Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kirjoittajat raportoivat, että 3′-hydroxypterostilbene (HPSB), luonnollinen pterostilbene analoginen, oli voimakkaampi kuin pterostilbene kasvua vastaan ​​ihmisen syöpäsoluja (COLO 205, HCT-116, ja HT-29), jossa mitataan IC

50-arvot 9,0, 40,2 ja 70,9 uM, vastaavasti. Olemme havainneet, että HPSB tehokkaasti inhiboivat ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa indusoimalla apoptoosia ja autophagy. Autophagy tapahtui varhaisessa vaiheessa ja havaittiin muodostamalla hapanta vesicular soluelimiin ja mikrotubuluksiin liittyvä proteiini 1 kevytketjun 3-II tuotantoa. Tällä molekyylitaso, tulokset western blot-analyysi osoitti, että HPSB merkitsevästi alassäädetty inositoli-3-kinaasi (PI3K) /Akt ja mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasien (MAPK) signaloinneista lukien vähentynyt fosforylaatiota nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR). Merkittäviä terapeuttiset vaikutukset osoitettiin

in vivo

käsittelemällä kantavissa nude COLO 205 tuumoriksenografteja kanssa HPSB (10 mg /kg

i.p..

). Nämä estäviä vaikutuksia liittyi mekanistinen down-regulation proteiinin tasojen syklo-oksigenaasi-2 (COX-2), matriisi metallopeptidaasi-9 (MMP-9), verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF), ja sykliini D1, sekä apoptoosin paksusuolen kasvaimissa. Tuloksemme viittaavat siihen, että HPSB voisi toimia uutena lupaava aine paksusuolen syövän hoitoon.

Citation: Cheng T-C, Lai C-S, Chung M-C, Kalyanam N, Majeed M, Ho C-T, et ai. (2014) Voimakkaat syövän vaikutusta 3′-Hydroxypterostilbene Human Colon ksenograftikasvaimissa. PLoS ONE 9 (11): e111814. doi: 10,1371 /journal.pone.0111814

Editor: Ying-Jan Wang, National Cheng Kung yliopisto, Taiwan

vastaanotettu: 08 elokuu 2014; Hyväksytty: 08 lokakuu 2014; Julkaistu: 12 marraskuu 2014

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Data Saatavuus: Kirjoittajat vahvistaa, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Science neuvosto NSC 101-2628-B-022-001-MY4, 102-2628-B-002-053-MY3, ja NTU-103R7777 (Dr. Pan) sekä terveys- ja hyvinvointi lisämaksu tupakkatuotteiden MOHW103-TD-B-111-01 (Dr. Ho). Sabinsa Corporation tuettiin muodossa palkkojen tekijöille NK MM, mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Erityinen roolit nämä kirjoittajat ovat muotoutuneet ”kirjoittaja maksujen osiossa.

Kilpailevat edut: NK ja MM ovat työntekijöitä Sabinsa Corporation. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

epidemiologiset tutkimukset antavat vakuuttavia todisteita siitä, että ruokavalion tekijät voivat muuttaa prosesseja Karsinogeneesin lukien aloittamista , edistäminen ja etenemistä useita erilaisia ​​ihmisen syövän [1]. Syöpä kemopreventiossa on käyttää farmakologisten tai luonnollisen aineiden kehittymisen estämiseksi invasiivisen syövän tai kääntää prosessi syövän. Se voisi olla suorin prosessi vähentää sairastuvuutta ja kuolleisuutta syöpätautia [2] – [4]. Suuri määrä kemopreventiivisiä ja kemoterapia-aineiden, luonnontuotteista, on käytetty lupaava strategia taistella syöpää vastaan ​​indusoimalla apoptoosin pahanlaatuisten solujen [5], [6].

pterostilbene (

trans

-3,5-dimetoksi-4′-hydroxystilbene), joka on dimetyylieetteri analoginen resveratrol, on todettu olevan yhtä tehokas kuin resveratrol estämään syöpää aiheuttavaksi aiheuttaman preneoplastiset leesiot on hiiren maitorauhasen kulttuurin malli ja estää metastaattista kasvua melanoomasolujen maksan [7], [8]. Me ja muut ovat osoittaneet, että pterostilbene esittelee pleiotrooppisia farmakologisia vaikutuksia, tulehdusta, antioksidantti, antiproliferatiivisia, anti-syöpä, ja kipua lievittävä toimintaa soluviljelmässä ja eläinkokeista [9] – [14]. Äskettäin, 3′-hydroxypterostilbene (Fig. 1), joka on uusi luonnollinen pterostilbene analoginen on eristetty

Sphaerophysa salsula

, on selvästi aktiivisempi kuin pterostilbene indusoimaan apoptoosin herkkiä tai resistenttejä leukemiasolujen [15], [ ,,,0],16]. Kuitenkin

in vivo

antituumorivaikutusta ja HPSB jää epäselväksi.

Autophagy, joka tunnetaan myös nimellä tyypin II ohjelmoidun solukuoleman, on tunnettu siitä, että muodostamalla kaksinkertainen kalvo tai eristäminen kalvo, joka on peräisin osasta endoplasmakalvoston (ER) [17], tai siitä cytolplasmic lipidi-allas [18]. Kaksinkertainen kalvo muotojen autophagosome mukaan sitomaan osia sytoplasmassa ja solunsisäinen soluelimiin [11], [12], [19], [20].

Autophagy on vaste eukaryoottisoluissa eri mikroympäristölle rasitukset mukaan lukien nälkään, taudinaiheuttaja tartuntoja ja kemoterapiaa. Lisäksi on olemassa myös useita raportteja on osoittanut, että autophagy induktio näyttää edistävän onnistuneen hoidon aiheuttama kasvainsolujen tappamista [21], ja pro-autophagic lääkkeet, kuten temotsolomidi ovat lupaavia ehdokkaita selektiivisen tappamisen apoptoosin vastustuskykyisten glioblastoomat [22].

Aloittava signaali autophagy muodostuminen tunnetaan huonosti, kun se on todettu, että useat molekyylit ja signalointireittejä ovat sekaantuneet säätelemään autophagy, kuten PI3K-AKT-mTOR (fosfatidyyli 3-kinaasi /proteiinikinaasi B /nisäkkään rapamysiinin kohde), MAPK, Raf-1-MEK1 /2-ERK1 /2 ja PTEN (fosfataasi ja tensin homologi) väyliä [10], [23]. PTEN ja AKT ovat ylävirtaan sääntelevät mTOR kulkureitti toimia estäjä eikä autophage, vastaavasti. AKT estää autophage säätelemällä loppupään molekyyli- 4E-BP1 (4 venymisen sitoa proteiini 1), p70S6K jotka johtavat edistämisessä mRNA käännös.

Tässä nykyisessä tutkimuksessa, ensin tutkinut antiproliferatiivisia vaikutuksia pterostilbene ja sen luonnollinen 3 ”hydroksijohdos ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Tuloksemme osoittivat selvästi, että HPSB oli tehokkaampi kuin pterostilbene apoptoosin annoksesta riippuvalla tavalla COLO 205 soluja.

Arvioimme lisäksi molekyylitason mekanismeja apoptoottisten ja autophagic aiheuttamia vaikutuksia HPSB. Valaista syövän vastaisen mekanismi HPSB, tutkimme signalointireittejä liittyvät HPSB aiheuttama autophagy ihmisen COLO 205 koolonkarsinoomasoluissa.

In vivo

terapeuttisen tehon tutkittiin edelleen käsittelemällä kantavissa nude COLO 205 tuumoriksenografteja 10 mg /kg

ip

HPSB. Tutkimus tarjoaa uusia todisteita siitä, että hydroksyyli- johdannainen pterostilbene voisi toimia uutena ja lupaava aine ihmisen paksusuolen syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

2.1 Reagenssit

propidiumjodidilla ( PI), akridiinioranssia (AO) ja klorokiinin (CQ) ostettiin Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA). 2 ’, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diasetaatti (DCFH-DA) ja 3,3’-dihexyloxacarbocyanine jodidi (DiOC6) hankittiin Molecular Probes (Eugene, OR, USA). PARP, DFF-45, LC-3 I /II, p-mTOR (Ser

2448), mTOR, p-p70S6K (Thr

398), p-p70S6K (Ser

371), s -Akt (Ser473), Akt, PI3K, p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), p-JNK1 /2 (Thr183 /Tyr185), JNK1 /2, s-p38 (Thr180 /Tyr182), p38: n ja MMP-9: vasta-aineet hankittiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). P-PI3K p85α (Tyr508), ERK1 /2, VEGF ja sykliini D1 vasta-aineet hankittiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Kaspaasi 3, 8 ja 9-vasta-aineet hankittiin IMGENEX (San Diego, CA, USA). COX-2-vasta-aine hankittiin Transduction Laboratories (BD Biosciences, Lexington, KY). Β-aktiini-vasta-aine hankittiin Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Pterostilbene ja HPSB saatiin Sabinsa Corp. (East Windsor, NJ). Puhtaus pterostilbene ja HPSB määritettiin HPLC: llä, kuten suurempi kuin 99,2%.

2,2 Soluviljely

Ihmisen paksusuolen syövän solulinjat COLO 205, HCT-116 ja HT-29 hankittiin American Type Culture Collection (Rockville, MD). Solulinjoja kasvatettiin RPMI-1640, johon oli lisätty 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (GIBCO BRL, Grand Island, NY), 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä), 2 mM L-glutamiinia (GIBCO BRL, Grand Island, NY), ja niitä pidettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa. Pterostilbene ja HPSB liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO, koska lopullinen konsentraatio 0,05%). Soluja käsiteltiin 0,05% DMSO: ta vehikkelikontrollina.

2,3 Sytotoksisuusmääritvs

Solujen elinkelpoisuus määritettiin 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyyli liumbromidi (MTT). Lyhyesti, COLO 205, HCT-116 ja HT-29-solut maljattiin tiheydellä 2 x 10

5 solua /ml 96-kuoppaisille levyille. Yön yli kasvun jälkeen, soluja käsiteltiin sarja pitoisuuksia pterostilbene tai 3′-hydroxypterostilbene 24 tuntia. Loppukonsentraatiot DMSO: n elatusaineeseen olivat 0,05%. Lopussa hoidon, 0,2% MTT lisättiin ja soluja inkuboitiin vielä 4 h. Solujen elinkelpoisuus määritettiin skannaamalla ELISA lukijalle 570 nm suodatin.

2.4 Virtaussytometrianalyysi sub-G1 solupopulaatio, mitokondrion kalvon potentiaalia ja ROS tuotanto

sub-G1 solupopulaatio analyysi, COLO 205-solut (2 x 10

5 solua /ml) viljeltiin 12 hyvin ja käsittely eri pitoisuuksilla pterostilbene tai 3′-hydroxypterostilbene 24 tuntia. Sitten solut talteen, pestiin PBS: llä, suspendoitiin uudelleen 200 ul: aan PBS: ää ja kiinnitettiin 800 ul: aan jääkylmää 100% etanolia -20 ° C: ssa. Sen jälkeen, kun sen annettiin seisoa yön yli, solupelletit otettiin talteen sentrifugoimalla, suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan hypotonista puskuria (0,5% Triton X-100 PBS: ssä ja 0,5 ug /ml RNaasi) ja PI (50 ug /ml) ja inkuboitiin 37 ° C ° C: ssa pimeässä 30 minuutin ajan. Fluoresenssi lähtevä PI-DNA-kompleksi kvantitoitiin sen jälkeen, kun heräte fluoresoivan väriaineen FACScan-sytometrialla (Becton Dickinson, San Jose, CA). Vuonna autophagy estäjä tutkimuksessa, soluja esi-käsiteltiin 25 uM SA: ssa 1 h, jonka jälkeen inkuboitiin pterostilbene tai HPSB.

mitokondrion kalvon potentiaalia ja ROS tuotto, solun käsiteltiin kuten edellä on kuvattu 15 min, ja sitten DiOC6 (40 nM) tai DCFH-DA (20 uM) lisättiin elatusaineeseen vielä 30 min 37 ° C: ssa. PBS-pesun jälkeen, fluoresenssin intensiteetti määritettiin FACScan-sytometrisesti.

2,5 havaitseminen autophagy

Autophagy induktio havaittiin AO-värjäyksellä. 24 tunnin kuluttua hoidon, Colo205-solut pestiin PBS: llä, suspendoitiin PBS: ään ja värjättiin 1 ug /ml AO 20 min. Valokuvat saatiin fluoresenssimikroskoopilla (Axioscop, Carl Zeiss, Thomwood, NY) varustettuna elohopea 100-W lamppu, 490 nm band-pass sininen herätesuotimet 500 nm puoliläpäisevä peili ja 515 nm: n long pass sulkusuodin. Kvantifiointiin Avós virtaussytometrialla, solut käsiteltiin, kuten on kuvattu, ja ne värjättiin AO 15 minuutin ajan ja analysoitiin FACScan: laser-virtaussytometrillä ja CellQuest-ohjelmaa.

2,6 Western-blottaus

kokonaisproteiinista COLO 205 soluja uutettiin kautta lisäksi kultaa lyysipuskuria (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1 mM NaF: ää, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 mM fenyylimetaanisulfonyylifluoridia, 1% NP-40, ja 10 ug /ml leupeptiiniä) solupelletteihin jäissä 30 minuutin ajan, mitä seurasi sentrifugointi 10,000 x g 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Yhteenlaskettu proteiinit mitattiin Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Munich, Saksa). Näytteet (50 ug proteiinia) sekoitettiin 5 x näytepuskuria, joka sisälsi 0,3 M Tris-HCl (pH 6,8), 25% 2-merkaptoetanolia, 12% natriumdodekyylisulfaatti (SDS), 25 mM EDTA, 20% glyserolia, ja 0,1% bromifenolisini. Seokset keitettiin 100 ° C: ssa 5 minuuttia ja alistettiin 10% SDS-polyakryyli- minigeeleissä vakiovirralla 20 mA. Elektroforeesi suoritettiin tämän jälkeen SDS-polyakryyliamidigeeleillä. Geelillä olevat proteiinit siirrettiin sähköllä kiinni liikkumattomassa kalvo (PVDF; Millipore Corp., Bedford, MA) ja siirretään puskurissa, joka koostuu 25 mM Tris-HCI (pH8.9), 192 mM glysiiniä, 20% metanolia. Membraanit blokattiin esto, joka sisälsi 20 mM Tris-HCI: a, ja sitten immunoblotattiin eri primaaristen vasta-aineiden ja β-aktiini. Blotit huuhdeltiin kolme kertaa PBST-puskurilla (0,2% Tween 20: 1 x PBS-puskuria) 10 min kukin. Sitten blotteja inkuboitiin 1:5000 laimentamisen piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Zymed Laboratories, San Francisco, CA), ja pestiin sitten jälleen kolme kertaa PBST: llä puskuria. Siirretyt proteiinit visualisoitiin parannetun kemiluminesenssidetektiolla kittiä (ECL; Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK). Tiheydet kvantitoitiin tietokoneella densitometrillä (AlphaImagerTM 2200 System Alpha-tiheysmittarilla. Innotech Corporation, San Leandro, CA).

2,7 Activity kaspaasien

kaspaasi 3, 8 ja 9 aktiivisuus proteiinin uuttoa COLO 205 soluja, määritettiin fluorogeenisen määritystä (Promega: n CaspACE Assay System, Madison, WI). Lyhyesti, 50 ug kokonais-proteiinia, määritettynä Bio-Rad proteiinimäärityksellä kit (Bio-Rad Laboratories), inkuboitiin 50 uM substraattia Ac-Asp-Glu-Val-Asp-methylcoumaryl-7-amiinia (kaspaasi-3 erityinen substraatti), Ac-Ile-Glu-Thr-Asp-AMC (Ac-IETD-AMC) (kaspaasi-8 erityinen substraatti), tai Ac-Leu-Glu-His Asp-AMC (Ac-LEHD-AMC) ( kaspaasi-9 spesifisen substraatin) 30 ° C: ssa 1 h. Vapauttamista methylcoumaryl-7-amiini mitattiin virityksellä 360 nm ja emissio 460 nm: ssä käyttäen fluoresenssispektrofotometriä (ECLIPSE, Varian, Palo Alto, CA).

2,8 COLO 205 ksenograftimallissa

Male Balb /c-nude-hiirillä 3-4 viikkoa vanhoja (paino 16-18 g) saatiin BioLASCO Experimental Animal Center (BioLASCO, Taipei, Taiwan). Kaikki eläimet pidettiin patogeenittomassa steriili isolaattorit ja valvotussa ympäristössä (25 ± 1 ° C 50% suhteellinen kosteus) ja 12 tunnin valo-12 h pimeä sykli hoitokäytännön mukaisesti. Eläimet ruokittiin standardin AIN-76 ruokavalio ja kaikki ruoka, vesi, altaaseen panemista, ja vuodevaatteet steriloitiin ennen käyttöä. Eläimillä oli vapaa pääsy ruokaan ja veteen kaikkina aikoina. Ruoka kupit täydennetään tuoreella ruokavalioon joka päivä. Kaikki eläin tutkimussuunnitelma Tässä tutkimuksessa käytetyt hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitea National Kaohsiung Marine yliopiston (IACUC, NKMU, # 099-AAA9-02, voimassaoloaikojen: 08/01 /2009-07 /31/2012) . Sen jälkeen 1 viikko ja totuttamistiedot, paksusuolen syöpä COLO 205-solut (5 x 10

6) 0,2 ml: ssa PBS: ää injektoitiin ihon alle lapaluiden välistä kunkin paljaan hiiren. Elinsiirron jälkeen, kasvaimen koko mitattiin mittaharpilla, ja tuumorin tilavuus arvioitiin seuraavalla kaavalla: kasvaimen tilavuus (mm

3) = L x W2 /2, jossa L on pituus, ja W on leveys. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet keskimääräinen koko 100-200 mm

3, hiiret jaettiin satunnaisesti kolmeen ryhmään (6 eläintä /ryhmä). Hiiret olivat

vatsaontelon

. injektion pterostilbene tai 3′-hydroxypterostilbene (10 mg /kg /d, vastaavasti) ja 15 päivää, kun taas ohjaus eläimet saatiin injektion maissiöljy. Ruokavaliossa saanti ja kehon kunkin eläimen paino tarkkailtiin joka päivä. Kasvaimen tilavuus määritettiin ja kirjattiin 5 päivän välein käyttäen mittaharppimittauksilla. 15 päivän kuluttua hiiret lopetettiin CO

2 tukehtumisen ja maksa, munuaiset, perna ja kiinteät kasvaimet irrotettiin välittömästi ja punnittiin. Keskimääräinen kasvaimen tilavuus ja tuumorin paino kussakin ryhmässä oli edustavat keskiarvoa ± standardipoikkeama (SD). Kasvain kudokset leikattiin useita annos western pultin analyysiä tai säilytettiin -80 ° C: ssa.

2.9 Tilastollinen

Tulokset esitettiin keskiarvoina ± SE on esitetty lukumäärä itsenäisesti suorittaa kokeita . Vertailut tilastollisen merkitsevyyden ryhmien välillä tehtiin yksisuuntaisella Studentin t-testillä tai yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA).

P

-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

3.1 Solujen lisääntymisen inhibitio in HPSB saaneilla ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa

ensin verrattiin pterostilbene ja HPSB (kuvio 1) kasvuun ihmisen paksusuolen syövän soluja käyttämällä trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä, kuten aiemmin on kuvattu. Kuten kuviossa 2 on esitetty, HPSB laski solujen kasvua viljellyissä ihmisen paksusuolen syövän soluja (COLO 205, HCT-116, ja HT-29), annoksesta riippuvalla tavalla, IC

50-arvot 9,0, 40,2 ja 70,9 uM (taulukko 1). Solun kasvua estävä vaikutus COLO 205 ja HCT-116-solujen (p53 villityypin) oli herkkä HPSB verrattuna HT-29 (p53-mutantti). Nämä tulokset viittaavat siihen, että p53 voisi olla keskeinen säädin COLO 205 soluja. Verrattuna pterostilbene, HPSB oli vahvempi estäjä COLO 205 solujen kasvua. Tämän seurauksena olemme edelleen tutkittiin sytotoksisia vaikutuksia HPSB in COLO 205 soluja.

Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla (5, 10, 25 ja 50 uM) pterostilbene tai 3′-hydroxypterostilbene 24 tuntia. (A) määritys Saharan G1 solujen COLO 205 -soluissa virtaussytometrillä jälkeen PI värjäyksen kuvatulla Materiaalit ja menetelmät. (B, C) hoidon jälkeen, kokosoluliuotteista valmistettiin COLO 205 soluja, ja lohkaisu PARP, DFF-45, pro-kaspaasi 8 ja pro-kaspaasi 9 analysoitiin Western-blottauksella. (D) kinetiikka kaspaasin aktivaation COLO 205 soluja. Soluja käsiteltiin 25 ja 50 uM pterostilbene tai 3′-hydroxypterostilbene 24 tuntia. Caspase toimintaa analysoitiin kuvatulla Materiaalit ja menetelmät. (E) Soluja käsiteltiin 50 uM pterostilbene tai 3′-hydroxypterostilbene 15 min. Mitokondrioiden kalvon potentiaalia ja ROS tuotanto värjättiin DiOC6 (40 nM) ja DCFH-DA (20 uM) ja mitattiin virtaussytometrialla. Arvot on ilmaistu keskiarvoina ± SE kolmena kappaleena testejä. *

P

0,05 osoittaa tilastollisesti merkittävää eroa pterostilbene-hoidetussa ryhmässä.

3,2 HPSB indusoi apoptoosin ihmisen kolorektaalikarsinoomasta solujen

Flow cytometry käytettiin tutkimaan induktion sub-G1 solupopulaatio, tunnusmerkki apoptoosin. Sen tutkimiseksi, sytotoksisia vaikutuksia HPSB havaittu COLO 205 soluja, koska apoptoottisen solukuoleman, soluja käsiteltiin pterostilbene ja HPSB (5-100 uM) 24 tunnin ajan ja DNA-pitoisuus COLO 205 soluja suoritettiin virtaussytometrialla (kuvio 2A). Kuten kuviossa 2A on esitetty, prosenttiosuudet apoptoottisten COLO 205 soluja, oli 6,2, 8,4, 10,2, 14,8, ja 7,2 ja 9,3, 20,1 ja 36,3% inkubaation jälkeen 5, 10, 25, ja 50 uM pterostilbene ja HPSB, vastaavasti. Kuva 2B verrattuna pterostilbene, HPSB selvästi aiheuttaa hajoamista 116 kDa PARP osaksi 85 kDa fragmentit ja aiheuttaa DFF-45-proteiinin hajoamista. Nämä proteiini katkeamiset liittyivät kaspaasi-3. Kuten kuviossa 2C on esitetty, HPSB indusoi dramaattisen kasvun kaspaasi-9 pilkkominen kuin pterostilbene. Kuitenkin vain vähemmän vaikutusta kaspaasi-8 aktiivisuuden HPSB käsitellyissä soluissa. Seurata entsymaattinen aktiivisuus kaspaasi-3, -8, ja -9, kaspaasi-aktiivisuus mitattiin käsittelyn jälkeen COLO 205 soluja 10 ja 50 uM HPSB. Kuten kuviossa 2D on esitetty, HPSB indusoi dramaattisen kasvun kaspaasi-3-aktiivisuus on noin 2,4-kertainen 24 tunnin jälkeen hoidon. Se on viime aikoina tullut selväksi, että apoptoosin liittyy Mitokondrioiden kalvon eheys joka on ratkaiseva solun kuoleman prosessi. Siksi arvioitiin vaikutuksia HPSB on mitokondriaalisen transmembraaninen potentiaali (ΔΨ

m). Mittaustulokset fluoresenssin intensiteetti COLO 205 soluja altistetaan pterostilbene ja HPSB käsittelemättömään kontrolliin verrattuna soluihin on koottu kuvioon. 2E. DiOC6 (3) fluoresenssin intensiteetti on siirtynyt vasemmalle 224-117 ja 75 pterostilbene ja HPSB aiheuttama apoptoottisia COLO 205cells, vastaavasti. Nämä tulokset vahvistivat, että HPSB vähensi mitokondrion transmembraanisen potentiaalin COLO 205 soluja. Rooli ROS apoptoosin induktioon on hyvin tunnustettu. Mielenkiintoista, HPSB merkittävästi vähentynyt keskimääräinen DCFH-DA fluoresenssin intensiteetin 114-38, kun taas pterostilbene lisääntynyt DCFH-DA fluoresenssin intensiteetti 114-141 15 min. Epätasapaino ROS pitoisuuksien voisi tärkeä rooli varhaisessa välittäjänä HPSB aiheuttaman apoptoosin.

3,3 HPSB osoitti voimakkaampaa asiakkuutta vaikutuksia autophagy kuin pterostilbene vuonna COLO 205 soluja

Kertyvät todisteita osoittaa selvästi että pterostilbene on anti-kasvaimien synnyn mahdollisuuden läpi apoptoosin induktion ja autophagy. Me seuraavaksi arvioi pterostilbene ja HPSB indusoi myös autophagy in COLO 205 soluja. Kuten kuviossa 3A on esitetty, HPSB hoito johti selvästi ulkonäkö AVO kuin pterostilbene kun solut värjättiin akridiinioranssilla 24 tunnin kuluttua hoidosta. Kvantifioimiseksi esiintyvyys HPSB aiheuttama autophagy, solut Avós osoitti parannettu punaisen fluoresenssin analysoitiin virtaussytometrialla, joka lisääntyi merkittävästi hoidon jälkeen HPSB annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 3B ja 3C). Vahvista esiintyminen autophagy aiheuttama pterostilbene ja HPSB, tutkimme prosessi LC3I /II, tunnusmerkkejä autophagy käyttämällä immunoblot havaitsemiseksi solun uutetaan lysaatit COLO 205 soluja. Kuten on esitetty kuviossa 3D, HPSB vahvempi lisäsi määriä LC3B I /II proteiineja kuin pterostilbene.

Soluja käsiteltiin 50 uM pterostilbene tai 3′-hydroxypterostilbene 24 h ja värjättiin akridiinioranssilla. (A) vihreä ja punainen fluoresenssi in akridiinioranssin-värjättyjen solujen havaittiin alle fluoresenssimikroskoopissa. (B, C) havaitseminen ja määrittäminen autophagy vuonna COLO 205 soluja. Soluja käsiteltiin 25 ja 50 uM pterostilbene tai 3′-hydroxypterostilbene 24 h ja värjättiin akridiinioranssilla. Mittaaminen vihreän ja punaisen fluoresenssin akridiinioranssin-värjäytyneiden solujen tehtiin käyttämällä virtaussytometria. (D) Solulysaatit valmistettiin 24 tunnin kuluttua käsittelystä ja proteiinin ilmentymistä LC3 I /II analysoitiin Western-blottauksella. Tulokset esitettiin keskiarvona ± SD kolminkertaisista kokeista. *

P

0,05 osoittaa tilastollisesti merkittävää eroa pterostilbene-hoidetussa ryhmässä.

3.4 HPSB esti mTOR /p70S6K, PI3K /Akt ja MAPK signaalireaktioteissä COLO 205 soluja

edelleen ymmärtää molekyylitason mekanismeja HPSB aiheuttama autophagy in COLO 205 soluja, tutkimme fosforylaatiota mTOR /p70S6K, PI3K /Akt ja MPAKs vuonna HPSB käsitellyissä soluissa. Tulokset osoittivat, että fosforylaatio mTOR ja p70S6K (Thr389) oli merkittävästi vähentynyt käsiteltyjen solujen HPSB (kuvio 4A). Kertyvät todisteet tukevat että PI3K /Akt ja MAPK reittejä ovat mukana säännellä autophagy kuitenkin JNK1 /2 tämän reitin on vielä selvittämättä. Siksi tutkimme miten nämä signalointireiteissä toiminut asiakkuutta autophagy mukaan HPSB vuonna COLO 205 soluja. Kuten kuviossa 4B ja 4C, fosforylaatiota PI3K, Akt, ja p38 MAPK laski käsitellyissä soluissa HPSB ajassa riippuvaisella tavalla. Päinvastoin, hoito HPSB lisäsi fosforyloidun ERK1 /2 ja JNK1 /2 tehokkaasti 1 h, sitten vähitellen laski fosforylaation ERK1 /2 ja JNK1 /2 3 tuntia 9 tunnin verrattuna yhteensä ERK1 /2 ja JNK1 /2 proteiinin COLO 205 soluja. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että HPSB estää PI3K /Akt /mTOR /p70S6K ja p38MAPK reittejä ja aktivoi ERK1 /2, JNK1 /2 MAPK polkuja ja viittaa siihen, että nämä muutokset välittävät HPSB aiheuttama autophagy in COLO 205 soluja.

COLO 205 soluja käsiteltiin 50 uM 3′-hydroxypterostilbene eri aikoina. Cell lyates valmistettiin ja proteiinin tasot (A) p-mTOR, p-p70S6K, (B) p-PI3K, p-Akt ja (C) p-ERK1 /2, p-JNK1 /2, s-p38 oli analysoitiin Western blotting -analyysi. Kaikki analyysit edustivat vähintään kolmen erillisen kokeen. Arvot kunkin kaistan osoittavat suhteellinen tiheys bändi normalisoitu p-aktiini käyttäen densitometriä.

Lisäksi käytimme klorokiinin (CQ), estäjä autophagy, onko estyminen autophagy tukahdutetaan HPSB aiheuttama sytotoksisuuden. Kuten on esitetty kuviossa 5, tulokset osoittivat, että käsittely CQ paljasti merkittävän kasvun sytotoksisuus (Fig. 5A) vahvistamalla HPSB-laukaista apoptoosin (kuvio. 5B ja 5C). Nämä tulokset tukevat sen havainnon kanssa, että HPSB hoito indusoi autophagic solukuoleman COLO 205 soluja.

Soluja esikäsiteltiin 25 uM SA: ssa 1 h ennen käsittelyä 50 uM pterostilbene tai 3′-hydroxypterostilbene 24 tuntia. (A) Solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksellä. (B, C) osa-G1 solupopulaatio (%) analysoitiin ja määrän sen jälkeen, kun PI-värjäyksen ja sen jälkeen virtaussytometrialla. Tulokset esitettiin keskiarvona ± SD kolminkertaisista kokeista.

*

P

0,05 ja

**

P

0,01 osoittaa tilastollisesti merkittävää eroa pterostilbene-hoidetussa ryhmässä.

3.5 HPSB esti voimakkaasti kasvaimen kasvua

in vivo

tutki vielä terapeuttinen teho HPSB

in vivo

käsittelemällä kantavissa nude ihmisen kolorektaalisyöpää COLO 205 tuumoriksenografteja käyttäen pterostilbene ja HPSB pitoisuutena 10 mg /kg. Kokeilun aikana kaikki Hiiriä seurattiin tutkimaan, ovatko pterostilbene ja HPSB hoito aiheuttaneet haittavaikutuksia. Kuten taulukosta 2, kehon ja elinten painot kussakin ryhmässä ei ilmennyt epäterveellistä oireita koko tutkimuksen ajan. Nämä tulokset viittaavat siihen, ei ole havaittavia sivuvaikutuksia tai myrkyllisyyttä johtuivat

vatsaontelon.

Injektion pterostilbene ja HPSB. Lisäksi hiiret, jotka saivat nämä hoito-ohjelmaan, ei brutto merkkejä toksisuudesta havaittu näkyviä tarkastusten ulkonäköön ja mikroskooppitutkimukset yksittäisten elinten (tuloksia ei ole esitetty). After15 päivää, kasvaimen tilavuus HPSB estyi merkittävästi verrattuna pterostilbene hoidetuissa hiirissä (Fig. 6A ja 6B). Kasvaimen paino voimakkaasti estyy HPSB hoidetuissa hiirissä (Fig. 6C). Kuten on esitetty kuviossa 6D, proteiinin tasot COX-2, MMP-9, VEGF, sykliini D1, ja pro-kaspaasi-3 oli merkittävästi vähentynyt COLO 205 ksenograftikasvaimissa päässä 10 mg /kg HPSB hoidetussa ryhmässä verrattuna pterostilbene ryhmä. Tuloksemme viittaavat siihen, että HPSB voisi toimia uutena lupaavana aineena syövän kemoterapia-tarkoituksiin.

Kokeellinen Hoitoprotokolla kuvatulla Materiaalit ja menetelmät. Hiirillä COLO 205 -ksenografteja

vatsaontelon.

Injektion pterostilbene tai 3′-hydroxypterostilbene 15 päivää missä verrokkiryhmä sai maissiöljy. (A) valokuva ksenograftikasvaimissa kehitetty kunkin ryhmän on esitetty lopussa day15. (B) Keskimääräinen kasvaimen tilavuutta rekisteröitiin käsittelyn aikana ja (C) kasvaimen keskimääräinen paino mitattiin kokeen lopussa. Kuusi näytettä analysoitiin kussakin ryhmässä, ja arvot edustavat keskiarvoa ± SD.

*

P

0,05 ja

**

P

0,01, verrattuna kontrolliryhmään.

#

P

0,05 verrattuna pterostilbene hoidetussa ryhmässä. (D) kokonaismäärä proteiineja ksenograftikasvaimissa kunkin ryhmän uutettiin western blot -analyysillä. COX-2, MMP-9, VEGF, PCNA, sykliini D1-proteiinin ilmentymisen ja pilkottiin kaspaasi-3 havaittiin käyttämällä spesifisiä vasta-aineita. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa, ensimmäistä kertaa, voimme verrata syöpäsolujen kasvua estävä vaikutus pterostilbene ja HPSB (kuvio 1) ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Tulosten perusteella tutkimus osoitti, että HPSB voimakkaammin aiheuttaman apoptoosin ja autophagy kuin pterostilbene vuonna COLO 205 soluja. Tämä tutkimus osoittaa, että ero bioaktiivisuus HPSB verrata pterostilbene liittyy läsnäolon ja aseman hydroksyyliryhmien perus- pterostilbene kemiallinen rakenne. Paksu- ja COLO 205 syöpäsolujen tehtiin apoptoosin sen jälkeen, kun hoidon HPSB, viittaa siihen, että apoptoosi on merkittävä syy kasvua estävää vaikutusta HPSB. Nämä tiedot on annettava lääke kemistit uusia tietoja suunnittelussa syöpälääkkeitä, sekä myös tukea muita biologisia tutkimuksia näiden modifioituja ja modifioimattomia funktionaaliset ryhmät tulevaisuudessa. Kuten kuviossa 2 on esitetty, HPSB on vahva inhibiittori solujen elinkelpoisuuden ja aiheuttaa voimakas ja nopea apoptoosin induktiosta COLO 205 soluja. Itse asiassa hoidon HPSB aiheuttaa väheneminen mitokondrion kalvon potentiaalia ja induktio kaspaasi-3 ja caspage-9, joka liittyy hajoamisen DFF-45 ja PARP, ennen apoptoosin alkaminen. Rooli ROS apoptoosin induktioon on hyvin tunnustettu. Mielenkiintoista on, kasvu solunsisäisen vetyperoksidin pitoisuuksia pterostilbene, kun taas merkittävästi pienentää vetyperoksidin pitoisuudet HPSB-käsiteltyjen COLO 205-solut (Fig. 2E). Me arveltu, että pterostilbene tunkeutuu solukalvon sytosoliin ja vaikuttaa mitokondrioita pyöräily dihappi kautta elektronien kuljetusta kokoonpanon. Kuitenkin HPSB voisi suoraan kaivella ROS soluissa ja edelleen häiritä solunsisäiset hapetus tasapainoa.

Syöpä kehitys, dynaaminen ja pitkäaikainen prosessi, liittyy useita monimutkaisia ​​tekijöitä vaiheittaista etenemistä lopulta johtaa hallitsematon leviäminen ja syövän kasvua soluille kaikkialla elimistössä etäpesäke. Epidemiologiset tutkimukset ovat saatu vakuuttavia todisteita siitä, että ruokavalion tekijät voivat muokata tätä prosessia [1]. Suhde apoptoosin ja autophagy on monimutkainen ja vaihtelee solutyyppien ja eri jännityksiä. Autophagy on myös geneettisesti ohjelmoitu, promoottorit autophagy on potentiaalia kliinistä hyötyä asettaminen syövän ehkäisyä [24]. Kuten autophagy tarvitaan tehokasta hallintaa metabolisen stressin, edistämällä autophagy kautta mTOR reitin eston voidaan olettaa rajoittavan taudin etenemiseen [25]. Ruokavalion luonnolliset yhdisteet tarjoavat suuria mahdollisuuksia taistelussa ihmisen syövän estämällä syövän synnyn prosessia solun puolustava ja apoptoottisten koneistot [10]. Kertyvät todisteet osoittavat selvästi, että apoptoosin induktio ja autophagy mekanismina syövän ehkäisyyn ruokavalion luonnollisia yhdisteitä [24]. Olemme osoittaneet, että syöpälääkkeen vaikutuksia HPSB säätelevät apoptoosin ja autophagy ja signalointireittejä välittävä HPSB aiheuttama autophagy tunnistettiin. Tuloksemme osoittivat, että inkubaation jälkeen HPSB, The LC3I /II ilmaisut oli huomattavasti lisääntynyt COLO 205 soluja (Fig. 3d). PI3K /Akt ja mTOR /p70S6K reitit ovat tärkeimmät signalointireitteihin että säädellä negatiivisesti autophagy [26].