Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Koska harvat lopulliset markkereita ovat saatavilla maksan syövän kantasoluja (HCSCs), joka perustuu fyysiseen sijasta Immunokemialliset ominaisuudet, haimme uutta menetelmää rikastuttaa HCSCs.

Menetelmät

Kun maksan kasvainsoluja (HTCs) eristettiin ensimmäisen kerran diethylinitrosamine aiheuttama F344 rotan HCC-mallilla käyttäen Percoll-epäjatkuvaa gradienttisentrifugoinnilla (PDGC) ja puhdistettiin ero trypsinisaatiolla ja ero kiinnitys (DTDA), ne erotettiin neljään jakeet käyttämällä Percoll-jatkuvalla gradientilla sentrifugoimalla (PCGC) ja peräkkäin nimetty fraktiot I-IV (FI-IV). Morfologiset ominaisuudet, mRNA ja proteiini tasoilla kantasolujen merkkiaineita, proliferatiivinen kyvyt, aiheuttama erilaistuminen,

in vitro

muuttavien kapasiteettia,

in vitro

kemiallis-kestävät valmiudet, ja

in vivo

pahanlaatuinen valmiuksia määritettiin solujen kunkin fraktion.

havainnot

Koska tiheys solujen lisääntynyt, 22,18%, 11,62%, 4,73% ja 61,47% ensisijaisen viljeltyjen HTCs oli eroteltu FI-FIV, vastaavasti. Solut FIII (tiheys on 1,041 ja 1,062 g /ml) näytetään korkeamman ydin–sytoplasman suhde ja vähemmän soluelimiin ja ilmaisivat korkeamman kantasolujen merkkiaineita (AFP, EpCAM ja CD133) kuin solut muista fraktioista (

P

0,01). Lisäksi

in vitro

, soluja FIII osoitti suurempi kyky itse uudistaa, erilaistua kypsä HTCs, kulkea kalvojen, lähellä naarmuja, ja kuljettaa vastustuskyky kemoterapia kuin teki solut muista jae;

in vivo

, injektio vain 1 x 10

4 solut FIII voisi tuottaa kasvaimia paitsi ihonalaiskudoksen mutta myös maksa nude-hiirten.

Johtopäätökset

kautta uusi menetelmä, HCSC kaltaisia ​​soluja onnistuneesti rikastuneet FIII. Tämä tutkimus edistää huomattavasti kaksi tärkeää alaa biologisesti kiinnostavien: CSC eristäminen ja HCC terapia.

Citation: Liu W-h, Wang X, Sinä N, Tao K-s, Wang T, Tang L-j, et al. (2012) Tehokas rikastaminen Maksan Cancer Stem-Like Solut Primary Rat HCC Malli kautta heysgradienttisentrifugoinnilla-Centered Method. PLoS ONE 7 (4): e35720. doi: 10,1371 /journal.pone.0035720

Editor: Kwan Man, The University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 03 helmikuu 2012; Hyväksytty: 20 maaliskuu 2012; Julkaistu: 25 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 81170419, 81172061, 8100309). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

viime vuosikymmenen, käsitys, että kasvaimia ylläpitää omia kantasoluja, ns syövän kantasolut (CSCS), on aiheuttanut suurta jännitystä tutkimusyhteisön [1]. CSCS ovat yleensä lepotilassa tai hitaasti pyöräily kasvainsoluja, joilla on kyky liuottaa kasvaimia [1]. Niiden oletetaan olevan osallisena kasvaimen vastustuskykyä Chemo /sädehoito ja kasvaimen uusiutumisen ja etenemiseen. CSCS ovat tärkeitä, koska ne ovat vastuussa hoito ei tehoa. Hankkiminen lisää ymmärrystä CSC-määriteltyjä ominaisuuksia tarjoaa oivalluksia alkuvaiheessa tumorigeneesin auttamaan ehkäisemään tätä ilmiötä ja parantaa selektiivisyyttä antitumor hoitoja. Olemassaolo CSCS ehdotti ensimmäisenä yli 40 vuotta sitten [2]; kuitenkin ne vasta äskettäin eristettiin kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien rinta- [3], eturauhassyöpä [4], aivojen [5] ja paksusuolen [6]. Vaikka CSCS on eristetty joidenkin kasvainten, siellä on paljon keskustelua ympäröivän tätä aihetta.

maksasolusyövän (HCC) on erittäin pahanlaatuinen tyyppi kiinteä kasvain liittyy usein etäpesäkkeitä ja huonon ennusteen [7]. Yksittäisiä maksan CSCS (HCSCs) ovat sopiva

in vitro

mallin kehittämiseen hoitostrategioita tarkoituksena on hävittää kasvaimia alaryhmästä sisällä HCC. Juuri tästä syystä tunnistamista ja ymmärtämistä HCSCs ovat ratkaisevia. Eristämiseksi HCSCs, erilaisia ​​erotusmenetelmiä ovat käytettävissä. Eräs yleinen tapa eristämiseksi CSCS on luonnehtia niiden solupinnan fenotyyppi ja käyttää merkkiaineita negatiivisesti tai positiivisesti valita tiettyjen solujen. On todettu maksan kasvainsoluja (HTCs) kanssa CD133 + tai EpCAM + fenotyyppiä on varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia [8]; ne ovat kuitenkin osoitettu olevan rajoitettu plastisuus. Tällä hetkellä tietty markkeri eristämiseen HCSCs edelleen kiistanalainen. Vaihtoehtoinen menetelmä eristämiseksi HCSCs tarvitaan kiireesti. Toinen menetelmä CSC erottaminen perustuu ero ulosvirtauksen fluoresoivia värejä, kuten rodamiini 123 tai Hoechst 33342. Äskettäin eristäminen puolella väestöstä (SP) soluista käyttämällä Hoechst 33342 väriainetta on tullut käyttökelpoinen menetelmä, jolla saadaan CSCS eri kasvaimia. Aiemmassa tutkimuksessa ryhmämme rikastettu HCSCs päässä MHCC97 solulinjasta perustuu ulosvirtausta rodamiini 123 tai Hoechst 33342 [9]. On kuitenkin olemassa vielä joitakin rajoituksia, jotka liittyvät tällä menetelmällä, kuten havaitaan vääriä positiivisia kantasoluja ja vaatimus erityisen välineitä. Viimeinen vaihtoehto eristämiseksi CSCS perustuu fyysiseen erotusmenetelmillä, kuten tiheysgradientti erottaminen. Aikaisemmassa tutkimuksessa olemme menestyksellisesti eristetty sikiön maksassa kantasolujen /kantasolujen (FLSPCs) ensisijaisesti viljellyistä fetaalimaksasoluilla kautta tiheys-tisentrifugaatiolla keskitetty kolmivaiheinen menetelmä [10].

Tässä tutkimuksessa, pyrittiin onko HCSCs voidaan saada hyödyntämällä niiden fysikaaliset ominaisuudet. Tätä tarkoitusta varten käytimme myös perustettu kolmivaiheinen menetelmä, jossa pieni mukautus eristämiseksi HCSCs primaarisista HTCs. HTCs eristettiin ensin käyttämällä Percoll-epäjatkuvaa gradienttisentrifugoinnilla (PDGC), sitten puhdistetaan eron perusteella trypsinisaatiolla ja differentiaalisen sitoutumista (DTDA), ja lopuksi kerrostetaan Percoll jatkuvalla gradientilla sentrifugoimalla (PCGC). HTCs oli siis jaettu neljään alapopulaatioihin. Kolmannen alapopulaatio, joka sisälsi vähiten solut, joiden tiheys vaihtelee välillä 1,041 ja 1,062 g /ml, osoitti korkeinta ekspressiota kantasolujen merkkiaineita, suurin kyky lisääntyä ja muodostaa pesäkkeitä

in vitro

, suurin kyky siirtää

in vitro

, vahvin kyky olla vastustuskykyisiä kemoterapiaa, ja rikkain kyky tuottaa kasvaimia NOD /SCID-hiiriin. Kaikki nämä tulokset osoittivat, että väestö kolmannesta kerroksesta PCGC kaltevuudet hallussaan CSC ominaisuudet. Tämä uusi strategia eristämiseksi HCSCs tekevät suuria maksuja kahteen pääalueeseen: se avaa uusia näkymiä, jotka liittyvät eristämiseen muunlaisia ​​CSCS; ja se antaa meille mahdollisuuden tutkia osuus HCSCs on HCC.

Materiaalit ja menetelmät

1 Menettely erottamiseksi HTCs

1,1 rakentaminen HCC mallin diethylnitrosamine (DEN ) induktio.

Kaksitoista mies Fisher 344 rotat (National Jyrsijöiden Laboratory Animal Resource, Shanghai, Kiina) kokeeseen ryhmässä käsiteltiin 0,05% DEN (Sigma Co., NY, USA) niiden juomavedessä 6 viikon ajan ja sitten vaihtuu normaaliin juomaveteen [11]. Toinen kaksitoista mies Fisher 344 rotat kontrolliryhmässä annettiin normaalia ruokavaliota. Klo 10, 14 ja 18 viikon kuluttua DEN induktion, neljä rottaa kustakin ryhmästä lopetettiin. Näytteet maksakudosta kustakin ryhmästä rutiininomaisesti käsitelty ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H Santa Cruz, CA). Vuohen anti-kani-lgG-vasta-aineita käytettiin värjäystä AFP tai CK-19. Nämä kohdat olivat myös vastavärjättiin 2- (4-diamidinophenyl) -6-indolecarbamidine dihydrokloridi (DAPI) (laimennus 1:100; Sigma), joka ilmaisee ytimeksi. Negatiiviset kontrollit värjättiin ilman ensisijainen vasta-aineita. Värjätyt leikkeet tutkittiin fluoresenssimikroskoopilla (FV1000MPE, Olympus, Tokio, Japani). Positiivinen hinnat AFP ja CK-19 määritettiin kaikissa osissa.

1,3 eristäminen HTCs mukaan PDGC.

Yksittäiset HCC kyhmyt poistettiin kustakin rotasta kokeeseen ryhmässä. Raaka HTCs eristettiin mukainen Hohne et ai. [13] pienin muutoksin. Lyhyesti, HCC kyhmyt jauhettiin William: n E-alustassa (Sigma Co., Louis, MO, USA), 0,1% kollagenaasia tyyppiä IV ja 0,005% trypsiiniä (Sigma Co, Louis, MO, USA) ja sitten inkuboidaan 20 minuuttia 37 ° C ravistellen vesihauteessa. Inkubaation jälkeen vapautuneet solujen supernatantit johdettiin 100 pm nylon mesh ja sentrifugoitiin 1000 x g: ssä 8 minuutin ajan. Pelletit pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) (Invitrogen Co., USA), jolloin saatiin raaka HTCs. Nämä raaka-HTCs valmistettiin yhden solun suspensiot ja erotettu eri fraktioihin käyttäen PDGC (30%, 50% ja 70% Percoll). Solut rajapinnassa 30% ja 50% Percoll kerättiin ja viljeltiin 6-kuoppaisilla levyillä, jotka sisältävät William n E väliaineessa, jota oli täydennetty 10% tilavuus /tilavuus naudan sikiön seerumia (Invitrogen Co, USA), 5 ug /ml insuliinia (Sigma Co Louis, MO, USA), 5 uM hydrokortisonia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä, 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. Kun kiinnittyneet solut pidennetään yksikerroksinen siirtomaa 20 päivää myöhemmin, keräsimme monoklonaalinen solut paikallisten pilkkomalla kloonaamalla sylinterit ja siirsi ne uuteen kulttuuriin lautasen jatkamaan viljelyprosessi.

1.4 puhdistaminen HTCs by DTDA .

Jos haluat saada puhdasta HTCs, soluviljelytutkimuksista käsiteltiin seuraavasti. Tulosten perusteella entisen tutkimuksen ryhmämme [10], erikokoisia soluja voidaan trypsinoitiin kuluessa erillisiä ajanjaksoina. On havaittu, kun solut hajotetaan käyttämällä 0,25% trypsiiniä 10 minuuttia, erittäin suuret solut trypsinoitiin ja pois, kun taas muut solut säilyvät. Tätä menetelmää kutsutaan ”ero trypsinoinnilla”. Mielenkiintoista on, kun solut olivat täysin trypsinoitiin jatkoviljelyn aikana 120 min, suuria soluja ei kiinni levyjen kuoppa ja helposti poistettavissa. Tätä ilmiötä kutsutaan nimellä ”ero kiinnittyminen”. HTCs puhdistettiin kautta näiden kahden stepsHTCs.

1,5 erottaminen HTCs mukaan PCGC.

protokolla suoritettiin menetelmien edellisessä tutkimuksessa [10]. Lyhyesti, luoda jatkuva kaltevuudet, 40% Percoll sentrifugoitiin 20000 x g 90 minuutin ajan käyttäen kulmapää roottori. Putken annettiin sitten seistä 30 min, ja solususpensio kerrostettiin varovasti päälle esimuotoillut kaltevuudet. Putki, joka sisältää solut sentrifugoitiin 500 x g: ssä 15 min käyttäen swinging bucket rotor. Ylhäältä pohjaan putken, kun solutiheydet kasvanut jatkuvasti, keräsimme neljä solufraktioiden ja nimetään ne fraktiot I-IV (FI-IV) (kuvio 1A).

(A) pieni kasvaimia (mustat nuolet) aiheutti 10 viikon DEN induktio. (B) Maksa oli lähes kokonaan korvattu suuria kasvaimia 18 viikkoa kuluttua DEN induktion. (C) Alhainen suurennos eräästä H Santa Cruz, CA), ja sitten fluoresoivalla FITC-konjugoitua vuohen anti-kaniini-vasta-ainetta (laimennus 1:100; Santa Cruz, CA) 2 tunnin ajan. Bruttomäärä solujen morfologia havaittiin fluoresenssimikroskoopilla, ja numerot värekarvojen ja valejalka laskettiin.

3 vertailu markkereita eri jakeet

3.1 Virtaussytometriaa (FCM).

vasta eristettyjä soluja kustakin fraktiosta valmistettiin pitoisuudessa 10

6cells /ml käyttäen William: n E-alustassa (joka sisälsi 20% FBS), ja inkuboitiin 15-30 minuuttia huoneen lämpötilassa estää epäspesifisen sivustoja. Nämä solut pestiin kahdesti PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen 990 ul: ssa PBS: ää. Sen jälkeen, 10 ui vasta-aineiden, mukaan lukien CD133 (PE-konjugoitu, Biolegend, USA) ja EpCAM (FITC-konjugoitu, Biolegend, USA), lisättiin kuhunkin solujen suspension. 30 min inkubaation 4 ° C: ssa pimeässä, solut pestiin kahdesti PBS: llä, kiinnitettiin 0,1% formaldehydillä ja analysoitiin käyttämällä FACSCaliburTM järjestelmän (BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA).

3,2 IF-analyysi.

sen jälkeen, kun vasta eristettyjä soluja kustakin osa kiinni kulttuurin dia, ne pestiin kahdesti PBS: llä, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 20 min ajan, ja upotettiin PBS: ssa 10 min, mitä seurasi altistus 0,01% Triton X-100 huoneenlämpötilassa 10 min. Soluja käsiteltiin 6% vuohen seerumia (Santa Cruz, CA) huoneenlämpötilassa 30 min estää epäspesifisen immuunijärjestelmän reaktioita ja sitten ensisijaisen CD133 (laimennus 1:200; Santa Cruz, CA), AFP (laimennus 1: 200; Santa Cruz, CA) ja CK-19 (laimennus 1:200, Santa Cruz, CA) vasta 4 ° C: ssa yön yli. Sen jälkeen näytteet pestiin kahdesti PBS: llä, niitä inkuboitiin fluoresoivien PE /FITC-konjugoitua vuohen anti-kaniini-vasta-aineiden (laimennus 1:100; Santa Cruz, CA) 2 tunnin ajan. Sen jälkeen näytteet käsiteltiin DAPI (laimennus 1:100, Sigma) 15 minuutin ajan. Fluoresenssi näytteiden havaittiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia (FV1000MPE, Olympus Co., Tokio, Japani).

3,3 Quantitative reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR).

Kokonais-RNA uutettiin vasta eristettyjä soluja kustakin fraktiosta käyttäen TRIzol-reagenssia (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) ja käänteistranskriptio cDNA: ksi, jossa SuperScript II Reverse Transcriptase mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Invitrogen, Carlsbad, CA). Yhtä suuri määrä cDNA: ta kustakin näytteestä monistettiin spesifisillä alukkeilla (taulukko 1). PCR suoritettiin käyttämällä SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) yli 40 sykliä. Pyöräily parametrit PCR oli 10 minuuttia 95 ° C: ssa, 15 sekuntia 95 ° C: ssa, ja 30 sekuntia 60 ° C: ssa, jonka lopullinen dissosiaatio vaihe 15 sekuntia 95 ° C: ssa, 20 sekuntia 60 ° C: ssa, ja 15 sekuntia 95 ° C: ssa käyttämällä Bio-Rad MyIQ5 reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Bio-Rad, Kalifornia, USA). Kukin näyte analysoitiin kolmena rinnakkaisena. mRNA-tasot normalisoitiin käyttämällä GAPDH sisäisenä viitteenä.

4 indusoi erilaistumisen hepatosyyttikasvutekijän (HGF) B

Kaikki solut kustakin osa viljeltiin erikseen kaupallisiin serum- väliaineessa (Sigma Co., Louis, MO, USA), johon oli lisätty HGF pitoisuutena 20 ng /ml. Sen jälkeen kun kaikki solut 96-kuoppalevyille (1 x 10

3 solua /kuoppa) viljeltiin 14 d, ne kerättiin ja tarkka tunnistus suoritettiin seuraavasti. Erilaistumisen arvioitiin havaitsemalla ilmaus CSCS markkeri CD133 FCM ja HCC markkeri AFP IF. Yksityiskohtaisia ​​protokollia ovat kuten edellä on kuvattu.

5 toiminnallinen vertailu eri jakeet

5,1-3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) määrityksessä.

proliferatiivinen kyvyt juuri eristettyjä soluja kustakin fraktiosta määritettiin käyttäen MTT-määritystä. Lyhyesti, soluja viljeltiin 96-kuoppaisille levyille tiheyteen 1 x 10

3 solua /kuoppa. 2, 4, 6, 8, 10, 12 ja 14 päivää viljelyn, MTT: tä (Sigma, St. Louis, MO, USA) liuotettuna PBS: ssä lisättiin kuhunkin kuoppaan, jonka lopullinen pitoisuus on 5 mg /ml, ja näytteitä inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 h. Veteen liukenemattomia tummansininen formatsaanikiteet aikana muodostuneiden MTT lohkaisu metaboloimaan aktiivisesti Sitten solut liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) (Gibco /Invitrogen, NY, USA). Optinen tiheys mitattiin aallonpituudella 490 nm Bio-Rad 680 mikrolevylukijaa (Bio-Rad, Kalifornia, USA).

5,2 Pesäkkeenmuodostusta testi.

tuoreeltaan eristettyjä soluja kustakin osa inokuloitiin erikseen kuhunkin kaivoon (10 solua per kuoppa) 96-kuoppaisille levyille (Corning Life Sciences, Acton, MA), jota oli täydennetty 100-200 ui William E alusta plus leukemiaa estävä tekijä (LIF), pitoisuutena 10 ug /ml. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin kautta värjäämällä trypaanisinisellä (Sigma-Aldrich), useissa aikapisteissä. Sen jälkeen kun 4 viikkoa viljelyn, kunkin kuopan tutkittiin valomikroskoopilla, ja kokonaismäärä solupesäkkeiden laskettiin. Kuvia pesäkkeet rekisteröitiin käyttäen mikroskooppia (Nikon Eclipse TS100, Nikon, Kingston-upon-Thames, Yhdistynyt kuningaskunta) ja digitaalinen kamera (C4742-95, Hamamatsu fotoniikan, Welwyn Garden City, Hertfordshire, UK) faasikontrastimikroskopialla olosuhteissa.

5,3 Transwell migraatiokokeessa.

yhteensä 1 x 10

5 solua 0,5 ml: ssa seerumitonta Williamsin E-elatusainetta kustakin fraktiosta ympättiin 8 um pore- koko polykarbonaattikalvosuodatinta Boyden kammion työnnetty transwell laitteessa (Costar, Cambridge, MA) päällystetään Matrigel. Yhteensä 600 ui Williamsin E-elatusaineessa, joka sisälsi 20% FBS: ää, lisättiin alempaan kammioon. Kun oli inkuboitu 24 tuntia 37 ° C: ssa 5% CO

2 yrityshautomo, solut yläpinnalla insertin poistettiin pyyhkimällä pumpulipuikolla. Solut, jotka olivat vaeltaneet pohjaan sisäkkeen kiinnitettiin 100% metanolissa 2 minuutin ajan, värjättiin 0,5% kristalliviolettia 2 min ajan, huuhdeltiin PBS: llä ja altistettiin tarkastus kautta mikroskoopilla. Arvot invaasio ja muuttoliikkeen saatiin laskemalla alla käänteinen valomikroskoopilla (Olympus, Tokio, Japani) 5 satunnaisesti valittu aloilla.

5,4

In vitro

tyhjästä määritys.

Jokainen kuoppa 24-kuoppaisille kudosviljelylevyille ympättiin soluilla lopulliseen tiheyteen 100000 solua per kuoppa, ja nämä solut pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 24 tuntia, jotta ne voivat tarttua ja muodostamaan konfluentteja yksisolukerroksiin. Nämä konfluentteja monokerrosten sitten sijoitettiin steriilillä pipetillä kärki lähteä tyhjästä noin 0,4-0,5 mm leveä. Elatusaine sitten välittömästi poistettiin (sekä mahdolliset syrjäytti solut). Poistettu väliaine korvattiin tuoreella Williamin E väliaine. Kaikki naarmu määritykset suoritettiin kolmena kappaleena. Scratch sulkeminen seurattiin keräämällä digitaalisten kuvien alussa kokeilun ja säännöllisin väliajoin prosessin aikana solumigraation sulkea tyhjästä, ja kuvat verrattiin määrällisesti maahanmuuttoluku soluja. Digitaaliset kuvat otettiin kiinni käyttämällä käännettyä mikroskooppia (Nikon Eclipse TS100, Nikon, Kingston-upon-Thames, Yhdistynyt kuningaskunta) ja digitaalinen kamera (C4742-95, Hamamatsu fotoniikan, Welwyn Garden City, Hertfordshire, UK) alla vaiheessa.

5.5 kemoterapia kokeilu.

vahvista

in vitro

kemoterapia-vastus, 1,5 x 10

5 solua kustakin osa maljattiin 24-kuoppalevyille ja hoidettiin paklitakselilla (10 ng /ml) 24 tuntia. Optimaalinen paklitakseliannos käytettiin tässä tutkimuksessa annettiin mukaan Alustavien kokeiden. Anneksiini V-FITC /PI apoptoosin detektioreagenssipakkaus (anneksiini V-FITC /PI Värjäys Kit; Immunotech Co, Marseille, Ranska) käytettiin havaitsemiseen solun apoptoosin. Lyhyesti, solut hoidettiin paklitakselilla kerättiin, pestiin kylmällä PBS: llä, inkuboitiin 15 min fluoreseiini-konjugoidulla anneksiini V ja PI mukaan valmistajan protokollia, ja analysoitiin FCM.

5,6 kasvainmuodostusta NOD /SCID-hiiriin.

Kolmekymmentäkuusi uros NOD /SCID-hiirten (6-8 viikkoa) saatu koe Pekingin keskustassa Xiehe Medical University (Peking, Kiina) ylläpidettiin taudinaiheuttajan-rajoitettu olosuhteissa eläin resurssikeskukseen neljännen Military Medical University (Xi’an, Kiina). Nämä hiiret jaettiin satunnaisesti kuuteen ryhmään: F0, FI, FII, FIII FIV, ja ohjaus HeG2 solulinjassa. Siten kukin ryhmä mukana 6 hiirtä. Solut injektoitiin NOD /SCID pistoksena ihon alle eri määriä (1 x 10

5 ja 1 x 10

4). Kasvaimen kasvua seurattiin joka 2 päivää sen jälkeen, kun toisella viikolla ymppäyksen. Kaikki hiiret lopetettiin 60 päivän kuluttua injektion. Kaikki tuloksena kasvaimen kudokset kerättiin, kiinnitettiin 4% formaldehydiä, ja upotettiin parafiiniin H kasvaimen halkaisija 0,2 cm: positiivinen (+); halkaisijaltaan 0,2-0,5 cm kohtalaisen positiivinen (++); ja halkaisija 0,5 cm niin voimakkaasti positiivinen (+++).

6 Tilastollinen

SPSS 14.0 ohjelmistoa käytettiin kaikkiin tilastollisia arviointeja. Kaikki tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± keskivirhe erillisen kokeen (n≥3, jossa n on lukumäärä itsenäisen kokeen). Aineisto analysoitiin tilastollista merkittävyyttä käyttämällä yksisuuntaista ANOVA.

P

0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

Tulokset

1 HCC muodostumista ja HTCs eristäminen

Kun rotat tapettiin 10 viikkoa sen jälkeen, kun DEN induktion vain pieniä kasvaimia ei löydetty (kuvio 1A). 18 viikon kuluttua DEN induktion, useimmat maksakudosta rottien oli korvattu kasvaimen kudokset, joissa on karkea pinnat (kuvio 1 B). Arviointien perusteella kolmen itsenäisen patologeja, H Siksi, esillä olevassa tutkimuksessa olemme sovelsi tätä menetelmää fraktioida HTCs. Näissä olosuhteissa, mukaan jakelu solupelletit, jaoimme HTCs väestöstä (F0) neljään fraktiot (fraktio I-IV, FI-IV). Seurannan perusteella Tiheyden Marker Helmet, neljä solufraktiot poistettiin varovasti erikseen putkesta ylhäältä pohjaan (kuvio 2A). Cell laskenta osoitti, että 22,18 ± 2,13%, 11,62 ± 1,06%, 4,73 ± 0,38% ja 61,47 ± 6,24% soluista oli erotettu FI-FIV, vastaavasti, mikä tarkoittaa, että FIV sisälsi eniten soluja, ja vähiten solut (vähemmän kuin 5% soluja) havaittiin FIII (kuvio 2A). Perustuen dot-plot histogrammien saatu FACS, ennen erottamista, solut F0 olivat heterogeenisiä kooltaan, kun taas erottamisen jälkeen, koko solujen kussakin murto tuli hieman homogeeninen. Kuten odotettua, FCM analyysi kustakin alaryhmästä paljasti lisäys solujen rakeisuus [FSC (sirontamittari) /SSC (sivusirontavirtaussytometriaa)] yhä Percoll tiheys (kuvio 2B). Näin ollen, mistä FI FIV, solujen lisääntynyt jatkuvasti koko.

(A) Kaaviokuva jatkuva Percoll-gradientti, jota käytetään fraktiointia ja prosenttiosuudet solujen erillisiä kussakin fraktiossa. (B) Dot-juoni histogrammit johtuvat FACS-analyysi osoittaa tiheydet solujen kussakin fraktiossa. (C) valomikroskoopilla soluja kustakin osa alla vaiheessa. (D) TEM kuvia ja halkaisijaltaan soluja kustakin fraktiosta. (E) Kuvia solun värjätään phalloidin heijastavat eri morfologioita solun pinnoilla. Alkuperäinen suurennoksilla: 100 x (C), 6000 x (D), 400 x (E).

3 morfologinen vertailu solujen FI-FIV

solut kunkin fraktion viljeltiin erikseen Williamin E väliaineessa. Solut FIII oli ensimmäisenä kiinni levyt, joka pidettiin alle 2 tuntia, jonka jälkeen solut FI ja FII 2,5 h, ja solut FIV ja F0, joka vaaditaan yli 3 tuntia. Alle

in vitro

viljelyolosuhteissa, heterogeenisesti kokoinen solut F0 voitiin helposti havaita. Erottamisen jälkeen, todettiin, että solut FI ja FII olivat pienimmät, jonka jälkeen FIII, ja soluja FIV olivat suurin (kuvio 2C).

TEM kuvia näytetään samanlaisia ​​ilmiöitä kuin havaittu saadut tulokset kautta valomikroskoopilla. F0 solut osoittivat hyvin erilaisia ​​halkaisijat, jotka vaihtelevat 6 pm ja 30 pm (kuvio 2D). Halkaisijat solujen FI ja FII olivat pienimmät, jonka jälkeen FIII, ja halkaisijat solujen FIV olivat suurin (kuvio 2D). Samaan aikaan soluja FIII oli korkein ydin–sytoplasmista suhde ja vähiten soluelimiin; sitä vastoin solut FIV osoitti alimman ydin- sytoplasmisen suhteen ja kaikkein soluelimiin (kuvio 2D). Tämä osoitti, että solut FIII olivat epäkypsiä.

Lisäksi olemme värjätään solut kustakin fraktiosta käyttämällä phalloidin. Under fluoresenssimikroskopiaa, solut FIII oli hieman kirkkaasti värjätty phalloidin ja näytetään enemmän värekarvojen tai valejalka niiden pinnoilla kuin teki solut muita murto (kuvio 2E). Kuitenkin tilastollinen analyysi osoitti, että ero ei ollut merkittävä (

P

0,05).

4 ilmentäminen kantasolujen merkkiaineiden

määrittämiseksi kantasolujen ominaisuuksia solujen kunkin osan, kaksi varsin laajalti hyväksytty kantasolujen markkereita havaittiin FCM heti erottamisen jälkeen. Sekä EpCAM ja CD133 olivat korkeimmin ilmaistu vasta eristettyjä soluja FIII verrattuna muihin jakeet (

P

0,01) (kuvio 3A, C). Prosenttiosuus EpCAM-positiivisten solujen FIII oli peräti 81,5 ± 7,96%, ja prosenttiosuus CD133-positiivisten solujen oli vielä korkeampi eli 84,7 ± 8,53%. Sitä vastoin ilmaisu sekä kantasolujen merkkiaineita tuoreeltaan eristetyt solut FIV oli alhaisin: 7,1% ± 0,64% EpCAM ja 5,7% ± 0,63% ja CD133 (kuvio 3A, C).

(A) Expression of kantasolujen merkkiaineiden (EpCAM ja CD133) kussakin fraktiossa määritettiin FCM. (B) Perustuu IF, CD133-positiivisia soluja (punainen, ytimet sinisellä) ja AFP ja CK-19-positiivisia soluja (vihreä, ytimet sinisellä) havaittiin sisällyttää eri suhteissa. (C) Pystypylväskuvioissa mikä saatujen tietojen kautta FCM. (D) Pystypylväskuvioissa heijastaa tuottamat tiedot IF. (E) qRT-PCR tulokset markkereita tuoreeltaan eristettyjä soluja kustakin fraktiosta. F0 edustaa fraktioimatonta HTCs; FI-IV osoittaa jakeet I-IV erottamisen jälkeen. * Viittaa

P

0,01 verrattuna muihin osa. Alkuperäinen suurennus: 100 x (B).

edelleen tunnistaa kantasolujen ominaisuuksia solujen kustakin osa, olemme havainneet ilmaus CD133: a käyttäen IF. Prosenttiosuus CD133-positiivisia soluja oli korkein FIII, klo 83,2% ± 8,01%, ja alhaisin FIV, 4,6% ± 0,42%, (kuvio 3B, D). Olemme myös valittu yksi maksan tuumorimarkkeri (AFP) ja yksi sapen tuumorimarkkeri (CK-19) solujen tunnistamiseksi kustakin fraktiosta. Sen jälkeen, kun erottelu, prosenttiosuus AFP-positiivisten solujen FIII oli korkein (89,6% ± 8,27%), on paljon suurempi muu osa (

P

0,01) (kuvio 3B, D). Kuitenkin, vain muutamia soluja FI määritettiin olevan CK-19 positiivinen (6,1% ± 0,54%), ja lähes soluja F0, FII, FIII ja FIV ilmaistuna CK-19 (kuvio 3B, D).

edellä kuvatun ilmiön kvantitatiivisesti todentaa qRT-PCR: ää. Suhteelliset tasot EpCAM ja AFP-mRNA oli korkein solujen FIII (

P

0,01), joka lähes neljä kertaa niin suuri kuin havaittiin soluja F0. Sen sijaan EpCAM ja AFP-mRNA: n tasot olivat alhaisimmat solujen FIV (

P

0,01), on puolet tasoja solujen F0 (kuvio 3E). Sopusoinnussa tulosten IF, CK-19 mRNA voi vain heikosti havaittavissa solujen FI (suhteellinen kertainen oli 0,103 ± 0,012); kuitenkin, CK-19 mRNA tuskin havaita solujen F0, FII, FIII ja FIV (kuvio 3E). Lisäksi kypsä maksan markkeri ALB kohtalaisesti ilmaistu solujen FIV, hyvin heikosti ilmaistu solujen F0, FI ja FII, ja ilmaisi melkein ei lainkaan solujen FIII. Voidaan arveltu, että solut FIII olivat paljon kypsymättömiä kuin solut muista jae (

P

0,01).

5 aiheuttama solujen erilaistumista kustakin osa