 ui FITC-anneksiini V: n ja 5 ui propidiumjodidia (PI). Solut pyörresekoitettiin varovasti ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 15 min ajan. Pesun jälkeen solut 1 x sitoutumispuskuria poistaa ylimääräinen FITC-anneksiini V: n ja PI, solut analysoitiin FACSCalibur-virtaussytometrillä. Aineisto analysoitiin käyttämällä FlowJo ohjelmistoa.

Cell cycle määrityksessä.

kohdun limakalvon syöpä soluja käsiteltiin SDGE (250 ng /ml tai 2,5 ug /ml) 24, 48, ja 72 h. Käsittelyn jälkeen solut otettiin talteen, pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin 75% etanolilla, pestiin PBS: llä ja värjättiin propidiumjodidilla. Virtaussytometria suoritettiin sitten analysoida näytteiden sekä apoptoosin ja solusyklin tilan, kuten aiemmin on kuvattu [35].

Western blot -analyysi

Käsittelyn jälkeen solut kanssa höyrytislataan uutteet inkivääri syöpä solut pestiin jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja lyysattiin RIPA-puskurilla (Pierce, Rockford, IL), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoriseoksen (Thermo Scientific, Rockford, IL). Kokonaismäärä proteiinin lysaatti määritettiin käyttäen BCA-määritystä (Pierce). Solulysaatit ladattiin 25 ug /kuoppa 7,5 tai 12% ratkaisemiseksi polyakryyliamidigeelillä ja erotettiin elektroforeesilla, jonka jälkeen, proteiinit siirrettiin PVDF-kalvoille. Membraanit blokattiin 5% maitoa Tris puskuroidussa suolaliuoksessa ja tutkittiin sopivan primaarisen vasta-aineita. Piparjuuriperoksidaasi konjugoitu sekundäärisen vasta-aineita ja SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (Thermo Scientific, Rockford, IL) käytettiin havaitsemiseen proteiinien blotit. Kalvot skannattiin käyttäen FluorChem 890 ja Image J ohjelmisto käytettiin määrällisesti intensiteetin bändejä.

Mitokondrioiden kalvojännite Pitoisuus

endometriumsyöpään soluja kasvatettiin T25 kudosviljelykolveissa. Eksponentiaalisesti kasvavat solut käsiteltiin 0,025 ug /ml tai 0,25 ng /ml inkivääriuute 24 tuntia. Sitten solut pestiin ja kerättiin. 1 x 10

6 solua lisättiin kuhunkin virtausputken käsittelemättömästä, 0,025 ug /ml ja 0,25 ug /ml inkivääriuute käsiteltyjen solujen. Soluja käsiteltiin 40 nM DiOC6 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Sitten solut pestään, suspendoidaan uudelleen 400 ul: aan PBS: ää, joka sisälsi 2% FBS: ää ja analysoitiin FACSCalibur-virtaussytometriä arvioida mitokondrion kalvon potential.The tiedot analysoitiin käyttäen FlowJo ohjelmistoa.

Kalsium Flux Mittaukset

Euroopan Ishikawa soluja log-vaiheen kasvun kerättiin käyttämällä trypsiiniä. Solut (1,2 x 10

7) pestiin kolme kertaa ja suspendoitiin 1 ml: aan 0,5% naudan seerumin albumiinia (BSA), joka sisälsi Hanks puskuroitua suolaliuosta, joka ei sisällä mitään kaksiarvoisia kationeja. Solut ladattiin Indo 1-AM (2 uM), kun läsnä oli 4 mM probenesidiä ja 30 min 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ympäristössä. Sitten solut pestiin ja suspendoitiin uudelleen Dulbeccon fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen, joka sisälsi 0,5% BSA: ta ja 1 mM CaCl

2: n lopulliseen konsentraatioon 2 x 10

6 solua /ml. Solut suodatettiin 35 mikronin kalvosuodattimen ennen virtaussytometria on LSR-II sytometrin. Alussa soluja analysoitiin 3 min määrittää solunsisäisen kalsiumpitoisuuden. SDGE (0,025, 0,25 tai 2,5 ug /ml) tai ionomysiini (1 uM, käytettiin positiivisena kontrollina) jälkeen lisättiin soluihin ja muutos Indo-1 fluoresenssi määritettiin jatkuvasti streaming solut virtaussytometrin lävitse ja noin 7 min. Saatuja tietoja analysoitiin FlowJo ohjelmistoa.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi tehtiin käyttäen GraphPad Prizm ohjelmisto. Kynnys tilastollinen merkittävyys on todennäköisyys 0,05. Aineisto analysoitiin käyttämällä paritonta t-testiä.

Tulokset

eristäminen höyrytislataan Otteita Ginger Roots

eteeriset öljyt voidaan kätevästi eristää inkivääri juuret höyrytislauksella vuonna modifioitu Clevenger laitetta. Olemme pystyneet eristämään noin 300 mg eteerisiä öljyjä 250 g inkivääri juuret saadaan paikallisilta kaupallisilta myyjiltä. Yhteensä viisi erissä inkivääri juurakot, kukin saatu erillinen kaupallisesta lähteestä, käytettiin eristämään eteeriset öljyt höyrytislauksella. Kaksi näistä viidestä erien inkivääri saatiin paikallisilta toimittajilta Bhubaneshwar, Intia ja höyry tislaus suoritettiin myös paikan päällä. Loput kolme erää inkivääri saatiin toimittajilta Wisconsinissa ja höyrytislauksella inkivääri toteutettiin laboratorio- University of Wisconsin. Saanto eteerinen öljy oli verrannollinen kaikissa erissä inkivääriä juuret tässä tutkimuksessa käytetty ja tiheys SDGE määritettiin olevan noin 0,87 g /l.

höyrytislataan inkivääriuute on voimakas estäjä endometriumsyöpätapausta Cell Proliferation

eteeristen inkivääri testattiin ensin niiden vaikutus leviämisen kaksi kohdun limakalvon syövän (ECC-1 ja Ishikawa) solulinjat. Sekä kohdun limakalvon syöpä solulinjat olivat herkkiä SDGE pitoisuus niinkin alhainen kuin 250 ng /ml (kuvio. 1A ja B), solujen lisääntyminen inhiboitui merkittävästi (P ​​ 0,05), 2,5 ug /ml pitoisuutena. Soluproliferaatioon tiedot sekä solulinjoja kuviossa. 1A ja B edustavat kumulatiiviset tiedot tehdyistä kokeista suoritettiin SDGE eristetty kolmesta eri erissä inkivääri juurakot. Kuusitoista rinnakkaista käytettiin kunkin ehto testataan jokaisen erän SDGE. Siksi jokainen data kohta kuvassa. 1 on keskimäärin 48 erillisten lukemat ja näyttää vain vähäiset erot mittauksissa, mikä osoittaa selvästi hyvin toistettavissa vaikutuksia SDGE erien proliferaatioon ECC-1 ja Ishikawa-soluja. Analyysi tietojen leviämisen määrityksessä osoitti, että 72 tunnin aikapisteessä, IC

50 SDGE sekä solulinjoissa oli noin 1,25 ug /ml.

Effect of SDGE soluproliferaatioon määritettiin johtavat MTT määrityksiä. Solut Ishikawa (A), ja ECC-1 (B), inkuboitiin kuvattu pitoisuudet SDGE 24, 48, ja 72 h. Optinen tiheys 570 nm: ssä määritettiin määrällisesti elävien solujen lukumäärä viljelmissä. Ohjaus (Con) kuopat kaikissa kokeissa hoidettiin DMSO, ajoneuvon hallinnassa. Kumulatiiviset tiedot SDGE eristetty kolmesta eri erissä inkivääri juurakot näkyy. Kukin tietopiste kaikissa kuvioissa on keskiarvo 48 erillisiä lukemia. Anti-proliferatiivinen vaikutus tuotetaan SDGE (2,5 ug /ml), Ishikawa (C ja E) ja ECC-1 (D ja F) soluissa oli verrattavissa hoitoa näiden kahden solulinjan säteilyn (C ja D) tai sisplatiinin (E ja F). Solut käsiteltiin samanaikaisesti SDGE ja säteily (4 Gy) tai sisplatiinin (5 uM). MTT testit suoritettiin vaikutuksen määrittämiseksi näiden hoitojen leviämisen Ishikawa ja ECC-1 solulinjoissa. Jokainen bar C-F edustaa keskiarvoa kahdeksan rinnakkaista. * P 0,001,

# p 0,05 ja

† p 0,05 (ei merkitsevä).

Yhdistetty hoito SDGE ja säteily tai sisplatiinia Tuottaa Enhanced anti-proliferatiivinen vaikutus

Advanced endometriumsyöpään hoidetaan käyttämällä säteilyn ja kemoterapiaa. Siksi tutkittiin jos yhdistetty käsittely endometriumin syöpäsolujen kanssa SDGE ja säteilyä tai sisplatiinin tuotettu parannetun antiproliferatiivinen vaikutus ECC-1 ja Ishikawa soluja. Tulokset MTT-määritystä osoitti, että SDGE käsittely laski proliferaatiota kahdessa solulinjassa 40% ja tämän laskun proliferaatiossa, ECC-1-soluissa, oli verrattavissa havaittiin soluissa, joita oli käsitelty säteilyllä yksin (kuvio. 1C ja D). Siinä tapauksessa, Ishikawa solujen proliferaation esto tuottaman SDGE oli noin 10% korkeampi kuin mitä havaittiin säteilyllä yksin (Fig. 1 C). Lopuksi, kun kyseessä on sekä ECC-1 ja Ishikawa-soluja, yhdistetty hoito SDGE ja säteily parantaa inhiboiva vaikutus proliferaatiota 23-25% verrattuna soluihin, joita oli käsitelty vain säteilyä (Fig. 1 C ja D) .

Seuraavaksi testasimme myös yhdistetty vaikutus SDGE ja sisplatiinin päälle Ishikawa ja ECC-1-soluissa. MTT, jotka suoritetaan 72 tunnin kuluttua hoidon osoitti, että yhdistetty hoito SDGE ja sisplatiinin vähentynyt proliferaatio Ishikawa solujen lisäksi 26% verrattuna sisplatiinin ainoa hoito (Fig. 1 E). Sen sijaan, me emme ole noudattanut parantaa edelleen proliferaation esto, kun ECC-1-soluja käsiteltiin yhdistelmällä SDGE ja sisplatiinin (kuvio. 1 F).

Nämä kokeet on myös antanut meille mahdollisuuden tehdä suhteellisen vertailu sytotoksisten vaikutusten SDGE kanssa sisplatiinia. Kun käytetään yksinään, Sisplatiini (5 uM; 1,5 ug /ml) vähensi leviämisen Ishikawa ja ECC-1-solujen 59%: lla ja 61%, vastaavasti verrattuna kontrolliin (Fig. 1 E ja F). Kun SDGE (2,5 ug /ml) käytettiin yksinään, esto leviämisen Ishikawa ja ECC-1-soluissa oli 37% ja 42%, vastaavasti, verrattuna kontrolleihin (Kuva. 1 E ja F). Nämä tulokset viittaavat siihen, samanlainen sisplatiinia, SDGE oli myös erittäin voimakas estossa kohdun limakalvon syöpä solujen lisääntymistä, joka tarjoaa vahvan perusteita lisätutkimuksia mekanismia, jolla tämä kasvitieteellinen uute tuottaa sen syöpälääkkeen vaikutuksia.

esto kohdun limakalvon syöpä Cell Proliferation kautta apoptoosi

MTT tutkimukset osoittivat, että SDGE oli tehokas inhibiittori leviämisen endometriumin syövän solulinjoissa. Vähentynyt proliferaatio kohdun limakalvon syövän solulinjat oli suora seuraus indusoiman apoptoosin soluissa seuraavat SDGE hoitoon. SDGE niinkin pienillä pitoisuuksilla kuin 250 ng /ml aiheutti lisääntymisen pinnan sitoutumisen FITC-anneksiini V: n ja propidiumjodidivärjäys määritettynä virtaussytometrialla (kuvio. 2A). Kasvu FITC-anneksiini V-positiivisia soluja havaittiin niinkin aikaisin kuin 30 minuutin kuluttua SDGE lisättiin soluviljelmiin (Fig. 2A). Western blot-analyysi vahvisti lisääntynyt ekspressio kaspaasi 3 ECC-1 (tuloksia ei ole esitetty), ja Ishikawa-soluja, joita oli käsitelty 24, 48, ja 72 h 250 ng /ml: n konsentraation SDGE (Fig. 2B). Seuraavaksi testasimme jos SDGE myös indusoivan solusyklin pysähtymisen endometriaalisessa syöpäsoluja. Ishikawa-soluja vuoksi käsiteltiin 250 ng /ml tai 2,5 ug /ml SDGE 24, 48, ja 72 h. Solut leimattiin propidiumjodidilla ja solusyklin tilan seurattiin virtaussytometrialla (Fig. 2C). Tämä analyysi osoitti, että SDGE ei aiheuttanut merkittävää vaikutusta solusyklin tilan soluja. Vain vähäistä laskua havaittiin solujen prosenttiosuus S-vaiheen solusyklin. Kuitenkin, tämä lasku havaittiin ainoastaan ​​silloin, kun Ishikawa-soluja käsiteltiin 2,5 ug /ml. Solujen käsittelyn 250 ng /ml ei indusoinut mitään muutosta solusyklin tilan, vaikka tämä pitoisuus SDGE indusoi apoptoosin syöpäsoluissa.

Ishikawa-soluja käsiteltiin 250 ng /ml SDGE varten 30 min, 2 h, 4 h, ja 16 h. Inkubaation jälkeen SDGE, solujen eloonjääminen määritettiin leimaamalla solut FITC-konjugoidulla FITC-anneksiini V: n ja propidiumjodidin (A). Solut analysoitiin virtaussytometrillä ja solukuoleman ja apoptoosin tunnistettiin tapahtumia, jotka olivat yksi positiivisia FITC-anneksiini V (oikeanpuoleiseen alanurkkaan) tai kaksinkertainen positiivinen sekä FITC-anneksiini V ja proidium jodidi (oikeasta yläneljänneksestä). SDGE aiheuttama apoptoottisen solukuoleman kohdun limakalvon syövän solujen vahvistettiin havaitseminen lohkaista kaspaasi 3 Western blot-analyysillä (B). Kasvu katkaistun kaspaasi 3 tasossa havaittiin, kun Ishikawa soluja käsiteltiin SDGE (250 ng /ml) 0, 24, 48, ja 72 h. Data A ja B edustaa tuloksia saatiin kolmessa erillisessä kokeessa,

kemiallinen koostumus SDGE

voimakas anti-syöpä vaikutuksia SDGE sai meidät tutkimaan mahdollisia bioaktiiviset ainesosat inkivääri, että todennäköisesti indusoivat apoptoosin kohdun limakalvon syövän solulinjoissa. SDGE eristettiin kolme erillistä erää inkivääri juuret analysoitiin GC-MS: llä. Inkivääri uute laimennettiin pentaanilla ja haihtuvat komponentit erotettiin kautta ei-polaarinen RTX-5MS sarakkeen (Fig. 3). Yksittäiset huiput eluoituvat kolonnista analysoitiin elektroni ionisaation massaspektrometrialla. Analyysi säilyttäminen indeksien ja massaspektrit antanut meille mahdollisuuden tunnistaa yhteensä 22 yhdisteiden SDGE (taulukko 1). Suhteellinen osuus kaikista tunnistetuista komponentin määritettiin myös tässä analyysissä. Tulokset osoittivat, että SDGE eristetty eri erien inkivääri juurakot oli verrattavissa sen kemiallisten ainesosien.

kolme erillisinä valmisteina SDGE, kaksi USA (kutsutaan Wisconsin 1 ja 2) ja yksi Intiasta erotettiin ei-polaarinen kaasun kromatografiakolonniin. Yhdisteet erottava Tähän pylvääseen tunnistettiin massaspektrometrillä. Yhdisteet tunnistetaan tämän analyysin sekä niiden suhteellinen runsaus on esitetty taulukossa 1.

GC-MS-analyysi johti myös päätellä, että SDGE ei sisällä merkittäviä määriä fenolisia yhdisteitä, gingerol, shogaol, ja paradol jotka on aiemmin tunnistettu syöpälääkkeiden läsnä inkivääri jauhe ja liuotin otteet inkivääri juurakot [20], [24], [25], [36]. Tämä data tukee myös havainto, että 6-gingerol ei inhiboida Ishikawa ja ECC-1-soluissa, vaikka testattiin pitoisuuksilla kuin 150 uM (Fig. 4A ja B).

MTT määrityksissä olivat suoritettiin vaikutuksen määrittämiseksi 6-gingerol (A ja B) ja sitraali (C ja D) proliferaatioon Ishikawa ja ECC-1-soluissa. Kukin tietopiste on keskiarvo 16 erillisiä lukemia. Näiden tietojen perusteella IC

50 sitraalin laskettiin olevan 15-25 uM.

terpenoids olivat olennaisimpia SDGE yksilöityjen GC-MS-analyysiä. Neral ja geraniaali ovat isomeerejä, jotka ovat kollektiivisesti kutsutaan Sitraali. Nämä kaksi yhdisteet muodostivat noin 35-45% kokonaismäärästä kemiallisten komponenttien tunnistettu meidän analyysi (taulukko 1).

in vitro

määrityksissä havaittiin, että hoito Sitraali johti merkittävään väheneminen leviämisen Ishikawa ja ECC-1-soluissa. IC

50 Sitraali sekä solulinjoissa oli välillä 15-25 uM (Fig. 4C ja D). Tämä IC

50 konsentraatio sitraalin vastaa 2,28-3,8 ug /ml. Vertailun vuoksi SDGE oli tehokas IC

50 1,25 ug /ml. Koska vain 35-45%: n SDGE koostuu Neral plus geraniaali, IC

50 pitoisuus SDGE vastaa vain 2,8-3,7 uM sitraalin. Tämä taso sitraalin on merkittävästi pienempi kuin IC

50 pitoisuus lasketaan tämän agentin meidän in vitro lisääntymismäärityksissä (Fig. 4C, D). Sen vuoksi päättelimme, että lisäksi sitraali, on olemassa muita bioaktiivisia komponentteja, jotka vaikuttavat merkittävästi syövän vaikutukset SDGE. Siksi teimme mekanistinen tutkimukset listattu alla SDGE sijasta Sitraali kuten bioaktiivisen aineen.

SDGE indusoi kalsiumvuomäärityksiä ja heikentää Mitokondrioiden kalvojännite

hoito Ishkawa solujen SDGE johtanut merkittävään tulva solunsisäisessä kalsiumin (Kuva. 5A). Kasvu solunsisäisen kalsiumin havaittiin noin 3 min lisäämisen jälkeen SDGE. Aika kinetiikka ja yleistä profiilia kalsiumvuomäärityksiä olivat samanlaisia ​​kuin käsitellyissä soluissa ionomysiinillä. Amplitudi kalsiumvuomäärityksiä vaste oli riippuvainen pitoisuudesta SDGE. Tällä korkein pitoisuus SDGE testattu, suurin kalsiumvuomäärityksiä havaittu oli noin 60-70%: n vaste havaittiin ionomysiinin (1 um). Ionomysiini aiheuttama äkillinen nousu solunsisäisen kalsiumin tasoa, joka laski sitten noin minuutin sisällä, mutta kaikkien pitoisuuksien SDGE testattu nousu ja myöhemmin lasku solunsisäisen kalsiumin oli suhteellisen hidas (Kuva. 5A). Kalsiumvuomäärityksiä väheni 5-6 min lisäämisen jälkeen SDGE mutta ei saavuttanut esikäsittely tasoja (Fig. 5A).

Effect of SDGE solusisäiseen kalsiumvuomäärityksiä määritettiin käsittelemällä Indo-1 ladattu Ishikawa soluja (A) . Välittömästi lisäyksen jälkeen SDGE solususpensioihin, Ishikawa solut virtasi sytometri ja fluoresenssin kasvu mitattiin havaita kalsiumvuomäärityksiä. Vähennys mitokondrion kalvon potentiaali havaittiin kuormittamalla Ishikawa soluja DiOC6 (B). SDGE tai ajoneuvon hallinnan lisättiin soluihin. 24 tunnin kuluttua hoidon jälkeen solut kerättiin ja niitä inkuboitiin DiOC6 15 min. Fluoresenssi mitattiin muutosten määrittämiseksi mitokondrion kalvon potentiaalia.

kasvu kalsiumin ja induktion apoptoosin SDGE käsitelty ECC-1 ja Ishikawa solujen ehdottivat alijäämää mitokondrioiden toimintaan. Mittaus mitokondrion kalvon potentiaalia osoitti 2-kertaisesti alentunut Ishikawa-soluja, joita oli käsitelty 24 h 25 ng /ml tai 250 ng /ml SDGE (Fig. 5B).

SDGE käsittely Tulokset Nostamalla Bax /Bcl-2-suhde

Bcl-2 on anti-apoptoottinen proteiini, joka assosioituu mitokondrion kalvon. Vähennykset mitokondrion kalvon potentiaalia johti meidät määrittää vaikutus SDGE (250 ng /ml) on Bcl-2: n ilmentymisen. Sekä ECC-1 (tuloksia ei ole esitetty) ja Ishikawa solut (Fig. 6), väheni Bcl-2: n ilmentymisen havaittiin 24, 48, ja 72 h hoito SDGE.