Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vaikka c-Abl on yhä tullut keskeinen toimija DNA-vaurio vastauksen, sen rooli tässä yhteydessä ei ole lainkaan selvää. Tutkimme vaikutus estämällä c-Abl kinaasiaktiivisuutta imatinibilla kemoterapiaa huumeiden ja löysi silmiinpistävää eroa solujen selviytymistä jälkeen yhdistetyn mitoksantronilla (MX) ja imatinibihoitoa verrattuna paneeli muuta kemoterapiaa huumeita. Kombinatoorista indusoi apoptoosin HeLa-soluissa ja muissa syöpäsolulinjoja mutta ei ensisijainen fibroblasteissa. Ero MX ja doksorubisiinin liittyi merkittävää lisäämisen DNA-vaurioita. Kopioinnin suhteen aktiivisia p53 kertyneet solut, joissa ihmisen papilloomaviruksen E6 normaalisti hajoaa p53. Yhdistelmä hoito johti kaspaasin aktivaation ja apoptoosin, mutta tämä vaikutus ei riipu myöskään p53 tai p73 aktiivisuutta. Lisääntymisestä huolimatta p53 aktiivisuutta, soluihin pidätettiin G2 vaiheessa oli vika tässä tarkistuspisteen, jolloin solusyklin etenemistä. Vaikutus jälkeen MX hoidon riippui osittain c-Abl: Lyhyt häiritsevä RNA knockdown c-Abl sulatettu HeLa-solujen vähemmän herkkiä MX. Vaikutus Imatinibin pieneni c-Abl-siRNA viittaa rooli katalyyttisesti aktiivinen c-Abl kuoleman kaskadeissa. Nämä havainnot osoittavat, että MX on ainutlaatuinen sytotoksinen vaikutus, kun kinaasiaktiivisuuden c-Abl estyy. Hoito johtaa lisääntyneeseen DNA-vaurioita ja c-Abl-riippuvaista apoptoosia, joka voi tarjota uusia mahdollisuuksia voimistaa syövän kemoterapiaan.

Citation: Alpay K, Farshchian M, Tuomela J, Sandholm J, Aittokallio K, Siljamäki E, et ai. (2014) esto c-Abl kinaasiaktiivisuuden Renders Syöpäsolut erittäin herkkä Mitoksantronia. PLoS ONE 9 (8): e105526. doi: 10,1371 /journal.pone.0105526

Editor: Stephan Neil Witt, Louisiana State University Health Sciences Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 9. joulukuuta, 2013 Hyväksytty: 24 heinäkuu 2014; Julkaistu: 22 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Alpay et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus sai taloudellista tukea avustuksilla Suomen Medical Society, Turun yliopiston säätiö ja Cancer Society of-Suomessa, Suomen Akatemia (projektit 137687 ja 268360), suomalainen Cancer Research Foundation, Sigrid Juseliuksen säätiö, TYKS EVO avustus (projekti 13336). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kemoterapia kasvaimen hoito toimii pääasiassa aiheuttaa DNA-vaurion joka indusoi monimutkainen verkosto soluvasteiden lopulta johtaa syöpäsolun kuoleman. Ytimessä vastaus ovat polkuja, jotka tunnistavat vahinko, pysäyttää solusyklin, ja säätää kuoleman kaskadeissa. Syövän hoidossa, sädehoito ja useimmat solunsalpaajiin toimivat suoraan vahingoittavat DNA: ta tai häiritsemällä DNA: n replikaatiota. DNA-vaurio vaste pahanlaatuisten ja normaalien solujen määrää tehoa ja sivuvaikutuksia hoidosta. Kohtalo solun piilee monimutkainen DNA korjaukseen reittejä mieleen lukuisia eri DNA-vaurioita, jotka voivat syntyä, kun genotoksinen hoidon [1]. Onnistunut korjaus on kriittinen normaalin kudoksen sivuvaikutusten voittamiseksi terapian, mutta kasvain voi johtaa hoidon kesto. Syöpäsolut yleensä on kertynyt mutaatioita geenien DNA: n korjaukseen, joka tarjoaa erilaisia ​​terapeuttisia mahdollisuuksia moduloivien aineiden jäljellä toiminnalliset korjaus reittejä. Sen jälkeen DNA: ta vaurioittavat hoidon, vaurioitunut emäksiä, epäsuhta, tai DNA additiotuotteet ovat yleensä sietivät tiettyyn määrällistä kynnysarvoa, mutta voi aiheuttaa mutaatioita, jos ne pysyvät korjaamatta [2].

c-Abl esto on äskettäin ehdottanut johtaa muuttuneessa DNA-vaurioita vastaus [3]. c-Abl on ei-reseptori-tyrosiinikinaasin, joka on tärkeä rooli erilaistuminen, adheesio, solunjakautumisen, kuoleman ja stressistä ja sitoo useita proteiineja, jotka liittyvät apoptoosin polkuja [4]. Muutokset c-Abl-proteiinin konformaation vaihtelevat, ja sitoutumispartnereista näin ollen vaihdella [4] – [6]. Useat proteiinit, kuten ATM, DNA-PK, BRCA1, ja transkriptiotekijät p73 ja RFX1 vuorovaikutuksessa c-Abl [5]. Varsinkin, c-Abl: n on raportoitu vuorovaikutuksessa homologisen rekombinaation-korjaus proteiinin Rad51, nostaa [7] sen ekspression geenin tasolla, ja aktivoi sen fosforylaatio. Aktiivinen c-Abl voidaan estää pienimolekyylinen lääkeaine imatinibi (Gleevec; STI-571), joka kehitettiin vastaan ​​poikkeavaa BCR /Abl-fuusioproteiinin löytyy kroonisen myelooisen leukemian (KML) [8]. KML-soluissa, ensimmäinen eksoni c-Abl korvataan BCR-geenin sekvenssin, joka johtaa konstitutiivisesti aktiiviseen c-Abl ilmentymistä. Tämä poikkeava kinaasiaktiivisuutta tuloksia parannetun leviämisen, joka voidaan estää imatinibin. Imatinibi on ATP-kilpaileva estäjä vakauttaa aktiivinen c-Abl konformaatioon [8]. Kinaasiaktiivisuuden c-Abl on lisääntynyt sen jälkeen, kun DNA-vaurioita, ja sitten lisää toiminnan Atm ja Atr [9]. Imatinibihoidon vähentää taso koholla RAD51 mukana double-lohkon murtuma (DSB) korjaus- ja herkistää useita solutyyppejä kemoterapiaa [10] – [13]. Suora vuorovaikutus on myös osoitettu välillä c-Abl: n ja DNA-PK, joka säätelee ei-homologisen lopussa liittymällä [14].

kehitys kohdun kohdunkaulan syöpä on monivaiheinen prosessi, johon liittyy kohdunkaulan limakalvon solujen transformaatio onkogeeninen ihmisen papilloomaviruksen (HPV) E6 ja E7-proteiinit. E7 inaktivoi solusyklin säädin pRb, estämällä solusyklin pysähtymisen, kun E6 inaktivoi tuumorisuppressoriproteiinia p53, avain säätelijä apoptoosin ja genotoksisten stressin vastaus [15]. Koska kohdunkaulan syövän solujen lähes aina kuljettaa villityyppisen p53, joka hajoaa korkean riskin HPV-, p53 oli aiemmin pidetty täysin toimimaton kohdunkaulan syövän soluissa. Kuitenkin työ useita ryhmiä on äskettäin tehnyt selväksi, että p53 inaktivointi voidaan palautui HPV E6-kuljettavat solut ja että p53 asema kohdunkaulan syöpäsolut ei ole sama kuin syöpäsolujen kanssa p53-geeni [16]. Olemme aiemmin havaittu, että chemoradiation aktivoi p53 kohdunkaulan syövän solujen ja edistää solukuolemaa synergistisesti. Kuitenkin, kun analysoitu yksityiskohtaisesti, p53-proteiini voi joko parantaa tai estää sytotoksisuus kemoterapian lääkkeen [17], [18]. Hiiren alkion fibroblastit null c-Abl ovat puutteellisia p53 fosforylaatioon ja kestävät kuolemaan jälkeen genotoksinen vaurioita. Inhibition c-Abl by imatinibi vähentää hydroksiurea indusoiman p53 fosforylaatio [9]. Oletimme, että aktiivinen p53 voi lisätä DNA: n korjaukseen ja näin halunnut tutkia vaikutusta solukuoleman korjaus modulaatiota. c-Abl uskotaan yleisesti välittää pro-apoptoottisen signaloinnin Atm ja Atr p53 ja p73, muun tavoitteet [3]. Tutkimme tässä vaikutusta c-Abl estoa p53 aktiivisuutta HPV-positiivisten solujen ja miten se liittyy vahinkoja ja kuolemaa vastauksia.

Kattava paneeli huumeiden edustavat alkyloivat aineet, platina huumeiden, ja topoisomeraasi I ja II-inhibiittorit tutkittiin yhdessä imatinibin kohdunkaulan syöpäsolut kuljettavat HPV ja HPV-negatiiviset solulinjoissa. Me raportoimme tässä, että c-Abl esto imatinibi yhdistettynä MX genotoksisia hoitotuloksia heikentynyt DNA korjaukseen, kumoamisen G2 vaiheen tarkistuspisteen, ja massiivinen apoptoosin.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja sytotoksisuusmäärityksissä

ihmisen kohdunkaulan syövän solulinjat SiHa (HPV 16 +), CaSki (HPV16 +), ja HeLa (HPV 18 +), rintasyöpä MCF7, ja ulkosynnyttimien syöpä A431 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Primaaristen ihmisen fibroblasteja on kuvattu aiemmin [19]. Soluja kasvatettiin yksikerrosviljelminä DMEM täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 2 mM L-glutamiinia, ei-välttämättömiä aminohappoja (Euroclone, Wetherby, Iso-Britannia), ja 50 ug /ml gentamysiiniä (Calbiochem, San Diego, CA, USA ). HeLa p53 reportteri solulinja, joka kantaa p53 reportteriplasmidilla ptkGC3p53-luc, on kuvattu aiemmin [18]. Läsnäolosta huolimatta HPV E6, jopa HPV-positiiviset solulinjat osoittavat joitakin p53 aktiivisuutta jälkeen genotoksinen stressi, mutta toiminta voi hajottaa dominanttinegatiivivaikutus p53 (DDp53) tai kohdunulkoisen E6 ohjaa voimakas promoottori. SiHa- DDp53, SiHa- CMV, HeLa DDp53, HeLa CMV (tyhjä vektori), ja SiHa E6 solulinjoja on myös kuvattu aiemmin [18].

vallitsevasti negatiivinen p53-ilmentävät HeLa-solulinjassa (HeLa DD ) johdettiin transfektoimalla emosolulinjassa plasmidilla, joka ekspressoi katkaistua hiiren p53, joka sisältää aminohappotähteet 1-14 ja 302-390 valvonnassa CMV-promoottorin. Vakaa transfektantteja valittiin 0,8 mg /ml G418.

Lyhytaikaisissa solujen elinkelpoisuuden määritykset, 1-2 x 10

4 solua kuoppaa kohti (riippuen solulinjasta) ympättiin 96-kuoppalevyille ja väliaine korvattiin lääkkeiden laimennettu väliaine. Solujen elinkelpoisuus mitattiin WST-1 ainetta (Roche, Mannheim, Saksa) tai MTT ainetta (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA), ja absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä (Multiskan levy microreader; Labsystems, Suomi) tai 570 nm (Tecan monilevy lukija, Tecan, Sveitsi), tässä järjestyksessä.

klonogeeniset kasvun määrityksissä, SiHa ja HeLa-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille 48 tuntia ennen käsittelyä. Solut altistettiin hoitoa 6 tuntia ja sitten ne trypsinoitiin ja suspendoitiin tuoreeseen väliaineeseen ja ympättiin 6-kuoppaisille levyille 3 uM imatinibi. SiHa-soluja inkuboitiin 14 päivää ja HeLa-solujen 7 päivää. Inkubaation jälkeen solut kiinnitettiin 01:01 asetoni-metanolilla ja värjättiin Giemsa-värillä (Merck, Whitehouse Station, NJ, USA). Sitten kloonit joko laskettiin manuaalisesti tai analysoitiin kuten aiemmin on kuvattu [20]. Kaspaasi 3/7 aktiivisuus solujen apoptoosin määritettiin käyttäen Apo-ONE kaspaasi-3/7 homogeeninen kaspaasi määritystä (Promega).

Reagenssit, lääkkeet ja vasta-aineet

kemoterapian yhdisteet mitoksantroni (MX) (Wyeth-Lederle, Suomi), doksorubisiini (DXR) (Nycomed, Roskilde, Tanska), syklofosfamidi (Orion Pharma, Espoo, Suomi), topotekaanin (GlaxoSmithKline, Uxbridge, Middlesex, UK), etoposidi (Pfizer), sisplatiinia (Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ, USA), doketakseli (Aventis), ja karboplatiinin (Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ, USA) säilytettiin ja valmistettiin kuten on kuvattu [17]. Imatinibi oli lahja Novartis Pharmaceuticals (Basel, Sveitsi). Kantaliuos imatinibin 200 mM valmistettiin liuottamalla yhdiste DMSO. C-kit ja PDGF-α ja β-reseptorin salpaaja AG1296 hankittiin Calbiochem (cat. No. 658551). PDGF-BB ostettiin Sigma-Aldrich. Seuraavia vasta-aineita käytettiin Western-blottauksella: hiiren monoklonaalinen DO-1 p53 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), kanin polyklonaalinen anti-GADD45α (Cell Signaling, cat. No. 3518), kanin polyklonaalinen anti-fosfo -PDGF β-reseptorin (Cell Signaling, cat. no. 3161), monoklonaalinen hiiren anti-RAD51 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; kat. nro 35-6500), monoklonaalinen hiiren anti-sykliini B1 (BD Biosciences, cat. no. 554178) ja monoklonaalinen anti-p73 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). RNA eristettiin käyttäen RNeasy-kittiä (Qiagen, Hilden, Saksa).

Short häiritseviä RNA: ita ja transfektiot

c-Abl lyhyt häiritseviä RNA: ita (siRNA: t) saatiin Invitrogen (Stealth, Carlsbad, CA, USA; kat. no. 1.299.003), ja ei-kohdistuksen siRNA (Qiagen, cat. no. 1027281) käytettiin kontrollina. Solujen transfektio suoritettiin 75 nM kolmesta erillisestä siRNA: iden kohdistaminen c-Abl ja ohjata siRNA käyttäen siLentFect Lipid Reagent (Bio-Rad).

p53 reportterimääritys

Stable ptkGC3p53luc-bsd SiHa, CaSki ja HeLa-solulinjat sekä koostumus p53 reportteriplasmidilla ptkGC3p53-luc on kuvattu aiemmin [17]. Solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille (10

4 solua /kuoppa). Sen jälkeen kun solujen kiinnityksen 24 tuntia, hoidot aloitettiin varten ilmoitettu kestoja. Elävät solut kussakin kuopassa määritettiin kolorimetrisesti kanssa WST-1 määrityksessä. Sen jälkeen solut huuhdeltiin PBS: lla ja peitettiin 100 ui seosta, joka sisälsi 50% PBS: ää ja 50% Kirkas-Glo lusiferaasi reagenssilla (Promega, Madison, WI, USA). Lusiferaasiaktiivisuus määrällisesti tuella hybridi capture luminometrillä (Digene, Gaithersburg, MD, USA). Lusiferaasi lukemat jaettiin WST-1-arvon saamiseksi normalisoitu reportteri toimintaa.

Western blotting

Solut kerättiin käyttämällä 200 ui standardia 1 x SDS-näytepuskuria. Saatu kokosolu-uutteet keitettiin ja tämän jälkeen erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin Immobilon-P polyvinylideenifluoridia kalvoja (Millipore, Bedford, MA, USA). Kalvot tutkittiin ilmoitettu primaarisilla vasta-aineilla, ja toisen tunnistus tehtiin anti-hiiri piparjuuriperoksidaasi (HRP) (GE Healthcare, NJ, USA), anti-kani-HRP: tä (DAKO, Glostrup, DK), ja ECL (GE Healthcare , NJ, USA). Beeta-aktiini käytettiin latauskontrollina. Western blot kalvot digitoitavaa ChemiDoc MP geeli analyysiympäristön (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). ja analysoitiin Fidžin (ImageJ) ver 1.47q (Wayne Rasband, NIH, USA) käyttäen Geelit vaihtoehto.

Virtaussytometria

Solusyklianalyysiä suoritettiin virtaussytometrialla. Solut kerättiin trypsinaatiolla yhdessä kelluva elottomia soluja. Solut pestiin kerran PBS: llä ja suspendoitiin natriumsitraattipuskurissa (40 mM Na-sitraattia, 0,3% Triton X-100, 0,05 mg /ml propidiumjodidia, PBS) 20 minuutin ajan ennen analyysiä. Solusyklin analyysi suoritettiin käyttäen FACSCalibur (Becton Dickinson, CA, USA) ja CellQuest Pro -ohjelmistoa (Becton Dickinson). Solusyklin ja apoptoosin analyysit suoritettiin ModFit LT (Verity Software House, Inc., Topsham, ME, USA) ja Virtaava Software ver. 2.5 (Perttu Terho, Turun biotekniikan, Suomi, www.flowingsoftware.com), tässä järjestyksessä. Analysoida edelleen apoptoosin induktion jälkeen ja MX + imatinibihoitoa HeLa-soluja kasvatettiin 6-kuoppalevyille ja käsitelty ilmoitettu lääkkeiden 24 ja 48 tuntia. Medium ja solut kerättiin ja näytteet värjättiin anneksiini-V-FITC Kit (ab14085; Abcam, Cambridge, UK) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tiedot hankittiin FACSCalibur -virtaussytometriä, ja analysoitiin virtaava Software.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen käänteistranskriptio-PCR

RT-PCR-menetelmällä on kuvattu aikaisemmin [18]. Alukkeet olivat HPV 18 E6, eteenpäin, 5′-TGGCGCGCTTTGAGGA-3 ’, ja reverse 5′-TGTTCAGTTCCGTGCACAGATC-3′; ja EF1α, eteenpäin, 5’-CTGAACCATCCAGGCCAAAT-3 ’, ja kääntää, 5′-GCCGTGTGGCAATCCAAT-3’. Määrät HPV 18 E6-transkriptien normalisoitiin vastaan ​​lukemat EF1α.

Comet määritys

DNA-vaurioita tutkittiin yksittäisen solun geelielektroforeesilla Kit (Trivigen, Gaithersburg, MD, USA). Määritys suoritettiin alkalisissa olosuhteissa havaita yksin- tai kaksijuosteinen DNA-vaurioita. Yhden solun geelielektroforeesi DNA suoritettiin, kuten valmistaja on kuvannut. Kuvat otettiin käyttäen Olympus BX60 fluoresenssimikroskooppia (Zeiss Axiovert 200 M) x 20 suurennus.

Aikaväli mikroskopia

Kuvat otettiin yhden tunnin välein 72 tunnin ajan IncuCyte ZOOM kineettinen kuvantamisjärjestelmä (Essen Bioscience, Michigan, USA). Edustavia kaivot valittiin ja elokuvia oli rakennettu ImageJ ver 1.47d (Wayne Rasband, NIH, USA). Palkki edustaa 200 pm.

Tilastot

arvioimiseksi ryhmien välisiä eroja, käytimme Studentin t-testejä. P-arvo alle 0,05 pidettiin osoittamaan tilastollista merkittävyyttä.

Tulokset

esto c-Abl mukaan imatinibin voimistaa sytotoksista vaikutusta mitoksantronia syöpäsoluissa mutta ei ensisijainen fibroblasteissa

potenssi imatinibin parantamisessa sytotoksisuuden seulottiin suuressa paneelissa kemoterapiaa huumeita. Lyhyellä aikavälillä -sytotoksisuusmäärityksiä imatinibi yksinään ei ollut sytotoksinen tahansa solulinjoista 3 uM 10 uM. Kun HeLa, CaSki, ja SiHa-soluja käsiteltiin topoisomeraasi I: n estäjät (topotekaani ja etoposidi), nukleosidianalogit (gemsitabiini, fluoriurasiili ja sytarabiini), alkyloivat aineet (syklofosfamidi ja dakarbatsiini) tai sisplatiinin, imatinibi ei lisätä sytotoksisuutta (data ei näytetty). Se ei myöskään vaikuta antrasykliiniä (doksorubisiini, DXR) käsitellyt solut (kuvio 1A). Vaikutus karboplatiinin parannettu kaksinkertaiseksi lisäämällä imatinibin 48 tunnin ajan (tuloksia ei ole esitetty). Toisin kuin kaikki muut kemoterapialääkkeet testattu, imatinibi oli dramaattinen vaikutus yhdessä mitoksantronilla (MX), topoisomeraasi II: n inhibiittori (kuvio 1A). Vaikutus imatinibin oli sama välillä 3 uM ja 10 uM osoittaa, että kinaasiaktiivisuuden estetty tutkituissa solulinjoissa jopa 3 uM.

(A) Ihmisen kohdunkaulan syöpä (HeLa) soluja käsiteltiin MX ( 0,6 uM), DXR (0,8 uM), imatinibi (10 uM) tai niiden yhdistelmiä. WST solujen elinkelpoisuuden määritys suoritettiin 12 h, 24 h ja 48 h. Tulokset normalisoitiin solun numero väliaineessa vain sisältäviä kaivoja. *** P 0,001 riippumaton näytteiden T-testi. (B) Sekä A-431 vulvan karsinooma solulinjaa, joka on missense mutaatio p53-geenin ja MCF-7 rintasyövän solulinjaa, joka on villityypin p53-geenin näytä parannettu vaikutus, kun MX ja imatinibi yhdistetään. Imatinibi ei lisää sytotoksisuutta MX perusterveydenhuollossa fibroblasteissa. Mittaukset suoritettiin 48 tuntia käyttäen WST solunelinkykyisyysmääritys. ** P 0,01, *** p 0,001 riippumaton näytteiden T-testi. (C) klonogeeninen määritys. Imatinibi tehostaa MX sytotoksisuutta sekä HeLa CMV solulinjassa villityypin p53 ja tyhjän vektorin ja HeLa DDp53 solulinja kuljettaa hallitseva negatiivinen p53. Soluja käsiteltiin kunkin lääkkeen 12 tuntia. Sitten väliaine korvattiin tuoreella alustalla ilman lääkkeitä. Pitoisuus imatinibin oli 3 uM ottaa huomioon, että MX käytettiin eri pitoisuuksina väliltä 1 nM 40 nM. Kloonit laskettiin mikroskoopilla. Koe suoritettiin kolmena kappaleena, keskiarvo ± SD. *** P 0,001.

parannettu vaikutus näkyi myös CaSki- ja SiHa solujen vaikkakin vähemmässä määrin (kuva S1). Solulinjat, että me ensisijaisesti halusimme testata olivat peräisin HPV-positiivisten kohdunkaulan syöpä. Kuitenkin vaikutus näyttää ei ole rajoitettu näihin soluihin. Lääkkeet testattiin kahdella syöpäsolulinjoissa eri alkuperää: Emättimen karsinooma A431 on missense mutaatio p53-geenin, ja MCF7 rintasyövän solulinjassa on villityypin p53. Selviytyminen oli silmiinpistävän samanlainen kuin HPV-positiivisissa solulinjoissa (kuvio 1 B). Sen sijaan ensisijainen ei-transformoidut fibroblastit eivät olleet herkempiä kun imatinibi lisättiin MX hoitoon (kuvio 1 B). Tämä tulos osoittaa, että havaittu vaikutus ei rajoitu HPV-positiiviset syöpäsolut, mutta voi esiintyä laajemmin riippumatta p53 status. Ei-transformoidut solut voivat resistenttejä tähän hoitoon.

parannetun vaikutus imatinibin nähtiin myös natiivin ja eri tavoin muutettu HeLa ja SiHa solujen riippumattomalla tavalla joko p53 tai E6 (kuva S2). MX edelleen tutkittiin klonogeeniset kasvun määrityksissä seurata pitkän aikavälin elpyminen kapasiteetti soluja. MX pitoisuudet niinkin alhainen kuin 1 nM yhdessä 3 uM imatinibin esti HeLasoluista kloonikasvuun kokonaan, sekä p53-null ja tyhjän vektorin kantava soluissa (kuvio 1 C). SiHa- solulinjoissa, 3 uM imatinibin yksinään ei vaikuta klonaalinen kasvuun. Herkkyys CaSki solujen imatinibilla lisäys oli välissä oleva SiHa ja HeLa-solut (kuvio S3).

Mitoksantronia indusoi kaspaasi 3/7, jota korostavat estämällä c-Abl imatinibiresistenssiä

käsittely MX kasvattaa julkaisun kaspaasi 3 ja 7 mitokondriot osoittavat apoptoosin. Imatinibi yksin ei pysty muuttamaan näitä tasoja (kuvio 2). Solut käsiteltiin 0,6 uM MX ja 0,8 uM DXR lisäsi kaspaasiaktiivisuus 2,5 kertaiseksi, kun taas MX + imatinibiryhmässä yhdistelmähoito lisääntynyt aktiivisuus 4 kertaiseksi. Imatinibi ei lisätä toiminnan aiheuttama DXR yksin.

HeLa-soluja käsiteltiin ilmoitettu lääkkeiden 48 tuntia. Sitten, tuore väliaine korvattiin ja kaspaasi 3/7 aktiivisuus mitattiin käyttäen ELISA-määritystä. Koe suoritettiin kolmena kappaleena, keskiarvo ± SD. *** P 0,001 T-testi.

esto c-Abl kinaasiaktiivisuuden lisää DNA-vaurioita MX-käsitellyissä soluissa

Lisäämällä imatinibi MX kasvoi komeetta pyrstön HeLa-soluissa kun taas imatinibin yksinään ei ollut mitään vaikutusta (kuvio 3A). Imatinibi ei aiheuttanut pyrstön in DXR-käsitellyissä soluissa. Määrä GADD45α proteiinin kasvoi hieman jopa kokosolulysaateista MX + imatinibin (5 kertaa, kuvio 3B). Tämä lisäys näyttää säätelevän transkriptionaalisella tasolla, koska meillä on myös havaittu selvästi lisääntynyt GADD45α transkriptipitoisuuksissa jälkeen yhdistelmähoitoa microarray RNA analyyseissä (julkaisematon data). Kuten p53-proteiinin kertymistä soluun stressi, GADD45α transkriptio kasvaa stressiä, myös DNA-vaurioita. Sekä DXR ja MX lisääntynyt RAD51 tasoa (10-kertainen), ja imatinibi esikäsittely esti kasvua yhtä (20%), mutta parantaa kertyminen p53, kun lisätään MX (13-kertainen, kuvio 4).

(A) DNA-vaurioita HeLa-soluissa tutkittiin Comet määritystä hoidon jälkeen MX (0,6 uM), DXR (0,8 uM) ja imatinibi (5 uM), tai niiden yhdistelmät. Cometting (pyrstön) osoittaa DNA-vaurioita. (B) Imatinibi yhdistettynä MX nostaa tasoa GADD45α. Western blot GADD45α proteiinin tasoja kokosolulysaateista. HeLa-soluja käsiteltiin MX (0,6 uM), DXR (0,8 uM), imatinibi (5 uM), tai niiden yhdistelmät 30 tuntia.

Western blot p53 ja RAD 51 HeLa-soluissa. Imatinibi yhdistettiin MX lisää p53-proteiinin tasoa HeLa-soluissa. RAD51 taso oli hieman vähäisempää käsitellyissä soluissa imatinibin ja MX. Soluja käsiteltiin MX (0,6 uM), DXR (0,8 uM), imatinibi (5 uM) tai niiden yhdistelmät 30 tuntia.

Mitoksantronia aiheuttama p53 aktivaation parantaa estämällä c-Abl-kinaasia aktiviteetti

kemoterapiaa huumeita käytetään tässä tutkimuksessa aiheuttaa erilaisia ​​DNA-vaurioita, jotka p53 kohdesoluissa aistien. p53 aktivoituu kohdunkaulan soluissa, vaikka hajoamista aktiivisuus E6 [16], [19]. Mittasimme p53 reportteriaktiivisuutta HeLa, CaSki-, ja SiHa solulinjoissa DXR, MX, ja sisplatiini. Kun lääkkeet verrattiin, sisplatiinin aiheuttama toimittaja yli MX HeLa ja CaSki soluissa, mutta samalla SiHa- soluissa, ja 0,6 uM MX yksinään ei aktivoi toimittaja lainkaan HeLa-soluissa 48 tuntia. DXR aiheuttama toimittaja yli sisplatiinin ja MX kaikissa solulinjoissa (taulukko 1). Imatinibin yksinään ei merkittävästi muuta toimintaa missä tahansa solulinjoista. Lisäämällä imatinibi sisplatiiniin hieman vähensi aktiivisuutta, mutta ei ollut vaikutusta DXR. Sen sijaan lisäämällä imatinibi 0,6 uM MX lisääntynyt aktiivisuus kaikissa solulinjoissa, 50% SiHa- soluissa mutta nelinkertaisesti HeLa-soluissa ja kahdeksan kertaisesti CaSki soluissa. Rajoitus tässä lähestymistavassa on, että suoran vertailun solulinjoja ei voida tehdä, koska eri määriä integroituja reportteriplasmidilla. Yhdenmukainen toimittaja määrityksissä, p53-proteiinin taso oli myös merkitsevästi lisääntynyt Western blot analyysit (kuvio 4). Näimme eivät pienene p53 tasolla imatinibin kanssa yksin, tulokset olivat mukaisesti toimittaja analyysin tuloksia.

p73 on jäsen p53-proteiinin perheen ja vuorovaikutuksessa c-Abl suoraan ja voi myös indusoida apoptoosia. P73-proteiinin tasot eivät muuttuneet käsittelyjen jälkeen (kuva S4).

Imatinib ei muuta HPV-E6 tasoilla

Useimmat kemoterapiassa lääkkeet vähentävät E6-mRNA: [17]. Halusimme tietää, onko imatinibille aiheuttaa väheneminen E6 ilmentyminen HeLa-soluissa joko yksinään tai yhdistettynä MX. Huomasimme, että 1 gM MX vähenee E6-mRNA-tasot HeLa-soluissa noin 50% ja 5 uM imatinibi ei yksinään alentaa E6-mRNA näissä soluissa. Yhdistelmä 5 uM imatinibin ja 1 uM MX ei alentaa E6-mRNA HeLa-soluissa yli 1 uM MX yksin.

Imatinibiin kumoaa S-vaiheen pysähtymisen aiheuttamia MX ja kasvattaa apoptoosin

HeLa-soluja käsiteltiin imatinibin yksin, 24 tuntia, solusyklin jakautuminen oli sama kuin solut yksistään alustassa, mutta oli hiukan enemmän soluja S-vaiheessa 48 tunnin kuluttua (kuvio 5A). 24 tunnin ja erityisesti 48 tuntia, DXR kertynyt solut G2 vaiheessa. Lisäämällä imatinibi aiheuttama S vaiheen pysähtymisen ohjelmistossa analyysi; kuitenkin 48 tuntia DXR + imatinibin, näytti olevan pieni G2 väestö että analyysi ohjelmisto ei havainnut. MX-käsitellyt solut edennyt 24 tuntia S ja G2, mutta jatkettu inkubointi 48 tunnin kuluttua näkyi selvä G2 pidätys. Lisäämällä imatinibi MX osoitti 24 tunnin populaatiosta etenee G1, joka ilmaisee kumoamista pidätyksestä. 48 tuntia, ei ollut soluja yli S-vaiheessa, mutta silti myös selkeä G1 väestöstä. Tämä havainto viittaa siihen, että solut olivat ennenaikaisesti tullut suoraan S-vaiheen mitoosin ja että imatinibi ajoi tämän vaikutuksen. Vaihtoehtoisesti MX + imatinibi voi aiheuttaa viivettä G1 /S G2. Kuitenkin useita epäonnistuneita mitoosien havaittiin Aikakierrosvideo MX + imatinibin käsiteltyjä soluja suosii tulkintaa, että solukierron pysähtymisen kumottiin (Video S1). Olemme myös määrittäneet sykliini B1 tasolle, hyvin tunnustettu mitoosi merkki, että lääke käsitelty solupopulaatioiden keräämään lisänäyttöä ajatus, että MX + imatinibia co-käsiteltyjä soluja kykenevät menettely solukierron ja syöttämällä M-vaiheeseen. Huomasimme, että hoito HeLa-solujen kanssa DXR, DXR + imatinibi ja MX + imatinibi johtaa kertymiseen sykliini B1. Proteiini taso imatinibin käsiteltyjen solujen oli alle tason havaitseminen samalla tavalla kuin käsiteltyihin kontrolleihin joilla perustason sykliini B1 lauseke (kuva S5).

(A) Soluja käsiteltiin MX (0,6 uM), DXR (0,8 uM), imatinibi (5 uM) tai niiden yhdistelmiä 24 ja 48 tuntia. Käsittelyn jälkeen solut kerättiin ja värjättiin propidiumjodidilla mitata DNA-pitoisuuden avulla virtaussytometrialla. Histogrammit esittävät solukierron jakaumat. (B) anneksiini-V (X-akseli) vs. PI (Y-akseli) värjäys HeLa-solut käsiteltiin ilmoitettu lääkkeitä 48 tuntia. Prosenttiosuudet osoittavat alussa (oikeanpuoleiseen alanurkkaan) ja myöhäinen (oikeasta yläneljänneksestä) apoptoottisten jae. MX ja imatinibi osoittavat selvän synergistisen vaikutuksen apoptoosin induktioon. Päästöjen spektrit PI ja DXR yhtenevät FL2-kanavalla, joten on mahdotonta erottaa alussa apoptoottiset väestöä myöhään apoptoottiset väestön DXR-käsitellyissä soluissa. Kuitenkin, kun oikea neljännesten laskettiin yhteen, ei ollut eroa DXR ja DXR + imatinibia populaatiot.

Imatinibin lisäsi osa G1 tapahtumien MX-käsiteltyjen HeLa-solujen, osittain ohjeellinen apoptoosin. Sub G1 väestö oli suurin (38,6%) MX + imatinibiryhmässä 48 tuntia. Imatinibi myös lisääntynyt DXR aiheuttama sub G1 mutta vähemmässä määrin (17,8%) 48 tunnin (taulukko S1). Analysoida edelleen mahdollista apoptoosin me värjättiin solut anneksiini V: joka on merkki varhaisen apoptoosin. Huomasimme, että imatinibi lisää merkittävästi osuutta apoptoottisten solujen MX-käsitellyissä soluissa, mutta ei havainnut mitään lisäystä, kun imatinibi lisättiin DXR (kuvio 5B) Virtaussytometria tulokset ovat linjassa kaspaasi kokeilu tukee käsitystä siitä, imatinibi MX on enemmän indusoi solukuoleman kuin DXR. Imatinibi on aiemmin raportoitu aiheuttavan G1 pidätykseen pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja [21], kun taas MX ja DXR syy G2 pidätys [22]. Näimme ei G1 pidätys imatinibin yksin.

alassäätely c-Abl siRNA vaikeuttaa sytotoksisuutta MX + imatinibin

Imatinibi ja MX osoitti additiivinen vaikutus vähentämällä ohjaus siRNA HeLa solut. Kun c-Abl pudotettiin siRNA, huomasimme, että leviämisen käsittelemättömien solujen väheni 30-50% vuonna kokeiden toisto (kuva 6, Video S2). Sekä kasvukäyrät ja time-lapse mikroskopia tiedot osoittavat pientä kasvua esto c-Abl-siRNA HeLa-soluissa. Kuitenkaan ei ohjaus siRNA eikä c-Abl-siRNA yksin solukuolema. Tämä tulos viittaa siihen, että c-Abl tarvitaan normaalin näiden solujen. Kohdistaminen c-Abl HeLa-soluissa siRNA sulatettu solut vähemmän herkkiä MX. CaSki- solut olivat myös vähemmän herkkiä MX kun c-Abl säädeltiin vähentävästi siRNA, mutta ei lisäkasvun estäminen havaittiin. Nämä solut olivat vaikeammin transfektoimaan siRNA ja vain 40% teho saavutettiin. Tämä voi myös selittää, miksi lisääntymistä ei inhiboinut näissä soluissa. Lisäksi kombinatoorista vaikutus imatinibin väheni merkittävästi, syyllistämättä c-Abl kuin keskeinen tavoite imatinibin tämän tuloksen. Jälkimmäinen havainto on linjassa myös kokeiluja muiden tavoitteiden imatinibi PDGF ja c-Kit. AG1296: n tiedetään estävän tehokkaasti signaloinnin ihmisen PDGF α- ja β-reseptoreihin sekä niihin liittyvän kantasolun factor receptor c-Kit, 1 uM ja 5 uM pitoisuudet, tässä järjestyksessä. AG1296 voinut matkivat imatinibin kanssa MX (kuvio 7A). Lisäksi MX ei ole mitään vaikutusta fosforylaatiota PDGF-reseptorin (kuvio 7B). Lisäksi siRNA kokeilu ymmärtää, että kinaasi-aktiivinen c-Abl vastaa solujen selviytymisen jälkeen MX vaurioita. On tärkeää, tämä koe osoittaa erilaisia ​​rooleja kinaasien-aktiivisen ja kinaasi-aktiivinen c-Abl. Kinase-aktiivinen c-Abl näyttää vaaditaan apoptoosin MX, mutta kinaasi-aktiivisia c-Abl on keskeinen toimija DNA Vahinkosaneerauksen jälkeen MX HeLa-soluissa.

(A) HeLa ja CaSki Soluja transfektoitu ei-kohdistamisen tai c-Abl-siRNA (75 nM). Western blot -analyysi suoritettiin tutkimaan vaikutusta siRNA. Taso c-Abl kvantitoitiin ja korjattiin β-aktiini tasolla. Arvot on suhteutettu valvonnan taso siRNA kunkin solulinjan. (B) HeLa, ja (C) CaSki-solut transfektoitiin ohjaus- tai c-Abl-siRNA. Jälkeen treansfection soluja käsiteltiin MX (0,6 uM), imatinibi (5 uM), ja niiden yhdistelmä: ssa 48 tuntia. Suhteellinen määrä eloonjääneiden solujen määritettiin WST-1 määrityksessä. Tulokset ovat kahden itsenäisen kokeen kolmena rinnakkaisena. Data näytetään keskimääräisenä ± SD. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001. NS, ei merkittävää.

(A) Soluja käsiteltiin MX ja AG1296 tai niiden yhdistelmät 48 tuntia ja mitattiin WST-1-määritystä. Wang et ai. Chen et ai.