Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida aktiivisuuden selektiivisiä Nuclear Export (SINE) yhdisteitä, jotka estävät funktio tumasta proteiinia Exportin 1 (XPO1 /CRM1) vastaan ​​koiran kasvainsolulinjoja ja suorittaa vaiheen I kliinisessä tutkimuksessa KPT-335 koirilla, joiden spontaani syöpä antaa alustava arvio biologinen aktiivisuus ja siedettävyys.

menetelmät ja havainnot

koiran kasvainsolulinjoja johdettu non-Hodgkin-lymfooman (NHL), syöttösolujen kasvain, melanooma ja osteosarkooma näytteillä kasvun esto ja apoptoosin vasteena nanomolaarisina pitoisuuksina sini yhdisteet; NHL-solut olivat erityisen herkkiä IC

50 pitoisuuksina 2-42 nM. Vaiheen I kliinisessä tutkimuksessa KPT-335 tehtiin 17 koirilla NHL (naiivi tai uusiutunut), syöttösolukasvainten kasvain tai osteosarkooman. Suurin siedetty annos oli 1,75 mg /kg suun kautta kahdesti /viikko (maanantai /torstai), vaikka biologinen aktiivisuus havaittiin annoksella 1 mg /kg. Kliinistä hyötyä (CB) ja osittainen hoitovaste (PR, n = 2) ja stabiili tauti (SD, n = 7) havaittiin 9/14 koirilla NHL ajan mediaani taudin etenemiseen (TTP) ja vasteen ja 66 päivää (alue 35-256 päivää). Annoksesta laajennus Tutkimus suoritettiin 6 koiraa NHL annettiin 1,5 mg /kg KPT-335 maanantai /keskiviikko /perjantai; CB havaittiin 4/6 koirilla mediaani vas- teen tuottaneiden TTP 83 päivää (vaihteluväli 35-354 päivää). Toksisuuksia olivat lähinnä maha koostuu anoreksia, laihtuminen, oksentelu ja ripuli ja hallittavissa mukaisen hoidon, annos modulaatio ja hallinnon pieniannoksisen prednisonin; maksatoksisuus, ruokahaluttomuus ja laihtuminen oli annosta rajoittavasta toksisuudesta.

Johtopäätökset

Tämä tutkimus antaa näyttöä siitä, että uusi suun kautta otettava XPO1 estäjä KPT-335 on turvallinen ja on aktiivisuutta asiaan, spontaani suuri eläinmallissa syövän. Tämän tutkimuksen tulokset sisältää tärkeitä uusia tietoja, luo perustan arvioida SINE yhdisteiden ihmisen syövässä.

Citation: London CA, Bernabe LF, Barnard S, Kisseberth WC, Borgatti A, Henson M, et al. (2014) Prekliiniset arviointi Novel, suun kautta otettava selektiivinen Nuclear Export (SINE) KPT-335 Spontaani Koirien Cancer: tulokset faasin I tutkimuksessa. PLoS ONE 9 (2): e87585. doi: 10,1371 /journal.pone.0087585

Editor: Kristy L. Richards, University of North Carolina at Chapel Hill, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 28 joulukuu 2013; Julkaistu 4 helmikuuta 2014

Copyright: © 2014 London et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: rahoittajien (Karyopharm Therapeutics) avustaa tutkimuksessa suunnittelussa ja muokata käsikirjoituksen sen jälkeen valmistelua. Karyopharm Therapeutics ei ollut roolia tietojen keräämistä, tietojen analysointia tai valmisteesta käsikirjoituksen itse.

Kilpailevat edut: Olen lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat konflikteja. J S-M, DM, MK, ja SS ovat kaikkien työntekijöiden Karyopharm Therapeutics. Kliinisen tutkimuksen rahoittivat Karyopharm terapeuttisia. CAL on saanut palkkioita päässä Karyopharm Therapeutics. Tämä ei muuta meidän noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

vaihto proteiinien välillä tumassa ja sytoplasmassa on tiukasti säänneltyä prosessi, johon useat proteiinit vastuussa for shuttling lastin ja ulos ydin. On seitsemän tunnettua tumasta proteiinit (Exportin 1-7), jotka kuljettavat makromolekyylien tumasta sytoplasmaan [1], [2], [3]. Exportin 1 (XPO1, jota kutsutaan myös Kromosomi Region Maintenance proteiini 1 [CRM1]) on jäsenenä karyopherin β perheen liikenteen reseptorien joka sitoo hyvin monipuolinen kokoelma noin 220 kohdeproteiinit hydrofobisen leusiinirikkaita tumasta signaali (NES) läsnä lastin [4]. Vuorovaikutus NES-suunnatun proteiini rahtia pieni GTPaasi molekyyli Ran johtaa soluliman liikenteen kautta tumahuokonen monimutkainen [5]. XPO1 on ainoa ydin- viejä useita merkittäviä tuumorisuppressorin ja kasvun säätelyproteiineihin (tsps ja bruttopeittoon, kuten p53, p75, Rb, p21, p27, STAT3, FOXO ja IKB mm) [6], [7]. Expression of XPO1 tiedetään voimistuvan eri sekä hematologisia syöpiä ja kiinteitä kasvaimia, ja tämä korreloi huonoon ennusteeseen [1], [2], [3], mikä osoittaa, että muutokset ydin–sytoplasman kaupan johtaa poikkeavaan lokalisoinnin avain proteiinit voivat edistää kasvainten synnyssä ja mahdollisesti vastustuskyky terapia.

Useat pienmolekyylisalpaajilla XPO1 on kehitetty ja testattu erilaisia ​​kasvainsolujen, ensisijaisesti

in vitro

. Näitä ovat Leptomycin B, ratjadone, anguinomycin, goniothalamin, muun muassa, jotka sitoutuvat kovalenttisesti reaktiivisen kysteiinitähteen (Cys528), joka sijaitsee NES-sitovaan uurteeseen XPO1 [1], [2], [3]. Tämä sitoutuminen toiminnallisesti inaktivoi XPO1 peruuttamattomasti ja kohdistettu proteiini proteasomi hajoamiseen [8], jolloin palauttaminen TSP ja GRP solusijaintipaikan ja toiminta. Esimerkiksi Leptomycin B aiheuttaa ydinvoiman säilyttäminen BCR-ABL1 fuusioproteiini ja indusoi apoptoosia kun samanaikaisesti imatinibin kanssa on KML soluja

in vitro

[9]. Vaikka Leptomycin B tehoaa useita syöpäsolulinjoja

in vitro

ja hiiren ksenografti kasvainmuodosta, se aiheuttaa merkittävää systeemistä toksisuutta sekä eläimillä että ihmisillä keskeyttämiseen johtanut kliinisen kehityksen [10]. Viime aikoina analogeja Leptomycin B on kehitetty, jotka osoittavat suurempaa tehoa

in vitro

ja

in vivo

on huomattavasti pienempi toksisuusprofiili hiirillä [11]. Nämä aineet vaativat suonensisäisen toimitus, rajoittamalla taajuus lääkkeen annon.

Äskettäin romaani, huumeiden kaltaisia, suun kautta otettava, pienimolekyylisiä selektiivinen Nuclear Export (SINE) yhdisteitä, jotka spesifisesti ja peruuttamattomasti sitoutuvat XPO1 on reaktiivinen kohta Cys 528 jäämiä on kehitetty [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18]. Nämä ovat hitaasti palautuvia t

1/2 noin 24 tuntia, ja aiheuttaa toiminnallisia Inaktivoitumisen XPO1 proteiinia. SINE yhdisteiden on osoitettu aiheuttavan apoptoosia ja estää proliferaatiota useissa syöpäsolulinjoissa, mukaan lukien ne, jotka ovat peräisin paksusuoli- [6], haiman [12], ja rintojen karsinoomat [16] sekä krooninen lymfaattinen leukemia (CLL) [15], säästäen normaalit solut [19]. Lisätutkimukset ovat osoittaneet, voimakas anti syövän aktiivisuus ja hyvä siedettävyys SINE

in vivo

hiirellä ihmisen ksenograftin (ihonalainen, potilaalle tehdä, tai leukemograft) malleja haimasyövän [12], munuaissyövän [20], KLL [15 ], manttelisolulymfooman (MCL) [18], multippelimyelooma [8] ja akuutti myelooinen leukemia (AML) [17]. Nämä tulokset tukevat käsitystä, että SINE yhdisteillä on biologinen aktiivisuus ihmisillä, joilla on syöpä.

Spontaani koiran syövistä näytteille monia kliinisiä ja molekyylitason yhtäläisyyksiä ihmisen syöpien ja sellaisena toimii houkuttelevana mallina prekliinisissä tutkimuksissa, jotka arvioivat biologinen aktiivisuus ja toksisuudet uusien anti-syöpähoitojen. Tällaiset tutkimukset on käytetty vahvistamaan aktiivisuuden multi-kohdennettuja reseptori tyrosiinikinaasin estäjät (toseranibi) [21], [22], uusi kemoterapeuttisten aineiden (GS-9219) [23], ja monet muut pienet molekyyli-inhibiittorit (ibrutinib, STA -1474) [24], [25]. Siksi Tämän työn tarkoituksena oli tutkia vaikutuksia SINE yhdisteiden koiran spontaani syövissä. Erityisesti niiden toiminta arvioitiin aluksi

in vitro

vastaan ​​koiran kasvainsolulinjoissa kanssa korostetaan erityisesti hematopoieettiset kasvaimet, jonka jälkeen vaiheen I tutkimuksen romaanin SINE KPT-335 suoritettiin koirilla, joilla oli metastaattinen osteosarkooman, masto kasvain ja non-Hodgkin-lymfooman (NHL). Nämä tutkimukset loi perustan nykyisen vaiheen I arvioinnin SINE yhdistettä KPT-330 ihmisillä, joilla on syöpä ja mahdollisesti pivotaalitutkimus KPT-335 koirille, joilla oli äskettäin diagnosoitu tai uusiutunut NHL.

Materiaalit ja menetelmät

primaarikasvaimen näytteet ja Cell Culture

Kryosäilötyt saadut kasvainsolut steriili imusolmuke biopsianäytteissä koirien kanssa diffuusi suuri B-solujen lymfooma (DLBCL) viljeltiin 100 ng /ml megaCD40L (Enzo Life Science, Plymouth Meeting, PA) kuten aiemmin on kuvattu [26], [27]. Ihmisen T-soluleukemiasolulinja, Jurkat, oli American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), ja niitä viljeltiin RPMI1640-väliaineessa (Gibco /BRL, Grand Island, NY), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Atlas Biologicals, Fort Collins, CO), 2-merkaptoetanolia (Gibco /BRL), HEPES, L-glutamiinia, natriumpyruvaattia (Mediatech Inc., Manassas, VA), ei-välttämättömiä aminohappoja (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) ja Primocin (Invivogen, San Diego, CA). Koiran DLBCL solulinja CLBL1 saatu Dr. Barbara Rütgen (Wienin yliopisto, Itävalta) [28], [29] ja ihmisen DLBCL solulinjoissa OCI-Ly3 [30], [31] ja OCI-Ly10 [32] saatuja Dr. Anne Novak (Mayo Clinic Cancer Center, Rochester, MN) viljeltiin täydellisessä Iscoven muokattu Dulbeccon alustassa (IMDM), joka sisälsi 20% FBS: ää, L-glutamiinia, ja Primocin. Kaikki solut pidettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-ilmakehässä. Lisäksi seuraavat koiran tuumorisolulinjat käytettiin arvioitaessa vastauksena SINE yhdisteet: C2, syöttösolujen kasvain line Dr. George Caughey, UCSF, San Francisco, CA [33]; OSA16, luusarkoomasolulinjassa, Dr. Jaime Modiano, UM, Minneapolis, MN [34]; ja 323610-3, pahanlaatuinen melanooma solulinjaa, Dr. Michael Kent, UCD, Davis, CA [35]. Kaikkia solulinjoja viljeltiin täydellisessä RPMI-elatusaineeseen, joka sisälsi 10% FBS: ää, antibiootti /antimykootti, HEPES, natriumpyruvaattia, ei-välttämättömiä aminohappoja ja Glutamax (media täydentää Gibco).

elinvoimaisuus ja lisääntymismääritykset

Solujen elinkelpoisuus lymfaattisen linjat määritettiin MTS (3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksimetoksifenyyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2H-tetratsolium) määritys käyttäen CellTiter 96 ® AQ

ueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit (Promega, Madison, WI). Lyhyesti, lymfaattisen solulinjat, 5 x 10

4-solut (tai 1 x 10

5 ensisijainen DLBCL soluja) viljeltiin 100 ul: aan täydellistä alustaa 96-kuoppaisilla levyillä, kun läsnä on SINE yhdisteitä. 72 tunnin jälkeen, 20 ui MTS-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja soluja inkuboitiin vielä 4 tunnin ajan, ennen kuin mittaamalla absorbanssi 490 nm: ssä käyttäen Wallac Victor 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer, Waltham, MA). IC

50 sini laskettiin käyttäen Prism 6 ohjelmistoa (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA).

Ei-lymfoidisolulinjojen, 96 kuopan levyille siirrostettiin kolmena kappaleena 90 ui 2500 solua /kuoppa OSA16, 5000 solua /kuoppa C2, ja 2500 solua /kuoppa 323610-3. Lisää levyjä kasvatettiin yön yli, sitten käsiteltiin seuraavana päivänä 10 ui KPT-214 C10 media pitoisuuksina 0,0001, 0,01, 0,1, 1,0 ja 10 uM. Levyt kerättiin 92 tuntia, sentrifugoitiin 1300 rpm, ja supernatantti poistettiin kääntämällä levyt imukykyinen paperi. Tämän jälkeen levyt suljettiin ja laitettiin välittömästi -80 ° C: ssa vähintään 12 tunnin ajan. Levyt sulatettiin sitten ja CyQuant ®Cell proliferaatiomääritystä (Life Technologies) tehtiin noudattamalla valmistajan protokollaa. Lyhyesti, 200 ui laimennettua työpäivän CyQuant lisättiin kuhunkin kuoppaan ja valolta suojattuna. Fluoresenssi mitattu käyttäen SpectraMax M2 mikrolevylukijalla 480 nm: n virityksellä ja 520 nm emissio. Tulokset olivat edustettuina prosenttia ohjaus, tai piirtää laskea IC

50-arvot 92 tuntia.

apoptoosimäärityksessä

Jurkat parit ja koiran DLBCL soluja viljeltiin 24 tuntia läsnä oli 100 nM KPT-335 tai dimetyylisulfoksidi (DMSO). Solut värjättiin anneksiini V (eBiosciences, San Diego, CA) valmistajan ohjeita. Virtaussytometria suoritettiin käyttäen BD LSRII virtaussytometrillä (BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA) ja tulokset analysoitiin käyttämällä FlowJo ohjelmistoa (Puu Star, Ashland, OR).

Immunoblottausmääritys

Kryosäilötyt ensisijainen canine DLBCL ja CLBL1 solut lyysattiin RIPA-puskuriin, joka sisälsi 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7,4, 0,1% natriumdodekyylisulfaattia (SDS), 1,0% Triton X-100, 1,0% natriumdeoksikolaattia, 5 mM EDTA, 1 mM ditiotreitolia, ja proteinaasi Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Liukenematon materiaali poistettiin sentrifugoimalla, ja proteiinin pitoisuudet solulysaateista määritettiin käyttämällä BioRad Protein Assay Kit (BioRad, Hercules, CA). Proteiinit (100 ug) erotettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (BioRad, Hercules, CA). Vasta-aineen värjäys suoritettiin käyttäen SNAP i.d. järjestelmä (EMD Millipore, Billerica, MA) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, kalvon estyi 50% LI-COR estopuskurilla (LI-COR, Lincoln, NE) ja värjättiin kaniinin anti-XPO1 vasta-ainetta (1:66 laimennus, Santa Cruz, Santa Cruz, CA) ja hiiren anti-aktiini-vasta (1:1666 laimennus, Sigma-Aldrich), jota seurasi toissijainen aasin anti-kani-vasta-aine konjugoituna IRDye800 ja anti-hiiri-vasta-aine konjugoituna IRDye680 (1:3,333 laimennus, LI-COR). Detection suoritettiin käyttäen Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR).

KPT-335 Formulointi

KPT-335 valmistettiin liivate kapselit vahvuudet vaihtelevat 2,5 mg 20 mg aktiivinen farmaseuttinen ainesosa (API). API oli märkäjauhetusta kanssa Lutrol F68 NF (BASF) ja vettä Mikrofluidistiikka mikro-fluidizer yhdistettynä Plasdone® K29 /30 (ISP Technologies), ja lyofilisoitiin. Lyofilisoitu jauheet sisälsivät 70-75% API. Kapselit yksitellen käsin täynnä lyofilisoituna jauheena haluttuun annosvahvuus. Kaikki apuaineet olivat sopivia laadut käytettäväksi lääkkeiden.

Farmakokinetiikka Analysis Healthy Dogs

KPT-335 annettiin yhtenä oraalisena annoksena kapseliformulaatiota 6 urosvainukoiraan noin 1,5 mg /kg aterian jälkeen. Serial verinäytteet kerättiin jokaisesta koirasta ennen annostelua ja 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 18, 24 ja 48 tuntia annoksen jälkeen ja sijoitettiin putkiin, jotka sisälsivät K

2EDTA. Verinäytteet säilytettiin kosteana asti jäissä käsitelty plasma sentrifugoimalla 3500 rpm: llä 10 minuuttia 5 ° C: ssa. Plasmanäytteet varastoitiin -80 ° C: ssa, kunnes analyysi Agilux Laboratories (Worcester, MA). Plasma analysoitiin kantalääkkeestä pitoisuuden avulla näytteen valmistelua proteiinisaostusta ja sitten analyysi LC-MS /MS käyttäen propranololia sisäisenä standardina. Menetelmää päteviä käytettäväksi (yhden erän arvioida menetelmän suorituskykyä: tarkkuus ja täsmällisyys, lineaarisuuden laimennus, ja matriisi spesifisyys) ennen aloittamista näytteen analysointia. Hyväksymiskriteerit Kalibrointistandardeihin ja laadunvalvonta näytteet korkeintaan ± 30% nimellinen. Yksittäisten eläinten farmakokineettiset muuttujat johdettiin farmakokineettinen analyysi ohjelma Phoenix WinNonlin versio 6.3 (Pharsight Corporation), käyttäen ei-compartmental Malli 200 yhtenäisin painotus. Kerta-annoksen farmakokineettiset parametrit arvioitiin kuuluvat: C

max (maksimipitoisuus havaittu); T

max (aika havaitun maksimin pitoisuus); AUC

0 → ∞ (pinta-ala pitoisuus-aika-käyrän nollasta ekstrapoloidaan äärettömään); AUC

0 → viime alaan (pitoisuus-aika-käyrän nollasta aikaan viime määrällisesti pitoisuus); ja t

1/2 (terminaalinen puoliintumisaika). Tarkempi tilastotietoja (keskiarvo, keskihajonta, ja vakio keskivirhe) laskettiin pyöristämättömistä numerot Excel (Microsoft) taulukkoon. Pitoisuus tulokset, välineet, ja lasketaan parametrit ilmoitettiin 3 merkitsevän numeron.

Kliinisessä kelpoisuus

Tämä kliininen tutkimus hyväksyttiin Ohio State University (OSU) Veterinary Medical Center (VMC) Clinical tutkimuksen neuvoa-antavan komitean ja OSU IACUC; IACUC hyväksyntä saatiin myös University of Minnesota ja Texas A M University. Kirjallinen suostumus omistajan jokaisen koiran saatiin ennen tutkimukseen osallistumista. KPT-335 annettiin koirille, joilla oli metastaattinen osteosarkooman, syöttösolukasvainten kasvain tai NHL joka oli epäonnistunut tavanomaista hoitoa tai joille ei ollut hoitovaihtoehtoja, tai joiden tavanomainen hoito ei ollut haluttua omistaja. Voidakseen saada tutkimukseen, kukin koira on pitänyt ehdottomasti diagnosoitu kautta sytologian tai histopatologian ja oli täyttänyt kaikki sisällyttämisen kriteerit ja mikään poissulkemisperusteiden. Muita kelpoisuusehdot sisältyvät: 1 vuotias tutkimuksen alkaessa; elinten toiminta oli riittävä; vähintään 2 viikkoa sen jälkeen ennen kemoterapiaa tai sädehoitoa täysin toipuminen välitön myrkyllisyys on näistä hoidoista (3 viikkoa kirurgisen toimenpiteen); vähintään 1 viikko alkaen aiemmin hoidettu muun tutkittavaa lääkettä; ja mitään näyttöä etäpesäkkeistä aivoissa tai vakavia systeemisiä häiriö ristiriidassa tutkimuksen harkinnan mukaan tutkijan.

Tutkimusasetelma

Tämä tutkimus oli vaiheen I annos kiihtyvän, avoimessa arviointi turvallisuus ja biologista aktiivisuutta KPT-335 client omistaa koirien kanssa spontaani syöpäsairauksia. Arviointi toksisuutta kliinisesti ja kasvaimen vasteen suoritettiin jokaisen käynnin. Koirat arvioitiin hematologiset ja biokemialliset toksisuutta 7 päivän välein rutiinilla bloodwork. Alkuannoksen 1 mg /kg suun kautta kaksi kertaa viikossa (maanantai /torstaina tai tiistai /perjantai) perustui aiempien tietojen laboratorion normaalia koirat (tuloksia ei ole esitetty) ja annoksen suurentaminen asetettiin 0,25 mg /kg kerrallaan kohortit 3 kunnes annosta rajoittava myrkyllisyys (DLT) tunnistettiin. DLT pidettiin tahansa asteen 3 tai 4 hematologinen tai ei-hematologinen toksisuus perusteella vakiintuneen VCOG-CTCAE kriteerien [36]. Lisäksi kaikki kroonisten ei-asteen 3 tai 4 toksisuutta katsotaan merkittävästi heikentää elämänlaatua (ts, uneliaisuus, ruokahaluttomuus) olivat päteviä kuin DLTS. Taudin etenemistä tai oireita varmasti liittyvien sairauksien ei pidetty haittatapahtumat (AE). Suurin siedetty annos (MTD) pidettiin yhden annoksen alapuolella, mikä DLT tapahtunut.

Myrkyllisyys Arvio

Jokainen potilas koki lähtötilanteessa täydellistä historiaa, lääkärintarkastus, ja ennen annosta laboratorio arviointi, johon sisältyi täydellinen verenkuva (CBC), seerumin biokemia profiilin, hyytymisparametrejä (PT /PTT) ja virtsa-analyysi. Potilaat arvioitiin haittavaikutusten päivinä 7, 14, 21, ja 28, ja 2 viikon välein sen jälkeen jolloin kaikki laboratoriokokeet toistettiin. Ehtoja koskien minimaalinen hematologinen vaatimuksista jatkuvan annostelun sisältyivät protokolla: hematokriitti 25%, neutrofiilejä 1500 /L, verihiutaleita 100000 /l. Lisäksi transaminaasit piti olla 4X normaalin ylärajan normaalilla kokonaisbilirubiini ja seerumin kreatiniini jatkamaan KPT-335 terapia.

samanaikainen lääkehoito

Hoitoon huumeisiin liittyvien ruoansulatuskanavan toksisuutta, tukihoito annettiin tarvitaan koiria ilmoittautunut tässä tutkimuksessa. Tämä koostui tyypillisesti famotidiini, omepratsoli, metronidatsoli, loperamidin, metoklopramidi, ondansetroni, ja /tai maropitantti. Antihistamiinit annettiin koirille masto kasvaimet, koska nämä kasvaimet ovat tiedossa vapauttaa histamiinia. Muut tukihoito annettiin koirille koostui prednisoni ja steroideihin kuulumattomien tulehduskipulääkkeiden lääkkeiden hoitoon kasvaimeen liittyvien tulehdus, ruokahaluttomuus, ja kivun hallintaan.

tuumorivaste Assessment

Kasvaimen arvioinnit valmistuivat ennen tutkimukseen osallistumista, ja päivää 7, 14, 21, ja 28. koirat jatkaa yli 4 viikon vaste arvioinnit tehtiin 2 viikon välein sen jälkeen, tai kun epäillään syövän etenemiseen. Vastaukset arvioitiin tutkijan mukaan ennalta määriteltyjen protokollaa kriteerit. Vastaus koirilla, joilla arvioitavissa tauti suoritettiin kliininen tutkimus, ultraääni, tai rintakehän röntgenkuvaus. Monet vauriot eivät myöntyväinen kvantitatiiviseen röntgenkuvausta, mutta seurasi joko sarja- kliininen tutkimus (pinnallinen vaurioita; kouraantuntuva imusolmukkeiden) tai ultraäänitutkimus (vatsaontelon imusolmukkeiden). Rintakehä vauriot arvioitiin rintakehä radiografian.

Vastaus koirilla, joilla mitattavissa oleva tauti arvioitiin tutkijan perusteella Response arviointiperusteet Peripheral solmukohtien lymfooma koirilla (v1.0) [37]. Täydellinen vaste (CR) määriteltiin katoavat kokonaan taudin kaksi mittausta erotettu vähintään 3 viikkoa. Osittainen vaste (PR) määritettiin yli 30%: n vähennys summa pisin halkaisija kohde vaurioiden dokumentoitu kahdella arvioinnit erotettu vähintään 3 viikkoa. Kasvua 20% koossa kaikkien mitattavissa kasvain alueilla mitattuna summa pisimmän halkaisijan kohde vauriot otetaan vertailukohdaksi pienimmän summan jälkeen hoidon aloittamisen tai ulkonäkö uusia leesio (t) täyttäisi kuten etenevä sairaus (PD). Vakaa tauti (SD) oli määritelty puuttuminen kriteerit joko vastauksen tai etenemisen; pidettävä SD, koirat on osoitettava mitään todisteita PD 28 vuorokauden arviointia. Koirat, joilla ei ollut näyttöä syövän etenemisen ja jotka eivät olleet kokeneet mitään hyväksyttävää myrkyllisyyttä olivat oikeutettuja pidennettyyn hoitojaksoa. Annoksen nostaminen kahdesti viikossa annettaessa kolme kertaa viikossa hallinnon yksittäisen koira oli sallittua, jos koira oli sietää hoitoa.

Elämänlaatu Assessment

keino arvioida elämänlaatua koirille, joilla on syövän hoidon aikana on aiemmin julkaistu [38]. Tätä käytettiin arvioimaan omistajalle koettu muutoksia koirien käynnissä KPT-335 hoidon aikana sekä annoksen suurentamisvaiheen annoksen laajennus tutkimuksissa. Yleistä elämänlaatua (QOL) pisteet luotiin perustuen vastaukset kysymyksiin elämänlaatua kyselylomakkeen. Pisteiden jokaisen kysymyksen laskettiin yhteen johtaen kaiken elämänlaatu pisteet jotka voivat vaihdella 23 115 trendit Elämänlaatu (QOL) tutkimuksen aikana tutkittiin käyttäen lineaarisia sekamalleja sisältävien kiinteiden vaikutusten aikaa ja autoregressive korrelaatiorakenteeseen että satunnaisia ​​virheitä. Wald testejä käytettiin testaamaan merkittävän muutoksen QOL kanssa vapausasteita laskettu käyttäen Kenward-Roger menetelmä [39]. Mittaukset saatiin 90 päivän kuluttua ei sisällytetty analyysiin varten annoksen kokoa kasvatettiin ja mittaukset 70 päivän jälkeen ei sisällytetty analyysiin annoksesta laajeneminen tietojen vuoksi vähän tietoa sen jälkeen, kun ne ajankohtina.

Tulokset

aktiivisuus SINE yhdisteiden vastaan ​​Koirien tuumorisoluissa

in vitro

ensin arvioitiin vaikutusta KPT-185, joka on yksi voimakkaimmista SINE yhdisteitä mutta rajoitettu suullinen hyötyosuutta ja siksi soveltuu vain

in vitro

tutkimuksissa Jurkat (ihmisen T-solujen leukemian solut) ja 6 ensisijainen koiran DLBCL näytettä (5 selvä kasvaimia yhdet sama kasvain). KPT-185 esti tehokkaasti elinkelpoisuus Jurkat ja koiran DLBCL soluja (kuvio 1A ja taulukko 1). IC

50 KPT-185 vastaan ​​Jurkat (n = 3) ja ensisijainen koiran DLBCL näytteitä (n = 6) olivat 8,7 ± 0,7 nM ja 13,3 ± 6,2 nM. KPT185-trans-isomeeri (joka on -100 kertaa vähemmän XPO1 eston aktiivisuus kuin cis-isomeeri), osoitti paljon vähemmän toksisuutta, kun sitä testattiin käyttäen Jurkat-soluja ja yksi ensisijainen koiran DLBCL näytteet (IC

50 olivat 1000 nM molemmissa kasvainsoluja). Seuraavaksi arvioimme vaikutus KPT-335, kliininen ehdokas yhdiste on hyvä suun altistus käytetään tässä kliinisessä tutkimuksessa, koirien ja ihmisten DLBCL soluja. KPT-335 inhiboi elinkelpoisuuden OCI-Ly3, OCI-Ly10, ja CLBL1 on IC

50 2,1 ± 1,3 nM, 41,8 ± 21,0 nM ja 8,5 ± 4,1 nM, vastaavasti (kuvio 1 B ja taulukko 1). Olemme myös osoittaneet KPT-335 indusoi apoptoosin CLBL1 parit ja koiran DLBCL soluihin käyttäen virtaussytometria. Solujen käsittely KPT-335: ssa 24 tuntia kasvanut apoptoottisten solujen (anneksiini V

+ solut) verrattuna pilkkaatte käsiteltyjen solujen (kuvio 1C). Lopuksi vahvistettu ilmaus XPO1, joka havaittiin arvioitu koko XPO1 (~123 kDa), koiran solut käyttämällä CLBL1 solulinja, ihmisen DLBCL solulinjat, ja koiran ensisijainen DLBCL soluja (kuvio 1 D). Yhdessä sekä ihmisen ja koiran DLBCL ilmaista XPO1 ja SINE yhdisteet osoittavat voimakasta aktiivisuutta näitä kasvainsoluja, mikä viittaa mahdollisen terapeuttista hyötyä ihmisen ja koiran potilaalla on DLBCL.

(A) Jurkat parit ja koiran DLBCL soluja (näyte # 1-5, # 5 on itsenäisesti testattiin kahdesti) viljeltiin 96-kuoppaisilla levyillä 72 tunnin ajan log sarjalaimennoksilla KPT-185 ja solujen elinkykyisyys analysoitiin käyttäen MTS-määritystä. Kukin koe suoritettiin kahtena kappaleena kuoppiin ja kokeet toistettiin kolme kertaa (B) Ihmisen ja koiran DLBCL soluja viljeltiin 96-kuoppaisella levyllä 72 tunnin ajan 3-kertainen sarjalaimennoksia (0-1000 nM) KPT-335 ja analysoidaan käyttäen MTS-määritystä. Kukin koe suoritettiin kahtena kappaleena kuoppiin ja kokeet toistettiin kolme kertaa. (C) CLBL1 parit ja koiran DLBCL soluja (näyte # 1) käsiteltiin 100 nM KPT-335: ssa 24 tuntia ja analysoitiin apoptoosin virtaussytometriaa käyttämällä. Kokeet suoritettiin kolmesti itsenäisesti ja keskimääräiset tulokset on esitetty. (D) ilmentäminen XPO1 ihmisen ja koiran DLBCL solulinjoissa. Proteiini lysaatit valmistettiin OCI-Ly3, OCI-Ly10, ja CLBL1 erotettiin SDS-PAGE: lla ja alistettiin immunoblottauksella varten XPO1; β-aktiini toimi kontrollina.

Tuottaa alustava arvio mahdollisista toiminnan SINE XPO1 antagonistien vastaan ​​ylimääräisiä koiran syöpiä, C2 syöttösolukasvainten kasvain linjan, OSA16 luusarkoomasolulinjassa ja 323610-3 melanoomasolulinja käytettiin. Näissä tutkimuksissa aiemmin analoginen, KPT-214, oli saatavilla in vitro kokeissa (kuvio 2). IC

50 KPT-214 vastaan ​​C2, OSA16 ja 323610 olivat 490 nM, 89 nM, ja 70 nM, vastaavasti. Yhteenvetona SINE osoittavat biologisen aktiivisuuden

in vitro

vastaan ​​monenlaisia ​​koiran kasvainsolulinjoissa, lymfaattisen linjat on kaikkein herkin aivan pieni nanomoolialueella. Nämä tiedot tukivat myöhemmin

in vivo

arvioinnissa SINE koirilla kanssa spontaani syöpiin, joissa korostetaan erityisesti koirille NHL.

Koirien kasvainsolulinjoja C2 (syöttösoluja), OSA16 (osteosarkooma) ja 323610-3 viljeltiin 96-kuoppaisilla levyillä kolmena kappaleena sarjalaimennoksilla KPT-214 92 tuntia, jonka jälkeen levyt otettiin talteen, media poistettiin ja levyt jäädytettiin -80 ° C: ssa. Analyysi vaikutukset soluproliferaatioon suoritettiin sitten käyttäen CyQuant määritystä mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kokeet toistettiin kolme kertaa; IC

50 jokaista solulinjaa on esitetty.

farmakokinetiikkaa KPT-335 in Healthy Dogs

arvioimiseksi farmakokinetiikkaa KPT-335, kuusi tervettä beaglekoirilla olivat annettiin yksi annos lääkettä 1,5 mg /kg sen jälkeen, kun syötetään aterian. Verinäytteet otettiin yli 48 tunnin ajanjakson ja analysoitiin plasman KPT-335 pitoisuuksia. Tulokset on esitetty taulukossa 2. Keskimääräinen T

max oli noin 4 tuntia, jossa C

max noin 250 ng /ml, ja keskimääräinen AUC 1800 ng /ml.

annoksen kokoa kasvatettiin

Potilaiden demografiset.

Potilaiden demografiset ja kasvain tyypit on lueteltu taulukossa 3. yhteensä 17 koiraa, otettiin annoksen suurentaminen osan tutkimuksesta. Mediaani-ikä oli 7,5 vuotta ja mediaani paino oli 35 kg. Suurin osa koirista otettiin oli NHL (n = 14), ja suurin osa (n = 12) oli myös saanut ennen hoitoa kirurgia, kemoterapiaa ja /tai prednisonia. Prednisoni annettiin 10 koiraa aikana KPT-335 käsittely 0,5 mg /kg joko kerran päivässä tai joka toinen päivä; in 8/10 tapauksissa koirat tuli tutkimuksen jälkeen, kun kokenut taudin etenemistä edessä prednisonin hoidon ja siten lääke ei lopetettu. Loput kaksi koiraa sijoitettiin prednisone jälkeen ensimmäisten 28 hoitopäivän käsittelemään ruokahaluttomuutta /anoreksia hoitoon liittyvät. Nämä koirat saivat prednisoni 0,5 mg /kg joka toinen päivä ajaksi hoidon KPT-335.

Kliininen toksisuuksia ja suurin siedetty annos.

Kaikille koirille kirjoilla annoksen suurentamista osa tutkimuksessa tärkeimmiksi toksisuutta kliinisesti koostui pääasiassa luokan 1 ja 2 ruoansulatuskanavan tapahtumia kuten ruokahaluttomuus, oksentelu ja ripuli sekä uupumus (yhteenveto taulukoissa 4 ja 5). MTD perustettiin 1,75 mg /kg kahdesti viikossa (maanantai /torstai). Kaikki kolme koiraa 2 mg /kg kohortti koki DLT lukien Asteen 3 anoreksia (n = 2), 3. asteen oksentelu (n = 1), 3. asteen ripuli (n = 1), 3. asteen ALT nousu (n = 2), arvosana 3 AST nousu (n = 1), ja 3. asteen ALP korkeus (n = 1). Siksi haittatapahtumaprofiili KPT-335 rajoittui lähinnä ruoansulatuskanavassa ja kliinisesti merkittävä hepatotoxicity havaittiin pääasiassa annoksilla yli MTD.

4 tapauksissa, koiria, jotka olivat lääke 4 viikon ajan ollut muutoksen hoito alkaen kahdesti viikossa kolme kertaa viikossa (maanantai /keskiviikko /perjantai) kuin lääke oli hyvin siedetty ja koirat olivat kokeneet stabiili tauti. Tämä tapahtui yhden Koira, joka sai 1 mg /kg, kaksi koiraa sai 1,25 mg /kg, ja yksi koira sai 1,5 mg /kg. He pysyi samalla lisääntynyt annostelun hoito-hoidon ajaksi (mediaani 68,5 päivää) ei lisää toksisuutta kliinisesti. 4 tapauksissa annoksen muutokset tehtiin koirille, jotka kokivat haittavaikutuksia. Kaksi näistä esiintyi koirilla, jotka saivat lääkettä 2 mg /kg ja kokenut asteen 3 haittavaikutukset; molemmissa tapauksissa, annosta pienennettiin 1,5 mg /kg kahdesti viikossa. Kahdessa muussa tapauksissa yksi koira väheni 1,75 mg /kg 1,5 mg: aan /kg sen jälkeen 1,25 mg /kg jatkuessa ongelmia anoreksia ja muut koira oli vähentynyt 1,5 mg /kg 1,25 mg /kg, myös johtuen ruokahaluttomuus. Tämä viimeinen potilas jatkoivat hoitoa varten 246 päivää.

hoitovaste.

TTP: n mediaani kaikille koirille oli 35 päivää (vaihteluväli 14-246 päivää). Yhteensä 7 koiraa kokenut PD ensimmäisen 4 viikon hoidon jälkeen.