Krooninen sairaus

tiivistelmä

Solupohjaisilla aktiivisen immunoterapian syövän on lupaava uusi strategia, jossa ensimmäinen dendriittisolujen (DC) rokote saavuttaa hyväksyntää kliiniseen käyttöön viime vuonna. Teollisuustuotanto on edelleen vaikea, erityisesti DC rokotteita, ja mahdollisuus käyttää solu-immunoterapian liitännäishoitona tai kemoterapiaan yhdistettynä edelleen pääosin testaamatta. Tässä käytimme vertailevaa onkologian lähestymistapa testata turvallisuutta ja mahdollisia tehoa kasvaimen RNA-ladattu, CD40-aktivoidut B-solut yksityisomistuksessa koirilla, joilla oli non-Hodgkin-lymfooman (NHL), kliininen skenaario, joka on paitsi suuri ongelma eläinlääketieteen mutta myös bona fide spontaani eläinmallissa ihmisen kunnossa. Kun annetaan NHL koirille lievittyneet induktiokemoterapiaa, CD40-B-solujen elektroporaatiolla

ex vivo

Autologisella kasvaimen RNA turvallisesti stimuloi immuniteetti

in vivo

. Vaikka kemoterapia plus CD40-B rokotusta ei parantunut aika-etenemisen tai lymfooma erityisiä eloonjääminen verrattuna koirien kemoterapiaa yksinään, rokotus voimisti vaikutuksia pelastus hoidon ja parantaa nopeutta kestävä toisen remissioiden sekä myöhemmin lymfooma-specific eloonjäämiseen pelastus hoidon. Useat näistä uusiutuneen koirat ovat nyt pitkäaikaisten perhe ja vapaa taudista yli vuosi. Kaiken kaikkiaan nämä kliiniset ja immunologisten tulokset viittaavat siihen, että solu-pohjainen CD40 syöpä rokotus on turvallinen ja toimii synergiassa kemoterapia parantaa kliinistä tulosta koiran NHL. Laajemmin havaintomme korostaa ainutlaatuista arvoa kliiniset tutkimukset kasvain seuraeläinten.

Citation: Sorenmo KU, Krick E, Coughlin CM, Overley B, Gregor TP, Vonderheide RH, et ai. (2011) CD40-Activated B Cell syövän rokotteen Parantaa Toisen kliinisen remission ja Survival yksityismetsissä koirat Non-Hodgkinin lymfooma. PLoS ONE 6 (8): e24167. doi: 10,1371 /journal.pone.0024167

Toimittaja: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 01 elokuu 2011; Julkaistu: 31 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Sorenmo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Alliance for Cancer Gene Therapy (RHV), Onyx ja Breezy Foundation (KUS), Barry ja Savannah Villakoira Memorial Fund ja Mari Lowe Comparative Oncology Center (NJM), The Immunobiologian ohjelma on Abram- Cancer Centerin University of Pennsylvania (NIH avustus P30 CA016520, RHV), ja Oncology Research rahastoon Veterinary Hospital, University of Pennsylvania (KUS). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kun viime FDA dendriittisen solun rokote sipuleucel-T edenneen eturauhassyövän [1], siellä on uusittu pyrkimyksiä optimoida toisen sukupolven solu-pohjainen hoitoja, joilla pyritään edistämään anti- kasvain immuniteettia syövän hoitoon [2] – [3]. Koska käyttö levossa tai unactivated antigeeniä esittelevien solujen (APC) voi tosiasiassa laukaista antigeenispesifisten T-solujen toleranssin ja näin ollen erittäin kielteisesti, jos annetaan potilaille, on tärkeää kehittää ja testata APC muotoiluja, jotka on nimenomaan suunniteltu aktivoimaan APC joko

in vivo

tai

ex vivo

. Eräs lähestymistapa, joka on syntynyt on farmakologinen silloittuminen CD40 ilmentyy pinnalla APC [4], jotta säätää ylös MHC ja kostimuloivia molekyylejä, stimuloivat eritystä tulehduksellisten sytokiinien, kuten IL-12, ja säätää ylös antiapoptoottinen molekyylejä – prosessi yhteisellä nimellä ”APC lupiin”, joka mahdollistaa pohjustamiseen naiiveja CD4 + ja CD8 + T-solut ja lisäämällä vankka muisti T-soluvasteita [5]. Kliininen reagenssit, jotka aktivoivat CD40 on kehitetty systeemiseen käyttöön ja ovat osoittaneet kliinistä lupauksen [6] – [8], mutta nämä aineet eivät välttämättä ajaa T-soluvasteita

in vivo

vuoksi rajoittavia ominaisuuksia kasvaimen mikroympäristössä [8]. Täällä opiskella

ex vivo

lähestymistapa APC lisensointi. Vaikka dendriittisolut useimmissa malleissa ovat soluja pääasiassa vastuussa fysiologisista T-solujen pohjustusta

in vivo

, B-solut voivat toimia myös APC: n ja myös lisensoitu CD40 aktivointi [9] – [10]. CD40-aktivoitujen B-solujen (CD40-B), kuten DC, voi prime naiivia T-soluvasteita neoantigeenien

ex vivo

ja ne voivat lisätä muisti-T-soluvasteita [9] – [11], mikä viittaa siihen, että antigeeni-loaded CD40-B voi edustaa varteenotettava vaihtoehto DC solu-pohjainen rokotusstrategiat. Jyrkässä ristiriidassa DC kuitenkin B-solut voidaan helposti laajennetaan

in vitro

käyttäen CD40 ligaatio, poistamalla tarvetta suuri määrä leukafereesejä (kuten valmistukseen tarvittavat sipuleucel-T) hankkia riittävästi APC toistuvat rokotukset [9] – [10], [12]. Vaikka CD40-B voivat tehostaa antigeenispesifisen efektori-T-soluvasteita

in vitro

vastaan ​​virus- ja kasvaimiin liittyviä antigeenejä, tiedetään hyvin vähän siitä, näitä vaihtoehtoisia APC voivat stimuloida antituumorista immuunivasteen

in vivo

.

tämän kysymyksen osoittamiseksi, olemme suorittaneet kliinisessä tutkimuksessa CD40-B-rokote yksityismetsissä koirilla (lemmikit) non-Hodgkin-lymfooman (NHL). Koirien NHL on merkittävä terveysongelma koirilla ja jakaa samat kliiniset, käyttäytymiseen, geneettiset ja sytogeneettinen ominaisuudet NHL ihmisillä. Se on nyt laajalti hyväksytty kliinisesti käyttökelpoista järjestelmään, jossa voidaan arvioida turvallisuutta ja tehoa uusia terapeuttisia aineita ennen niiden kääntämistä kliinisissä tutkimuksissa [13]. Kuten ihmisen potilaalla on NHL, standardin hoidon alkuhoidoksi koiran NHL koostuu yhdistelmästä kemoterapiaohjelmat. Vaikka induktiokemoterapiaa on erittäin tehokas ja 60% -85% hoidetuista koirista saavuttaa täydellisen remission induktion jälkeen hoidon, lähes kaikki koirat taudin uusiutumiseen vuoden sisällä lääkeresistentissä tauti ja kuolevat lymfooma [14] – [15]. Lääke hinnat koirien NHL eivät ole muuttuneet merkittävästi viime vuosikymmeninä käytöstä huolimatta enemmän annoksesta voimakkaampi protokollia.

Tässä tutkimuksessa olemme kliinisesti testattu terapeuttista alusta, jota olemme aiemmin kuvattu prekliinisissä tutkimuksissa [12 ], jossa B-soluja NHL koirat laajennetaan

in vitro

käyttämällä CD40L transfektoituja K562-solut (KtCD40L) ja ladattiin sitten autologisilla kasvaimen RNA tuottaa soluun perustuva rokote. RNA-ladattu CD40-B peräisin koiran perifeerisen veren B-soluja stimuloivat toiminnallinen, antigeenispesifisiä T-soluvasteita

in vitro

terveistä koirista ja koirien kanssa spontaanisti esiintyviä NHL [12]. Käyttö Koko kasvaimen RNA antigeeninen hyötykuorman mahdollistaa HLA-riippumaton, kokonainen antigeeni lähestymistapa, joka pyrkii edistämään polyklonaalinen anti-kasvain T-soluvasteen. Täällä raportoimme ensimmäistä kliinisessä tutkimuksessa lajien kasvaimen RNA ladattu CD40-B syöpä rokote, suoritetaan asettaminen minimaalinen jäljellä tauti. Tuloksemme osoittavat, että CD40-B voi stimuloida immuunivaste

in vivo

jotka vaikuttavat toinen peruuttaminen ja hengissä spontaani, suuri eläinmallissa NHL. Nämä tulokset viittaavat siihen, että kasvaimen antigeeni ladataan CD40-B voi toimia käytännön vaihtoehtona DC solu-pohjainen rokote strategioita sekä koirien ja ihmisten kanssa syöpä.

Tulokset

Yksityiset koira protokolla

Kolmekymmentä yksityisomistuksessa koirien kanssa NHL oli kirjoilla tauti esitys tämän prekliinisen toteutettavuus tutkimus ja jalostustoiminto induktiokemoterapiaa (ryhmä 1, ITT). Potilaiden ominaisuudet on esitetty taulukossa 1. Yhdeksäntoista koiraa (63%) varmistettiin olevan täysin Sytologisten ja kliininen remissio lopussa kemoterapiaa ja oli siksi oikeutettu rokotuksen autologisten CD40-aktivoitujen B-solujen (joka toinen viikko kolmen nahansisäiset kylkeen), jotka oli ladattu kokonais-RNA aiemmin eristetty autologisia lymfoomasolut (menetelmät ja materiaalit, ja Supplemental Methods) (ryhmä 2). Yhtä suuri määrä autologisia CD40-B ladattu penikkatauti virusta hemagglutiniini mRNA ruiskutettiin vastakkaiseen kylkeen kuin immunologista säätelyä. Kuusikymmentä-neljä koiraa NHL valittiin ryhmästä 130 koirien kontrolleina rokottamattomia (ryhmä 3). Nämä koirat valittiin perustuu siihen, että niitä käsiteltiin samalla induktion solunsalpaajahoito kuin rokotetun ryhmän (ryhmä 2) ja vahvistettiin olevan täydellinen kliininen ja sytologiseen remission lopussa kemoterapiahoidon protokollan mutta he eivät saaneet CD40 -B solurokotteet. Ei ollut kannustimia koirien mihinkään ryhmään saamaan kemoterapiaa Näin vältetään puolueellisuutta hoitomuoto tai intensiteetti hoidon. Vaikka määrä koiria kontrolliryhmässä (ryhmä 3) oli suurempi kuin rokotetun koiran ryhmä (ryhmä 2), ei ollut tilastollisesti merkitseviä eroja ennustetekijöiden lukien immunofenotyypin ryhmien välillä 2 ja 3 (taulukko 1).

myrkyllisyys

Rokotus RNA ladattu CD40-B erittäin hyvin siedetty. Yksi koira osoitti merkkejä akuutista systeemisen reaktion, kuten heikkoutta, hypotensio, ja oksentelu muutaman tunnin kuluessa ensimmäisestä rokotetta. Hoito laskimoon nesteitä, difenhydramiini ja oksetuslääkkeet johtanut parani ilman komplikaatioita. Tämä erityisesti koira esikäsiteltiin difenhydramiini välittömästi ennen 2 myöhemmät rokotukset, eikä muita systeemisiä reaktioita esiintyi. Lieviä pistoskohdan reaktioita kuten punoitusta ja turvotusta esiintyi useita koiria. Ei ollut merkittäviä muutoksia täydellinen veren kemialliset aikana tai sen jälkeen rokotuksen missään koiria. Lisäksi ole pitkän aikavälin komplikaatioita rokotuksia kuten autoimmuniteetin todettiin kliinisesti, clinicopathologically (seurattiin sarja CBCS) tai ruumiinavauksessa.

kliiniset tulokset

Mediaani aika taudin etenemiseen (TTP) oli 236 päivää (95%: n luottamusväli [CI], 158-314 päivää) ryhmän 1 (ITT), 366 päivää (95% CI, 349-383 päivää) ryhmässä 2 (rokotettu koira), ja 327 päivää (95 % CI, 223-431) ryhmässä 3 (rokottamattomat koirat). Ei ollut tilastollisesti merkitseviä eroja TTP välillä ryhmien 1 ja 3 (p = 0,16) tai Ryhmät 2 ja 3 (p = 0,34). Kaplan Meier -käyrät TTP on esitetty kuvioissa. 1A ja 2A. Mediaani lymfooma erityisiä eloonjäämisen (LSS) oli 489 päivää ryhmässä 1 (95% CI, 309-669 päivää), 809 päivää ryhmän 2 (95% CI, 289-1335 päivää), ja 594 päivää konsernin 3 (95% CI, 536-652 päivää). Kaplan Meier -käyrät LSS esitetään kuvioissa. 1B ja 2B. Vaikka oli 36% parannus mediaani LSS rokotetussa ryhmässä 2 verrattuna rokottamattomiin ohjaus Ryhmä 3, ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p = 0,18). Samoin ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa mediaani LLS välillä Ryhmien 1 ja 3 (p = 0,37). Yleinen eloonjääntiaste ryhmien 2 ja 3 koiraa 1 vuosi oli 89,5% ja 74,1%, tässä järjestyksessä, ja vuoden 2 oli 41,4% ja 25,4%, tässä järjestyksessä. Ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa kokonaiselinaika, mikä osoittaa, että rokotus ei lisännyt kuolleisuutta.

Viisitoista 19 (79%) rokotettu koira ryhmässä 2 lopulta uusiutunut, mutta 4 koiraa (21 %) ei ja saavuttaa kestävä ( 16 kuukautta) ensimmäisen remission jälkeen kemoterapiaa ja CD40-B rokotuksen. Yksi näistä neljästä koiraa kuoli ulkopuoliselta syistä 492 päivää ilman näyttöä lymfooman varmistettiin ruumiinavauksessa. Muut 3 koirat ovat elossa ilman näyttöä lymfooman 959, 1103, ja 1287 päivää alkamisen jälkeen kemoterapian (kliinisen seuranta käynnissä). Kymmenen rokotettujen koirien (52,6%) ovat kuolleet takia lymfooma; kuusi pysyvät elossa kestäviä ensimmäisessä tai toisessa remissio, ja 3 lopetettiin johtuen muista syistä. Kaksi kolmesta koiraa lopetettiin oli hemangiosarkoooma, ei ollut näyttöä lymfooma, ja toinen koira lopetettiin johtuen ”laskussa terveyttä.” Limited työstämisen sallittiin tämän koiran, mutta ruumiinavaus löytänyt näyttöä lymfooma. Syy terveyden heikkeneminen ei tunnistettu; kuitenkin, ei ollut näyttöä autoimmuniteetin ja kaikkien solulinjojen täydellä kypsymiseen olivat läsnä luuytimessä. Yhteensä 7 koiraa tehtiin ruumiinavaus, kun he kuolivat tai lopetettiin. Lukuun ottamatta 3 aiemmin keskusteltu koiraa, kaikki muut koirat (4 koiraa) lopetettiin johtuen pitkälle lymfooma ja ollut mitään todisteita myöhässä toksisuuksien rokotteesta. Neljä 64 koiraa kontrolliryhmässä (ryhmä 3) menetettiin seurata jälkeen restaging, ja lopputulos tietoja ei ollut saatavilla. Lopuista 60 koiraa, 46 (76,7%) uusiutunut ja 14 (23,3%) ei. Ei ollut merkittävää eroa relapsimäärä välillä Ryhmät 2 ja 3 (p = 1,0).

Salvage hoito ja kuolinsyy

Kymmenen 15 rokotettujen koirien (66,7%) ryhmässä 2 että uusiutunut hoidettiin syklofosfamidilla, vinkristiinin ja prednisonin, (COP) salvage hoitoa ja neljä näistä koirista (40%) saavutti kestävä toisen kliinisen remission ( 22 kuukautta) eikä taudin uusiutumiseen. Toinen 5 rokotettu koira että uusiutuneen vastaanotetut yhden aineen prednisonia salvage terapia, joista yksi saavutti kestävä toinen remission eikä taudin uusiutumiseen. Kolme näistä neljästä rokotettujen koirien kanssa kemoterapian aiheuttama kestävä toinen peruuttamista ovat vielä elossa, eikä viitteitä lymfooman 689, 1209, ja 1216 päivää aloittamisen jälkeen alkuperäisen kemoterapiaa. Kaksi muuta koiraa (yksi hoidettu COP kemoterapiaa ja 1 käsiteltiin prednisonin yksin) tapettiin klo 722 ja 958 päivää vastaavasti; kuten edellä mainittiin, ensimmäinen koira oli hemangiosarkoooma ja toinen koira lopetettiin johtuen ”laskussa terveyttä.” Kumpikaan koira oli merkkejä lymfooma ruumiinavauksessa. Toinen Kymmenen koiraa uusiutunut aikana pelastus hoidon ja tapettiin koska niiden lymfooma.

rokottamattomia ryhmä 3, 39 46 koiraa (84%) että uusiutuneen hoidettiin pelastus kemoterapiaa ja yksi koira sai prednisoni yksin; kuitenkin vain 3 (7,7%) koirien ryhmä 3, joka sai taltiointi hoito saavuttaa kestävä toisen peruutuksen, verrattuna 40%: lla rokotetuista koirista joka saavutti kestävä toinen remission pelastaa hoito, ero, joka oli tilastollisesti merkitsevä (p = 0,025). Tämä ero johti tilastollisesti merkittävä parannus selviytymisen jälkeen pelastus relapsin Ryhmä 2 koiraa sai pelastus lääkitystä kuin uusiutunut ryhmä 3 koiraa, jotka saivat salvage terapiaa (p = 0,038) (Fig. 3). Mikä tärkeintä, ei ollut merkittävää eroa käytön pelastaa hoidon välillä koirat uusiutunut ryhmän 2 (66,7%) ja ryhmä 3 (84%), (p = 0,15).

Immunologinen arviointi

Sen määrittämiseksi, onko kasvain RNA: lla lastattuja CD40-B-solujen indusoima kasvain on toiminnallinen-spesifisten T-soluvasteiden

in vivo

, perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMC) on saatu aikaan diagnosointiin ja 3 viikkoa sen jälkeen, kun viimeinen rokotus analysoitiin läsnäolon IFN-γ tuottavat, kasvaimen spesifisten T-solujen ELISPOT. IFN-γ ELISPOT analyysi oli käytettävissä 9 koirille ryhmän 2 (Fig. 4). Positiivinen IFN-γ hoitovaste määriteltiin 50%: n lisäys määrä sytokiinin erittävien solujen rokotuksen jälkeen verrattuna perustasoon ja p-arvo 0,05. Positiivinen immuunivasteita CDV HA havaittiin 4 9 rokotettu koira; positiivisen IFN-γ immuunivasteen autologista tuumoriantigeeniin havaittiin myös 1 dog ja suuntauksen merkitys (p 0,1) havaittiin toisessa 2 koiraa. 2 muut koirat (koira 1 ja koira 16) oli 50% lisäys määrä sytokiinin erittävien solujen vastauksena autologista tuumoriantigeeniin rokotuksen jälkeen verrattuna lähtötilanteeseen, mutta tilastollista merkitsevyyttä ei voitu sijoittaa vuoksi päällekkäisiä sijaan kolmena kappaleena analyysi. Ei ollut mitään korrelaatiota immunologisen vasteen ja keskimääräinen CD40-B-solujen annettiin kullekin koiralle aikana kolme rokotusta. Koska vain 9 koirat pystyivät analysoitava (riittämättömän saatavuuden PBMC kaikkina ajankohtina), emme pystyneet havaitsemaan tilastollisesti merkitsevä korrelaatio immunologisen vasteen ja kliiniseen tulokseen.

PBMC saatiin koirista diagnoosin aikana (pre) ja 3 viikkoa rokotuksesta (post) ja antigeenispesifisiä immuunivasteita suunnattu (A) CDV-HA: n ja (B) imusolmuke kasvaimen antigeenejä määritettiin IFN-y-ELISPOT. * P 0,1, ** p 0,05.

Keskustelu

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, onko kasvain RNA-transfektoidut CD40-aktivoidut B-solut voitaisiin turvallisesti aiheuttaa anti- kasvainimmuniteetin ja vaikuttaa luonnonhistorian spontaanin NHL koirilla jälkeen remission induktion kemoterapiaa. Kliinisessä tutkimuksessa yksityisomistuksessa koirien, RNA-ladattu autologisia CD40-B-solujen intradermaalisesti asettamisessa vähäinen taudin toimi APC

in vivo

ja stimuloi IFN-γ erittävien solujen. Vaikka rokotus lähestymistapa ei vaikuta TTP tai LSS verrattuna kontrolliryhmään koiria kemoterapiaa yksinään, havaitsimme tilastollisesti merkittävää parannusta rokotettujen ryhmän nopeus kestävästä toisen remissioiden sekä myöhemmin lymfooma erityisiä eloonjäämisen uusiutunut koirien hoidon jälkeen salvage terapiaa. Tämä havainto on erityisen kiehtova, koska pelastus terapiassa käytetyt mukana vain lääkkeitä, jotka oli jo käytetty alkuperäisessä kemoterapiaa. Jo pitkään on ymmärrettävä, että valtaosa koirien kanssa NHL että uusiutumisen jälkeen alkuperäisen remission kärsivät nopea kasvaimen etenemistä ja kuolevat huolimatta meripelastus hoitoja [15]. Osoituksena tästä, kemoterapiassa (ei rokotetta) ryhmä tässä tutkimuksessa, kestävä toinen remissio saavutettiin vain 7,7% koirista. Sen sijaan, koirille, jotka uusiutuneen saatuaan kemoterapiaa plus CD40-B rokotuksen, 40% koirista saavutti toisen, kestävä remissio. Lisäksi lymfooma-specific eloonjääminen oli enää uusiutunut koirilla, jotka oli aiemmin rokotettu kuin koirat, jotka eivät olleet (aktiivinen kliinistä seurantaa käynnissä). Vaikka määrä koiria rokotettujen ryhmä on pieni, kliinisiin tuloksiin tässä toteutettavuutta tutkimuksessa ovat rohkaisevia ja takaa lisätestausta suuremmassa, kaksoissokkoutettu, satunnaistettu kliininen tutkimus. Kaiken kaikkiaan meidän kliinisten ja immunologisten tulokset viittaavat siihen, että solu-pohjainen CD40 syövän rokotus synergoi kemoterapia parantaa kliinistä tulosta tätä tautia.

Rokote strategia Tässä tutkimuksessa käytetyt perustuu aiempiin prekliinisissä työ [10], [ ,,,0],12], jotka osoittavat, että CD40-B voidaan käyttää vaihtoehtona DC syövän rokotteen strategioita, joissa lisäetuna

ex vivo

solun laajenemisen, jolloin saadaan useita rokotteita tuotetaan pieni tilavuus perifeeristä verta. Tuloksemme vahvistavat, että kokonaisten kasvaimen RNA transfektoidut CD40-B-solujen vaihtoehtona DC rokotus on sekä toteuttamiskelpoinen ja hyvin siedetty

in vivo

. Tässä tutkimuksessa käytettiin koko kasvaimen RNA antigeeninen hyötykuorma, joka toimittaa sekä mutatoidut kasvain /lymfooma antigeenejä ja ei-mutatoidun self-antigeenejä.

In vitro

, RNA-transfektoidut CD40-B voivat stimuloida sytotoksisia T-soluvasteita tuumoriantigeenejä vastaan, jotka ovat verrattavissa vasteita aiheuttama antigeeni-ladattu DC [10], [16]. Täällä olemme kääntänyt nämä havainnot osaksi kliinisen areenalle ja osoittavat, että samanlainen antigeeni ladattu DC, CD40-B voi aiheuttaa immuunivasteita, kun sitä annetaan

in vivo

. Mikä tärkeintä, olemme huomanneet, että autologiset RNA ladattu CD40-B voidaan antaa turvallisesti koirille, joilla on vain satunnaista ja lieviä pistoskohdan reaktioita huomattava, koska akuutti haittatapahtumia. Yksi koira oli yksi anafylaksian kaltainen reaktio ensimmäisen rokotuksen joka ei esiintyä toisen tai kolmannen rokotuksen. Ei pitkäaikaisia ​​komplikaatioita rokotuksesta lukien autoimmuniteetin tunnistettiin joko kliinisesti tai ruumiinavauksessa missään koiria. Lisäksi olemme myös arvioida eloonjäämiseen välillä rokotetun ryhmän ja kontrolliryhmän ja löytänyt tilastollisesti merkitsevää eroa, mikä osoittaa, että rokotus ei lisännyt kuolleisuutta.

havaintojen ennen CD40-B rokotuksen vaikuttaa myönteisesti nopeudella toisen peruuttamista ja myöhemmät eloonjäämisen uusiutunut hoidetuilla koirilla taltiointi hoidon yhtymäkohtia havainnot, jotka ovat toipumassa viime työtä ihmisillä rokotteen kokeissa; nimittäin, pitkittynyt kokonaiselinajan mediaani [1] tai odottamattoman suuri vastausprosentti pelastaa hoito [17], ei välttämättä parantaa ilman taudin etenemistä ihmispotilaille rokotettu antigeenillä ladattu DC. Nämä ihmisen tutkimukset dokumentoitu yhdistyksen välillä varhain rokotteen immuunivasteet ja odottamaton ja kestäviä vastauksia myöhemmin kemoterapiaa, ja ehdottaa monimutkainen vuorovaikutus kemoterapiaa ja immunoterapia, jotka voivat olla terapeuttisesti hyödynnettävissä. Vaikka taustalla mekanismeja nämä havainnot eivät ole täysin ymmärtäneet, se on arveltu, että käyttö solunsalpaajahoito potilailla, joiden immuunijärjestelmä on asianmukaisesti pohjustettu tunnistamaan tuumoriantigeeniin kautta syövän rokotus voidaan lisätä kasvaimen vastaisen immuniteetin [18] – [19] . Sytotoksiset aineet, kuten antrasykliinit voivat aiheuttaa ”immunogeeninen” kasvainsolun kuoleman ja vapauttaa voimakas proinflammatoristen molekyylien, jotka edistävät DC aktivointi- ja antigeenin käsittely ja esittely [20]. Lisäksi sytotoksisia vaikutuksia salvage hoito voi tuottaa immunologisen anti-kasvain booster vaikutus hajottaa kasvainsoluja ja vapauttaen kasvaimen antigeenien esittely [21]. Viimeaikaiset tiedot viittaavat myös siihen, että kemoterapia voi herkistää tuumorikohteita tappamiseen by T-soluja indusoitiin rokottamalla [22]. Sytotoksiset aineet, kuten syklofosfamidi voi myös parantaa kasvaimen vastaisen immuniteetin estämisen kautta säätelijä-T-solujen [23] ja moduloimalla tasapaino dendriittisolujen osajoukkojen imukudoselimissä [24]. Näin tutkimuksessamme, on mahdollista, että pelastus hoito palvellut laajentaa kasvaimen vastaisen immuunivasteen, joka oli asianmukaisesti pohjustettu etukäteen CD40-B rokotusta, mikä kestävä toinen peruuttamista kertaa ja pitkäaikaiseen eloonjäämiseen.

käytetyt tiedot koirista hoidettiin samalla kemoterapiaa protokollaa samaan laitoksen kontrollina väestön TTP /LSS analyysit. Ihannetapauksessa vertailupopulaatiossa olisi koostui koirista satunnaistettiin saamaan kemoterapiaa yksinään, ja vertailut suoritetaan Intent-to-treat pohjalta; kuitenkin peräti 40% koirista esitellä meidän toimielimen NHL epäonnistua induktio kemoterapiaa ja näin ollen eivät voi saada rokotuksen tai sisällytettäväksi vertailupopulaatiossa. Näytteen koko vaaditaan riittävästi virtaa tehdä tällainen tutkimus olisi melko suuri ja näin ollen ole käytännön toteutettavuustutkimukseen. Vaihtoehtona, valitsimme koiria, joilla on sama tauti, hoidettiin samalla 20 viikon kemoterapiakäytäntö joka johti täydellisen remission suurempaa ryhmää koirien NHL rokottamattomaan kontrolliryhmään. Tärkeää on, analysoimalla aiemmin dokumentoitu negatiivinen ennustetekijöiden ryhmien välillä 2 ja 3 (taulukko 1), me vahvisti, että ei ollut tilastollista eroa näiden tekijöiden ryhmien välillä 2 ja 3. Kuitenkin johtuen pienestä populaation koko ryhmän 2 ja monimuotoisuus muuttujien on mahdollista, että erot negatiiviset ennustetekijöitä ryhmien välillä voi olla olemassa.

Lopuksi havaintomme korostavat arvon vertailevaa onkologian lähestymistapa [13], [25], jossa yksityisomistuksessa koirien kanssa NHL edustavat paitsi merkittävä kliininen ongelma eläinlääketieteen mutta myös spontaani eläinmallia ihmisen kunnossa. Testaus Uusien immuuni hoitomuotojen suuren riskin mutta minimaalinen jäljellä tauti asetus koirilla on tarkoituksenmukaista ja eettisesti, ja mahdollisesti ratkaiseva menestyksekkään kehittämisen immunologisten lähestymistapoja, jotka muutoin tukahduttaa suuret kasvaintaakat. Täällä sen sijaan käyttöön monimutkaisia ​​terapeuttista pyrkimyksiä kysymyksiä immunosuppression kasvaimen mikroympäristössä, ensin käytetään tavanomaisen kemoterapian massiivisesti vähentää kasvaintaakkaa ennen immuuniterapiassa. Valtaosassa vaiheen I kliiniset kokeet arvioida immuuni hoitomuotoja ihmisillä, potilailla on merkittävä tuumorikuorma, edenneen taudin, ja ovat kärsineet immunosuppressiiviset vaikutukset useita kierroksia kemoterapiaa ja muita hoitoja. Tutkimus koirien spontaani NHL tarjoaa ainutlaatuisen mahdollisuuden arvioida terapeuttista tehoa immuuni hoitomuotojen asettaminen minimaalinen jäljellä tauti. Tulokset tästä tutkimuksesta osoittavat, että synergiavaikutuksia kemoterapiaa ja immunoterapia esiintyy ja että optimaalinen yhdistelmä mainittu menettely voi johtaa merkittäviin terapeuttisen vaikutuksen. Lisätutkimukset yksityismetsissä koirilla, joissa on luonnollisesti syöpiä saattaa tarjota mahdollisuuden ymmärtää taustalla olevien mekanismien tämän vaikutuksen taustalla ja määrittää optimaalisen yhdistelmän ja järjestys Chemo-immunoterapia terapeuttista menestys. Tämä lähestymistapa voi nopeuttaa kääntämistä näiden yhdistelmiä ihmispotilaille.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tutkimus hyväksynyt meidän yliopiston Institutional Animal Care ja käyttö lausunnon ( Protocol 800900) ja Yksityisomistuksessa Eläinprotokolla komitea Pennsylvanian yliopiston School of Veterinary Medicine (Protocol POAP-197).

Protocol tutkimuspopulaatiossa, kelpoisuusvaatimukset ja tutkimuksen suunnittelu

Koirat hiljattain diagnosoitu, hoitamaton multisentrinen NHL painoi yli 5 kg seulottiin osallistumiskelpoisuuden tässä tutkimuksessa. Tuolloin diagnoosi, täydellinen lavastus, kuten CBC, seerumin kemia profiili, virtsa-analyysin, rintakehä röntgenkuvat, vatsan ultraääni, Immunofenotyypitys, luuydinaspiraatit, imusolmuke aspiraatteja ja koepaloja, suoritettiin. Tukikelpoisuusvaatimukset sisälly mitään vakavia samanaikaisia ​​tauti, alle 30% lymphoblasts on luuydinaspiraattien, harvinaista poissa lymphoblasts havaittu ääreisveren kokeena tarkastelun ja kirjallinen suostumus omistajalta.

Ennen induktiokemoterapiaa yhteen, perifeeristen imusolmukkeiden kirurgisesti poistettu, ja ääreisverenkierron kerättiin rokotteiden tuotantoon ja perustason immuunijärjestelmän toimintaa tutkimuksia. Induktiokemoterapiaa koostui lyhyen, 20-viikon yhdistelmä kemoterapia-protokollan mukaan lukien syklofosfamidi, doksorubisiini, vinkristiini, L-asparaginaasi, ja prednisoni, kuten aiemmin on kuvattu [14]. Sama induktiokemoterapiaa protokollaa käytettiin koirien ryhmissä 2 ja 3. Kaikki koirat kävivät täydellinen restaging, kuten ohuella neulalla aspiraatteja ja sytologinen arviointi reuna imusolmuke, kahden viikon kuluttua loppuun protokollan. Vain koiria, jotka vahvistettiin olevan täydellinen remissio olivat oikeutettuja rokotuksia ja vain nämä koirat tehtiin edelleen verinäytteet PBMC kokoelma.

autologinen rokote koostui yhteensä kasvaimen RNA-ladattu CD40-B-solujen ja ohjaus rokote koostui CD40-B-solujen ladattu CDV-HA-mRNA: n. Rokotukset aloitettiin 3-4 viikkoa lähtien kemoterapian päättymisen jälkeen. Rokotetut alueet ajeltiin ja aseptisesti valmis ennen rokotusta. Rokotteet annettiin ihonalaisesti (kasvaimen RNA CD40-B yhden kyljen, CDV-HA CD40-B vastapuolella olevaan kylkeen) joka 2-3 viikko yhteensä kolme rokotusta. Veri immuuni tutkimuksia ja myrkyllisyyttä seurantaa kerättiin välittömästi ennen jokaista rokotusta ja 3 viikkoa viimeisen rokotteen annettiin.

Koirat, jotka eivät saavuttaneet remission ja siksi ei saanut rokotteen ja koirat rokotettiin, mutta uusiutunut myöhemmin tarjottiin standardi-of-care pelastaa terapia mukaan niiden omistajien suosivat ja eläinlääkärin suosituksiin. Kaikki rokotetut koirat olivat seurattiin uusiutumisen kautta kuukausittain tutkimukset ensimmäisenä vuonna, joka toinen kuukausi 2

toinen vuosi ja 3 kuukauden välein kolmantena vuonna. Pahenemisvaiheita vahvistettiin ohuella neulalla aspiraattien kaikilla koirilla.

RNA ja mRNA valmistelu

Manufacturing tiedot CD40-B valmiste, RNA: n eristys ja elektroporaatio on aiemmin raportoitu [12]. Lyhyesti, kokonais-RNA uutettiin pahanlaatuinen imusolmukekudoksesta otettu aikaan diagnosointiin ja ennen kemoterapiaa käyttäen RNAeasy (Qiagen, Valencia, CA). RNA määrä määritettiin mittaamalla O.D. 260 nm: n ja RNA laatu määritettiin geelin electophoresis. RNA säilytettiin -80 ° C: ssa ennen käyttöä. mRNA, joka koodaa täyspitkää CDV-HA tai GFP valmistettiin mallin plasmideista in vitro transkription, kuten aikaisemmin on kuvattu [12]. Transkriptoidaan RNA polyadenyloituja 3′-terminukseen käyttämällä Escherichia coli Poly (A) polymeraasi I (E-PAP), käsiteltiin DNAasi poistamiseksi plasmidisekvenssejä ja puhdistettiin hapan fenoli /kloroformi-uutolla ja RNeasy pylväserottelulla (Qiagen).

Vaccine valmistus

CD40-B oli tuotettu koiran perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC) käyttäen K562-soluja, jotka on transfektoitu ihmisen CD40L (KtCD40L) solua syöttösoluina, kuten aiemmin on kuvattu [12]. 5 x 10

6 PBMC: itä viljeltiin yhdessä 10

6 säteilytetään kuolettavasti KtCD40L solujen rekombinanttisen canine IL-4 ja syklosporiini. Jälkeen 5-7 päivää, B-solut kerättiin, laskettiin ja stimuloitiin uudelleen säteilytetyillä KtCD40L solujen läsnä ollessa IL-4 ja syklosporiini. Soluja stimuloitiin KtCD40L soluja kolme kertaa. Viisi päivää viimeisen stimuloinnin CD40-B talteen, pestiin kahdesti PBS: ssä ja suspendoitiin uudelleen 2 x 10

6 solua 100 ui Nucleofector B liuosta (Amaxa, Köln, Saksa). Jopa 5 x 10

6 solua elektroporaatio joko 10 ug autologisia RNA: n tai 2 ug CDV mRNA käyttäen Amaxa Nuceofector laite (pulssi ohjelma U08). -elektroporaattoria On suunniteltu ja valmistettu mukaisesti GMP-standardien asettamien FDA ja on hyväksytty käytettäväksi ihmisen rokotteen valmistukseen. Elektroporaation jälkeen solut pestiin kerran B-solujen median ja sitten kahdesti PBS: ssä. Elektroporaatiolla solut suspendoitiin uudelleen 300 ul: aan PBS ja intradermaalisesti yli oikealta laidalta ja kasvainten RNA-ladattu CD40-B-solujen ja yli vasemman laidalta ja CDV-ladattu CD40-B-solut.

Rokotteen valmistus ja sukupolvi

CD40-B-solujen ja kasvaimen RNA muodostettiin kaikki koirat, vaikka määrä CD40-B-solut tuottivat vaihteli per koira.