Krooninen sairaus

tiivistelmä

Context

Lisämunuaisen kuorikerroksen karsinooma (ACC) on harvinainen ja erittäin aggressiivinen hormonitoimintaa kasvain, rajoitettu hoitovaihtoehtojen. Aktivointi β-kateniinin somaattiset mutaatiot löytyvät ACC ja on yhdistetty huono kliininen tulos. Itse asiassa, aktivoituminen Wnt /β-kateniinin signalointireitin näyttää olevan tärkeä rooli ACC aggressiivisuutta, ja saattaisi näin ollen edustaa lupaava terapeuttinen kohde.

tavoite

Samanlainen potilaalle kasvaimen näytteen osalta H295 solulinja, joka on johdettu ACC satamiin luonnollisen aktivoivan β-kateniinin mutaatio. Olemme tässä arvioida

in vitro

ja

in vivo

vaikutuksen β-kateniinin inaktivointi käyttäen doxycyclin (DOX) indusoituva shRNA plasmidista H295R lisämunuaiskuoren syöpäsoluissa linja (klooni nimettiin shβ).

tulokset

jälkeen DOX hoitoa syvällinen väheneminen

β-kateniinin

ilmentyminen oli havaittavissa shβ klooneja verrattuna ohjata klooneja (Ctr). Niinpä havaitsimme lasku Wnt /βcatenin riippuvainen lusiferaasireportteri aktiivisuus sekä vähentynyt ilmentyminen

AXIN2

edustavat endogeenisen

β-kateniinin

kohdegeenin. Samanaikaisesti

β-kateniinin

hiljentäminen johti vähentynyt solujen proliferaatiota ja sykli muutoksia solun kertymistä G1 vaiheessa ja lisääntynyt apoptoosi

in vitro

.

In vivo

, on perustettu tuumoriksenografteja kateenkorvattomissa nude-hiirissä 9 päivän

β-kateniinin

hiljentäminen johti merkittävään vähentämiseen

CTNNB1

ja

AXIN2

ilme. Lisäksi jatkuva

β-kateniinin

hiljentäminen, aloittaen 3 päivää tuumorisolujen inokulaation jälkeen, liittyi täydellinen puuttuminen kasvaimen kasvun shβ ryhmän, kun kasvaimet olivat läsnä kaikissa eläimissä ja kontrolliryhmässä.

Johtopäätös

Yhteenvetona nämä kokeet tarjoavat todisteita siitä, että Wnt /β-kateniinin reitin inhibitio ACC on lupaava terapeuttinen kohde.

Citation: GAUJOUX S, Hantel C, Launay P, Bonnet S, Perlemoine K, Lefèvre L, et ai. (2013) hiljentäminen mutaation

β-kateniinin

Estää Cell Proliferation ja stimuloi apoptoosi Lisämunuaisen kuorikerroksen Cancer Cell Line H295R. PLoS ONE 8 (2): e55743. doi: 10,1371 /journal.pone.0055743

Editor: Hans A. Kestler, University of Ulm, Saksa

vastaanotettu: 14 syyskuu 2012; Hyväksytty: 30 joulukuu 2012; Julkaistu: 07 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 GAUJOUX et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Contrat d’Initiation à la Recherche Clinique (avustus CIRC 05045 – AP-HP), Plan Hospitalier de Recherche Clinique (AOM06179) muuttamisesta COMETE Network, Recherche Translationnelle DHOS /INCA 2009 (RTD09024), ESR (07-RNP-067), Association pour la Recherche sur le Cancer (SFI20111203542), The Weigand Trust Saksan Sander Stiftung (2011.003.1) ja Ligue contre le syöpä (RS12 /75-105). Lisäksi tutkimus Näihin tuloksiin johtanut on saanut rahoitusta seitsemännestä puiteohjelmasta (FP7 /2007-2013) avustussopimuksen numero 259735 (ENS @ T-Cancer). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Lisämunuaisen kuorikerroksen karsinooma (ACC) on harvinainen ja erittäin aggressiivinen hormonitoimintaa kasvain, jossa on 5-vuoden eloonjääneiden kokonaismäärästä noin 40% [1] – [4]. Hoitovaihtoehdot näille potilaille ovat niukat, ja käytettävissä solunsalpaajahoitojen vähäiseksi. Parempi ymmärrys tuumoribiologiassa ja molekyylitason ennustetekijät auttaisi valitsemaan asiaan hoitotavoitteet ja kehittämään innovatiivisia hoitostrategioita.

Aktivointi Wnt /β-kateniinin signalointireitin vuonna lisämunuaiskuoren kasvainten synnyssä on hiljattain tutkittu yksityiskohtaisesti [ ,,,0],5] – [10], ja näyttää olevan tärkeä rooli lisämunuaiskuoren karsinooma ennusteeseen. Eläinmalleissa, konstitutiivinen aktivointi Wnt /β-kateniinin väylän lisämunuaisen kuorikerros siirtogeenisiä hiiriä johtaa kehitystä lisämunuaiskuoren kasvaimet, joilla on pahanlaatuinen ominaisuudet [11]. Ihmisillä tämä toteutustapa on usein aktivoidaan pääasiassa aallonpohjasta β-kateniinin geeni (

CTNNB1

eli kateniinin (kadheriinin liittyvä proteiini), beeta 1) mutaatioita [5], [7], ja liittyy kliininen ja patologiset ominaisuudet ja huono tulos [8]. Samoin tietty transcriptomic allekirjoitus kasvainten

CTNNB1

mutaatio on äskettäin osoitettu [12], ja ne voivat olla vastuussa erityisesti huonon ennusteen sairaiden potilaiden. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot viittaavat Wnt /β-kateniinin signalointireitin inaktivointi lupaava terapeuttinen tavoite ACC.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida

in vivo

ja

in vitro

vaikutukset Wnt /β-kateniinin signalointireitin erityinen poistoa käyttämällä lyhyitä hiusneula-RNA (shRNA) on kasvain malli adrenokortikaalisen karsinooma (H295R).

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja sukupolven H295R kloonien

Lisämunuaisen kuorikerroksen karsinooma solulinja H295R stabiilisti transfektoitu Tet-repressorin (H295R /TR) luovutti ystävällisesti Dr. Lalli [13]. Soluja kasvatettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [14]. PTER-β-kateniinin vektori, joka ilmentää doxycyclin indusoituvan shRNA suunnattu

CTNNB1

(

β-kateniinin

, kohdennettu sekvenssi: 5′-GTGGGTGGTATAGAGGCTC-3 ’) mRNA: n, ja kontrollivektorin ( PTER) saatiin tri van de Wetering [15]. H295R /TR transfektoitiin PTER-β-kateniinin tai Pter ja kloonit valitaan zeosiinille (50 ug /ml, InvivoGen). Kolme shRNA-βcatenin klooneista (shβ) valittiin, jossa

CTNNB1

ilmentyminen alassäädetty vähintään 5 kertaisesti doxycyclin (DOX, 0,2 ug /ml, Sigma) riippuvaisella tavalla verrattuna kolmeen ohjaus klooneja ( Ctr) transfektoitu PTER vektori. Kaikki solun klooneja tutkittiin niiden kyky ilmaista tietyn steroidien geenejä (

StAR

ja

CYP11B1

) ja niiden vastaukset cAMP /PKA-reitin, joka todettiin olevan verrattavissa vanhempien solulinja, H295R [16] (tuloksia ei ole esitetty). S45P

CTNNB1

(

β-kateniinin

) geenin aktivoiva mutaatio, aiemmin tunnistettu vanhempien H295R solulinjassa [5], [8], varmistettiin suoralla sekvensoinnilla kaikissa Ctr ja shβ klooneja (tuloksia ei ole esitetty). Vaikka tiedot esitetään yhden Ctr ja shβ klooni kaikki

in vitro

kokeet vahvistivat vastaavia tuloksia 2-3 yksittäistä kloonia (Ctr ja shβ).

analyysi RNA: n ja proteiinin tasot

Yhteensä RNA: n tai proteiinin uuttoa ja analyysia solulinjoja suoritettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [14] alukkeilla ja vasta kuvattu taulukossa S1.

solun transfektio, ja toimittaja määritykset

Kuten Wnt /β-kateniinin reitin reportteri-konstrukti ajo lusiferaasin ilmentymistä geenin TopFlash plasmidi (Top) käytettiin, joka sisältää kaksi kopiota β-kateniinin /T-solu-tekijä TCF-sitoutumiskohtien taas FopFlash plasmidi (Fop) sisältää kaksi mutatoitua kopiota β-kateniinin /TCF-sitoutumiskohtia [5]. Rousin sarkoomaviruksen (RSV) -Renilla (Promega) käytettiin kontrollina transfektion tehokkuutta. Solut kotransfektoitiin ja Firefly ja Renilla Lusiferaasiaktiivisuudet peräkkäin mitattiin, kuten aiemmin on kuvattu [14].

Solujen lisääntyminen, solusyklin ja apoptoosin analyysi

Lisääntyminen mitattiin MTT-määrityksellä (Promega). Solusyklin ja apoptoosin analysoitiin virtaussytometrialla, kuten aiemmin on raportoitu [17].

Vieraslajisiirteen, patologinen tutkimus ja immunohistokemiallisella värjäyksellä

nainen kateenkorvattomiin NMRI nu /nu-hiiriä (6-8 viikkoa), olivat ostettu Harlan Winkelmann (Borchen, Saksa) ja sijoitettu alle patogeenivapaissa olosuhteissa. Kaikki kokeet suoritettiin seuraavia protokollia hyväksymä Regierung von Oberbayern ja noudattaen saksan suuntaviivojen eläinkokeissa. 15 x 10

6 solua yksittäistä kloonia siirrostettiin 200 ui PBS: ää ihonalaisesti kaulaan kunkin hiiren. Lyhytaikaisissa terapeuttinen kokeita DOX hoito aloitettiin, kun pisin kasvain halkaisijat vaihtelivat 0,2-0,9 cm koossa (jälkeen 21-31 päivää). Doxycyline lisättiin loppupitoisuudeksi 2 mg /ml juomaveteen keltaisena vesipulloja. 9 päivän kuluttua DOX hoidon kasvaimet irrotettiin, kiinnitettiin formaliiniin, valettiin parafiiniin ja 4 um: n osat leikataan ja värjätään hematoksyliinillä-Eosiini-Saffron. Immunohistokemiaa β-kateniinin suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [5]. Solut pitkäaikaista terapeuttista kokeissa ympättiin ja 3 päivää tuumorin induktion hiiret alkaen sitten käsitellä jatkuvasti DOX vedellä. Tuumorin koko mitattiin joka toinen päivä käyttäen tulkki, kuten aiemmin on kuvattu [18]. Päivänä 31 päivää sen jälkeen, kun kasvaimen induktiota, kun ensimmäinen kasvaimet saavuttivat pisin kasvaimen halkaisija on 1,5 cm, hiiret uhrattiin ja tuumorit leikattiin.

Tilastollinen analyysi

Kaikki

in vitro

tietoja tilastollisia analyysejä edustavat määrällisesti vähintään kolmen kokeen. Ohjausehdot asetettiin 100% ja tulokset analysoitiin käyttämällä Fisherin testiä. Tilastollinen analyysi vertailun kasvaimen paino, kun pitkäaikainen terapeuttinen kokeilu

in vivo

suoritettiin Mann-Whitneyn testi. Merkitys asetettiin P 0,05 (edustaja * kuvissa); P 0,01 (**) ja P 0,001 (***).

Tulokset

tehokas inaktivaatio

CTNNB1

mukaan shRNA vuonna lisämunuaiskuoren syöpäsoluissa

H295R soluja, kätkeminen heterotsygoottinen

CTNNB1

geenimutaatio on GSK3p fosforylaatiokohdan (S45P), näytteille konstitutiivinen transkriptionaalista aktiivisuutta β-kateniinin-LEF /TCF [5]. Solukloonit ilmentävät doxycylin indusoituvan shRNA kohdistaminen β-kateniinin luotiin. Kahden päivän kuluttua shRNA-β-kateniinin induktio doxycyclin (DOX) käsittely,

CTNNB1

mRNA: ta (-85%, p 0,01), ja proteiinin tasot olivat merkittävästi vähentynyt (kuva 1-A). Tämä lasku

CTNNB1

mRNA ja proteiini tasoilla jatkaneet DOX hoitoa jopa 10 päivää. Sen sijaan, DOX hoito ei vaikuttanut

CTNNB1

ilmentymisen kontrolli klooni (Ctr) (kuva 1-A).

, histogrammi ja Western blot paneelit edustavat

CTNNB1

(

β-kateniinin

) mRNA ja proteiini kertymistä, vuonna Ctr ja shβ kloonit jälkeen 2, 5 tai 10 päivän kuluttua lisäyksen doxycyclin (DOX) kasvualustaan ​​(0,2 ug /ml). B-vasen, solut ohimenevästi kotransfektoitiin keinotekoinen Wnt /-β-kateniinin reitin toimittaja raken (Top) tai hänen valvonnassaan mutatoitunut (Fop). 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin ajoneuvon tai Dox (0,2 ug /ml) 24 tuntia, ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin. -Aivan, histogrammi edustaa

AXIN2

mRNA kertymistä 2 päivän DOX hoidon. C-vasemmalle, Solujen eloonjääminen käyrä solujen, kuten arvioitiin MTT-menetelmää ilman tai DOX (0,2 ug /ml) 1, 4, 8 tai 12 päivää. -Center, solujen jakauma eri vaiheissa solusyklin analysoitiin virtaussytometrianalyysin propidiumjodidivärjäys jälkeen ajoneuvo tai dox hoito 2, 5 ja 10 päivää. Western blotit osoittavat β-kateniinin, CyclinA ja CDK2-proteiinia tasolla 10 päivässä. -Aivan, histogrammit edustavat apoptoottiset solut mitattiin virtaussytometrisellä anneksiini V sisällyttäminen, kun ajoneuvo tai DOX hoitoa 2, 5 ja 10 päivää, ilman tai staurosporiinia yhteistyössä hoitoa viimeksi 6 h (0,5 ug /ml). Western blotit osoittavat halkaistut kaspaasi 3 (CC3) samassa kunnossa.

CTNNB1

hiljentäminen pienenee Wnt /β-kateniinin-LEF /TCF riippuvaisen transkription

Wnt /β-kateniinin-LEF /TCF riippuvainen transkriptio tutkittiin käyttämällä Top-Flash /Fop-Flash plasmidit (Top ja Fop). Kuten odotettua, transfektoidut H295R soluista osoitti korkeampaa tran- aktiivisuutta β-kateniinin-LEF /TCF-riippuvainen lusiferaasireportteri- konstrukti Top verrattuna mutatoitunut Fop konstrukti (kuva 1-B, Ctr-Fop: 5% verrattuna Ctr-Top: 100 %, p 0,01 ja shβ-Fop: 9% verrattuna shβ-Top: 100%, p 0,01). H295R soluja, jotka ilmaisivat shRNA-β-kateniinin (shβ kanssa DOX) osoitti pienempi transkriptionaalista aktiivisuutta reportteri rakentaa Top (shβ-Top: -53%, p 0,01). Dox hoito ei vaikuttanut aktiivisuuteen Top rakentaa kontrolliryhmässä klooni (Ctr-Top) tai Fop rakentaa kanssa mutatoitunut LEF /TCF sivustoja sekä klooneja (Ctr-Fop ja shβ-Fop).

Lisäksi

CTNNB

1 hiljentäminen kahden päivän merkittävästi vähentynyt mRNA taso sisäsyntyinen kanoninen alavirtaan kohdegeenin Wnt /β-kateniinin reitin eli

AXIN2

, että shβ klooni (kuvio 1-B , shβ: -82%, p 0,01) verrattuna kontrolliin klooneja (Ctr,

ns

).

CTNNB1

vaientaminen muuttuu leviämisen, solusyklin ja apoptoosin

aika tietysti tutkimus

CTNNB1

hiljentämisen H295R solulinjassa osoitti merkittävän laskun proliferaatiossa (-45,8% 12 päivää, p 0,05) verrattuna shβ klooni ilman

CTNNB1

hiljentäminen (-dox) tai kontrolli-kloonin (kuva 1-C), määritettiin MTT muuntaminen.

virtaussytometrinen analyysi solusyklin propidiumjodidilla värjäys osoitti mitään vaikutusta solusyklin kunnes 5 päivää. Kuitenkin seuraavat 10 päivän DOX hoidon,

CTNNB1

hiljentäminen johti kertymistä solujen G1 vaiheet ja laskua solujen osuus S vaiheessa (kuva 1-C, shβ-10d-G1: 55.3 ± 0,4%

vs

65,8 ± 2,2%, -S: 27,5 ± 0,2%

vs

16,5 ± 1,6%, p 0,05). Tällaista eroa ei havaittu kontrolli-klooni (Ctr). Tällä hetkellä vaiheessa, havaitsimme vähennystä kaksi tärkeää proteiinien G1 /S siirtymä, sykliini ja CDK2 vain soluissa vaimentaa

CTNNB1

(kuva 1-C).

Samalla tavoin, ei ole vaikutusta apoptoosin määritettiin virtaussytometrisesti analyysi annexine V sisällyttäminen soluihin, havaittiin vasta 5 päivää, kun taas 10 päivää DOX indusoidun

CTNNB1

hiljentäminen kasvattanut apoptoottisten solujen (kuva 1-C, shβ- 10d: 167%, p 0,05) verrattuna soluihin, joita ei ole DOX hoitoa. Tällaista eroa ei havaittu kontrolli klooni. Tämä lisäys apoptoosin

CTNNB1

hiljentäminen vahvistettiin myös voitto on proapoptoottiset proteiinin taso, halkaistut caspase3 (CC3), joka oli havaittavissa jo sitä ennen (5 päivää, kuva 1-C). Samoin,

CTNNB1

hiljentäminen lisäsi apoptoottinen vaikutus staurosporiinia (kuva 1-C; shβ-5d + stau: 224%

vs

377%, p 0,05), kun taas mitään merkittävää eroa ei havaittu hallinnassa klooneja.

CTNNB1

hiljentäminen lakkauttaa ksenografti kehittämiseen ACC solulinjan

arvioimiseksi toiminnallista merkitystä β-kateniinin knock-alas kasvainten kehittymistä me eteni tutkimuksessa in ihonalaisen ksenograftin kasvain malli kateenkorvattomissa nude-hiirissä.

ensimmäisessä vaiheessa, lyhyen aikavälin kokeiluja

CTNNB1

inaktivaatio vakiintuneisiin kasvaimiin (21-31 päivää sen jälkeen, kun ksenografti) ajaksi 9 päivinä tehtiin peilata ajan myötä meidän

in vitro

kokeita (kuva 1-C). Samanlainen

in vitro

asettamalla mRNA ilmaisu analyysit paljastivat DOX riippuvainen merkittävä lasku tuumorien

CTNNB1

ja

AXIN2

ilmentymistä shβ klooni (kuvio 2-A;

CTNNB1

: -89%, p = 0,007;

AXIN2

: -87%, p 0,001), kun taas kontrolli klooneja pysynyt vaikuta DOX hoitoa. Lisäksi, ja noudattaen soluviljelmäkokeita, immunohistokemiallinen analyysi (kuvio 2-B) paljasti dox hoitoon riippuvainen väheneminen β-kateniinin proteiinia. Mutta emme ole havaittu mitään eroja Ki67 ja katkaistun caspase3 ekspressiota immunohistokemiallisesti analyysit (tietoja ei esitetä), mikä viittaa siihen, että 9päivä DOX ei ole riittävä

in vivo

indusoimaan vaikutuksia proliferaation ja apoptoosiin . Koska tällä kertaa kurssi on liian lyhyt tutkia mahdollinen vaikutus kasvaimen kasvuun käytettäessä

in vivo

mallissa pitkän aikavälin DOX käsittely suoritettiin. Ctr ja shβ kloonit injektoidaan subkutaani- ja 3 päivää sen jälkeen, kun kasvaimen induktion hiiriä käsiteltiin DOX jatkuvalla tavalla. Ei ole mitään merkittävää eroa ajassa 31 päivää kasvaimen koon välillä shβ ja Ctr klooneja puuttuessa DOX hoitoa, mutta se näyttää, että shβ klooni kasvaa hitaammin kuin Ctr klooni, luultavasti siksi klonaalisen vaikutus. Tästä syystä doxycyclin-indusoituva järjestelmä on sopiva, koska kloonit ovat omaa valvontaa. Vaikka DOX hoito ei vaikuttanut kasvaimen kasvua ja painon valvonta-klooni (kuva 2-C-vasemmalle, mediaanit paino: 112 mg

vs

162,7 mg,

ns

), oli merkittävä vaikutus

CTNNB1

hiljentäminen kun DOX kohtelun shβ klooni (kuva 2-C-rigth). Itse asiassa, ja shβ klooni, ensimmäisen 10 päivää, kasvaimen kasvu oli havaittavissa molemmissa ryhmissä (ilman tai DOX), mutta sen jälkeen, kun 13 päivää, ei kasvain oli havaittavissa missään hiirillä shβ ryhmässä, jota käsiteltiin DOX, mukaan lukien avauksen jälkeen ja patologinen analyysi (kuva 2-C-rigth, mediaani paino 67,4 mg

vs

0 mg, p 0,001).

, histogrammit edustavat

CTNNB1

(

β-kateniinin

) ja

AXIN2

mRNA kertyminen vierassiirrekokeissa sekä Ctr (-dox n = 6, + Dox, n = 5) ja shβ (-dox, n = 5; + Dox, n = 5) klooneja olevien kasvainten ja sen jälkeen 9 päivää DOX hoidon. B, hematoksyliini- eosiini-sahrami ja β-kateniinin, värjäys (× 20) edustavilla kasvaimet shβ kloonin ilman ja DOX hoitoon (saman kokeen kuin B). C, Boxplots edustavat kasvaimen kokoa Ctr ja shβ hiirissä jatkuvasti hoidettu ajoneuvo tai DOX 3 päivän kuluttua kasvaimen induktio. Boxplots vasemmassa kulmassa edustavat painot tuumorit leikattiin. Ctr (-dox n = 7, + Dox n = 8), shβ (-dox, n = 7, + Dox, n = 8).

Keskustelu

Monissa syövät, Wnt /β-kateniinin signalointireitin on tärkeä rooli säätelemällä solujen kasvua, liikkuvuuteen, ja erilaistumista [19]. Me ja muut ovat aikaisemmin osoittaneet, että on tärkeää Wnt /β-kateniinin signalointireitin aktivaatio lisämunuaiskuoren kasvainten synnyssä [5] – [10]. Tämä aktivointi liittyy tiettyyn molekyyli allekirjoitus ja huonompi tulos pienemmillä eloonjäämiseen [12]. Doghman ja työtovereiden aiemmin osoitti, että TCF-antagonisti estää leviämisen lisämunuaisen kuoren solut H295R, mikä viittaa keskeinen rooli Wnt /β-kateniinin väylän lisämunuaiskuoren kasvainten synnyssä [20]. Tämä farmakologinen lähestymistapa ei välttämättä ole spesifinen Wnt signalointia. Me tässä käyttäen sekä

in vitro

ja

in vivo

kokeet osoittavat, että suorat ja erityiset β-kateniinin inaktivaatio johtaa muutoksiin leviämisen, solusyklin ja apoptoosin, jotka johtavat dramaattiseen laskuun kasvainten kehittymistä kasvain malli ACC. Jatkotutkimukset ovat tarpeen tietää, jos β-kateniinin inaktivaatiota estää kasvua tai estää siirteen solujen. Kuitenkin nämä tulokset vahvistavat, 1 /biologinen seuraus Wnt /β-kateniinin reitin aktivaation lisämunuaiskuoren kasvainten synnyssä, ja 2 /the huomattavaa terapeuttista hyötyä kohdistaa tämän reitin kautta.

esto Wnt /β-kateniinin polku on alaryhmä aggressiivinen ACC näyttää olevan mielenkiintoinen terapeuttinen tavoite ja olisi arvioitava tarkemmin tulevaisuudessa.

tukeminen Information

Taulukko S1.

PCR-olosuhteet ja vasta-aineita käytetään.

doi: 10,1371 /journal.pone.0055743.s001

(XLS) B

Kiitokset

Tri. E Lalli antelias lahja H295R /TR soluja ja Dr. H Clevers antelias lahja PTER-sh

βcatenin

vektori.